FR3116731A1 - Extrait fermenté de miel d’Ikaria - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un extrait fermenté de miel d’Ikaria ainsi que sa méthode de préparation et des compositions cosmétiques le comprenant. L’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut notamment être utilisé comme actif pour favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.

Description

Extrait fermenté de miel d’Ikaria
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine cosmétique et en particulier un extrait fermenté de miel d’Ikaria ainsi que le procédé de fermentation permettant de l’obtenir, une composition cosmétique contenant ledit extrait fermenté de miel d’Ikaria, et son utilisation dans un procédé cosmétique de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La peau est la première barrière de protection de l'organisme vis-à-vis de l'environnement. En plus du vieillissement chronologique, notre peau est ainsi quotidiennement soumise à des stress d’origine exogène ou endogène susceptibles d’induire des réactions cutanées non pathologiques inesthétiques et/ou d’inconfort pouvant entraîner une accélération du vieillissement cutané. Les stress exogènes sont nombreux : ils sont notamment d'origine chimique (ex : xénobiotiques, antigènes, allergènes) ou d'origine environnementale (température, climat, rayonnement UV, pollution atmosphérique, fumée de cigarette…) ou encore d’origine mécanique (blessures, frottements, rasages, nettoyages…).
L’intégrité de la peau est notamment médiée par le cytosquelette des cellules, composé de filaments d’actine, de microtubules et de filaments intermédiaires. En effet, le cytosquelette des cellules est responsable de diverses propriétés structurelles et mécaniques des cellules mais aussi de la peau, qui sont essentielles pour son homéostasie. Le cytosquelette cellulaire permet également de générer les forces contractiles. Ces forces sont ensuite exploitées comme force motrice pour plier et donner leurs formes actives aux constituants cellulaires et ainsi assurer des fonctionnalités cellulaires aussi cruciales que le métabolisme cellulaire, la conversion des cellules souches kératinocytaires et les interactions entre des cellules et la matrice extra-cellulaire, nécessaires pour obtenir une tenségrité. Cette intégrité permet aux cellules de la peau de former un ensemble plus résistant et solide que la somme de ses constituants.
Toutefois, les stress notamment exogènes, peuvent rompre cet équilibre et entraîner la perte de fonctionnalité cellulaire. Afin de réparer et/ou redensifier la peau, les cellules doivent immédiatement reformer les forces contractiles à travers leur cytosquelette. Toutefois, avec l’âge, on observe une diminution de la résilience des cellules aux stress ainsi que leur capacité à maintenir l’homéostasie de la peau. Cette diminution peut être attribuée, entre autres, à une perturbation de la polymérisation des filaments d’actine et dans leur renouvellement, ainsi qu’à une réduction des forces contractiles des cellules.
On comprend donc que le cytosquelette joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et de la qualité de la peau. Il existe donc un besoin constant de trouver des agents capables de prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment permettant de lutter contre les stress et/ou permettant de stimuler et/ou favoriser l’homéostasie et le renouvellement cutané.
De manière inattendue, la Demanderesse a mis en évidence les effets ‘anti-âge’ d’un extrait fermenté de miel d’Ikariain vitrosur des cultures de fibroblastes. En effet, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria a un effet tenseur sur les fibroblastes, permettant d’augmenter le nombre et l’organisation de filaments d’actine-F présents dans le cytosquelette, ainsi que le rayon de courbure et les forces contractiles des fibroblastes sur une matrice de collagène, favorisantin finel’intégrité cellulaire et l’homéostasie des cellules de la peau. Ces effets permettent donc d’envisager l’utilisation de cet extrait fermenté de miel d’Ikaria pour prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané. L’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment utilisé selon l’invention comme actif cosmétique destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse de la peau, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau, et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
Le premier objet de l’invention concerne donc un extrait fermenté de miel d’Ikaria comprenant une teneur en acide lactique comprise entre 0,01 et 0,08 %, une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,05 et 0,5 %, et une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
Un autre objet de l’invention porte sur un procédé de fermentation de miel d’Ikaria comprenant les étapes suivantes :

a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide pendant 1 à 10 jours à 17 à 38°C afin d’obtenir une culture de micro-organismes,
ledit consortium comprenant au moins une bactérie lactique appartenant au genreLactobacillusouPediococcus, au moins une levure appartenant au genreSaccharomyces,SchyzosaccharomycesouTorulaspora, et au moins une bactérie acétique appartenant au genreA cetobacter,G luconobacterouK omagataeibacter;
b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria à une teneur en poids de 20 à 300 g/kg d’eau afin d’obtenir un mélange de fermentation,
ladite culture étant ajoutée à une concentration comprise entre 0,5 et 15 % en poids par rapport au poids total du mélange de fermentation ;
c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) à une température comprise entre 25 et 35°C pendant 10 à 15 jours ;
d) filtration du mélange de fermentation, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria, et optionnellement,
e) ajout d’au moins un conservateur, de préférence choisi parmi le propanediol, la glycérine, et le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol, à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 25 à 50 % en poids par rapport au poids total.
Aussi, un autre objet de l’invention porte sur un extrait fermenté de miel d’Ikaria obtenu par le procédé tel que décrit selon l’invention.
L’invention concerne également une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait fermenté de miel d’Ikaria.
Un autre objet de l’invention concerne un procédé cosmétique de soin et/ou maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres, comprenant l’application sur lesdites matières kératiniques, d’au moins une couche de la composition cosmétique telle que décrite selon l’invention.
L’invention concerne enfin l’utilisation cosmétique d’un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention comme actif pour favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
DESCRIPTION DES FIGURES
Évaluation de la géométrie et du cytosquelette des fibroblastes dermiques humains après 16 heures dans les conditions suivantes : (1) absence de traitement (témoin négatif), (2) traitement par le TGF-β à 10 ng/mL (témoin positif pour la contraction cellulaire), (3) traitement par la cytochalasine D à 1 µM (témoin positif pour la relaxation cellulaire), (4) traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,1 %.
Évaluation de la contraction cellulaire induit par le cytosquelette des fibroblastes dermiques humains après 16 heures de traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,1 % : (A) ratio d’étirement (ou «stretching ratio»), (B) rayon de courbure.
Évaluation du réseau des fibres d’actine dans les fibroblastes dermiques humains après 16 heures de traitement par l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à 0,1 % : (A) nombre de fibres d’actine, (B) longueur moyenne des fibres d’actine du réseau, (C) longueur totale des fibres d’actine du réseau.
Courbe Force-indentation brute acquise sur la matrice de collagène autour du fibroblaste. Z (μm) est la distance parcourue par la sonde AFM. La zone entre les lignes bleues permet le calcul des propriétés mécaniques. Le module élastique est extrait sur les 50 % de la force maximale appliquée.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Miel d’Ikaria
Le miel est l'un des produits issus de l'apiculture comme la gelée royale, la propolis, le pollen, le venin d'abeille et la cire. Ces produits sont toutefois distincts les uns des autres, tant par leur mode de production au sein de la ruche que par leur composition et leurs propriétés.
Le miel et le pollen sont des substances qui constituent l'alimentation des abeilles pendant toute l'année, le premier apportant les sucres, le second les protéines. Le miel et le pollen peuvent être stockés pendant de longues périodes dans la ruche.
Le miel est produit par les abeilles qui butinent, qui collectent le nectar des fleurs et le fabriquent par des digestions et régurgitations successives. Le pH acide de l'estomac des abeilles ainsi que les activités enzymatiques de l'invertase, la diastase et l'amylase, donnent lieu à une solution aqueuse supersaturée, composée de plus de 80 % de sucres, principalement du fructose (environ 38 %) et du glucose (environ 31 %), avec des quantités plus faibles de sucrose, maltose et autres sucres complexes. Le miel est par ailleurs pauvre en graisses, fibres et protéines. Selon la variété des abeilles et l'environnement dans lequel elles évoluent, les différents miels peuvent présenter une grande variabilité.
