KR101933600B1 - 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벌꿀을 발효한 발효물을 포함한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 각질제거 및 주름개선 활성이 우수하여 기능성 화장품 제조에 효과적이다.

Description

벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for removing keratin and anti-wrinkle comprising fermented honey}

본 발명은 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벌꿀을 사용하여 효모를 통해 발효한 발효물의 유효성분을 포함하는 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 웰빙(Well-being), 웰에이징(Well-aging), 안티에이징(Anti-aging) 및 감성소비와 같은 새로운 소비트렌드에 부합하여 지속적인 성장세를 보이며 화장품산업에 다양한 바이오기술이 접목되고 있다.

특히, 소비자들이 천연, 활성, 건강 화장품에 관심을 갖기 시작하면서, 한방 얼굴 피부보호용 화장품이 열렬한 환영을 받고 있는 트렌드에 따라 생물제제, 생물활성 추출물, 천연식품 첨가제는 화장품 원료가 되었으며, 이미 피부 보호용 화장품 연구개발의 중요 영역 중 하나가 되는 추세이며, 바이오산업인 화장품은 유용한 물질을 생산하는 고부가 가치산업으로 최근엔 IT, NT 융·복합 기술을 접목, 응용하여 확대되고 있다.

또한, 현대인에게 이미 필수품이 된 화장품의 소모량은 매년 급격하게 증가하고 있으며 동시에 다기능과 고기능성 화장품이 출시 되고 있고, 피부유형뿐만 아니라 남녀, 연령층, 기능별, 화장품의 사용목적별, 신체부위별, 가격대별 및 개인의 피부에 따른 맞춤형 화장품으로 구분되어 무한히 생산되고 있다.

그러나 오자와다카하루(2006)의 '화장품, 얼굴에 독을 발라라', 케빈 도노반(2008)의 '화장품의 진실'이란 저서 등을 통해 전문가들이 화장품에 들어가는 상당 부분의 물질이 피부에 유해함을 줄 수 있다는 견해를 밝히는 등 소비자들로부터 화장품의 안전성에 대한 인식을 불러일으키는 사회적 이슈가 끊임없이 발생하고 있다. 그 결과, 화장품에 대한 안전성 부분에서의 인식의 변화는 소비자들이 천연원료를 구입하여 직접 만든 DIY 화장품을 사용한다거나 무방부제 또는 천연원료만 사용한 천연화장품, 유기농 화장품으로 시선을 돌리게 만들었으며, 세계 화장품 생산업체는 이에 맞는 화장료를 개발하기에 이르렀다.

앞으로 다가오는 미래에는 인간의 수명이 늘고 고령층이 증가된 사회에서 노화를 조금이라도 늦추기 위한 다양한 기능성 화장품 개발이 더욱 발전할 것이며, 발전된 과학이 화장품에 도입되는 것은 매우 바람직한 현상이나 동시에 유해함을 최소화 하는 것이 우리의 숙제가 되고 있다.

이러한 변화에 발 맞춰 화장품도 자연친화적인 성분과 제조에 있어서도 인간에게 유익한 미생물을 이용한 발효가 도입되고 다양한 방면에서 꽤 많은 성과를 보이고 있는 바, 화장품의 전성분표시제가 도입되면서 천연성분 혹은 한방성분을 표방하는 제품이 자연친화적인 이미지를 내세우면서 앞 다투어 개발, 제조 되었으며 우리의 생활 속에 발효과학이 식품이 아닌 화장품에 접목되고 있다.

따라서 본 발명의 발명자들은 안전하고 효능 있는 제품을 선호하는 소비자들의 욕구에 가장 부합하는 발효화장품으로서, 각질을 효과적으로 제거하면서 주름 개선 효능이 있는 화장료를 개발하고자 연구하던 중 이러한 트렌드에 맞춰 효모라는 생물을 활용하여 벌꿀을 발효함으로써 생성되는 다양한 발효부산물과 발효라는 과정을 통해 야기되는 성분의 변화와 2차산물을 이용한 화장료를 개발하였으며, 그 화장료가 각질제거 및 주름개선 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

특히, 기존의 화장료의 선택은 소재가 천연유래인지 또는 가격이 저렴하고 컨셉으로 사용이 가능한지에 대한 여부가 중요하였다면 현재는 전통적인 방법으로 장기간에 걸쳐 개발된 유효성, 안전성, 안정성을 확보한 글로벌 수준의 원료를 원하고 있으므로, 단순한 추출물이 아닌 유효성물질로서 화장료를 개발하였다.

