FR2916633A1 - Utilisation cosmetique d'un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1 - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé cosmétique de soin de la peau, destiné à prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition renfermant au moins un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1.Elle se rapporte également à l'utilisation cosmétique d'un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1 pour prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement.Enfin l'invention concerne également un extrait d'élémi ou de Canarium indicum L. ou de Canarium luzonicum ou de Canarium commune et une composition cosmétique contenant ledit extrait.

Description

Utilisation cosmétique d'un actif capable de stimuler l'expression de la

tensine 1

La présente invention concerne un procédé cosmétique de soin de la peau, destiné à prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition renfermant au moins un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1.

Le vieillissement cutané est défini par l'ensemble des altérations du revêtement cutané, résultant de l'accumulation au fil des ans de modifications progressives de ses différents constituants et de la désorganisation des structures existantes, en particulier au niveau du derme qui constitue le tissu de soutien de la peau.

On observe ainsi dans le derme une diminution des interactions transmembranaires entre les composants de la matrice extracellulaire, ou MEC (collagènes, élastine, glycosaminoglycanes et en particulier fibronectine) et le cytosquelette intracellulaire des fibroblastes, constitué de filaments d'actine. Ces interactions se font au niveau d'adhésions focales qui sont des complexes protéiques situés sur la membrane plasmique des fibroblastes. Ces complexes assurent la transmission de signaux bidirectionnels entre les compartiments intracellulaire et extracellulaire. Ils jouent un rôle essentiel dans la stabilisation de la forme des cellules et du noyau ; dans le maintien de l'organisation de la MEC; au niveau moléculaire, dans l'équilibre des forces de tenségrité et sur le fonctionnement biochimique de la cellule (D.

Ingber, Pour la science, 1998 ; Zamir E. et al., J. Cell Sci., 2001). Ces complexes comprennent principalement une intégrine intramembranaire a5(31 qui est le récepteur spécifique de la fibronectine de la MEC et est reliée directement à des protéines intracellulaires. La réduction des interactions précitées entraîne une désorganisation moléculaire au niveau des sites d'adhésion, une diminution des capacités prolifératives des fibroblastes, de leur activité métabolique (synthèse des composants de la MEC) et de leur capacité de migration (Sottile et al., Mol. Biot. Cell., 2002 ; Katz et al., Mol Bic) Cell, 2000). Ces dysfonctionnements sont responsables des modifications des propriétés biomécaniques de la peau et en particulier du relâchement cutané qui est l'un des principaux signes fonctionnels du vieillissement cutané. Pour lutter contre le relâchement cutané, il a été proposé dans l'art différents ingrédients cosmétiques permettant de stimuler la prolifération des fibroblastes, tels que des protéines de soja, ou d'augmenter la synthèse de collagène, d'élastine et/ou de glycosaminoglycanes, tels que l'acide ascorbique et ses dérivés ou encore de relâcher les muscles faciaux responsables des rides et des ridules d'expression par l'injection de toxine botulique. En dépit de leur intérêt, ces solutions ne sont pas totalement satisfaisantes, dans la mesure où elles ne permettent pas de traiter à la source, et par conséquent à long terme, le problème du relâchement cutané. Pour maintenir l'activité métabolique cellulaire dans le derme et la synthèse des constituants de la MEC sur le long terme, il serait souhaitable de pouvoir assurer le maintien d'une bonne rigidité et d'une bonne organisation de la MEC et des interactions entre les fibroblastes et leur matrice environnante.

La tensine 1 est une phosphoprotéine qui se lie aux filaments d'actine du cytosquelette des cellules et à la matrice extracellulaire, au niveau des adhésions focales précitées (Chen et al., PNAS, 2001 ; Takahara et al . , J.