Il existe ainsi différents types de miels que l’on distingue en fonction du type floral ou encore en fonction de sa zone géographique d’origine, chacun présentant une saveur et un aspect caractéristique. On parle notamment de miel de nectar lorsque le miel est fabriqué par les abeilles à partir du nectar des fleurs qu’elles butinent, et en particulier de miel « monofloral » lorsque qu’il provient en grande partie d’une seule variété de fleurs, tandis que les autres miels seront qualifiés de « polyfloraux ».
Le « miel d’Ikaria » ou « miel de l’île d’Ikaria » utilisé dans le cadre de l’invention est un miel originaire de l’île grecque d’Ikaria, qui est confectionné par l’abeille grecqueApis mellifera cecropia. De préférence, il est récolté dans les collines de la partie ouest de l’île. Le miel d’Ikaria est de préférence un « miel de forêt d’Ikaria », confectionné majoritairement à partir des bruyères d’été (Erica manipuliflora) et des chênes verts (Quercus ilex) par l’abeille grecqueApis mellifera cecropia.
Extrait fermenté de miel d’Ikaria
Le miel d’Ikaria, de préférence le miel de forêt d’Ikaria, est utilisé dans un procédé de fermentation afin de générer un extrait fermenté de miel d’Ikaria, objet de la présente invention.
Il est précisé que dans la présente description, l’expression « extrait fermenté » désigne le produit issu du procédé de fermentation par la fermentation, avec ou sans filtration, donc aussi bien avec que sans la biomasse microbienne du milieu fermentaire, ainsi que tout produit ayant subi des étapes supplémentaires, tel qu’une étape de formulation (par ex par ajout d’un conservateur).
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention se présente sous la forme d’une solution aqueuse d’extrait fermenté comprenant l’extrait sec fermenté, de l’eau et un conservateur. L’extrait fermenté sous forme de solution aqueuse est également nommé ‘matière première’ dans la description, par opposition à ‘matière sèche’ ou extrait sec fermenté.
Selon un mode particulier, la solution aqueuse d’extrait fermenté comprend l’extrait fermenté en une teneur active (matière sèche) allant de 2 à 5 % en poids, notamment 3 à 4 % en poids et en particulier 3,2 % en poids de matière active par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté), de l’eau et un conservateur, de préférence le propanediol. La teneur en eau ira généralement de 60 à 70 % en poids, notamment de 65 % à 70 % en particulier de 66,8 % en poids par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté) et la teneur en conservateur (par ex : propanediol) ira généralement de 25 à 50 % en poids, notamment de 30 à 40 % en poids, en particulier 30 % en poids par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté).
Ainsi, l’invention porte également sur un extrait fermenté de miel d’Ikaria sous la forme d’une solution comprenant 3 à 4 % en poids de matière active d’extrait fermenté de miel d’Ikaria, 30 à 35 % en poids de propanediol et 60 à 70 % en poids d’eau.
Selon un mode particulier, la solution aqueuse d’extrait fermenté, autrement nommée ‘matière première’ dans la caractérisation qui est illustrée ci-après, comprend 3,2 % en matière active (matière sèche) d’extrait fermenté, 30 % de propanediol et 66,8 % d’eau par rapport au poids total de matière première (solution aqueuse d’extrait fermenté).
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide lactique comprise entre 0,001 % et 1 %, une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,01 % et 1 % et une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 % en poids par rapport au poids d’extrait sec (matière sèche) de l’extrait fermenté. De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide lactique comprise entre 0,005 % et 0,5 %, plus préférentiellement 0,01 et 0,08 %, encore plus préférentiellement comprise entre 0,03 et 0,05 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté. De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,05 et 0,5 %, plus préférentiellement comprise entre 0,1 et 0,2 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté. De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 %, de préférence entre 5 et 15 %, plus préférentiellement entre 10 et 14 %, encore plus préférentiellement environ 12, 13, ou 14 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut comprendre d’autres acides organiques, tels que l’acide citrique, l’acide gluconique, l’acide malique, l’acide quinique, et/ou l’acide shikimique. Aussi, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut notamment comprendre :
- une teneur en acide citrique comprise entre 0,001 et 0,1 %, de préférence entre 0,005 et 0,08 %, plus préférentiellement entre 0,01 et 0,06 %, %, encore plus préférentiellement entre 0,03 ou 0,06 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté,
- une teneur en acide gluconique comprise entre 1 et 15 %, de préférence entre 5 et 10 %, plus préférentiellement comprise entre 6 et 9 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté,
- une teneur en acide malique comprise entre 0,001 et 1 %, de préférence entre 0,01 et 1 %, plus préférentiellement entre 0,005 et 0,5 % plus préférentiellement comprise entre 0,1 et 0,2 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté,
- une teneur en acide quinique comprise entre 0,001 et 1 %, de préférence entre 0,01 et 0,5 %, plus préférentiellement entre 0,01 et 0,05 % encore plus préférentiellement entre 0,2 et 0,3 % en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté, et/ou
- une teneur en acide shikimique comprise entre 0,001 et 0,20 %, de préférence entre 1 et 15 % plus préférentiellement entre 5 et 10 %, encore plus préférentiellement entre 6 et 8 %, en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
De préférence, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria ne comprend pas d’acide glucuronique, d’acide propionique, et/ou d’acide tartrique.
Les quantités de sucres, de polyphénols, vitamines et minéraux sont exprimés en % en poids de matière première au sens de matière première telle que définie ci-dessus (solution aqueuse comprenant 3,2 % d’extrait sec, 30 % de propanediol et 66,8 % d’eau).
La quantité des sucres présente dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est réduite par rapport à la quantité présente dans le miel d’Ikaria avant fermentation. Selon un mode particulier, la teneur en miel d’Ikaria dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment comprise entre 0,1 et 50 g/kg de matière première (soit entre 0,01 et 5 %), de préférence entre 0,5 et 40 g/kg de matière première (soit entre 0,05 et 4 %), plus préférentiellement entre 20 et 30 g/kg de matière première (soit entre 2 et 3 %). Selon un mode particulier, la teneur en glucose dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment comprise entre 0,1 et 100 g/kg de matière première (soit entre 0,01 et 10 %), de préférence entre 0,5 et 20 g/kg de matière première (soit entre 0,05 et 2 %). La teneur en fructose dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est notamment comprise entre 0,1 et 100 g/kg de matière première (soit entre 0,01 et 10 %), de préférence entre 0,5 et 20 g/kg de matière première (soit entre 0,05 et 2 %). La teneur totale en polyphénols peut être comprise entre 50 et 2000 mg/kg de matière première, de préférence entre 75 et 1000 mg/kg de matière première, plus préférentiellement entre 100 et 500 mg/kg de matière première (soit entre 0,01 et 0,05 %).
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend également au moins l’un des composés suivants (métabolites secondaires) : l’acide succinique, l’acide 2-hydroxyhépanoique, le syringaldéhyde, l’acide malique 2-isopropyle, la catéchine, le gallate d’epigallocatéchine, l’acide syringique, le picéide, l’acide cinnamique, le protocatéchuicaldéhyde, la quercétine, et leurs mélanges.
Selon un mode particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend également des vitamines et minéraux, plus particulièrement du potassium. La teneur en potassium peut être comprise entre 25 et 500 mg/kg de matière première, de préférence entre 75 et 250 mg/kg, encore plus préférentiellement entre 100 et 175 mg/kg.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria peut également comprendre un ou plusieurs conservateurs. Par « conservateur » on entend un composé qui a pour but de préserver la composition de l’extrait ou la cosmétique le contenant de toute altération physico-chimique et/ou microbienne.
