FR3071742A1 - Procede d'utilisation d'un inhibiteur de let-7b en cosmetique et/ou en nutraceutique - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un procédé d'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b en cosmétique et/ou en nutraceutique, et en particulier à l'utilisation cosmétique ou nutraceutique d'un extrait aqueux de graine d'Hippophaerhamnoïdesprésentant une capacité inhibitrice de Let-7b pour inhiber l'expression de Let-7b dans la peau et/ou des muqueuses pour maintenir ou améliorer leurs propriétés biomécaniques, notamment leur fermeté, élasticité et/ou densité.

Description

Procédé d'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b en cosmétique et/ou en nutraceutique

La présente invention concerne un procédé d'utilisation d'un inhibiteur potentiel du micro ARN hsa-Let-7b-5p (ci-après Let-7b) dans les domaines cosmétiques et/ou en nutraceutiques.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un nouvel ingrédient cosmétique et/ou nutraceutique ainsi qu'une composition le comprenant pour inhiber l'expression de Let-7b, notamment dans la peau saine et/ou les muqueuses saines, et/ou pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines.

La structure et les propriétés de la peau changent sous l'effet de processus biologiques, physiques et biomécaniques complexes, entraînant une perte d’élasticité, de fermeté, de densité du derme. Il en résulte un relâchement et un affaissement inesthétique de la peau du corps, notamment celle du visage.

D'un point de vue structurel, les altérations des propriétés biomécaniques de la peau sont généralement dues à des changements dans l'organisation de la matrice extracellulaire du derme. Ils comprennent notamment les dérégulations de la synthèse des glycosaminoglycanes (ou GAG), notamment des chondroïtines sulfates, impliquées dans les fonctions structurelles et de régulation physiologique dans la peau. Ces changements comprennent également les altérations de la polymérisation et de la réticulation des fibres de collagène et d'élastine. Dans ce cas, ces réseaux de fibres perdent leurs propriétés biomécaniques, la peau perd sa fonction de support et s'affaisse.

Ces phénomènes sont causés par des facteurs intrinsèques d'une part, notamment génétiques, ainsi que par des facteurs extrinsèques d'autre part, tels que les rayons ultraviolets et/ou le tabagisme et/ou la pollution. Ces derniers peuvent notamment entraîner des modifications épigénétiques parmi lesquelles figurent la régulation par les microARN.

Les microARN (ou miARN) endogènes sont une famille de petits ARN non codants, généralement 20 à 24 nucléotides de longueur, qui régulent négativement l'expression génique au niveau post transcriptionnel. Ils lient base à base la régions 3'-UTR de leurs ARNm cibles, entraînant leurs dégradations et par conséquent la diminution ou l'inhibition de la traduction des protéines correspondantes dans la cellule. Dans les années 2000, les premiers travaux ont démontré que ces molécules jouaient un rôle de régulateurs biologiques et étaient impliquées dans de nombreux processus du vivant. La compréhension des régulations épigénétiques et la découverte des ARNm ciblés par les miARN est depuis un enjeu majeur notamment dans les domaines thérapeutique et cosmétique.

La prédiction par alignement des séquences assistée par des algorithmes de calculs est l'une des méthodes employées à ces fins. Cependant, des résultats expérimentaux suggèrent qu'un alignement, même parfait, n'est pas la preuve absolue de l'interaction in κ/Vodu miARN et de sa cible. En effet, l'expression des miARN et des ARNm étant cellule spécifique, la prédiction par alignement des séquences souffre du fait qu'elle ne tienne pas compte de la co-expression, ou non, des deux entités dans la cellule.

La Demanderesse a découvert que Let-7b régule épi génétiquement de manière négative la synthèse de cinq protéines dans les fibroblastes : la fibrilline 1 (FBN1), la xylosyl transferase 1 (XYLT1), le récepteur TGF bêta 2 (TGFBR2), l'intégrine bêta 3 (ITGB3) et la chondroïtine sulfate synthase 3 (CHSY3). (Voir exemple 2)

Les protéines CHSY3 et XYLT1 sont responsables de la synthèse des chondroïtines sulfates telles que la décorine et le biglycane nécessaires à l'assemblage des chaînes de glycosaminoglycanes (GAG), elles-mêmes impliquées dans l'organisation des fibres de collagène et des fibres élastiques au sein de la matrice extracellulaire.

TGFBR2 est l'un des deux récepteurs de la voie de signalisation TGF-bêta. Il participe à la régulation de la cicatrisation et de la réparation tissulaire. De plus, la non expression de TGFBR2 entraîne le ralentissement du phénomène de contraction de cicatrice et retarde la réorganisation du collagène du derme au sein de la matrice extracellulaire.

FNB1 est l'un composant majeur des myofibrilles qui servent de trame au sein de la matrice extracellulaire pour le dépôt de la tropoélastine durant la synthèse des fibres élastiques.

ITGB3 participe au complexe d'intégrine et est impliquée dans les interactions cellule-matrice par l'intermédiaire de sa liaison avec la fibriline 1, influençant le dépôt de la matrice extracellulaire et la structure 3D du derme.

La Demanderesse a donc découvert que l'augmentation de Let-7b, en plus de réguler négativement la synthèse de collagène dans le derme, joue un rôle majeur dans la perte d'organisation de la matrice extracellulaire du derme, notamment de l'organisation des fibres de collagène, des fibres élastiques et des GAG. Ce miARN est ainsi responsable de la diminution de la fermeté, de l'élasticité et de la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines.

La Demanderesse a pu constater, comme explicité dans la demande EP2721408 que les molécules de la matrice extracellulaire (MEC) sont synthétisées sous forme native dans les cellules en contact avec la MEC. Du compartiment intracellulaire, elles sont excrétées en dehors des cellules. Après des phénomènes de maturation, elles s'organisent et s'agencent en un réseau qui forme la MEC. Elles sont alors sous leur forme fonctionnelle. Certains ingrédients actifs cosmétiques permettent de stimuler globalement la synthèse de collagène de la MEC sans toutefois visualiser d'amélioration de la fonctionnalité du collagène c'est-à-dire pas d'augmentation de la teneur du collagène dans la MEC ni d'augmenter la teneur en fibres de collagènes organisées. La Demanderesse a également constaté que certains ingrédients améliorent la fonctionnalité du collagène c'est-à-dire la qualité de l'organisation des fibres de collagène dans la MEC et/ou la quantité de fibres de collagène organisées dans la MEC sans toutefois mesurer d'augmentation de la synthèse de procollagène. Une synthèse importante de molécules de la MEC par des cellules en culture mesurée dans le milieu intracellulaire et/ou extracellulaire ne se traduit donc pas nécessairement par une quantité plus importante de molécules fonctionnelles.

L'invention porte donc également sur l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un inhibiteur de Let-7b pour améliorer la fonctionnalité des molécules de la matrice extracellulaire. Ainsi, elle vise l'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b pour maintenir et/ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire, et/ou pour maintenir et/ou améliorer la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques et/ou pour maintenir et/ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

Par conséquent, l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un inhibiteur de l'expression de Let-7b permet de maintenir et/ou d'améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, préférentiellement la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

Cette nouvelle cible cosmétique étant identifiée, il est donc nécessaire de déterminer un nouveau moyen de tester les éventuels inhibiteurs.

En effet, comme détaillé ci-dessus, les miARN tels que Let-7b ont une expression cellule spécifique. La demanderesse a donc mis au point un procédé d'utilisation d'un inhibiteur potentiel de Let-7b permettant de prendre en considération l'expression cellule spécifique des miARN et des ARNm.

Grâce à ce dernier, la demanderesse a découvert que l'extrait aqueux de graine d Hippophae rhamnoïdes L. (ci-après abrégé Hippophae rhamnoïdes} est un inhibiteur de l'expression de Let7b particulièrement intéressant pour son utilisation en cosmétique et/ou en nutraceutique pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment maintenir et/ou augmenter la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain, et/ou pour maintenir et/ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire et/ou pour maintenir et/ou augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques et/ou pour maintenir et/ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

Hippophae rhamnoïdes, également connu sous le nom d'argousier, est une espèce de plante ligneuse retrouvée en Europe et en Asie, notamment en Chine, appartenant à la famille des Éléagnacées.