Histochem. Cytochem., 2004) et précisément de la partie intracellulaire de l'intégrine a5131. Dans des tissus conjonctifs ainsi que dans le derme, la tensine 1 est connue pour permettre le déplacement des intégrines le long de la membrane cellulaire et leur regroupement, entraînant ainsi la fibronectine associée à ces intégrines et modifiant la conformation des molécules de fibronectine de façon à favoriser leur polymérisation (Pankov et al., J. Cell. Biot., 2000), la fibronectine jouant elle-même un rôle critique dans la composition et la stabilité de la matrice extracellulaire et en particulier dans le maintien du collagène I sous forme de fibrilles. La Demanderesse a mis en évidence pour la première fois que la tensine 1 est une protéine clé dans le processus à.e mise sous tension des cellules du derme (fibroblastes) et au niveau de l'activité cellulaire pour l'augmentation de la fermeté et pour la prévention et/ou la lutte contre le relâchement cutané résultant du processus de vieillissement dermique.

La Demanderesse a en outre mis en évidence une diminution de l'expression de la tensine 1 au cours du vieillissement, conduisant à une désorganisation de la MEC, en particulier de la fibronectine, et résultant en un relâchement du derme. Elle a en outre démontré que la contraction du derme était considérablement réduite en l'absence de tensine. Il lui est donc apparu que l'utilisation dans des compositions cosmétiques d'actifs capables de stimuler la tensine 1 pourrait permettre de lutter contre le relâchement cutané observé au cours du vieillissement.

La Demanderesse a enfin eu le mérite de mettre au point un test de criblage permettant de sélectionner des actifs biologiques, et en particulier des extraits botaniques, tels que des extraits non huileux de plantes du genre Canarium, susceptibles d'agir par voie topique sur la tensine 1 pour stimuler son expression.

Des extraits huileux de Canarium sont déjà connus comme agents anti-inflammatoires pour lutter contre les rides et la perte de fermeté de la peau (WO 2005/053718). Il n'a toutefois encore jamais été suggéré, à la connaissance de la Demanderesse, que des extraits non huileux de Canarium pouvaient présenter un effet cosmétique anti-âge, en particulier par stimulation de l'expression de la tensine 1.

La présente invention a par conséquent pour objet un procédé cosmétique de soin de la peau, destiné à prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition renfermant au moins un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1.

La présente invention a également pour objet l'utilisation cosmétique d'un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1 pour prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement.

En préambule, il est précisé que par "actif capable 5 de stimuler l'expression de la tensine 1", on entend un composé ou (notamment dans le cas d'un extrait botanique) un mélange de composés susceptible(s) de stimuler l'expression de la tensine 1 par rapport à un témoin non traité, déterminée en particulier à l'aide de la méthode décrite à l'Exemple 1 ci-après, c'est-à-dire par immunofluorescence sur culture de fibroblastes supplémentés en TGF13. Préférentiellement, l'augmentation du marquage par rapport au témoin est d'au moins 20%.

Les actifs utilisables selon l'invention sont avantageusement des extraits botaniques, c'est-à-dire des actifs obtenus par extraction à l'aide de tout type de solvant de toute partie d'une plante telle que l'écorce, le bois, les rhizomes, les tiges, les feuilles ou les fleurs, les exsudats tels que les gommes-résines, les gommes-oléorésines, par exemple. Des exemples de tels actifs comprennent des extraits (en particulier de résine ou gomme) d'élémi, c'est-à-dire de Canarium indicum L (ou Canarium commune L) ou de Canarium luzonicum.

Ces actifs peuvent par exemple être obtenus selon un procédé comprenant : a) l'hydrodistillation de la gomme ou de la résine de la plante, b) l'élimination des huiles essentielles, c) l'extraction des résidus d'hydrodistillation à l'aide d'un solvant organique polaire autre que l'eau ayant un indice de polarité supérieur à 3,5, tel qu'un alcool, notamment le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol.Dans tous les cas, l'extraction peut être réalisée sur tout ou partie de la plante considérée, qui peut être broyée ou réduite en morceaux de manière usuelle. L'extraction est généralement réalisée en immergeant ou en agitant doucement le broyat dans un ou plusieurs des solvants cités ci-dessus à des températures allant, par exemple, de la température ambiante à 100 C, pendant une durée d'environ 30 min à 12 h. La solution est alors de préférence filtrée afin d'éliminer les substances insolubles de la plante. On élimine également, le cas échéant, le solvant s'il s'agit d'un solvant volatil tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol.