De préférence, au moins un conservateur est choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, de préférence parmi le propanediol et la glycérine, plus préférentiellement le propanediol. L’extrait fermenté peut notamment comprendre un ou plusieurs conservateur(s) à une concentration finale comprise entre 25 et 50 %, préférentiellement entre 30 et 40 %, plus préférentiellement 30 % en poids par rapport au poids total (de l’extrait fermenté sous forme de solution), de préférence au moins un des conservateurs décrits ci-dessus choisi parmi le propanediol, la glycérine et le butylène glycol.
Procédé de fermentation
Cet extrait fermenté de miel d’Ikaria est obtenu par un procédé de fermentation comprenant des étapes de :

a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide à une température comprise entre 17 à 38°C afin d’obtenir une culture de micro-organismes ;
b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria afin d’obtenir un mélange de fermentation ;
c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) à une température comprise entre 12 et 42°C pendant 2 à 20 jours ;
d) filtration du mélange de fermentation, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria ; et, optionnellement,
e) ajout d’au moins un conservateur.
Par « procédé de fermentation » on entend un procédé permettant d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria par la mise en culture d’un consortium des micro-organismes tel que défini ici dans un milieu contenant du miel d’Ikaria et permettant leur croissance. La fermentation peut avoir lieu dans des conditions de culture discontinue (en «batch»), de culture continue, ou en continu‐discontinu (en «Fed batch»). La fermentation peut être réalisée en aérobie, micro-aérobie et/ou anaérobie.
Par « consortium de micro-organismes » on entend un assemblage d’au moins trois espèces de micro-organismes pouvant coexister de manière stable et reproductible. Avantageusement, les micro-organismes permettent d’associer des activités complémentaires. À titre d’exemple non-limitatif, l’utilisation ou assimilation d’une source de carbone par une première espèce permet de produire des métabolites pouvant ensuite être métabolisés par une deuxième espèce.
Le consortium de micro-organismes selon la présente invention comprend :
i) au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries lactiques,
ii) au moins un micro-organisme appartenant au groupe des levures, et
iii) au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries acétiques.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries lactiques est un micro-organisme de l’ordre des Lactobacillales de la famille des Lactobacillaceae, notamment ceux appartenant aux genresLactobacillusetP ediococcus, tel queLactobacillus plantarumet/ouLactobacillus acidophilus, plus préférentiellementL. plantarum.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des levures est un micro-organisme de l’ordre des Saccharomycetales de la famille des Saccharomycetaceae ou de l’ordre des Schyzosaccharomycetales de la famille des Schyzosaccharomycetaceae, notamment ceux appartenant aux genresSaccharomyces,SchyzosaccharomycesouTorulaspora.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des levures estSaccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces boulardiiet/ouSchyzosaccharomyces pombe.
De préférence, au moins un micro-organisme appartenant au groupe des bactéries acétiques est un micro-organisme de l’ordre des Rhodospirillales de la famille des Acetobacteraceae, notamment ceux appartenant aux genresA cetobacter,G luconobacteretK omagataeibacter(aussi appeléG luconacetobacter). Les bactéries acétiques peuvent être originaires d'un vinaigre de cidre ou de vin non pasteurisé ayant un taux d'acidité de 4% à 5%, de préférence d’un vinaigre de cidre du commerce, labélisés « Agriculture biologique » selon la définition de l'Union Européenne. De préférence, l’ajout des bactéries acétiques au consortium se fait par ajout direct d’un aliquot de vinaigre dans la composition comprenant les autres espèces de micro-organismes. Il existe dans les vinaigres, à côté des bactéries acétiques dominantes, une flore indigène naturelle complexe dont une partie va pouvoir cohabiter avec les micro-organismes ajoutés. Une autre partie va péricliter lors de l'établissement du consortium, de la même manière que le développement en symbiose de l’ensemble des micro-organismes formant le consortium empêche le développement des espèces indésirables, dont les espèces pathogènes.
Selon un mode préférentiel, le consortium comprend :
- au moins une bactérie lactique appartenant au genreLactobacillusouPediococcus,plus préférentiellement choisie parmiLactobacillus plantarumetLactobacillus acidophilus,
- au moins une levure appartenant au genreSaccharomyces,SchyzosaccharomycesouTorulasporaplus préférentiellement choisie parmiSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Schyzosaccharomyces pombeetTorulaspora delbrueckii, et
- au moins une bactérie acétique provenant d’un vinaigre de cidre ou d'un vinaigre de vin, préférentiellement appartenant au genreA cetobacter,G luconobacterouK omagataeibacter.
Étape a) : préparation d’une culture de micro-organismes
Selon une première étape, a), du procédé, une culture de micro-organismes (autrement dit, un consortium comprenant les micro-organismes tels que décrits ci-dessus) est préparée. Cette étape permet avantageusement d’activer et faire multiplier les micro-organismes tout en établissant un consortium stable et équilibré. Lors de cette étape, les différents micro-organismes qui seront présents dans le consortium sont introduits dans une solution comprenant un glucide (autrement appelé un « milieu nutritif ») afin de générer une suspension microbienne. La suspension est ensuite incubée pendant 1 à 21 jours afin de préparer la culture des micro-organismes (autrement dit, le consortium).
La solution comprend au moins un glucide, généralement un ou plusieurs mono- ou disaccharides. Il peut s'agir d'un sucre pur, tel que le saccharose, le glucose ou le fructose, ou bien d'un produit transformé ou coproduit, tel que de la mélasse. Aussi, selon un mode préférentiel, la solution comprend un glucide choisi parmi le saccharose, le glucose ou le fructose, la mélasse, ou un mélange d’un ou plusieurs de ceux-ci. De préférence, le glucide est le saccharose ou un mélange de glucose et de fructose. De préférence, au moins un glucide est présent à une concentration de 50 à 95 g/l de solution.
Les micro-organismes peuvent être introduits dans le milieu nutritif sous forme sèche et/ou humide ; le taux d'inoculation peut notamment être compris entre 103CFU/g et 105CFU/g de solution. La suspension microbienne peut ensuite être incubée entre 12°C et 45°C, de préférence entre 25°C et 35°C, plus préférentiellement à 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, ou 35°C encore plus préférentiellement à 26°C. Selon un mode particulièrement avantageux, l’incubation a lieu dans un réacteur ouvert, sans avoir besoin d’assurer des conditions aseptiques.
La suspension peut être incubée pendant 1 à 21, de préférence pendant 1 à 10 jours, plus préférentiellement pendant 3 à 4 jours, encore plus préférentiellement pendant 3 jours ou 4 jours. À la fin de la durée d’incubation, la flore totale dans la suspension peut être comprise entre 104et 107CFU/g.
Le consortium ainsi obtenu est apte à réagir avec un substrat naturel, tel que le miel d’Ikaria, en milieu aqueux. Avantageusement, il est capable de diriger la fermentation extractive du miel, pour rendre accessible, et éventuellement transformer, une grande diversité des composés qu'il renferme.
Étape b) : préparation d’un mélange de fermentation
Aussi, selon l’étape b) du procédé, la culture obtenue à l’étape a) ci-dessus est ensuite ajoutée dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria afin d’obtenir un mélange de fermentation.
De préférence, la culture de micro-organismes est ajoutée dans le milieu fermentaire à un taux compris entre 102CFU/g et 104CFU/g de milieu fermentaire. De préférence, la culture de micro-organismes est ajoutée au milieu fermentaire à une concentration comprise entre 0,5 % et 15 % en poids rapporté au poids de milieu fermentaire, de préférence entre 0,75 et 10 %, plus préférentiellement à 5 %.