또한, 발효는 미생물이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정에서 다양한 대사산물이 발생하며 이러한 대사산물은 기존의 원물이 갖지 못하는 특별한 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 발효라는 과정은 기존 원물의 새로운 기능을 부여함으로써 새로운 기능성 원료를 탄생시킬 수 있는 하나의 수단이 될 수 있으므로, 본 발명은 효모를 이용하여 새로운 벌꿀 발효법을 개발하고, 발효를 통해 생산되는 2차산물의 특성을 분석하여 이를 유효성이 확보된 화장료로 개발함으로써 유효성과 원료의 안전성을 확보하고자 한다.

따라서 본 발명의 목적은 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 와인발효용 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 벌꿀을 1차 혐기발효 및 젖산균을 이용한 2차 호기발효를 통하여 유기산형태로 생성된 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 와인발효용 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 벌꿀을 1차 혐기발효 및 젖산균을 이용한 2차 호기발효를 통하여 유기산형태로 생성된 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기와 같이, 본 발명은 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 각질제거 및 주름개선 활성이 우수하여 기능성 화장품 제조에 효과적이다.

도 1은 종래기술에 따른 효모를 이용한 벌꿀 발효과정을 도식화한 도면,
도 2는 본 발명에 따른 효모를 이용한 벌꿀 발효 및 원료화 과정을 도식화한 도면,
도 3은 본 발명에 따른 발효과정을 거친 벌꿀 발효물의 유기산의 HPLC 분석 그래프,
도 4는 6가지 벌꿀 발효액에 대한 발효 전후의 유기산의 총 함량을 도시한 그래프,
도 5는 6가지 벌꿀 발효액에 대한 발효 전후의 폴리페놀 함량을 도시한 그래프,
도 6은 6가지 벌꿀 발효액에 대한 발효 전후의 플라보노이드 함량을 도시한 그래프,
도 7은 본 발명에 따른 벌꿀의 발효 전과 후의 세포독성 결과 그래프,
도 8은 본 발명에 따른 벌꿀의 발효 전과 후의 피부 각질 상태 변화를 촬영한 사진,
도 9는 본 발명에 따른 벌꿀의 발효 전과 후의 콜라겐 생합성 정도를 나타낸 그래프,
도 10은 본 발명에 따른 벌꿀의 발효 전과 후의 MMP-1 활성 저해도를 나타낸 그래프,
도 11은 본 발명에 따른 벌꿀 발효 전과 후의 피부섬유아세포의 변화를 나타낸 현미경 사진.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예들의 상세한 설명이 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 하기 설명에서 구체적인 특정 사항들이 나타나고 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해 제공된 것일뿐, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명은 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 와인발효용 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 벌꿀을 1차 혐기발효 및 젖산균을 이용한 2차 호기발효를 통하여 유기산형태로 생성된 벌꿀 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

종래의 화장료의 선택은 소재가 천연유래인지 또는 가격이 저렴하고 컨셉으로 사용이 가능한지에 대한 여부가 중요하였다면, 현재는 전통적인 방법으로 장기간에 걸쳐 단순한 추출물이 아닌 유효성물질로 개발된 유효성, 안전성 및 안정성을 확보한 글로벌 수준의 원료가 요구된다.

발효는 미생물이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정에서 다양한 대사산물이 발생하며 이러한 대사산물은 기존의 원물이 갖지 못하는 특별한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 발효라는 과정은 기존 원물의 새로운 기능을 부여함으로써 새로운 기능성 원료를 탄생시킬 수 있는 하나의 수단이 될 수 있으므로, 본 발명은 효모를 이용하여 발효과정을 개발하고 발효를 통해 생산되는 2차산물의 특성을 분석하여 이를 유효성이 확보된 화장료로 개발함으로써 유효성과 원료의 안전성을 확보할 수 있다.