Cette étape d'extraction est usuelle dans le domaine des extraits de plantes, et l'homme du métier est à même d'en ajuster 1es paramètres réactionnels, sur la base de ses connaissances générales.

A la connaissance de la Demanderesse, ce procédé conduit toutefois à un nouveau produit lorsqu'il est appliqué à l'élémi. L'invention a donc également pour objet un extrait d'élémi ou de Canarium indicum L. ou de Canarium luzonicum ou de Canarium commune, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu selon le procédé décrit ci-dessus.

Elle a encore pour objet une composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un milieu cosmétiquement acceptable, au moins un tel extrait.

L'actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1 peut être utilisé à raison de 0.00001 à 5 % en poids, de préférence à raison de 0.0001 à 0.1 % en poids, et plus préférentiellement à raison de 0.001 à 0.3 en poids, par rapport au poids total de la composition.

Les signes cutanés du vieillissement visés dans la présente invention peuvent être des signes de vieillissement chronologique (intrinsèque) ou actinique (photo-vieillissement). L'invention vise plus particulièrement à prévenir et/ou traiter les signes cutanés liés au ralentissement de la production et/ou à la dégradation et/ou à la désorganisation du collagène, tels que la formation de rides et ridules, la perte de fermeté de la peau et/ou l'atrophie dermique. Le procédé selon l'invention est plus particulièrement destiné à prévenir et/ou lutter contre le relâchement cutané.

De façon préférée, l'actif utilisé selon l'invention, ou la composition mise en œuvre dans le procédé selon l'invention, sont appliqués sur une peau humaine, en particulier sur une peau âgée, plus particulièrement sur la peau de femmes ménopausées et/ou de plus de 50 ans, voire de plus de 60 ans.

La composition renfermant cet actif peut être appliquée le matin et/ou le soir, de préférence le soir, sur l'ensemble du visage, du cou et éventuellement du décolleté voire du corps.

La composition mise en oeuvre selon l'invention comprend généralement, outre l'actif décrit précédemment, un milieu physiologiquement acceptable et de préférence cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort (rougeurs, tiraillements, picotements...) inacceptables pour l'utilisateur.

Ce milieu contient généralement de l'eau.

La composition utilisée selon l'invention peut se présenter sous toute forme adaptée à une application topique sur la peau et en particulier sous forme d'émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou multiple (E/H/E ou H/E/H), qui peuvent éventuellement être des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme d'hydrodispersion, de solution, de gel aqueux ou de poudre. On préfère que cette composition se présente sous la forme d'une émulsion huile-dans-eau.

Cette composition est de préférence utilisée en tant que produit de soin ou de nettoyage de la peau du visage et/ou du corps et elle peut se présenter notamment sous forme de fluide, de gel ou de mousse, conditionnés par exemple dans un flacon-pompe, un aérosol ou un tube, ou de crème conditionnée par exemple dans un pot. En variante, elle peut avoir la forme d'un produit de maquillage et en particulier d'un fond de teint ou d'une poudre libre oa compacte.

Elle peut contenir différents adjuvants, tels qu'au moins un composé choisi parmi :