Le milieu fermentaire comprend de l’eau déchlorée ainsi que du miel d’Ikaria à une concentration comprise entre 20 à 300 g/kg d’eau, de préférence compris entre 50 et 150 g/kg d’eau, plus préférentiellement 60 et 100 g/kg d’eau, encore plus préférentiellement à 75 g/kg d’eau. Selon un aspect particulier, le degré Brix du milieu fermentaire est compris entre 2 et 10. Afin de faciliter la dissolution du miel d’Ikaria, qui est une substance visqueuse, dans le milieu fermentaire, ce dernier peut être chauffé avant ou après ajout du miel, par exemple à une température comprise entre 25°C et 90°C, préférentiellement 35°C. De préférence, en cas de chauffage du milieu fermentaire, ceci est fait avant ajout de la culture de micro-organismes ou alors à une température inférieure ou égale à 45°C, de préférence inférieure ou égale à 35°C, si après ajout de la culture. De préférence, le mélange de fermentation est obtenu par l’ajout de la culture selon l’étape a) dans de l’eau déchlorée à une température de 35°C comprenant 50 à 150 g de miel d’Ikaria par rapport au kg d’eau à une concentration de 5 % en poids rapporté au poids de milieu fermentaire. Selon un aspect, le miel d’Ikaria correspond au seul composant apportant des glucides au milieu fermentaire.
Étape c) : incubation
Selon la prochaine étape, c), du procédé, le mélange de fermentation obtenu à l’étape b) est ensuite incubé afin d’assurer la fermentation du miel d’Ikaria.
L’incubation a lieu à une température comprise entre 12°C et 45°C, de préférence entre 25°C et 35°C, plus préférentiellement à 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, ou 35°C, encore plus préférentiellement à 26°C. L’incubation est effectuée pendant une durée de 2 à 20 jours, de préférence pendant 10 à 15 jours, plus préférentiellement pendant 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 jours, encore plus préférentiellement 10 jours.
Selon un aspect particulier, l’incubation a lieu dans un réacteur ouvert, sans avoir besoin d’assurer des conditions aseptiques. Selon un aspect particulier, l’incubation a lieu à un taux d’humidité compris entre 20 % à 60 %, de préférence entre 30 % à 50 %, plus préférentiellement de 40 %.
Étape d) : filtration
Le mélange de fermentation est ensuite filtré lors de l’étape d). Par « filtration » on entend ici une étape permettant de séparer les fractions solides et liquides. Avantageusement, la filtration permet de retirer l’ensemble des micro-organismes présents dans le mélange, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria stérile. La filtration peut être réalisée par l’utilisation d’un ou plusieurs filtres. Aussi, selon un mode de réalisation, l’étape d) correspond à une ou plusieurs étapes de filtration, de préférence comprenant au moins une étape de filtration stérilisante, de préférence sur un filtre ayant une taille moyenne de pores compris entre 0,1 µm à 0,2 µm, de préférence de 0,2 µm. De façon avantageuse, une filtration stérilisante permet de retirer tout débris cellulaire de manière rapide et peu coûteuse. De préférence, le filtre est un filtre de cellulose.
Étape e) : concentration et/ou formulation (optionnelle)
Le procédé décrit ci-dessus permet d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria clarifié. Toutefois, dans certains cas, il peut être avantageux d’effectuer une ou plusieurs étapes supplémentaires, par exemple de concentration ou de formulation. Le procédé selon l'invention peut ainsi en outre comprendre au moins une étape supplémentaire et postérieure à l’étape d) de concentration ou de formulation.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre, après l'étape d) de filtration, une ou plusieurs des étapes suivantes visant notamment à adapter la composition à une formulation particulière :
- une étape de concentration ; et/ou
- une étape de formulation.
Chaque étape optionnelle identifiée ci-dessus peut être présente en tant qu’étape supplémentaire unique du procédé, ou en combinaison avec une ou plusieurs autres étapes optionnelles. De préférence, le procédé fermentation comprend une étape e) d’ajout d’au moins un conservateur à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria. De préférence, ledit conservateur est choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol. Dans certains cas, au moins deux conservateurs peuvent être ajoutés à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria. De préférence, le conservateur est ajouté à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria de l’étape d) à une concentration finale compris entre 25 et 50 %, de préférence compris entre 30 et 40 %, plus préférentiellement 30 %, en poids par rapport au poids total. Lorsque le conservateur est ajouté à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria de l’étape d) à une concentration finale compris entre 25 et 50 %, ledit conservateur est sélectionné parmi le propanediol, la glycérine et le butylène glycol.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria est préférablement conservé à environ 4°C (4 ± 2°C) et/ou à l'obscurité à l’issue de l’étape d) de filtration ou à l’issue de toute autre étape lorsqu’une étape supplémentaire est présente après l’étape d). Lorsque le procédé comprend l’ajout d’au moins un conservateur, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est préférablement conservé à température ambiante.
L’extrait fermenté de miel est référencé sous la nomenclature internationale, INCI : Aqua, propanediol, yeast ferment extract, lactobacillus ferment lysate, honey. Ce produit contient notamment 3,2 % en poids d’extrait sec d’extrait fermenté de miel dans un mélange eau/propanediol.
Composition cosmétique
De façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria présentein vitrodes effets bénéfiques sur les fibroblastes, permettant d’augmenter le nombre et l’organisation de filaments d’actine-F présents dans le cytosquelette, ainsi que le rayon de courbure et les forces contractiles des fibroblastes. Ainsi, de par ses effets tenseurs sur le cytosquelette des cellules, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria permet de lutter contre les signes du vieillissement cutané liés à l’âge et/ou aux stress, notamment la perte de fermeté et/ou d’élasticité.
Selon l’invention, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est utilisé dans une quantité efficace pour obtenir l’effet recherché. Il peut être utilisé tel quel ou avantageusement incorporé dans une composition cosmétique adaptée à une application topique sur les matières kératiniques.
En particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est utilisé tel quel ou est présent dans une composition cosmétique.
Aussi, un autre objet de l’invention porte sur une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention.
Par « composition cosmétique » on entend toute composition à visée cosmétique, c’est à dire esthétique, pouvant être mise en contact avec les parties superficielles du corps humain et plus particulièrement avec les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres humaines.
Par « milieu physiologiquement acceptable » on entend tout excipient convenant à une utilisation topique, en contact avec les matières kératiniques, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité et/ou de réponse allergique.
Par « matières kératiniques » selon l’invention, on entend la peau et/ou ses phanères, et plus particulièrement la peau et/ou les lèvres humaines. En particulier, il s’agira de la peau du visage et/ou du cou et/ou du corps, et des lèvres.
Les matières kératiniques selon l’invention sont notamment des matières kératiniques saines (sujets « sains »), c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets « non sains », atteints d’une pathologie). On parlera indifféremment de peaux et/ou lèvres saines ou de peaux et/ou lèvres dans le reste de la description.
L’extrait fermenté de miel d’Ikaria est présent dans la composition de l’invention en une teneur allant 0,0001 à 2 % en poids, notamment de 0,01 à 1 % en poids et en particulier de 0,1 à 0,5 % en poids de matière première (solution d’extrait fermenté obtenue selon le procédé décrit ci-dessus) par rapport au poids total de la composition. Ainsi l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est présent dans la composition de l’invention en une teneur allant de 0,0000032 % à 0,64 %, de préférence de 0,00032 % à 0,032 %, plus préférentiellement de 0,0032 % à 0,016 % en poids de matière active (matière sèche d’extrait fermenté de miel) par rapport au poids total de la composition.
Les ingrédients additionnels utilisés avantageusement dans la composition de l’invention peuvent être présents en une teneur allant de 0,0001 % à 10 %, de préférence de 0,001 % à 5 % en poids (de matière première) par rapport au poids total de la composition.
Le milieu physiologiquement acceptable représente généralement de 1 à 99 % en poids, par rapport au poids total de ladite composition. Le milieu physiologiquement acceptable de la composition selon l'invention comprend de l'eau et éventuellement le conservateur tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition cosmétique comprenant un extrait fermenté miel d’Ikaria selon l’invention est une composition de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou.
La composition cosmétique de l’invention comprend généralement, outre l’extrait fermenté d’Ikaria et le milieu physiologiquement acceptable, un ou plusieurs excipients cosmétiques acceptables parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition pour l’application topique par exemple sous forme de lait, de crème, de pommade, d’émulsion eau-dans-huile ou huile-dans-eau, de baume, de stick, de gel, de lotion, de sérum, ou encore de poudre.