L'utilisation de baie d'argousier est connue en médecine traditionnelle tibétaine depuis plus de mille ans, et la plante est largement utilisée en médecine traditionnelle chinoise notamment pour traiter les maladies cardio-vasculaires. Les grecs ont également utilisé le fruit d Hippophae rhamnoïdes pour ses propriétés antalgiques, pour traiter les douleurs d'estomac et le scorbut.

L'huile de graine est très largement utilisée, notamment en cosmétique en tant qu'anti-âge, mais aussi en tant que supplément alimentaire ou en dermatologie pour la cicatrisation des brûlures, et ce, en raison de sa richesse en acides gras polyinsaturés.

La fabrication de l'huile de graine d Hippophae rhamnoïdes génère un résidu constitué par la fraction aqueuse de la graine. Cette dernière fraction est habituellement éliminée et constitue une perte conséquente de matière. De manière particulièrement inattendue, la Demanderesse à découvert que cette fraction aqueuse de la plante, jusqu'alors peu étudiée, était porteuse de nombreuses activités faisant l'objet de ce brevet.

Les brevets FR2840809, JP4933768 et JP4495925 divulgue l'utilisation de la fraction hydrophile du fruit d'Hippophae rhamnoïdes en tant qu'agent anti-âge. Cependant, aucun de ses brevets ne divulgue l'utilisation d'un extrait aqueux de graine d Hippophae rhamnoïdes.

La demande de brevet EP2282750 décrit l'utilisation du résidu de l'extraction par CO₂ supercritique de baies d Hippophae rhamnoïdes ensuite. extrait par extraction aqueuse pour maintenir une peau saine, réduire le vieillissement de la peau, pour maintenir et améliorer l'élasticité de la peau, ou comme principe actif pour promouvoir la régénération de la peau et la cicatrisation. Cette demande ne divulgue cependant pas l'utilisation cosmétique d'un extrait aqueux de graine d Hippophae rhamnoïdes

Le brevet KR101276141 divulgue une méthode d'extraction de graine d Hippophae rhamnoïdes permettant d'éliminer les composés huileux comprenant l'utilisation d'alcool en Ci-C₄ comme solvant d'extraction et la filtration sous vide à l'aide de diatomite. L'extrait obtenu possède des propriétés anti-oxydante et a nti bactérien ne et peut notamment être utilisé comme ingrédient actif dans une composition pour prévenir le vieillissement de la peau. Ce brevet ne divulgue cependant pas l'utilisation cosmétique d'un extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes pour inhiber de l'expression de Let-7b pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau.

Ainsi à la connaissance de la Demanderesse, aucun des arts antérieurs ne divulgue l'utilisation cosmétique et/ou en nutraceutique d'un extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau, notamment maintenir et/ou augmenter la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau, en particulier du derme sain et/ou pour maintenir et/ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire et/ou pour maintenir et/ou augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques et/ou pour maintenir et/ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

Un premier aspect de l'invention est de fournir un procédé d'utilisation des inhibiteurs de Let-7b.

Un second aspect de la présente invention est également de fournir un nouvel ingrédient actif cosmétique et/ou nutraceutique capable d'inhiber l'expression de Let-7b, notamment dans la peau.

Un tel ingrédient présente l'avantage de maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain et/ou pour maintenir et/ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire et/ou pour maintenir et/ou améliorer la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques et/ou pour maintenir et/ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

Un autre aspect de la présente invention est également d'utiliser une fraction non valorisée d Hippophae rhamnoïdes, notamment dans la fabrication de compositions cosmétiques.

L'avantage de ce nouvel ingrédient actif cosmétique est d'être topiquement acceptable pour la peau, notamment le cuir chevelu, et/ou les muqueuses, non toxique, disponible facilement, pouvant être fabriqué et conditionné facilement à l'échelle industrielle.

La présente invention a pour premier objet un procédé d'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b en cosmétique et/ou nutraceutique, comprenant les étapes suivantes :

a) Mise en contact des cellules cibles et d'un inhibiteur potentiel de Let-7b,

b) Quantification de l'expression de Let-7b,

c) Sélection de l'inhibiteur potentiel de Let-7b si l'expression de Let-7b est diminuée,

d) Utilisation de l'inhibiteur potentiel de Let-7b sélectionné en tant que principe actif en cosmétique et/ou en nutraceutique.

Au sens de la présente invention on entend par « inhibiteur potentiel » tout extrait de matériel biologique végétal, animal et/ou procaryote ainsi que toute molécule ou mélange de molécules issue de la synthèse chimique et leurs mélanges. Préférentiellement, l'inhibiteur potentiel est un extrait de matériel biologique végétal.

Cet extrait et/ou cette molécule de synthèse est sélectionné comme un « inhibiteur de Let-7b » lorsque la quantité de Let-7b mesurée par RT-qPCR après mise en contact de l'inhibiteur potentiel est inférieure à la quantité mesurée en l'absence de mise en contact de l'inhibiteur potentiel, dans des conditions de température, de temps de contact, et de conditions opératoires identiques, ou comparables. Préférentiellement, il s'agit d'une inhibition d'au moins 10 % en présence de l'inhibiteur potentiel de Let-7b, encore préférentiellement d'au moins 30 % par rapport à la quantité de Let-7b mesurée en l'absence de l'inhibiteur potentiel selon l'invention.

Par Let-7b est entendu hsa-Let-7b-5p. Sa séquence de ce microARN est décrite de SEQ ID NO: 1.

L'étape a) correspond à la mise en contact, c'est-à-dire à l'ajout de l'inhibiteur potentiel dans la cellule cible et/ou dans le milieu de culture de ladite cellule cible. Préférentiellement, les cellules cibles sont les fibroblastes, préférentiellement humains, préférentiellement sains.

Au sens de la présente invention, on entend par « cellule cible » l'ensemble des cellules dans lesquels les protéines cibles et/ou leurs ARNm correspondants et Let-7b sont co-exprimées.

Au sens de la présente invention, on entend par « protéines cibles et/ou les ARNm correspondants » l'ensemble des protéines et/ou des ARNm codant pour ces protéines dont l'expression est régulée par Let-7b. Préférentiellement, les protéines à réguler et/ou leurs ARNm correspondants sont la fibrilline 1 (FBN1) et/ou la xylosyl transferase 1 (XYLT1) et/ou le récepteur TGF bêta 2 (TGFBR2) et/ou l'intégrine beta 3 (ITGB3) et/ou la chondroïtine sulfate synthase 3 (CHSY3), préférentiellement la xylosyl transferase 1 (XYLT1) et/ou l'intégrine bêta 3 (ITGB3) et/ou la chondroïtine sulfate synthase 3 (CHSY3), encore préférentiellement la xylosyl transferase 1 (XYLT1) et/ou la chondroïtine sulfate synthase 3 (CHSY3).

Sauf indication contraire, on entend par cellules « saines » et notamment fibroblastes « sains », des cellules et notamment des fibroblastes ne présentant pas de pathologie.

Les cellules cibles sont de préférence des fibroblastes.

Les cellules cibles sont préalablement cultivées selon les méthodes de culture classiques connues de l'homme du métier. Préférentiellement, les cellules cibles sont cultivées en milieu DMEM® (Dubecco's Modified Eagle Medium® - Life Technologie®).

Selon un mode avantageux du procédé selon l'invention, l'inhibiteur potentiel est présent à une concentration allant de lxl0^_4% à 10% (p/v), préférentiellement de 0,001% à 0,1% (p/v), encore préférentiellement de 0,003% à 0,02% (p/v) en poids d'inhibiteur de Let-7b par rapport par rapport au volume du milieu de culture. De manière avantageuse, les concentrations testées d'inhibiteur potentiel sont de 0,003% à 0,02% (p/v) en poids de l'inhibiteur de Let-7b par rapport au volume total du milieu de culture.