- les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi : les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles, telles que les polydiméthylsiloxanes (dimethicones), les polyalkylcyclosiloxanes (cyclomethicones) et les polyalkylphenylsiloxanes (phenyldimethicones); les huiles synthétiques telles que les huiles fluorées, les alkyl benzoates et les hydrocarbures ramifiés tels que le polyisobutylène; les huiles végétales et notamment de soja ou de jojoba; et les huiles minérales telles que l'huile de paraffine; les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba; - les élastomères de silicone obtenus notamment par réaction, en présence d'un catalyseur, d'un polysiloxane ayant au moins un groupe réactif (hydrogène ou vinyle, notamment) et portant au moins un groupe alkyle (notamment méthyle) ou phényle, terminal e-:/ou latéral, avec un organosilicone tel qu'un organohydrogenpolysiloxane; les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, et en particulier les esters d'acides gras et de polyols tel que les esters d'acides gras et de glycérol, les esters d'acides gras et de sorbitan, les esters d'acides gras et de polyéthylèneglycol et les esters d'acides gras et de sucrose; les éthers d'alcools gras et de polyéthylèneglycol; les alkylpolyglucosides; les polysiloxanes modifiés polyéthers; la bétaïne et ses dérivés; les polyquaterniums; les sels de sulfate d'alcools gras éthoxylés; les sulfosuccinates; les sarcosinates; les alkyl- et dialkylphosphates et leurs sels; et les savons d'acides gras; - les co-tensioactifs tels que les alcools gras linéaires et en particulier les alcools cétylique et stéarylique; - les épaississants et/ou gélifiants, et en particulier les homo- et copolymères réticulés ou non, hydrophiles ou amphiphiles, d'acide acrylamidométhylpropane sulfonique (AMPS) et/ou d'acrylamide et/ou d'acide acrylique et/ou de sels ou d'esters d'acide acrylique; la gomme de xanthane ou de guar; les dérivés cellulosiques; et les gommes de silicone (dimethiconol); - les humectants, tels que les polyols, dont la glycérine, le propylène glycol et les sucres, et les glycosaminoglycanes tels que l'acide hyaluronique et ses sels et esters; les filtres organiques, tels que les dérivés de dibenzoylméthane (dont le butyl methoxydibenzoylmethane), les dérivés d'acide cinnamique (dont l'ethylhexyl methoxycinnamate), les salicylates, les acides para-aminobenzoïques, les 13- 3'-diphénylacrylates, les benzophénones, les dérivés de benzylidène camphre, les phénylbenzimidazoles, les triazines, les phénylbenzotriazoles et les dérivés anthraniliques; les filtres inorganiques, à base d'oxydes minéraux sous forme de pigments ou de nanopigments, enrobés ou non, et en particulier à base de dioxyde de titane ou d'oxyde de zinc; les colorants; les conservateurs; - les charges, et en particulier les poudres à effet soft-focus, qui peuvent être notamment choisies parmi les polyamides, la silice, le talc, le mica, les fibres (notamment de polyamide ou de cellulose); - les tenseurs, et en particulier les protéines végétales, les latex synthétiques (notamment acryliques) et les dispersions colloïdales de charges inorganiques; - les séquestrants tels que les sels d'EDTA; - les parfums; - et leurs mélanges, sans que cette liste ne soit limitative.

Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Sème Edition, 2002).

La composition utilisée selon l'invention peut en outre comprendre d'autres actifs que celui stimulant l'expression de la tensine 1, et en particulier au moins un actif choisi parmi les agents stimulant la production de facteurs de croissance; les agents antiglycation ou déglycants; les agents augmentant la synthèse de collagène ou prévenant sa dégradation (agents anti-collagénases, notamment inhibiteurs de métalloprotéinases matricielles); les agents augmentant la synthèse d'élastine ou prévenant sa dégradation (agents anti--élastases); les agents augmentant la synthèse de g:Lycosaminoglycanes ou de protéoglycanes ou prévenant leur dégradation (agents antiprotéoglycanases); les agents stimulant la synthèse d'intégrines par les fibroblastes ; les agents augmentant la prolifération ou la différenciation des kératinocytes; les agents augmentant la prolifération des fibloblastes; les agents dépigmentants ou anti-pigmentants; les agents anti-oxydants ou anti-radicalaires ou anti-pollution; les agents augmentant la synthèse de lipides épidermiques; et leurs mélanges, sans que cette liste ne soit limitative.