La composition cosmétique de l’invention peut également se présenter sous forme d’un patch ou d’un masque, notamment un masque sous forme d’une crème épaisse, ou encore sous forme d’un masque cellulosique imbibé d’extrait fermenté de miel d’Ikaria ou d’une composition en contenant.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite composition est sous la forme d’une crème, émulsion, solution, suspension, gel, lait, lotion, ou sérum. Lorsque la composition est sous la forme d’une émulsion, l’émulsion peut être une émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple.
La composition cosmétique de l’invention peut se présenter sous toute forme galénique adaptée à une application topique sur les matières kératiniques en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou comprenant l’extrait fermenté de miel d’Ikaria et au moins un ingrédient cosmétique choisi parmi les antioxydants, les parfums, les vitamines, les agents épaississants, les agents émollients, les agents hydratants, les agents anti-âge, les agents liftants, les agents tenseurs, les agents repulpants, les agents apaisants, les agents antipollution, les agents éclaircissants ou dépigmentants, les charges, les nacres et leurs mélanges.
Aussi, selon un objet préféré de l’invention, la composition cosmétique peut comprendre en outre au moins un adjuvant cosmétique choisi dans le groupe constitué par des agents antioxydants, des agents émollients, des agents hydratants, des agents anti-âge, et leurs mélanges.
Selon la nature de la composition, on sélectionnera un ou plusieurs excipients cosmétiquement acceptables parmi des émulsionnants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, des colorants, et leurs mélanges.
À titre d’exemple particulier, la composition cosmétique peut comprendre des gélifiants hydrophiles, des antioxydants, des conservateurs et leurs mélanges.
La composition cosmétique de l’invention peut comprendre en outre une phase grasse (corps gras solides) ou huileuse.
On entend par « phase huileuse » une huile ou un mélange d'huiles miscibles entre elles, ou non. Par « huile », on entend, au sens de l'invention, un corps gras, non soluble dans l'eau, liquide à 25°C et pression atmosphérique. Ces huiles peuvent être volatiles ou non volatiles, végétale, minérale ou synthétique.
Une phase huileuse selon l’invention peut comprendre des huiles naturelles, hydrocarbonées, siliconées, et leurs mélanges.
La teneur en phase grasse ou huileuse dans la composition cosmétique de l’invention ira généralement de 0,2 % à 45 %, de préférence de 0,5 % à 30 %, et de préférence encore de 2 % à 25 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Procédé cosmétique
La présente invention a également pour objet un procédé cosmétique de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou, comprenant l’application topique sur lesdites matières kératiniques, d’au moins une couche de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria ou d’une composition cosmétique en contenant telle que décrite selon l’invention.
Le procédé cosmétique de la présente invention est notamment destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
Par « favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée », on entend on entend notamment que le miel de forêt d’Ikaria est destiné à maintenir les équilibres fonctionnels de la peau et/ou des lèvres pour en préserver son fonctionnement optimal normal.
Par « favoriser et/ou stimuler le renouvellement épidermique » on entend que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à promouvoir la différenciation kératinocytaire.
Par « favoriser et/ou stimuler la régénération cutanée », on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à promouvoir le renouvellement et le développement cellulaire et tissulaire cutané, notamment de la peau et/ou des lèvres.
Par « favoriser et/ou stimuler l’intégrité de la peau », on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à promouvoir l’état général de la peau, son éclat.
Par « prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané » on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à diminuer et/ou retarder la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité et/ou l’apparition de rides et/ou ridules, qui sont associées à des modifications de la cytosquelette cellulaire (par ex. la réduction du nombre de fibres d’actine par cellule de la peau).
Par « prévenir et/ou diminuer l’altération de la fonction barrière de la peau » on entend notamment que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est destiné à diminuer et/ou retarder des modifications de l’intégrité de la peau, qui peuvent être associés, par exemple, à des modifications des interactions entre les cellules et/ou entre des cellules et la matrice extracellulaire, susceptibles de générer une altération des différentes fonctions de la barrière cutanée (ex : mécanique, hydrique, antioxydante…).
Selon un mode particulier, ledit extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention ou ladite composition cosmétique en contenant est appliqué sur une peau âgée ou présentant des signes de vieillissement et/ou une peau exposée à un stress, de préférence une peau âgée ou présentant des signes de vieillissement.
Par « peau exposée à un stress », on entend que la peau est soumise à un stress d’origine endogène ou exogène, notamment un stress mécanique ou chimique susceptible d’induire des réactions cutanées non pathologiques inesthétiques – par ex. la peau est visiblement fatiguée et/ou plus sensible aux stimuli.
Les peaux et lèvres sur lesquelles sont appliquées les compositions de l’invention, sont saines, c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets « non sains », atteints d’une pathologie).
De façon avantageuse, les compositions comprenant de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria employées dans le cadre du procédé cosmétique de l’invention sont celles décrites ci-dessus.
Utilisation de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria
Un autre objet de l’invention porte sur l’utilisation cosmétique de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’invention pour une application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres et notamment de la peau du visage et/ou du cou, en tant qu’actif cosmétique destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
Exemples
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Les % sont exprimés en poids de matière première par rapport au poids total de la composition, sauf indication contraire.
Exemple 1 : Procédé de f ermentation du miel d’Ikaria
Matériel et méthodes
Matériel source
Le Miel d’Ikaria utilisé dans le procédé de fermentation ci-après est un miel provenant de l’île grecque d’Ikaria.
Les micro-organismes faisant partie du consortium comprennent :
- au moins une bactérie lactique appartenant au genreLactobacillusouPediococcus,
- au moins une levure appartenant au genreSaccharomyces,SchyzosaccharomycesouTorulaspora, et
- au moins une bactérie acétique appartenant au genreA cetobacter,G luconobacterouK omagataeibacter .
Procédé de fermentation
Une fermentation du miel d’Ikaria a été effectué selon le procédé suivant :
a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide à 26°C pendant 3 à 4 jours afin d’obtenir une culture ;
b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) à une concentration de 5 % en poids à un milieu fermentaire comprenant de l’eau déchloré et du miel d’Ikaria à une teneur en poids de 75 g/kg d’eau à 35°C afin d’obtenir un mélange de fermentation ;
c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) dans un fermenteur à 26°C pendant 10 jours, et à 40 % d’humidité ;
d) filtration du mélange de fermentation sur un filtre de cellulose ayant une taille moyenne de pores de 0,2 µm, et,
e) ajout du propanediol à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 30 % en poids par rapport au poids total.
On obtient un extrait de miel fermenté d’Ikaria sous la forme d’une solution à 3,2 % en poids de matière active de miel fermenté, 30 % de propanediol et 66,8 % d’eau.
L’effet de cet extrait va être illustré dans les exemples suivants.
Exemple 2 : Caractérisation de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria
Matériel et méthodes
Quantification des acides organiques par analyse HPLC
L’analyse a été réalisée sur une HPLC agilent 1260 couplée au spectromètre de masse MSD iQ.
Les paramètres dans la méthode d’acquisition citée ci-dessus sont les suivants :
Volume d’injection : 5 µL
Température : 30°C
Colonne : Phenomenex Hydro-RP 150x4,6mm 4µm (n°8)
Solvants :
Isocratique 100 % A : H2O + 0,1% acide formique
Débit : 0,400mL/min
Durée d’analyse 25 min
RMN
Fractionnement par Chromatographie de P artage C entrifuge (CPC)
L’extrait préalablement lyophilisé dans un mélange phase stationnaire phase mobile, est injecté en CPC dans une colonne préalablement équilibrée (FCPE300® (Rousselet Robatel Kromaton)). Le taux de débit a été de 20mL/min et la vitesse de rotation de la colonne de 1200 rpm. Le système de solvant à deux phases correspond à l’acétate d’éthyle/acétonitrile/eau (3/3/4, v/v). La phase stationnaire correspond à la phase inférieure du système de solvants à deux phases (mode ascendant) alors que la phase mobile correspond à phase supérieure du système de solvants à deux phases.