Préférentiellement, la mise en contact est réalisée pendant une période allant de 12 heures à 72 heures. De manière avantageuse, elle est d'environ 48 heures.

Avantageusement, la mise en contact est réalisée à une température allant de 20°C à 45°C, de préférence à température ambiante, de préférence à environ 37°C.

A titre d'exemple, et de manière non limitative, les cellules peuvent être cultivées selon le protocole détaillé dans l'exemple 3.1.

L'étape b), dite de quantification est une étape de mesure de l'expression de Let-7b. Elle peut être réalisée par toute méthode de mesure de biologie moléculaire connue. L'étape de quantification est une quantification directe par mesure de la quantité de Let-7b et/ou une quantification indirecte par mesure de la quantité de protéines régulées par Let-7b et/ou de leurs ARNm correspondants.

Il peut s'agir de la quantification directe par mesure de la quantité de Let-7b, notamment par mesure sur puces à ARN et/ou par mesure de réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse en temps réel (RT-qPCR ou real time RT-PCR).

Il peut également s'agir de la quantification indirecte par mesure de la quantité des protéines cibles et/ou des ARNm correspondants. La quantité de protéines et/ou d'ARNm correspondants est inversement corrélée au niveau d'expression de Let-7b. La quantification des ARNm cibles peut être faite par mesure sur puces à ARN et/ou par mesure de réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse en temps réel (RT-qPCR ou real time RT-PCR). La quantification des protéines cibles peut être faite par Western Blot.

Préférentiellement, la quantification de l'expression de Let-7b est effectuée par quantification directe par RT-qPCR.

De manière avantageuse et non limitative, l'étape b) peut être réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 3.2.

L'étape c), dite de sélection comprend la comparaison des résultats de l'étape b) par rapport à un ou plusieurs témoins positifs de l'inhibition de Let-7b et/ou par rapport à un ou plusieurs témoins négatifs de l'inhibition de Let-7b et/ou entre plusieurs substances potentiellement actives entre elle et/ou par rapport à l'absence de toute substance ajoutée dans milieu de culture et/ou dans la cellule. Préférentiellement, la comparaison est réalisée par rapport à la quantité mesurée en l'absence de toute substance ajoutée dans le milieu de culture et/ou dans la cellule.

Avantageusement la Demanderesse considère, dans le cadre de l’invention, que la sélection des molécules potentiellement actives lors du criblage peut être réalisée pour des inhibitions de la synthèse de Let-7b qualifiées de fortes. Au sens de la présente invention on entend par « inhibition forte » toute inhibition supérieure ou égale à 30% de l’activité de référence. Cette activité de référence est mesurée sans que la cellule cible n’ait été mise en contact avec la substance potentiellement active, dans des conditions de température, de temps de contact, et de conditions opératoires identiques, ou comparables.

Dans un mode préférentiel du procédé d'utilisation selon l'invention, l'inhibiteur de Let-7b est un extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoides.

L'étape d) correspond à l'utilisation de l'inhibiteur de Let-7b sélectionné, en tant que principe actif en cosmétique et/ou en nutraceutique.

L'invention a également pour objet un procédé d'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b en cosmétique et/ou en nutraceutique tel que décrit, dans lequel l'inhibiteur de Let-7b est utilisé pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines notamment pour maintenir et/ou d'améliorer la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment du derme sain.

L'invention a également pour objet un procédé d'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b en cosmétique et/ou en nutraceutique tel que décrit, dans lequel l'inhibiteur de Let-7b est utilisé pour maintenir et/ou d'améliorer la fermeté et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

L'invention a également pour objet un procédé d'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b en cosmétique et/ou en nutraceutique tel que décrit, dans lequel l'inhibiteur de Let-7b est utilisé pour maintenir et/ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire et/ou pour maintenir et/ou améliorer la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques et/ou pour maintenir et/ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

La présente invention a également pour objet l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un extrait aqueux de graine dHippophae rhamnoides pour inhiber l'expression de Let-7b dans la peau saine et/ou les muqueuses saines et/ou pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

La présente invention a également pour objet un procédé de soin cosmétique comprenant l'application, préférentiellement par voie topique, d'un extrait aqueux de graine dHippophae rhamnoides et/ou d'une composition cosmétique le comprenant, au niveau de la peau saine, notamment du cuir chevelu sain, et/ou des muqueuses saines, pour inhiber l'expression de Let7b dans la peau saine et/ou des muqueuses saines ou pour maintenir ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier pour maintenir ou améliorer la fermeté, l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain. L'application peut être effectuée sur tout ou partie saine du corps et/ou du visage et/ou du cuir chevelu, préférentiellement les jambes, les cuisses, les bras, le ventre, le décolleté, le cou, les aisselles, tout ou partie du visage, préférentiellement au niveau des joues et/ou de la zone angulaire du visage.

En particulier, l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique ou le procédé sont mis en œuvre pour maintenir ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire, pour maintenir ou améliorer la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques, et/ou pour maintenir ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

L'extrait selon l'invention est un extrait de graine. Au sens de la présente invention, la graine correspond à la baie (ou fruit) d Hippophae rhamnoïdes débarrassée de la partie charnue, autrement dénommée péricarpe.

L'extrait peut être obtenu par les méthodes d'extraction aqueuse de végétaux connues dans le domaine, par exemple par macération d'au moins une partie de la graine, de préférence allant de 1% à 90% (p/p) en poids, préférentiellement allant de 1% à 50% (p/p) en poids, encore préférentiellement allant de 5% à 20% (p/p) en poids, par rapport au poids total de la partie de graine et du solvant, dans l'eau ou un mélange de solvant tel que eau/alcool, eau/glycol ou eau/polyol. Par exemple, l'extrait pourra être obtenu par extraction dans un mélange eau/éthanol, de façon particulière en proportion respective de 70/30 en volume. Préférentiellement, l'extrait est obtenu par extraction aqueuse avec l'eau pour seul solvant.

Au sens de la présente invention, on entend par « extraction aqueuse » toute extraction réalisée avec une solution aqueuse comprenant au moins 60 % (p/p) en poids, avantageusement au moins 70% (p/p) en poids, en particulier au moins 80% (p/p) en poids, plus particulièrement au moins 90% (p/p) en poids, de façon particulière au moins 95% (p/p) en poids, d’eau par rapport au poids total de la solution aqueuse. Selon un mode préférentiel, l'extraction aqueuse de la graine d'Hippophae rhamnoidesest réalisée avec de l'eau comme unique solvant.

Selon un mode avantageux, l'extrait peut donc être obtenu par extraction aqueuse effectuée avec une quantité allant de 1% à 50% (p/p) en poids de graine d'Hippophae rhamnoides par rapport au poids total de de graine d'Hippophae rhamnoides et de solvant, préférentiellement avec l'eau comme unique solvant.

L'extrait peut être obtenu par extraction aqueuse effectuée à une température allant de 4°C à 95°C, préférentiellement de 20°C à 95°C, encore préférentiellement de 50 à 95°C, de préférence de 70°C à 90°C. Dans un mode de réalisation particulier, l'extraction est effectuée à environ 80°C.

L'extraction peut être conduite durant une période de 1 heure à 24 heures, préférentiellement de 1 heure à 12 heures, encore préférentiellement de 1 heure à 6 heures. Avantageusement, l'extraction est effectuée durant une période de 2 à 3 heures.

Préférentiellement, l'extrait est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple la).

Une étape supplémentaire d'ajout de maltodextrine peut être réalisée. Avantageusement une quantité d'au moins 20 % (p/p) en poids par rapport au poids total de l'extrait et de la maltodextrine, préférentiellement d'au moins 50 % (p/p), encore préférentiellement d'au moins 70 % (p/p) en poids de maltodextrine, est alors ajoutée à l'extrait. L'extrait peut être ensuite concentré par évaporation du solvant et/ou séché par lyophilisation et/ou par atomisation.

Dans un mode préférentiel de réalisation de l'invention, l'extrait est séché par atomisation après ajout de maltodextrine dans la solution.