본 발명은 효모를 활용하여 벌꿀을 발효함으로써 생성되는 다양한 발효부산물과 본 발명에 따른 특정한 발효방법을 통해 야기되는 성분의 변화를 이용한 화장료를 제공한다. 또한, 발효과정에서 나오는 발효부산물을 분석기술을 통하여 구조를 동정하고 개발된 화장료의 피부 민감성 정도를 in silico 프로그램을 이용하여 독성화 데이터를 얻음으로써 안전한 화장료의 원료를 제공할 수 있다. in silico 프로그램은 기전에 근거하여 화합물의 피부 민감화의 유해성을 평가하는 시험법으로, 원료의 개발과 동시에 in silico의 빅데이터를 이용하여 미리 피부 유해성을 확보함으로써 화장료 개발의 비용과 시간을 절약 할 수 있다.

<원료선정>

상기 벌꿀의 종류는 특별히 제한되지 아니하나, 하기의 표 1에 나타낸 밀원 별 벌꿀의 기능성 물질 함량을 대비하여 선정할 수 있으며, 이하의 실시 예에서는 이 중 집단재배가 가능하며 꿀 함유량이 높고 각 기능성 물질의 함량이 비교적 높은 메밀꽃을 밀원으로 선별하였다. 하기의 표 1은 페놀화합물 및 플라보노이드 함량에 따른 밀원별 항균 및 항산화 활성을 나타낸 것이다(2010년, 한국양봉학회지 25).

메밀꿀은 메밀꽃을 밀원으로 하는 꿀로 적갈색이나 암갈색을 띠는데, 메밀꽃이 피는 시기에 맞춰 주로 9월에서 10월 사이에 서늘한 지역에서 생산되며 꿀향이 독특하고 맛이 자극적이어서 약용으로 많이 사용된다.

벌꿀 성분은 크게 포도당과 과당으로 나눌 수 있는데 메밀꿀은 포도당 성분을 많이 함유하고 있어 결정이 잘 만들어지며, 또한 메밀꿀은 산도가 높으며, 효소가 많아 효소작용의 활성도가 높고, 항세균성 작용이 강해 잘 변질되지 않아 저장성도 높다.

메밀꿀에는 루틴이라는 영양소가 많이 들어있어 모세혈관을 강하게 해 출혈성 질병이나 심장병, 고혈압 등을 예방하는데 좋으며, 또한 메밀꿀은 다른꿀 에 비해 총페놀물질함량이 1.7~2.1배 이상 높고, 활성산소를 제거하는 항산화능력도 아카시아꿀보다 1.6배 높은 것으로 나타났다.

효모는 오래전부터 사용되어 왔으며, 특히 식품 분야에서는 안전하고 단백질, 미네랄, 베타글루칸 등의 영양이 풍부한 식품원료로 알려져 있으며 화장품에서도 효모의 세포벽을 이루고 있는 베타글루칸이나 효모추출물 등이 보습의 기능을 갖는 원료로 사용되고 있다.

또한 효모의 피부 유용성은 1970년대부터 연구가 되어왔으며, 효모가 상처 치유에 도움을 준다는 연구들을 통해 효모추출물(Yeast extract)이 섬유아세포의 활성을 증진시키고, 콜라겐의 합성을 촉진하는 과정을 통하여 상처치유를 촉진하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 시판되는 많은 종류의 효모 중에 메밀꿀의 산도와 특성에 따라 와인발효에 사용되는 특정효모인 Saccharomyces cerevisiae를 선정하였다.

벌꿀 자체로는 효모의 발효가 불가능하므로 이를 희석할 희석수로, 충북지역의 대표수인 초정의 광천수를 선정하였다. 초정 광천수의 pH는 약산성이며 미네랄함량이 균형 있게 함유되어 있으며 유리탄소가 효소와의 반응을 활성화시켜주는 중요한 역할을 한다.

효모는 배양환경에 따라 혐기적 또는 호기적으로 반응하고 또 환경이 좋지 않을 때에는 생장을 중지하고, 이형 접합 등을 통해 외부의 열악한 환경에 대처하는 등 다른 미생물과는 달리 외부의 영향에 민감하게 대응하는 기능이 있다. 또한, 모든 유기체는 스트레스를 처음 지각하면 스트레스에 대항하여 경고반응이 나타나서 신체자원을 동원하는 생리적 각성 반응이 나타나다가, 스트레스가 계속되면 저항단계에 들어가서 스트레스에 대한 대응 노력이 효과가 있어 생리적 변화는 안정된다는 사실을 근거로 효모에 스트레스를 주어 유용한 물질을 생산하여 응용한다.