Des fractions de 20 ml ont été collectées pendant toute l’expérience (élution et extrusion) et combinées selon leurs profils de chromatographie sur couche mince. 8 fractions ont ainsi été obtenues.
Identification des principaux métabolites
Un aliquot de chaque fraction de F1 à F08 a été dissoute dans du DMSO-d6 et analysée par RMN 13C à 298 K sur un spectromètre Bruker Avance AVIII-600 (Karlsruhe, Allemagne) équipé d'une cryosonde. Après le traitement des spectres, les intensités absolues de tous les signaux RMN 13C ont été automatiquement collectées et regroupées sur les spectres des séries de fractions en utilisant un script informatique développé par Natexplore. Le tableau résultant a été soumis à une analyse de regroupement hiérarchique (PermutMatrix, 1.9.3, LIRMM, Montpellier, France). Les grappes de déplacement chimique RMN 13C résultantes ont été visualisées sous forme de dendrogrammes sur une carte bidimensionnelle. Pour l'identification des métabolites, chaque grappe de décalage chimique RMN 13C obtenue par HCA a été manuellement soumise au moteur de recherche de structure du logiciel de gestion de base de données ACD/NMR Workbook Suite 2012 (ACD/Labs, Ontario, Canada) comprenant les structures et les décalages chimiques prévus des produits naturels de faible poids moléculaire. Des expériences de RMN 2D (HSQC, HMBC et COSY) ont été réalisées sur des fractions contenant des composés supposés identifiés afin de confirmer les structures moléculaires proposées par la base de données à la fin du processus de déréplication.
LC-HRMS
L’extrait est évaporé puis dissous dans l'eau et soumis à une extraction liquide-liquide. Les solvants d'extraction étaient de l’acétate d’éthyle/dichlorométhane (8:2, v/v).
L'analyse LC-HRMS des fractions organiques a été réalisée en utilisant un système Accela de chromatographie liquide à ultra-haute performance (UHPLC) relié à un spectromètre de masse hybride LTQ-Orbitrap Discovery XL (Thermo Scientific, Brehmen, Allemagne), équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI).
Résultats
Le procédé de fermentation génère un extrait fermenté de miel d’Ikaria ayant une composition très différente du miel d’Ikaria non fermenté.
En particulier, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria comprend différents acides organiques, comme illustré dans le Tableau 1 ci-dessous. L’acide glucuronique, l’acide propionique et l’acide tartrique n’ont pas été détectés, ni dans le miel d’Ikaria non-fermenté ni dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria.
Tableau 1 : Acides organiques présentes dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel non-fermenté (en µg par rapport au g d’extrait sec).
Acide acétique Acide citrique Acide gluconique Acide lactique Acide malique Acide pyrivique Acide quinique Acide shikimique
µg/g µg/g µg/g µg/g µg/g µg/g µg/g µg/g
Miel Ikaria Fermenté 6045 22 3629 15 48 72 112 62
Miel d'Ikaria non fermenté nd 251 non mesuré nd 183 nd 1312 784
nd : non détecté
Les sucres ont été quantifiés par dosage enzymatique selon la technique d’Eurofins. Une diminution importante est observée dans la teneur en sucres dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel d’Ikaria non fermenté, comme l’illustre le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Quantité de sucres dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel d’Ikaria non-fermenté (en g/kg de matière première)
Miel d’Ikaria non fermenté Extrait fermenté de miel d’Ikaria
Glucose 254 9
Fructose 302 13,5
Saccharose 0 0
On observe également une diminution de la teneur en polyphénols totaux dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria (0,0331 %), par rapport à l’extrait de miel d’Ikaria non fermenté (0,6201 %).
L’analyse des métabolites secondaires fait par LC-HRMS démontre également des différences entre le miel d’Ikaria non fermenté et l’extrait fermenté, comme l’illustre le Tableau ci-dessous.
Tableau 3 : Présence ou absence des métabolites secondaires dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria par rapport au miel d’Ikaria non-fermenté
Miel d’Ikaria non fermenté Extrait fermenté de miel d’Ikaria
Acide gluconique présent présent
Acide succinique nd présent
Acide gallique présent présent
Acide protocatéchique présent présent
Acide 2-Hydroxyheptanoïque nd présent
Syringaldéhyde nd présent
Acide malique 2-Isopropyle nd présent
Acide caféique présent présent
Catéchine nd présent
Gallate
d'épigallocatéchine 		nd présent
Myricétine nd présent
Acide benzoïque présent présent
Acide p-coumarique présent présent
Vanilline présent présent
Acide syringique nd présent
Picéide nd présent
Acide 3-Phényllactique présent présent
Acide cinnamique nd présent
Quercétine-O-rhamnoside présent présent
Kaempferol-7-O-rhamnoside présent présent
Acide anchoïque présent présent
Acide (trans,trans)-abscissique présent présent
Acide camphorique présent présent
Acide 4-Hydroxybenzoïque présent présent
Protocatéchuicaldéhyde nd présent
Acide (cis,trans)-abscissique présent présent
Quercétine nd présent
Apigénine présent présent
Génistéine présent présent
Isorhamnétine présent présent
Kaempférol or Lutéoline présent présent
8-Méthoxykaempférol présent présent
Naringenine or Pinobanksine présent présent
nd : non détecté
Enfin, l’étude RMN a permis d’identifier les métabolites suivants dans l’extrait fermenté de miel d’Ikaria : Acide succinique (CAS 110-15-6) ; Mannono-1,4-lactone (CAS 22430-23-5) ; Acide shikimique (CAS 138-59-0) ; Dihydroxyacétone (CAS 96-26-4) ; Acide lactique (CAS 50-21-5) ; Acide 2-hydroxyglutarique (CAS 2889-31-8) ; Acide hydroxyméthyl glutarique (CAS 503-49-1) ; Acide 3-hydroxypropanoïque (CAS 503-66-2) ; Acide phénylacétique (CAS 103-82-2) ; Acide 4-hydroxyphénylacetique (CAS 156-38-7) ; Tyrosol (CAS 501-94-0) ; p-hydroxybenzaldéhyde (CAS 123-08-0) ; 1-(4-méthoxyphényl)-1,2-éthanediol (CAS 13603-63-9) ; Caféine (CAS 58-08-2) ; Mévalonolactone (CAS 674-26-0) ; Acide glutarique (CAS 110-94-1) ; Acide 3-hydroxybutyrique (CAS 300-85-6) ; 1,2-propylène glycol (CAS 57-55-6) ; Acide glycolique (CAS 79-14-1) ; α-D-glucose (CAS 492-62-6) ; β-D-glucose (CAS 492-61-5) ; α-D-fructofuranose (CAS 10489-79-9) ; β-D-fructofuranose (CAS 470-23-5) ; β-D-fructopyranose (CAS 7660-25-5).
E xemple 3 : Caractérisation de l’activité de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria
Matériel et méthodes
Des fibroblastes primaires dermiques humains ont été ensemencés dans une plaque 96 puits dans laquelle des micro-motifs fluorescents en forme de « L » ont été photolithographiés (plaque de type « CTYOOplateTM» contenant « X-Large fluorescent L micropatterns »). Les cellules sont cultivées en environnement contrôlé à 37°C et 5 % de CO2.
Les cellules sont laissées dans du milieu de culture pendant 4h afin qu’elles adhèrent et s’étirent sur les micro-motifs avant traitement. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture complémenté avec l’extrait fermenté d miel fermenté d’Ikaria à une concentration finale de 0,1 %. Le traitement a été appliqué pendant 16h. Du milieu de culture sans ingrédient supplémentaire est ajouté à certains puits et représente donc le témoin contrôle.