Dans un mode préférentiel de l'invention, la graine d'Hippophae rhamnoïdes est préalablement extraite par extraction supercritique au dioxyde de carbone.

Selon ce mode de réalisation, l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoidesest obtenu par extraction aqueuse du coproduit de l'extraction supercritique au dioxyde de carbone de la graine d'Hippophae rhamnoïdes.

L'extraction supercritique au dioxyde de carbone est une technique connue de l'homme du métier permettant d'isoler la fraction huileuse du composé à extraire pour l'utiliser pour diverses applications. Le résidu de cette extraction est appelé « coproduit » au sens de la présente invention et contient l'ensemble des composés non extrait par ladite technique. Il s'agit donc de la fraction délipidée de la graine $ Hippophae rhamnoïdes.

Au sens de la présentation, l'extrait aqueux de graine üHippophae rhamnoïdes ne contient des composés lipidiques qu'à l'état de trace. Préférentiellement, l'extrait comprend une concentration allant de lxl0^_6% à 1% (p/p) de composés lipidiques par rapport au poids total de l'extrait, encore préférentiellement entre 0,01% et 1% (p/p), avantageusement l'extrait contient entre 0,1 et 1% (p/p) de composés lipidiques par rapport au poids total de l'extrait.

Cette technique d'extraction permet d'obtenir un coproduit dépourvu de solvant résiduel pouvant être plus facilement isolé et intégré dans une composition cosmétique et/ou nutraceutique.

Elle peut être réalisée en présence ou non de co-solvant, avantageusement elle est réalisée sans co-solvant. Elle peut être réalisée à une pression allant de 50 à 80 bar et à une température allant de 25 à 70°C, préférentiellement elle est réalisée à environ 60 bar et environ 30°C. La durée de l'extraction supercritique peut aller de 30 à 120 minutes, préférentiellement de 60 à 100 minutes.

Le coproduit est ensuite extrait par une extraction aqueuse telle que décrite ci-dessus.

Préférentiellement, l'extrait est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple lb).

Un autre aspect de l'invention est relatif à l'utilisation d'un inhibiteur de Let-7b pour maintenir ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté, l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

Par ailleurs, l'invention est également relative à un procédé de soin cosmétique comprenant l'application, préférentiellement par voie topique, d'un inhibiteur de Let-7b et/ou d'une composition cosmétique le comprenant, au niveau de la peau saine, notamment du cuir chevelu sain, et/ou des muqueuses saines, pour maintenir ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté, l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain. L'application peut être effectuée sur tout ou partie saine du corps et/ou du visage et/ou du cuir chevelu, préférentiellement les jambes, les cuisses, les bras, le ventre, le décolleté, le cou, les aisselles, tout ou partie du visage, préférentiellement au niveau des joues et/ou de la zone angulaire du visage.

De préférence, le procédé et l'utilisation sont mis en œuvre pour maintenir ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire, pour maintenir ou augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques, et/ou pour maintenir ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

Dans un mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de Let-7b est sélectionné par le procédé selon la présente invention, tel que décrit ci-dessus. Un certain nombre d'inhibiteurs de Let-7b sont disponibles pour l'homme du métier. On peut citer par exemple un oligonucléotide complémentaire de la séquence de Let-7b comme celui de séquence SEQ ID NO : 2.

La présente invention est relative à une composition cosmétique comprenant un inhibiteur de Let-7b et au moins un excipient cosmétiquement acceptable.

Au sens de la présente invention, on entend par « utilisation cosmétique et/ou composition cosmétique » une utilisation et/ou une composition non pharmaceutique, c'est-à-dire qui ne nécessite pas de traitement thérapeutique, c'est-à-dire destinée à toute zone de peau saine notamment le cuir chevelu sain, et/ou muqueuse saine.

Au sens de la présente invention, on entend par « utilisation nutraceutique et/ou composition nutraceutique » une utilisation et/ou une composition à administration orale non pharmaceutique, c'est-à-dire qui ne nécessite pas de traitement thérapeutique.

On entend par « peau saine » et/ou « muqueuse saine » et/ou « cuir chevelu sain », une zone de peau et/ou de muqueuse et/ou de cuir chevelu sur laquelle sont appliqués l'extrait selon l'invention dite « non pathologique » par un dermatologue, c'est à dire ne présentant pas d'infection, de cicatrice, de maladie, ou de plaies ou de blessures et/ou autres dermatoses.

On entend par « muqueuse », la muqueuse oculaire, la muqueuse vaginale, la muqueuse urogénitale, la muqueuse anale, la muqueuse nasale et/ou la muqueuse buccale, labiale et/ou gingivale, préférentiellement, les muqueuses oculaires et/ou buccales.

Au sens de la présente invention, on entend par « inhiber l'expression de Let-7b » diminuer la quantité de Let-7b, notamment dans la peau saine et/ou les muqueuses saines, préférentiellement au niveau du derme sain. Préférentiellement, il s'agit d'une inhibition d'au moins 10 % en présence de l'extrait aqueux de graine dHippophae rhamnoïdes, encore préférentiellement d'au moins 30 % par rapport à la quantité de Let-7b mesuré en l'absence de l'extrait selon l'invention.

Selon un mode particulier de l'invention, il s'agit de l'utilisation de l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes selon l'invention pour inhiber l'expression de Let-7b dans le derme sain et/ou les lames basales saines, notamment de la jonction dermoépidermique saine, préférentiellement dans le derme sain.

Selon un mode préférentiel de l'invention, il s'agit de l'utilisation de l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes selon l'invention pour inhiber l'expression de Let-7b au niveau dans les fibroblastes sains.

La quantité de Let-7b peut être mesurée par toute méthode de biologie moléculaire de quantification connue. Il peut s'agir de la quantification directe de la quantité de miARN Let-7b, notamment par mesure sur puces à ARN et/ou par mesure de réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse en temps réel (RT-qPCRou real time RT-PCR). De préférence, la quantité de Let-7b est mesurée par RT-qPCR selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. Encore préférentiellement elle est mesurée selon l'exemple 3.2.

Au sens de la présente invention on entend par « propriété biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines » la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité et/ou la résistance à la compression et/ou la résistance à l'étirement et/ou la flexibilité et/ou l'extensibilité et/ou la capacité à résister à la déformation de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain. Préférentiellement il s'agit de la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

Les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines peuvent être étudiées par les techniques de mesure connues par l'homme du métier notamment par traction, par torsion, succion, indentation, levatométrie, ballistométrie, par scanner ultrason à haute résolution ou élastographie, préférentiellement par indentation, par scanner ultrason à haute résolution. De manière avantageuse, les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines sont étudiées selon le protocole décrit dans l'exemple 5.

Au sens de la présente invention, on entend par « maintenir les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines » empêcher une diminution des propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain, par rapport aux propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses sainesmesurées en l'absence de l'extrait selon l'invention.

Au sens de la présente invention, on entend par « améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines» une augmentation des propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain, préférentiellement d'au moins 10% en présence de l'inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait aqueux de graine d Hippophae rhamnoïdes par rapport aux propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines mesurées en l'absence de l'inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

Selon un mode particulier de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un inhibiteur de Let-7b ou d'un extrait aqueux de graine d'Hippophaerhamnoides selon l'invention pour maintenir et/ou augmenter la fermeté et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

En particulier, le maintien et/ou l'amélioration des propriétés biomécaniques de la peau saine permet de limiter et/ou de réduire le relâchement de la peau saine du visage en particulier au niveau des joues et/ou de la zone angulaire du visage (communément appelé arrondie du visage ou V du visage).

Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un inhibiteur de Let-7b ou d'un extrait aqueux de graine ù'Hippophae rhamnoïdes selon l'invention pour maintenir et/ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques.