따라서 본 발명에서는 효모를 이용하여 벌꿀을 발효 시 효모가 죽지 않을 정도의 온도 및 최소한의 배양 조건을 설정함으로써 환경스트레스를 제공하여 유용한 물질을 생산하도록 설계하였다.

각질제거 효과를 극대화하기 위하여 당 분해 시 다양한 유기산 성분으로 전환이 가능하도록 배양조건(혐/호기)을 설계하고, 효모의 활성화를 극대화 시키며 공정시간의 최소화를 위한 배양시간을 설정하였다.

발효물의 성분 분석은 유기산, 총페놀 및 플라보노이드 함량을 분석하였다.

세포독성효과(세포독성, 독성 프로그램을 통한 피부독성예측) 및 주름개선 효과 측정(콜라겐 생합성, MMP-1 저해활성)에 대해 생체 외(in vitro) 효능 평가를 실시하였고, 각질제거효과를 확인하기 위해 간이 임상 평가를 실시하였다.

마사지 크림 형태로 제조하여 효능 및 화장료 조성물의 안정성 평가를 실시하였다.

<실시예1: 발효 및 원료화 과정>

도 1은 종래기술에 따른 효모를 이용한 벌꿀 발효과정을 도식화한 도면으로서, 벌꿀 발효과정은 일반적으로 혐기 조건에서 발효를 통하여 알코올을 생성하고, 젖산균을 이용하여 호기발효과정을 통하여 각질제거에 필요한 유기산을 만들어낸다. 그러나 당의 혐기발효과정이 끝난 이후 알코올이 14%가 넘어가면 젖산균의 활성이 어렵기 때문에 원료개발을 위한 최적화 과정이 필요하다.

따라서 본 발명에서는 시중에 판매되는 잡화 꿀을 사용하여 도 2에 도시된 바와 같은 벌꿀 발효과정을 수행한다. 도 2는 본 발명에 따른 효모를 이용한 벌꿀 발효 및 원료화 과정을 도식화한 도면이다.

이하, 도 2를 참조하여 본 발명에 따른 효모를 이용한 벌꿀 발효물을 유효성분으로 함유하는 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물의 원료화 과정을 상세히 설명한다.

먼저, 201단계에서 혐기 조건의 30ℓ짜리 발효조에 잡화 꿀 5kg, 생수 3.5배, 효모5g, 화분 30g을 혼합하고, 203단계에서 활동 최적조건인 당도 24% 저온(25℃)으로 발효한다. 이때, 스트레스 조건을 부여하기 위해 자외선 등을 조사할 수 있다.

203단계의 1차 혐기 발효가 끝난 후에 알코올함량은 11%이었으나 유리병 뚜껑으로 완전히 밀봉한 후 2일후에 측정한 결과는 13%로 2% 증가하기 때문에 발효에 대한 최적화를 시행한다.

알코올함량 측정 이후, 205단계에서 온도를 30℃로 높여주고 공기를 주입하여 산소가 공급되도록 하여 2차 호기 발효를 시행한다. 이때, 효모는 당분을 먹고 유기산을 생성하므로, 시간 및 비용의 단축을 위하여 젖산균으로 유기산 중 citric acid를 첨가한다. 증류 후에 알코올함량을 측정한 결과 당도 24%를 15%로 떨어뜨릴 때 알코올함량은 9%~13%로 나타나 당분 1%는 약 1.3%의 알콜을 만드는 것으로 추정된다.

다음으로, 207단계에서 공기주입을 멈추고 호모게나이저로 균질화시킨 효모균 투입하여 자가소화 과정(숙성과정)을 거친다.

이후, 209단계의 여과 및 살균을 통하여 균을 없애고 211단계에서 농축을 통하여 제품화한다.

<실시예2: 발효 전과 후의 총페놀 함량 및 유기산 성분분석>

도 3은 본 발명에 따른 발효과정을 거친 벌꿀 발효물의 유기산의 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면으로서, 크로마토그램으로 피크의 분리에 성공한 총 10 종의 유기산에 대하여, 먼저 정확한 분석법의 확립을 위한 밸리데이션(Validation)을 시행하였다.