Ensuite, les cellules ont été fixées avec du formol, perméabilisées avec un tampon contenant de la saponine, et marquées par Hoechst (pour les noyaux) et phalloidine (pour la F-actine). Des images des cellules ont été acquises en utilisant l’instrument Operetta à un grossissement 20X avec 3 canaux (pour les micro-motifs, les noyaux, et la F-actine).
Les images ont ensuite été analysées afin de déterminer les caractéristiques suivantes des cellules appartenant à chaque groupe de traitement :
  • Ratio d’étirement (ou «stretching ratio») : ratio entre la superficie cellulaire et l’enveloppe convexe de la cellule sur le micro-motif ;
  • Rayon de courbure : rayon de courbure de l’hypoténuse d’une cellule entre les deux extrémités du micro-motif en forme de « L » ;
  • Nombre de fibres de F-actine par cellule ;
  • Longueur moyenne totale des fibres de F-actine du réseau cellulaire (somme des longueurs des fibres de F-actine dans une cellule) ;
  • Longueur moyenne d’une fibre de F-actine par cellule (somme des longueurs des fibres de F-actine dans une cellule/le nombre de fibres présentes).
Entre 56 et 116 cellules ont été détectées par puits. Les données brutes ont été moyennées utilisant 5 réplicats de puits. Les résultats des différents traitements sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin négatif (cellules non-traitées). Les résultats obtenus pour les cellules traitées ont été comparées aux résultats obtenus pour le témoin négatif par le t-test de Welch (* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).
Résultats
Les fibroblastes dermiques humains sont des cellules ayant une grande capacité de contraction, qui peuvent facilement s’étirer sur des micro-motifs en forme de L en formant un réseau de fibres d’actine, comme l’illustre la (voir la condition (1), correspondant à une cellule n’ayant pas subi de traitement particulier).
Lorsque les cellules étirées sont traitées avec le TGF-β, connu pour induire la contraction cellulaire par le renforcement du cytosquelette d’actine, on observe un renforcement dans le réseau d’actine par rapport au témoin négatif comme l’illustre la (compare les conditions (1) et (2)). À titre d’exemple, le rayon de courbure des cellules traitées avec du TGF-β est augmenté de 36% (+36 %, p<0,001) tout comme le ratio d’étirement. Le nombre de fibres de F-actine par cellule est également augmenté (+43 %, p<0,001), ainsi que la longueur totale des fibres (+47 %, p<0,001) (données non illustrées).
Par contraste, le traitement par la cytochalasine D, connu pour son activité inhibitrice sur la polymérisation de l’actine, provoque un effondrement des cellules sur les micro-motifs comme l’illustre la (compare les conditions (1) et (3)) et la détection de très peu de fragments d’actine. Aussi, le rayon de courbure est réduit de 66 % (-66 %, p<0,001) tout comme le ratio d’étirement. Enfin, on observe également une réduction dans le nombre de fibres de F-actine par cellule (-31 %, p<0,001) et la longueur totale des fibres (-46 %, p<0,001) (données non illustrées).
Ainsi, les effets des traitements TGF-β et cytochalasine D sur les fibroblastes dermiques humains démontrent que des effets contractiles/relaxants peuvent être détectés de façon sensible et robuste dans ce modèle de micro-motifs.
Lorsque les fibroblastes sont traités avec l’extrait fermenté de miel d’Ikaria, on observe une activité sur le réseau d’actine, comprenant une augmentation du nombre de fibres de F-actine ( , compare les conditions (1) et (4)). Par ailleurs, le rayon de courbure des cellules traitées avec l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est augmenté de 33 % (+33 %, p<0,01, voir la B) tout comme le ratio d’étirement (p<0,001, voir la A) par rapport aux cellules non-traitées, démontrant l’augmentation de la contraction cellulaire induit par le cytosquelette. De façon notable, l’extrait fermenté de miel d’Ikaria a un effet sur l’étirement des cellules quasi-identique au TGF-β.
En ce qui concerne les fibres d’actine elles-mêmes, les inventeurs ont observé une augmentation dans leur nombre par cellule (+25 %, p<0,05, voir la A), une diminution dans le longueur moyenne par fibre (p<0,01, voir la B), et une augmentation de la somme des longueurs de toutes les fibres par cellule (+29 %, p<0,001, voir la C), révélant la stimulation, la mise en tension et la réorganisation du cytosquelette.
E xemple 4 : Évaluation de l’effet de l’ extrait fermenté de miel d’Ikaria sur les forces contractiles des fibroblastes
L’effet de l’extrait fermenté de miel d’Ikaria sur les forces contractiles des fibroblastes humains a été étudié.
Matériel et méthodes
Préparation et traitement des fibroblastes
Les fibroblastes primaires humains ont été cultivés en flacon T75 jusqu’à ce qu’ils soient confluents à 90 %. Ensuite, une trypsinisation est réalisée afin de transférer les cellules du flacon vers des boîtes de Pétri 33 mm préalablement coatées avec du collagène de type I (15µL/cm²).
Les cellules ont été ensemencées à hauteur de 2 000 cellules par boîte de Pétri. Les cellules sont laissées dans le milieu de culture pendant 24h, en environnement contrôlé à 37°C et 5 % de CO2, afin qu’elles adhèrent à leur matrice et qu’elles se stabilisent dans leur environnement avant le traitement. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture complémenté avec le témoin ou l’ingrédient actif : soit du TGF-β (témoin positif) à une concentration finale de 10 ng/mL soit l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 0,1 %.
Le traitement a été appliqué pendant 48h. Ensuite, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 15 minutes. Les fibroblastes ont été maintenus dans du PBS 1X à 4°C avant mesure immédiate par Microscopie de Force Atomique.
Mesure par Microscopie de Force Atomique (MFA)
Les mesures ont été effectuées par Microscopie de Force Atomique (MFA) au moyen d’un Bioscope Resolve-Bruker® sur lequel est monté un microscope épifluorescence (Leica DMi8) pour corréler la mesure mécanique au signal fluorescent.
Le mode PeakForce® QNM (Quantitative Nanomechanical Mapping) Fluid et le mode Force-Volume ont été utilisés pour cette étude. La pointe MFA sélectionnée avait une constante de raideur théorique de 0,35 N/m et la pointe pyramidale avait un rayon de courbure <10nm. Avant chaque expérience, la sensibilité de déflexion du levier est calibrée sur du Saphir et sa constante de raideur est également calibrée par la méthode du bruit thermique (en anglais, le «thermal noise method»).
Une analyse MFA complète consiste en l’acquisition de force-volume (FV) sur la zone d’intérêt (prolongement cytoplasmique des fibroblastes) en milieu liquide (PBS 1X). Un FV consiste en l’acquisition de 16384 courbes de force-indentation (force appliquée 50 nN) sur une superficie de 50x50 µm, soit un point de mesure tous les 500 nm autour des prolongements du fibroblaste. 15 fibroblastes ont été mesurés par condition (5 fibroblastes sélectionnées au hasard par boite, 3 boites).
Analyse des courbes
Les quantifications du module élastique à partir des courbes de force brutes sont réalisées à l’aide du logiciel de traitement BioMeca Analysis®.
Dans cette étude, le module élastique (Ea) a été extrait au niveau des prolongements cytoplasmiques des fibroblastes. Il est exprimé en KiloPascal (KPa). Cette extraction précise permet de quantifier les forces contractiles exercées par le fibroblaste sur la matrice de collagène environnante.
La quantification du Ea, qui se fait par l’application du modèle de Sneddon sur chaque courbe à partir du point de contact jusqu’à 50 % de la force appliquée, est présentée dans la . Les pourcentages d’augmentation des forces contractiles sont calculés par rapport à la moyenne de chaque condition.