Au sens de la présente invention, on entend par « qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire » le niveau d'organisation fonctionnel des molécules qui constituent la matrice extracellulaire. Comme explicité dans l'introduction de la demande, les protéines FBN1 et/ou XYLT1 et/ou TGFBR2 et/ou ITGB3 et/ou CHSY3 sont impliquées dans le dépôt et/ou l'organisation de la matrice extracellulaire et sont régulées négativement par le Let-7b. L'inhibition de Let-7b entraîne une diminution de l'inhibition de ces protéines et permet de maintenir et/ou d'améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire.

Au sens de la présente invention, on entend par « maintenir la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire » empêcher une diminution de l'organisation de la matrice cellulaire, notamment en limitant la régulation négative des protéines FBN1 et/ou XYLT1 et/ou TGFBR2 et/ou ITGB3 et/ou CHSY3 par rapport à l'organisation de la matrice extracellulaire visualisée en l'absence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

Au sens de la présente invention, on entend par « améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire » une amélioration de l'organisation de la matrice extracellulaire, notamment en limitant la régulation négative des protéines FBN1 et/ou XYLT1 et/ou TGFBR2 et/ou ITGB3 et/ou CHSY3 par rapport à l'organisation de la matrice extracellulaire visualisée en l'absence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

La visualisation de l'organisation fonctionnelle de la matrice extracellulaire peut être réalisée par des techniques immunohistochimique ou selon la méthode telle que décrite dans le brevet EP2721408 de la demanderesse.

Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un inhibiteur de Let-7b ou d'un extrait aqueux de graine ô'Hippophae rhamnoïdes selon l'invention pour maintenir et/ou augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques.

Au sens de la présente invention, on entend par « quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées » le nombre de molécules de la matrice extracellulaire agencées et fonctionnelles au sein de la matrice extracellulaire.

Au sens de la présente invention, on entend par « maintenir la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées » empêcher une diminution de molécules de la matrice extracellulaire organisées par rapport à la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées mesurée en l'absence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

Au sens de la présente invention, on entend par « augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées » une augmentation de la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées par rapport à la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées mesurée en l'absence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

La quantité de molécule de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques, et la qualité de leur organisation peuvent être mesurées selon la méthode tel que décrite dans le brevet EP2721408 de la demanderesse.

Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un inhibiteur de Let-7b ou d'un extrait aqueux de graine dHippophae rhamnoïdes selon l'invention pour maintenir et/ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes notamment des chondroïtines sulfates.

Au sens de la présente invention, on entend par « maintenir la synthèse des glycosaminoglycanes notamment des chondroïtines sulfates » empêcher une diminution du niveau de synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfate, par rapport au niveau de synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfate, détectée en l'absence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

Au sens de la présente invention, on entend par « augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes notamment des chondroïtines sulfates » une augmentation du niveau de synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates, préférentiellement d'au moins 10% en présence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait de graine d Hippophae rhamnoïdes, préférentiellement d'au moins 50 %, encore préférentiellement d'au moins 70% par rapport au niveau de synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfate détectée en l'absence d'un inhibiteur de Let-7b ou de l'extrait selon l'invention.

Selon un mode préférentiel de l'invention, l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes un extrait cosmétique, topiquement acceptable.

Selon un autre mode préférentiel de l'invention, l'inhibiteur de Let-7b est topiquement acceptable.

Au sens de la présente invention, on entend par « topiquement acceptable », un ingrédient adapté à une application par voie topique, non toxique, non irritant pour la peau saine, notamment le cuir chevelu sain, et/ou les muqueuses saines, n'induisant pas de réponse allergique, qui n'est pas instable sur le plan chimique.

L'inhibiteur de Let-7b ou l'extrait selon l'invention est appliqué sur une peau saine pouvant être tout ou partie de la peau saine, et/ou muqueuses saines du corps et/ou du visage et/ou du cuir chevelu, préférentiellement les jambes, les cuisses, les bras, le ventre, le décolleté, le cou, les aisselles, encore préférentiellement tout ou partie du visage, préférentiellement au niveau des joues et/ou de la zone angulaire du visage (communément appelée arrondi du visage ou V du visage).

L'inhibiteur de Let-7b ou l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes peut être utilisé seul en tant qu'ingrédient actif cosmétique et/ou nutraceutique ou compris dans une composition cosmétique et/ou nutraceutique.

Lorsqu'il est utilisé seul sous forme d'ingrédient actif, l'extrait selon l'invention est préférentiellement sous forme de poudre et dissout dans un solvant notamment polaire, tel que l'eau, un alcool, un polyol, un glycol, ou un de leurs mélanges, en présence ou non de glycérine. Dans un mode particulier de l'invention, l'extrait selon l'invention est mélangé à la maltodextrine. Dans ce cas, la maltodextrine permet d'obtenir un ingrédient cosmétique et/ou nutraceutique non hygroscopique.

Avantageusement une quantité d'au moins 20 % (p/p) en poids par rapport au poids total de l'extrait et de la maltodextrine, préférentiellement d'au moins 50 % (p/p), encore préférentiellement d'au moins 70 % (p/p) en poids de maltodextrine, est alors ajoutée à l'extrait. L'extrait peut être ensuite concentré par évaporation du solvant ou séché par exemple par lyophilisation ou par atomisation. Préférentiellement, l'extrait est séché par atomisation.

Avantageusement dans ce cas, l'ingrédient cosmétique est tel que décrit dans l'exemple 6.

La présente invention a également pour objet l'utilisation cosmétique de l'extrait selon l'invention par voie topique sur la peau saine, notamment le cuir chevelu, et/ou les muqueuses dans une composition cosmétique comprenant au moins un excipient cosmétiquement acceptable.

La présente invention à également pour objet l'utilisation de l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdesdans une composition cosmétique et/ou nutraceutique comprenant au moins un excipient cosmétiquement acceptable, et dans laquelle l'extrait est présent à une concentration de lxl0^_4% à 10% (p/v) en poids d'extrait selon l'invention par rapport au volume total de la composition, préférentiellement de lxl0^_4% à 5% (p/v), encore avantageusement de lxl0^_3% à 0,5% (p/v) en poids d'extrait selon l'invention par rapport au volume total de la composition.

Dans un mode particulier de l'invention, la composition cosmétique contient 0,2% (p/v) en poids d'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes par rapport au volume total de la composition.

Préférentiellement, l'extrait est utilisé dans une composition telle que décrite dans l'exemple 7.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'extrait est utilisé dans une composition cosmétique et/ou nutraceutique pour inhiber l'expression de Let-7b et/ou pour maintenir et/ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines en particulier pour maintenir et/ou d'améliorer la fermeté et/ou l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment du derme sain, et/ou pour maintenir ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire, pour maintenir ou augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques, et/ou pour maintenir ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.

Selon l'invention, la composition cosmétique peut comprendre en outre un véhicule cosmétiquement acceptable. Par « véhicule cosmétiquement acceptable », on entend un véhicule adapté pour une utilisation en contact avec des cellules humaines cutanées, en particulier les cellules de l'épiderme, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaire, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable. Il peut s'agir par exemple de maltodextrine.

La composition selon l'invention peut être administrée par voie topique et/ou par voie orale. Avantageusement, elle est administrée par voie topique.

La composition cosmétique peut en outre renfermer un ou plusieurs excipients cosmétiquement acceptables choisis parmi des agents tensioactifs et/ou émulsifiants, des conservateurs, des agents tampons, des agents chélatants, des dénaturants, des agents opacifiants, des ajusteurs de pH, des agents réducteurs, des agents stabilisants, des épaississants, des gélifiants, des polymères filmogènes, des charges, des agents matifiants, des agents de brillance, des pigments, des colorants, des parfums, et leurs mélanges. Le PCPC (Personal Care Products Council) décrit différents excipients cosmétiques adaptés à une utilisation dans la présente invention.