Des exemples de tels agents sont notamment : les extraits de plantes et en particulier les extraits de Chondrus crispus, de Thermus thermophilus, de Pisum sativum, de Centella asiatica, de Scenedesmus, de Moringa pterygosperma, d'hamamélis, de Castanea sativa, d'Hibiscus sabdriffa, de Polyanthes tuberosa, d'Argania spinosa, d'Aloe vera, de Narcissus tarzetta, ou de réglisse; une huile essentielle de Citrus aurantium (Neroli); les a-hydroxyacides tels que les acides glycolique, lactique et citrique, et leurs esters; les lhydroxyacides, tels que l'acide salicylique et ses dérivés; les hydrolysats de protéines végétales (notamment de soja ou de noisette); les oligopeptides acylés; les extraits de levure et en particulier de Saccharomyces cerevisiae; les extraits d'algues et en particulier de laminaires; les vitamines et leurs dérivés tels que le palmitate de rétinyle, l'acide ascorbique, le glucoside d'ascorbyle, l'ascorbyl phosphate de magnésium ou de sodium, le palmitate d'ascorbyle, le tétraisopalmitate d'ascorbyle, le sorbate d'ascorbyle, le tocophérol, l'acétate de tocophéryle et le sorbate de tocophéryle; les homo- et copolymères de méthacryloyloxyéthylphosphorylcholine; l'urée; les céramides et les phopholipides; l'arbutine; l'acide kojique; l'acide ellagique; et leurs mélanges.

Selon une forme d'exécution préférée, la composition mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention renferme au moins un actif stimulant la synthèse de macromolécules extracellulaires et en particulier de collagène IV et/ou de hyaluronane et/ou de fibronectine, tel qu'au moins un oligopeptide acylé. L'oligopeptide peut notamment être choisi parmi les séquences lysyl-thréonyl-thréonyl-lysylsérine, glycyl-histidyl-lysine, glycyl-glutamyl-prolyl- arginine et leurs mélanges, modifiés par un groupement alcanoyle qui contient au moins 6 et de préférence au moins 10 atomes de carbone, en particulier un groupement palmitoyle. Un actif de ce type est notamment commercialisé par la société SEDERMA sous la dénomination commerciale Matrixyl 3000.

En variante ou en plus, la composition utilisée selon l'invention peut comprendre au moins un agent antioxydant, de préférence hydrosoluble, ayant de préférence la propriété de réduire les hydroperoxydes, tel que le chlorhydrate de carcinine qui est notamment commercialisé par la société EXSYMOL sous la dénomination commerciale Alistine.

En variante ou en plus, la composition utilisée selon l'invention peut également comprendre au moins un actif choisi parmi . les agents stimulant la synthèse d'élastine, les agents anti-élastases, tels qu'un extrait d'une micro algue Chlorella vulgaris qui est notamment commercialisé par la société CODIF sous la dénomination commerciale DermochlorellaD/DP, et leurs mélanges.

L'invention sera maintenant illustrée par les exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLES Exemple 1 : Test de stimulation de l'expression de la tensine par l'extrait d'élémi (Canarium commune)

On a évalué l'effet sur l'expression de la tensine 1 d'un extrait d'élémi (Canarium commune).

Protocole :

- Préparation de l'extrait d'élémi (Canarium commune): Cet extrait est obtenu par hydrodistillation des gommes d'élémi, élimination de l'huile essentielle obtenue, récupération des résidus de distillation (gommes épuisées) et extraction éthanolique, filtration, récupération du filtrat et évaporation de l'éthanol, reprise par le dipropylène glycol et filtration pour obtenir un extrait liquide pâteux. Les étapes suivantes sont mises en oeuvre :

lare étape : Hydrodistillation a. Insertion de 150g de gomme-résine d'élémi brute dans un hydrodistillateur classique. b. Distillation de l'huile essentielle jusqu'à épuisement des gommes-résines c. Refroidissement du distillateur et filtration des résidus de la distillation d. Séchage des gommes épuisées d'élémi

Le rendement de cette étape est de 25% en huile essentielle, soit 75% en gommes-résines épuisées. 2'd étape : Extraction éthanolique a. Insertion dans un réacteur de 100g de gomme épuisée avec 500m1 d'éthanol à 96.3 % (vol/vol) b. Agitation du mélange durant 1h à 60 C c. Refroidissement de la solution d. Filtration sur Buchner de la solution et récupération du filtrat e. Evaporation de l'éthanol avec un évaporateur rotatif Le rendement de cette seconde étape est de 82%.