Résultats
De façon surprenante, les inventeurs ont observé une évolution des forces contractiles des fibroblastes après l’application des traitements par rapport au témoin non-traité. Comme attendu, la force contractile des fibroblastes a été augmentée par le traitement avec le TGF-B (contrôle positif) d’environ 8 %. La force contractile des fibroblastes traités avec l’extrait fermenté de miel d’Ikaria a également été largement augmentée, et est environ 2-fois supérieure à l’effet observé pour le TFG-β (soit environ 17,6 %) (données non démontrées).
Exemple 5 : Formulations cosmétiques
5.1.Composition sous la forme d’une crème riche
Ingrédients % en poids
Glycerine 7,5000
Acrylates/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,3000
Gomme xanthan 0,2000
Cetyl alcool/glyceryl stearate/PEG-75/ceteth/steareth-2 5,2500
C10-C18 triglycerides 5,0000
Hydrogenated coco-glycerides 2,5000
Cetyl alcohol 1,0000
Hydrogenated polyisobutene 8,2000
Acide citrique 0,0200
Citrate trisodique 0,1400
Miel fermenté d’Ikaria* 0,1000
Gelée royale 0,0800
Tocopheryl acetate 0,2000
Parfum, neutralisant, conservateur qs
Eau purifiée qsp 100%
*préparé selon l’exemple 1
La composition est préparée selon le mode opératoire suivant :
La glycérine et l’eau sont mélangés sous agitation jusqu’à homogénéité. Les gélifiants acrylates/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer et gomme xanthane sont dispersés sous agitation turbulente.
Cette phase est chauffée à 80°C et l’ensemble cetyl alcool/glyceryl stearate/PEG-75/ceteth/steareth-2 ; C10-C18 triglycérides, hydrogenated coco-glycerides, cetyl alcohol et hydrogenated polyisobutene préalablement chauffé à 80°C est ajouté et l’ensemble est émulsionné sous forte agitation. À 60 °C, le couple acide citrique/ citrate trisodique et le neutralisant sont additionnés, puis les poudres sont ajoutées. A la température de 35°C, le miel fermenté d’Ikaria préparé selon l’exemple 1 et la gelée royale sont ajoutés avant le parfum. Appliquée sur la peau, en particulier sur le visage, seule ou à la suite de l’application d’un sérum, cette composition apporte une action anti-âge avec des effets bénéfiques sur la fermeté et/ou l’élasticité de la peau.
5.2.Composition sous la forme d’un sérum
Ingrédients % en poids
Cetearyl isononate 7,0000
Steareth-2 0,5000
Steareth-21 0,5000
Jojoba esters 1,5000
Butylene glycol 1,0000
Glycerine 6,0000
Sodium hyaluronate 0,0500
Acrylates/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,2500
Gomme xanthan 0,1000
Acide citrique 0,0200
Citrate trisodique 0,1400
Polymethyl methacrylate 1,8000
Miel fermenté d’Ikaria* 0,5000
Gelée royale 0,1000
Tocopheryl acetate 0,2000
Parfum, neutralisant, conservateur qs
Eau purifiée qsp 100%
*préparé selon l’exemple 1
Le sérum est appliqué sur l’ensemble du visage et en particulier sur les zones présentant des signes de vieillissement. La peau est plus souple, plus ferme et plus tonique.

Claims (13)

  1. Extrait fermenté de miel d’Ikaria comprenant :
    - une teneur en acide lactique comprise entre 0,01 et 0,08 %,
    - une teneur en acide pyruvique comprise entre 0,05 et 0,5 %, et
    - une teneur en acide acétique comprise entre 1 et 20 %,
    en poids par rapport au poids d’extrait sec de l’extrait fermenté.
  2. Extrait fermenté de miel d’Ikaria selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend en outre au moins l’un des composés suivants : l’acide succinique, l’acide 2-hydroxyhépanoique, le syringaldéhyde, l’acide malique 2-isopropyle, la catéchine, le gallate d’epigallocatéchine, l’acide syringique, le picéide, l’acide cinnamique, le protocatéchuicaldéhyde, la quercétine, et leurs mélanges.
  3. Extrait fermenté de miel d’Ikaria selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend au moins un conservateur, de préférence choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol.
  4. Procédé de fermentation de miel d’Ikaria comprenant les étapes suivantes :
    a) incubation d’un consortium de micro-organismes dans une solution comprenant un glucide pendant 1 à 10 jours à 17 à 38°C afin d’obtenir une culture de micro-organismes,
    ledit consortium comprenant au moins une bactérie lactique appartenant au genreLactobacillusouPediococcus, au moins une levure appartenant au genreSaccharomyces,SchyzosaccharomycesouTorulaspora, et au moins une bactérie acétique appartenant au genreA cetobacter,G luconobacterouK omagataeibacter;
    b) ajout de la culture obtenue à l’étape a) dans un milieu fermentaire comprenant du miel d’Ikaria à une teneur en poids de 20 à 300 g/kg d’eau afin d’obtenir un mélange de fermentation,
    ladite culture étant ajoutée à une concentration comprise entre 0,5 et 15 % en poids par rapport au poids total du mélange de fermentation ;
    c) incubation du mélange de fermentation obtenu à l’étape b) à une température comprise entre 25 et 35°C pendant 10 à 15 jours ;
    d) filtration du mélange de fermentation, afin d’obtenir un extrait fermenté de miel d’Ikaria, et optionnellement,
    e) ajout d’au moins un conservateur, de préférence choisi parmi le propanediol, la glycérine, le butylène glycol, plus préférentiellement le propanediol, à l’extrait fermenté de miel d’Ikaria à une concentration finale de 25 à 50 % en poids par rapport au poids total.
  5. Extrait fermenté de miel d’Ikaria obtenu par le procédé selon la revendication 4.
  6. Extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5, caractérisé en ce qu’il est sous la forme d’une solution comprenant 3 à 4 % en poids de matière active d’extrait fermenté de miel d’Ikaria, 30 à 35 % en poids de propanediol et 60 à 70 % en poids d’eau.
  7. Composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’une quelconque des revendication 1 à 3, 5 ou 6.
  8. Composition cosmétique selon la revendication 7, caractérisée en que l’extrait fermenté de miel d’Ikaria est présent en une teneur allant de 0,0000032% à 0,64 %, de préférence de 0,00032 % à 0,032 %, plus préférentiellement de 0,0032% à 0,016% en poids de matière active (matière sèche d’extrait fermenté de miel) par rapport au poids total de la composition.
  9. Composition cosmétique selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre au moins un adjuvant cosmétique choisi dans le groupe constitué par des agents antioxydants, des agents émollients, des agents hydratants, des agents anti-âge, des parfums, et leurs mélanges.
  10. Composition cosmétique selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu’elle est sous la forme d’une crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, gel, lait, lotion, ou sérum.
  11. Procédé cosmétique de soin et/ou maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau et/ou des lèvres, comprenant l’application sur lesdites matières kératiniques, d’au moins une couche d’une composition cosmétique telle que définie dans l’une quelconque des revendications 7 à 10.
  12. Procédé cosmétique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu’il est destiné à favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
  13. Utilisation cosmétique d’un extrait fermenté de miel d’Ikaria selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, 5 ou 6, comme actif pour favoriser et/ou stimuler l’homéostasie cutanée et/ou le renouvellement épidermique et/ou la régénération cutanée et/ou l’intégrité de la peau, et/ou prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, notamment la perte de fermeté, la perte d’élasticité, la perte de densité, la perte de souplesse, la perte de tonicité, l’altération de la fonction barrière de la peau et/ou l’apparition de rides et/ou ridules.
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KR101933600B1 (ko) * 2016-12-01 2018-12-31 이현기 벌꿀 발효물을 함유한 각질제거 및 주름개선용 화장료 조성물
EP3564381A1 (fr) * 2016-12-28 2019-11-06 Yamada Bee Company, Inc. Produit fermenté à base de miel, et procédé de fabrication de celui-ci

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