Avantageusement, le ou les excipients sont choisis dans le groupe comprenant les polyglycérols, les esters, les polymères et dérivés de cellulose, les dérivés de lanoline, les phospholipides, les lactoferrines, les lactoperoxidases, les stabilisants à base de sucrose, la vitamine E et ses dérivés, les gommes de xanthane, les cires naturelles et synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides, les insaponifiables, les phytostérols, les silicones, les hydrolysats de protéines, les bétaïnes, les aminoxides, les extraits de plantes, les esters de saccharose, les dioxydes de titane, les glycines, et les parabènes, et encore de préférence parmi le groupe comprenant le stéareth2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryle éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylparabène, l'éthylparabène, le propylparabène, le butylparabène, le butylène glycol, le caprylyl glycol, les tocophérols naturels, la glycérine, le dihydroxycetyl sodium phosphate, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, la triisononanoine, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l'isoparaffine, le laureth-7, un carbomère, le propylène glycol, l'hexylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, le PEG 30-dipolyhydroxystérate, les triglycérides caprique/caprylique, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépins de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, l'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'acide citrique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, l'isostéaryl isostéarate, le dipélargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8, la cire d'abeille, les glycérides d'huile de coeur de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de sésame, le cétyl lactate, le lanoline alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de titane, le lactose, le saccharose, le polyéthylène basse densité, une solution isotonique salée, et leurs mélanges.

La composition cosmétique selon l'invention peut être choisie parmi une solution aqueuse, une crème ou un gel aqueux notamment un gel douche, un lait, une émulsion, une microémulsion ou une nano émulsion, notamment huile-dans-eau ou eau-dans huile ou multiple ou siliconée, un masque, un sérum, une lotion, un savon liquide, une pommade, une mousse, un patch, préférentiellement une crème, un lait, une émulsion, un masque, un sérum.

La composition utilisée selon l'invention peut en outre contenir des ingrédients actifs cosmétiques conduisant à un effet complémentaire ou synergique tels que des actifs anti-âges. On citera parmi ces actifs des actifs stimulant la synthèse des macromolécules du derme ou empêchant leur dégradation, des agents stimulant la prolifération des kératinocytes, des agents apaisants, hydratants, ou encore des agents actifs sur la régulation de la taille des pores et/ou leur ouverture.

Parmi les actifs anti-âges, on peut citer :

- un agent stimulant la synthèse de fibronectine, en particulier un extrait de maïs, un tel extrait étant notamment commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Deliner™ et le palmitoyl pentapeptide commercialisé par la société SEDERMA sous la dénomination commerciale Matrixyl® ;

- un agent stimulant la formation des fibres de collagène comme un extrait d'Origanum majorana commercialisé sous le nom Dermagenist™ par la demanderesse.

- un agent stimulant l'expression du perlécane et du dystoglycane dans la matrice extracellulaire et/ou dans la membrane basale épithéliale comme par exemple un extrait de Polygonum bistorta commercialisé sous le nom Perlaura™ par BASF Beauty Care Solutions France.

- un agent de protection du facteur de croissance des fibroblastes (FGF2) de la matrice extracellulaire contre sa dégradation et/ou sa dénaturation, notamment un extrait d’Hibiscus Abelmoscus tel que décrit dans la demande de brevet au nom de la BASF Beauty Care Solutions France déposée sous le numéro FR0654316 et commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Linefactor ™ et/ou un agent de stimulation de croissance des fibroblastes par exemple un extrait de soja fermenté contenant des peptides, connu sous le nom de Phytokine™ commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France et également décrit dans la demande de brevet EP1119344B1 (Laboratoires Expanscience), et préférentiellement une combinaison de ces deux extraits ;

- un agent stimulant la synthèse de laminine, en particulier un extrait de malt modifié par biotechnologie, un tel extrait étant notamment commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Basaline™ ;

- un agent stimulant l'expression et/ou l'activité de la Hyaluronane synthase 2 (HAS2) tels que les extraits végétaux décrits dans la demande de brevet FR2 893 252 Al et en particulier un extrait aqueux de Galanga (Alpinia galanga) et commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Hyalufix™ ;

- un agent stimulant la synthèse de lysyl oxydase like (LOXL) tel qu'un extrait de Geophila cordifolia et ceux décrits dans la demande de brevet FR2855968, et en particulier un extrait d'aneth et commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Lys'lastine ™ ;

- un agent stimulant la synthèse d'ATP intracellulaire, notamment un extrait d'algue Laminaria digitata commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom de Seanergilium™;

- un actif stimulant la synthèse des glycosaminoglycanes, tels que le produit de fermentation du lait ;

- un actif stimulateur de collagène tel que le rétinol et/ou la vitamine C ;

- un actif inhibiteur des métalloprotéinases (MMP) telles que plus particulièrement les MMP 1, 2, 3, 9 tel que les rétinoïdes et dérivés, les oligopeptides et les lipopeptides, les lipoaminoacides, l'extrait de feuilles d'Argania spinosa commercialisé par BASF Beauty Care solutions France SAS sous le nom Arganyl™ ; le lycopène ; les isoflavones, la quercetine, le kaempferol, l'apigénine.

- un agent pour augmenter l'expression de LOX pour augmenter l'architecture de l'épiderme comme par exemple un extrait de Cichorium intybus commercialisé sous le nom de LOX-AGE™ par BASF Beauty Care Solutions France.

- un agent pour augmenter la déglycation du collagène et/ou augmenter l'expression du collagène de type I tel qu'une combinaison d'un extrait de feuilles de Salvia miltiorrhiza et de niacine commercialisée par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Coll Repair™.

- un agent stimulant la synthèse de lumican et de collagène tel qu'un tétrapeptide synthétique acetyl Gin Asp Val His commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Dermican™et décrit dans la demande de brevet W02005120554A1.

- un agent de protection et de stimulation de l'élastine, du collagène comme l'extrait de feuilles de Manilkara multinervis commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Elestan™ et l'extrait de racine de Eperua falcata commercialisé par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Eperuline™

Comme agents apaisants préférentiellement utilisables dans la composition selon l’invention, on peut citer : les triterpènes pentacycliques, l’acide ursolique et ses sels, l’acide oléanolique et ses sels, l’acide bétulinique et ses sels, les sels de l’acide salicylique et en particulier le salicylate de zinc, le bisabolol, l’allantoïne, les huiles insaturées en oméga 3, la cortisone, l’hydrocortisone, l'indométhacine et la beta méthasone, les actifs anti-inflammatoires, et notamment ceux décrits dans la demande FR2847267, en particulier l'extrait de racine de Pueraria lobata commercialisé sous le nom Inhipase® par BASF Beauty Care Solutions France SAS, les extraits de Theobroma cacao.

Parmi les agents actifs sur la régulation de la taille des pores et/ou leur ouverture, on citera à titre d'exemple un extrait de Cichorium intybus commercialisé sous le nom de LOX-AGE™ par BASF Beauty Care Solutions France et/ou sur la production de sébum, on citera à titre d'exemple la sarcosine synthétique commercialisée sous le nom de Mat-XS™ Clinical et/ou un extrait d'Orthosiphon stamineus tel que décrit dans la demande de brevet W02010063674 au nom de

BASF Beauty Care Solutions France et commercialisé sous le nom MAT XS™ Bright.

Comme agents hydratants préférentiellement utilisables dans la composition selon l’invention, on peut citer : une combinaison de pullulan, de hyaluronate de sodium et d'alginate de sodium tel que celle commercialisée par BASF Beauty Care Solutions France sous le nom Patch20™.

D’autres buts, caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront clairement à l’homme de l’art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d’illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l’invention.

Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l’invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale.

D’autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

Exemple 1 : Préparation de l'extrait aqueux de graine d Hippophae rhamnoïdes se\ox\ l'invention.

Exemple la^ Extraction aqueuse de graine d'Hioooohae rhamnoïdesse\ox\ l'invention

Une quantité de 20% en poids de graines de Hippophae rhamnoïdes par rapport au poids total de graines et d'eau a été broyée au robot broyeur puis homogénéisée quelques secondes à l'aide d'un homogénéisateur avant d'être extraite dans l'eau comme unique solvant à température ambiante durant une période de 2 heures. L'extrait a ensuite été centrifugé et le culot éliminé. L'extrait obtenu est ensuite filtré sur des filtres de 0,1 - 0,3 micromètres puis lyophilisé.