하기의 표 2는 유기산 분석을 위한 밸리데이션의 직선성, LOD(limit of detection, 검출한계) 및 LOQ(limit of quantification, 정량한계)를 나타낸 것이고, 표 3은 도 3에서 검출한 10종의 유기산에 대한 정확성 및 정밀성을 규정한 것이다.

상기 유기산의 HPLC-UV/Vis를 이용한 분석방법 확립과 밸리데이션을 통하여 확립된 신뢰성 높은 분석방법을 하기의 표 4에 정리하였다.

표 4와 같이 확립된 유기산 분석방법에 따라 아카시아, 백년초, 메밀꿀, 유채꿀, 밤꿀 및 잡화꿀의 발효를 통하여 유기산 및 총 폴리페놀의 함량의 측정하고, 이들 6가지의 벌꿀 발효액에 대한 유기산 함량을 하기의 표 5에 나타내었고, 각각의 벌꿀 발효액에 대하여 발효 전후의 유기산의 총 함량을 하기의 표 6에 나타내었다. 또한, 도 4에 상기 6가지의 벌꿀 발효액에 대한 유기산의 총 함량을 발효 전후로 대비하여 도시하였다.

발효 전과 후의 총페놀 함량 및 유기산 성분분석 결과를 살펴보면, 하기의 표 2에 나타난 바와 같이, 잡꿀을 이용하여 벌꿀을 발효한 발효액의 경우 발효하지 않은 벌꿀에 비해 총 페놀(Total Phenol)함량을 비교했을 때 약 20%이상 증가한 것을 확인할 수 있다. 표 7은 발효 전과 후의 총페놀(Total phenol)함량을 비교(mg/L)한 것으로, DSA는 벌꿀희석액을 25℃에서 발효한 것이고, DSC는 벌꿀희석액을 30℃에서 발효한 것이다.

또한 발효된 벌꿀(30℃)의 Tartaric acid, Citric acid 함량이 약 2배가 증가하였고, 각질제거의 가장 효과가 높은 Lactic acid 역시 약 2배 증가한 것으로 보아 본 발명에 따른 벌꿀 발효액의 성분변화는 피부각질제거에 효과적일 것으로 판단된다. 특히, 잡화꿀 및 밤꿀 발효물은 총 유기산이 2배이상 증가하였다.

하기의 표 8에 벌꿀 발효 전과 후의 폴리페놀(Polyphenol) 및 플라보노이드(Flavonoid)의 총 함량 변화를 정리하였고, 도 5 및 도 6에 6가지 벌꿀 발효액에 대한 발효 전후의 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량을 그래프로 도시하였다.

상기 표 8와, 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 꿀을 이용하여 벌꿀을 발효한 발효액의 경우 발효하지 않은 벌꿀에 비해 총 페놀(Total Phenol)함량을 비교했을 때 약 20%이상 증가한 것을 확인하였으나, 플라보노이드의 경우에는 발효 시 감소하는 경향도 나타났다.

전술한 발효 전후의 유효성분, 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량, 그리고 유기산의 함량을 고려할 때 가장 높은 함량을 가지는 잡화꿀 발효물을 사용하기로 결정하였다.

<실시예3: 세포독성 및 피부독성 평가>

세포독성 측정을 위한 세포(세포주)는 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast)를 Cambrex(UK)로부터 구입하여 사용하였다. 구입한 세포를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 10% Fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin- streptomycin을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.

벌꿀 발효액의 피부섬유아세포에 대한 세포독성 측정은 24 h 후에 살아 있는 세포를 CCK-8 분석법으로 측정하였다.

피부섬유아세포는 96-well plate에 2 × 10⁴ cells/well로 1일 동안 배양한 후 배지를 제거하고 벌꿀 발효액을 농도별(0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1mg/ml, 1.5mg/ml) 로 처리 후 24hr 경과 후 CCK-8 assay solution을 50ul씩 넣고 37℃ CO₂ incubator에서 3hr 반응 후 450nm의 파장에서 OD값을 확인하였다. 또한, negative control로 세포와 CCK-8 solution과 반응시킨 OD값과 소재 및 CCK-8 assay solution이 들어간(소재별 농도별로) OD값을 blank값으로 사용하여 실험하였다.