Exemple lb) Extraction suoercritiaue de graine d'HioDoohae rhamnoïdes selon l'invention

Une quantité de 10% en poids de graine d Hippophae rhamnoïdes a été broyée au robot broyeur avant d'être extrait par extraction supercritique au dioxyde de carbone à 60 bars, 30°C pendant 80 minutes.

Le coproduit de l'extraction supercritique au dioxyde de carbone d Hippophae rhamnoïdes a été introduit dans de l'eau osmosée lh à 80°C +/-2°C sous agitation et le pH a été ajusté à 5,4 +/0,2. Le mélange a ensuite été laissé à refroidir jusqu'à 23°C +/-3°C. L'extrait a ensuite été grossièrement tamisé puis centrifugé et le surnageant a été éliminé. Enfin, l'extrait fut filtré jusqu'à 0,1 - 0,3 micromètres. Une quantité de 60% à 80% (p/p) de maltodextrine par rapport au poids total du mélange, fut ajouté. L'extrait obtenu a ensuite été à nouveau filtré puis atomisé à une température de 180°C.

Exemple 2 : Détermination des protéines cibles de Let-7b,

La variation de concentration des cinq protéines identifiées comme potentiellement régulées par Let-7b ont été mesurées par Western Blot au travers d'une expérience de gain-perte de fonction.

Les protéines totales furent extraites 72 heures et 96 heures après la transfection d'ARN de synthèse complémentaire de Let-7b (ref 4100945-101, EXIQON, ACCACACAACCTACTACCTC (SEQ ID No : 2)) inhibant son activité et d'ARN de synthèse ayant la même séquence que Let-7b (ref 470775-001, EXIQON, TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT (SEQ ID No : 1)) mimant son activité dans le fibroblaste primaire (obtenu par biopsie sur sujet femme, 47 ans).

10pg de protéine ont été séparées sur gel d'acrylamide (NuPAGE Novex 4-12% BBos-Tris gel ®Invitrogen®) et transférées sur membrane de nicocellulose (GE Amersham®). Les protéines furent spécifiquement détectées à l'aide d'anticorps primaires (anti-XYLTl, anti-CHSY3 et antiTGFBR2 de Santa Cruz Biotechnology®, anti-FBNl de Thermofisher technologies® et anti-ITGB3 de Cell signaling technology®). Le contrôle fut réalisé à l'aide d'un anticorps anti HRP-b-actine (Sigma®). L'intensité du signal obtenu pour chaque bande fut mesurée grâce à un logiciel de traitement de donnée (ImageJ® - Gel analyzer algorithm).

Protéine	Expression de la protéine normalisée dans le fibroblaste contrôle	Taux relatif d'expression de la protéine dans le fibroblaste transfecté avec un inhibiteur de Let-7b par rapport au fibroblaste contrôle.
FBN1	1	+ 70%
XYLT1	1	+ 190%
TGFBR2	1	+ 110%
Actine	1	1

Tableau 1 : Analyse des résultats des Western Blot réa isés avec ou sans transfection d'un 10 inhibiteur de Let-7b.

Protéine	Expression de la protéine	Taux relatif d'expression de la protéine dans le fibroblaste transfecté avec un ARN mimant l'activité de Let-7b par rapport au fibroblaste contrôle.
normalisée fibroblaste cont	dans :rôle	le
ITGB3	1	- 80%
CHSY3	1	- 58%
Actine	1	1

Tableau 2 : Analyse des résultats des Western Blot réalisés avec ou sans transfection d'un ARN mimant l'activité de Let-7b .

Conclusion

Le miARN Let-7b a une influence négative sur la synthèse de FBN1, XYLT1, TGFBR2, ITGB3 et CHSY3, en particulier sur XYLT1 et CHSY3.

Exemple 3 : Quantification de Let-7b en présence ou non de substance potentiellement active.

3.1 Culture

Des fibroblastes issus de dermes sains ont été isolés par trypsination (abdomen, femme entre 53 et 68 ans) et cultivés en milieu DMEM® (Dubecco's Modified Eagle Medium® - Life Technologie®) contenant 10% (v/v) de sérum de veau fœtal et d'antibiotiques, puis incubés à 37°C en présence de 5% (v/v) de CO2 pendant 24 heures. Les cellules furent ensuite mises en présence ou non de la substance potentiellement active à deux concentrations différentes, 0,003% (p/v) et 0,02% (p/v) en poids d'extrait selon l'invention par rapport au volume total du milieu de culture, pendant 48h sans sérum de veau fœtal et en présence de 5% de CO2.

3.2 Quantification

Les ARN totaux ont été extraits des différentes cultures (cultures réalisées telles que présenté dans l'exemple 3.1, en présence ou non de la substance active telle que présentée dans l'exemple lb) en utilisant un kit d'isolement d'acides nucléiques (NucléoSpin miRNA® - Marcherey-Nagel®) avec séparation physique entre les ARN longs et courts. La mesure de densité optique à 260nm et 280nm permet ensuite la validation de la qualité et de la quantité d'ARN.

Suite à cela, l'étape de transcription inverse a été réalisée sur lpg d'ARN courts provenant de différentes conditions testées dans un volume final de 20pL à l'aide d'un kit de transcription inverse (miScript II RT kit®, Qiagen®). Le mélange réactionnel fut incubé pendant une heure à 37°, puis les enzymes de reverse transcription ont été inactivées par augmentation de la température jusqu'à 95°C pendant 5 minutes et le mélange réactionnel est conservé à -20°C jusqu'à l'analyse par PCR quantitative.

L'étape de PCR quantitative a été réalisée à l'aide de trois types d'amorces (présentées dans le tableau ci-dessous). La première permet l'amplification des miARN Let-7b et les deux suivantes servent à l'amplification de petits ARN nucléaires afin d'élaborer des courbes de calibration par méthode des delta-delta-Ct. Cette étape est réalisée dans lpL de mélange réactionnel de transcription inverse diluée à 1/250 en utilisant des oligonucléotides spécifiques et un kit de quantification PCR dans un thermocycleur (LightCycler® 480 Roche®). Chaque essai est réalisé en double exemplaire. La fluorescence du SYBR Green contenu dans le kit est mesurée après chaque cycle d'amplification. Les courbes de fusions sont réalisées à la suite de chaque qPCR.

Amorce sens hsa-let-7b-5p TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT SEQ ID NO: 3

Amorce sens snoRNA U6 ATGTTATGATGATGGGCGAAATGT SEQ ID NO: 4

Amorce sens snRNA U1A TTACCTGGCAGGGGAGATAC SEQ ID NO: 5

Amorce antisens poly T I I I I I I I I I I I I I I I SEQ ID NO: 6

	Contrôle non traité	Extrait aqueux de graine üHippophae rhamnoïdes 0,003% (p/v) dans le milieu	Extrait aqueux de graine ü'Hippophae rhamnoïdes 0,02% (p/v) dans le milieu
Quantité de Let-7b vs non traité (en %)	100	82	61
Erreur type	0	6	11
P value		0,047	0,028

Tableau 3 : Diminution de la concentration de Let-7b dans le fibroblaste humain en présence de l'extrait selon l'invention.

Conclusion

Les extraits selon l'invention induisent une diminution de l'expression de Let-7b de 18% et de 39% pour des concentrations respectives à 0,003% (p/v) et 0,02%(p/v) en poids d'extrait selon l'invention par rapport au volume total de la composition dans le milieu, par rapport au contrôle non traité.

Exemple 4 : Evaluation in vitro de l'amélioration des propriétés biomécaniaues du derme.

La densité et la fermeté du derme sont mesurées grâce au test d'indentation à basse pression et relaxation sur équivalent dermique.

L'équivalent dermique utilisé correspond à la technologie Mimederm® de la Demanderesse. Pour sa fabrication, 500 000 cellules/cm2 de fibroblastes primaires humain (derme du sein, donneur femme 18 ans) ont été ensemencées sur une éponge de collagène (Mimedisk® de la Demanderesse) en milieu DMEM/HAM F12 (Life Technologies®) supplémentée avec 20% de sérum de veau fœtal. Le milieu de culture a été changé tous les jours avec 50pg/mL d'acide ascorbique. A partir du 3^ème jour de culture, les dermes furent traités ou non avec 0,02% (p/v) de l'extrait aqueux de graine dHippophae rhamnoïdes selon l'exemple lb), en poids d'extrait selon l'invention par rapport au volume total de la composition. La culture des équivalents dermiques traités et non traités furent arrêtée au bout de 28 jours.

Le test d'indentation à basse pression et relaxation a ensuite été réalisé sur les équivalents dermiques ainsi obtenus. Le test fut répété trois fois pour chaque échantillon à profondeur de pénétration constante (lOOpm), le déplacement est appliqué à vitesse d'indentation constante (δ¹Α 50 pm/s pendant 120 secondes). Les données sont collectées à un taux d'échantillonnage de 1kHz.

L'indenteur utilisé est un indenteur sphérique PTFE, avec un rayon de courbure R¹/4l,6 mm. Les essais furent effectués dans une pièce climatisée à température contrôlée de 22 à 24 °C et une humidité relative d'environ 30% à 40 %.

Conclusion

Suite au traitement, la Demanderesse a constaté que l'extrait selon l'invention induit une augmentation de 14% du module d'Young par rapport au contrôle non traité (p=0,06), ce qui démontre que l'extrait entraîne une augmentation des propriétés biomécaniques du derme.

Exemple 5 : Etude in y/Vo sur volontaire humain.

Une étude sur volontaire humain a été réalisée afin de tester l'efficacité d'une formulation, contenant 0,2% (p/v) de l'extrait décrite dans l'exemple lb, vis-à-vis des signes majeurs de la perte des propriétés biomécaniques du derme, notamment de l'affaissement de la peau.

1. Protocole de l'étude.

TJ femme caucasienne, âgées de 55 à 70 ans, présentant une perte de fermeté et d'élasticité de peau ont été soumises à un test en double aveugle randomisé comprenant l'application deux fois par jour pendant 56 jours de la formulation décrite dans l'exemple sur la moitié du visage et d'un placébo sur l'autre moitié. Les résultats furent mesurés au début du traitement (D0), au bout de 28 jours (D28) et au bout de 56 jours (D56) sous contrôle dermatologique.

2. Etude des variations de la densité et de l'élasticité du derme

Les variations de la densité et de l'élasticité du derme furent mesurées à l'aide d'un scanner ultrason à haute résolution (Dub SkinScanner - TPM, 22Mhz) mesurant le facteur de densité hyperéchogène, correspondant au pourcentage de pixel mesuré ayant une intensité forte (entre 200 et 255).

Conclusion

La Demanderesse a observé que l'extrait selon l'invention entraînait une augmentation du facteur 5 de densité hyperéchogène significatif d'environ 26% par rapport au placébo après 56 jours d'application.

3. Etude des variations de la fermeté de la peau

Les variations de fermeté de la peau furent mesurées au niveau de l'angle inférieur du visage à l'aide d'un dispositif permettant la mesure de la fermeté de la peau du type SkinFibroMeter® (DelfinTechnologies®). Une augmentation de ce facteur correspond à une augmentation de la fermeté du derme.

Conclusion

La Demanderesse a observé que l'extrait selon l'invention entraînait une augmentation de la fermeté de la peau des joues significative d'environ 18,5% par rapport au placébo après 56 jours d'application, ce qui signifie que la composition comprenant l'extrait selon l'invention a augmenté la densité et l'élasticité du derme.

Exemple 6 : Ingrédient cosmétique comprenant un extrait aqueux de graine à'Hipoophae rhamnoïdes.

Extrait aqueux de graine dHippophae rhamnoïdes obtenu selon l'exemple lb)	30% en poids
Maltodextrine	70% en poids

Exemple 7 : Composition cosmétique comprenant un extrait aqueux de graine d'Hipppphae rhamnoïdes.

On procède selon les méthodes connues de l'homme du métier pour mélanger ensemble les différentes phases A, B, C, D ci-dessous pour préparer une composition selon la présente invention. Les proportions sont exprimées en %.

Phase A

Propylheptyl caprylate 4,00

Dicaprylyl carbonate 4,00

Sodium polyacrylate 0,70

Phase B

Eau 69,55

Propylène glycol, phénoxyéthanol, chlorphénésine, méthylparabène 2,50

Glycérine, glyceryl polyacrylate 10,00

Butylène glycol 5,00

Disodium EDTA 0,05

Phase C

Gomme de sclerotium 2,00

Phase D

Ingrédient cosmétique selon l'exemple 6 Eau

Claims (9)

1. 2,00

   Revendications

   1. Utilisation cosmétique et/ou nutraceutique d'un extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdespow inhiber l'expression de Let-7b dans la peau saine et/ou les muqueuses saines ou pour maintenir ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, notamment la fermeté, l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain.

   2. Utilisation selon la revendication 1, pour inhiber l'expression de Let-7b dans le derme sain et/ou les lames basales saines, notamment de la jonction dermoépidermtque saine, préférentiellement dans le derme sain.
2. 3. Utilisation selon l'une des-revendications 1 ou 2 pour inhiber l'expression de Let-7b dans les fibroblastes sains.
3. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour maintenir ou améliorer la qualité de l'organisation de la matrice extracellulaire, pour maintenir ou augmenter la quantité de molécules de la matrice extracellulaire organisées, notamment des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques, et/ou pour maintenir ou augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.
4. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l'extrait aqueux de graine d'Hippophae rhamnoïdes est obtenu par extraction aqueuse du coproduit de l'extraction supercritique au dioxyde de carbone de la graine d'Hippophae rhamnoïdes.
5. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'extraction aqueuse de la graine d'Hippophae rhamnoïdes est réalisée avec un solvant comprenant au moins 60% en poids, avantageusement au moins 70% en poids, en particulier au moins 80% en poids, plus particulièrement au moins 90% en poids, de façon particulière au moins 95% en poids, d’eau par rapport au poids total de la solution aqueuse.
6. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'extraction aqueuse de la graine d'Hippophae rhamnoïdese& réalisée avec de l'eau comme unique solvant.
7. 8. Utilisation d'un extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l'extrait d'Hippophae rhamnoides est présent dans une composition cosmétique et/ou nutraceutique comprenant au moins un excipient cosmétiquement acceptable, et dans laquelle l'extrait est présent à une concentration de IxlO^/o à 10% (p/v) en poids d'extrait selon l'invention par rapport au volume total de la composition, préférentiellement de ^10^-4% à 5% (p/v), encore avantageusement de lxî0'³% à

   0,5% (p/v) en poids d'extrait selon (Invention par rapport au volume total de la composition,
8. 9, Procédé de soin cosmétique comprenant l'application, préférentiellement par vote topique, d'un extrait aqueux de graine ù'Hippophae rhamnoïdes selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et/ou d'une composition cosmétique le comprenant, au niveau de la peau saine, notamment du cuir chevelu sain, et/ou des muqueuses saines, pour inhiber l'expression de Let-7b dans la peau saine et/ou des muqueuses saines ou pour maintenir ou améliorer les propriétés biomécaniques de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier pour maintenir ou améliorer la fermeté, l'élasticité et/ou la densité de la peau saine et/ou des muqueuses saines, en particulier du derme sain, de préférence pour maintenir ou améliorer la qualité de ('organisation de la matrice extracellulaire, pour maintenir ou améliorer {'organisation des fibres de collagène et/ou des fibres élastiques, et/ou pour augmenter la synthèse des glycosaminoglycanes, notamment des chondroïtines sulfates.
9. 10. Procédé de soin cosmétique selon la revendication 9, dans lequel l'application est effectuée sur tout ou partie saine du corps et/ou du visage et/ou du cuir chevelu, préférentiellement les jambes, les cuisses, les bras, le ventre, le décolleté, le cou, les aisselles, tout ou partie du visage, préférentiellement au niveau des joues et/ou de la zone angulaire du visage.

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