세포독성 측정결과, 실험결과 벌꿀 발효 전 과 후의 세포독성은 거의 없는 것으로 나타났다 본 발명에 따른 벌꿀의 발효 전과 후의 세포독성 결과 그래프를 도 7에 도시하였다. 세포독성 결과, 발효 전과 후의 세포독성에는 거의 변화가 없음을 확인하였다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 동물실험을 통한 독성예측이 불가능하므로, 현재 식약처가 피부독성 측정서류로 인정하는 추세에 있는 독성 예측 프로그램(in silico)을 사용하여 피부독성 결과를 예측하였다. 독성 예측 프로그램(in silico)은 빠르게 독성을 예측하고 물질의 정보를 한발 앞서 알 수 있기 때문에 시간 및 비용을 줄여 화장품을 개발할 수 있는 기법으로서, 독성 예측 방법을 skin irradiation으로 설정하고, 인터넷 searching을 통해 물질의 기본정보를 입력하여 피부독성 결과를 예측한다.

<실시예4: 각질제거 효과>

잡화꿀 발효액의 각질제거 효과 측정은 온도 24±1℃, 습도 55±10℃ 환경에서 진행하였다. 실험 전 수분량을 측정하였고 무작위로 대조군(Control) 3명, 일반꿀처리군(NFHG) 3명, 꿀발효액처리군(FHG) 3명으로 나누어서 측정하였다.

클린징 이전, 벌꿀 추출물을 이용한 클린징 10분 후, 그리고 딥클린징 시술 후 10분에 피부진단기를 사용하여 각질량을 측정하고, 피부표피층의 변화를 관찰하기 위해 피부 진단기로 클린징 후와 딥클린징 후에 사진촬영하여 변화를 관찰하여 비교하였다. 각질량 측정은 왼쪽 U-zone인 관골근 아래쪽에 각질테이프(봄텍사, 서울, 한국)를 붙였다가 떼어서 피부진단기의 SD 프로그램으로 측정하였다. 하기의 표 9에 각질 인덱스의 변화를 정리하였고, 발효 전과 후의 피부 각질상태에 대한 현미경 사진을 도 8에 도시하였다.

표 9에 나타난 바와 같이, 실험 전과 4주 후 각질량의 감소 변화량을 비교한 결과, NFHG와 FHG가 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 나타났고(p<.05) NFHG와 FHG 두 그룹간에 통계적으로 유의한 차이가 있으므로(p<.05), 발효전보다 발효후의 각질제거 효과가 높은 것을 확인하였다.

<실시예5: 주름제거 효과>

본 발명에 따른 벌꿀 발효액의 주름제거 효과는 콜라겐 생합성, Matrix Metalloprotease-1 (MMP-1) 저해 활성 및 피부섬유아세포의 이동의 세가지 방법으로 측정 및 확인하였다.

먼저, 콜라겐 생합성은 세포를 2 × 10⁶ cells/well 농도로 6-well plate에 접종한 후, 각 well에 잡화꿀 발효 추출물을 500 μg/mL의 농도로 첨가하여 CO₂ 배양기에서 24hr 배양 후 배양액을 수거하여 이용하였다. 세포배양액 내 콜라겐 생합성 정도를 procollagen type-IC peptide (PIP) EIA kit(Takara)을 사용하여 프로펩타이드의 양을 측정하였다. 도 9는 벌꿀 발효 전과 후의 콜라겐 생합성 정도를 도시한 그래프로서, 발효 전 벌꿀 추출물 대비 발효 후 추출물의 프로펩타이드의 양이 크게 증가하였음을 확인할 수 있다.

다음으로, Matrix Metalloprotease-1 (MMP-1) 저해 활성 확인을 위해, 세포를 2 × 10⁶ cells/well 농도로 6-well plate에 접종한 후, 각 well에 잡화꿀 발효 추출물을 500 μg/mL의 농도로 첨가하여 CO₂ 배양기에서 24 hr 배양한 다음 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하였다. 이렇게 처리된 세포의 배양액을 사용하여 Gross B. E. 등의 방법에 따라 Matrix Metalloproteinase-1 Biotrack activity Assay Kit(Amersham Bioscience)을 이용하여 plate reader로 흡광도를 측정하고 표준곡선을 통해 계산식을 구하여 세포 배양액 내 MMP-1 활성을 수치화하였다.

본 발명에 따른 벌꿀의 발효 전과 후의 MMP-1 활성 저해도를 도 7에 그래프로 나타내었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 세포 내 MMP-1 활성 저해도가 발효 전에 비해 낮게 나타났으며, 이를 통해 본 발명에 따른 벌꿀 발효 추출물은 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성을 저해하는데 효과적임을 확인할 수 있다.

또한, 피부섬유아세포의 이동을 살펴보기 위하여, 세포를 2 × 10⁶ cells/well 농도로 24-well plate에 접종한 후, CO₂ 배양기에서 24hr 배양하여 각 웰당 90% 이상의 세포가 성장되게 키운 후 200uL 팁을 이용하여 긁어내어 각 well에 잡화꿀 발효 추출물을 500 μg/mL의 농도로 첨가하고, CO₂ 배양기에서 24 h 배양하여 세포의 이동을 현미경으로 확인하였다. 확인결과를 도 8에 도시하였다. 도 11은 본 발명에 따른 벌꿀 발효 전과 후의 피부섬유아세포의 변화를 나타낸 현미경 사진이다. 확인결과, 본 발명에 따른 벌꿀 발효 추출물을 첨가하여 배양한 피부섬유아세포의 변화가 두드러지게 나타났다.

이로서 본 발명의 화장료 조성물은 각질제거 효과 및 주름개선 효과가 우수한 것을 확인하였다.

<실시예6: 제형개발>

상술한 바와 같이, 각질제거 효과 및 주름개선 효과가 우수한 것으로 확인된 본 발명에 따른 화장료 조성물을 이용하여 시제품 및 화장품을 만들기 위하여 4가지의 제형을 개발하였다.

첫째, 잡화꿀 발효물 내에는 유기산 및 폴리페놀 그리고 플라보노이드가 많지만 당이 많기 때문에 당의 hydroxyl기가 수분을 잡아줄 수 있어 피부 수분보충을 위한 미스트 제형의 화장품을 개발하였다.

둘째, 잡화꿀 발효물 내에는 유기산 및 폴리페놀 그리고 플라보노이드가 많지만 당이 많기 때문에 당의 hydroxyl기가 수분을 잡아줄 수 있어 자기전 피부 수분 보충을 해줄 수 있는 하이드로겔 형태의 제형을 개발하였다.

셋째, 잡화꿀 발효물 내에는 유기산 및 폴리페놀 그리고 플라보노이드가 많아 일반적으로 사용하며, 피부에 영양분을 줄 수 있는 형태의 로션을 개발하였다.

넷째, 잡화꿀 발효물에 많은 유기산을 이용하여, 발랐을 때 열이 나는 마사지 크림 형태로 개발함으로써, 바르고 30분 뒤 각질을 제거할 수 있는 형태의 제형으로 개발하였다. 이에 따라, 각질 제거와 동시에 효모 발효에 의한 유효성분의 피부 침투로 피부의 주름개선을 기대할 수 있다.

한편 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구의 범위뿐 아니라 이 특허청구의 범위와 균등한 것들에 의해서 정해져야 한다.

Claims (3)

1. 벌꿀에 와인발효용 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 물에 희석, 첨가하여 1차 혐기발효 후 젖산균을 이용하여 2차 호기발효한 벌꿀 발효물을 함유한 주름개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 벌꿀 발효물은,
   꿀, 물, 상기 효모 및 화분을 1000:3500:1:6의 중량비로 혼합한 혼합물을 섭씨 25도로 10-15일간 혐기발효하고, 젖산균을 첨가한 후 섭씨 30도로 7-10일간 호기발효하며, 공기 주입을 멈추고 균질화된 효모균을 첨가한 후 숙성시킨 후, 여과 및 살균하여 농축한 것을 특징으로 하는 벌꿀 발효물을 함유한 주름개선용 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미스트, 하이드로겔, 로션, 핸드크림, 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 스킨토너, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 에멀젼 및 파우더로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.

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