3éme étape : reprise au Dipropylène Glycol a. Insertion dans un réacteur de 10g de l'extrait 10 éthanolique avec 10g de dipropylène glycol et 30m1 d'éthanol à 96.3 % (volume/volume) b. Agitation du mélange durant 30 minutes à 50 C c. Refroidissement de la solution jusqu'à température ambiante 15 d. Filtration e. Evaporation de l'éthanol sur évaporateur rotatif f. Récupération de 20g d'extrait en solution dans du dipropylène glycol. On obtient ainsi un extrait contenant 50% en poids de dipropylène glycol. 20 L'extrait ainsi obtenu est ensuite dilué à 0,0003% en poids dans le milieu de culture.

- Test de stimulation de l'expression de la tensine 1 : 25 Des cellules (fibroblastes) isolées d'échantillons de peau issus de 5 donneurs, obtenus par chirurgie plastique, ont été mises en culture dans des microplaques en plastique, en utilisant du milieu DMEM supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 50 UI/ml de pénicilline, 50 pg/ml de streptomycine 30 et 10% de sérum de veau foetal (FCS). Le milieu de culture et les suppléments ont été obtenus auprès d'INVITROGEN. La stimulation de l'expression de la tensine 1 a été contrôlée après ajout de TGF(3 (R&D SYSTEMS) à 10 ng/ml.5 Les cellules ont ensuite été placées dans des puits à raison de 1000 cellules par puits sur une plaque de 96 puits, et mises en culture pendant 72 heures. La fixation / perméabilisation a été réalisée dans un tampon phosphate (PBS, INVITROGEN) contenant 4% de para-formaldéhyde (SIGMA) et 0,1% de Triton X-100 (SIGMA). Les étapes de saturation, de marquage et de lavage ont été effectuées dans du PBS contenant 0,05% de Tween 20 (SIGMA), supplémenté ou non avec 5 g/1 de lait sec écrémé (saturation). L'anticorps primaire monoclonal contre la tensine 1 (TNS1) humaine provient de BD TRANSDUCTION LABORATORIES. Les anticorps secondaires couplés à l'agent fluorescent Alexa fluor 488 provenaient d'INVITROGEN. La coloration des noyaux a été réalisée à l'aide d'un colorant HOECHST, le bis benzimide en solution dans le PBS/Tween (SIGMA). Les plaques ont été analysées en utilisant un analyseur InCell 1000 (GE HEALTHCARE). Un minimum de 5 zones fixes de chaque puits a été utilisé pour l'analyse d'image et au moins 3 puits ont été utilisés pour chacune des conditions de culture (triplicata). L'analyse d'image a été effectuée en utilisant le logiciel Toolbox 1.5 (GE HEALTHCARE). Après étalonnage du seuil minimal de fluorescence, le signal de fluorescence (FS) a été exprimé en tant que surface marquée (positive) (en pm2) rapportée au nombre de cellules.

Résultats : Une surface marquée moyenne de 87138 ( 18188) p 2 a été mesurée, soit un pourcentage de variation de +48% par rapport au témoin non stimulé (p<0,05).

Cet essai montre ainsi que l'extrait d'élémi testé stimule de façon significative l'expression de la tensine 1.

Exemple 2 : Evaluation par immunofluorescence de l'expression de la tensine 1 dans différents échantillons de peau

De manière analogue à l'Exemple 1, on a comparé par immunofluorescence l'expression de la tensine 1, de l'intégrine a5 et de la fibronectine sur des cultures de fibroblastes d'échantillon de peau provenant de chirurgie mammaire (peau humaine adulte normale, pool de 5 donneurs de 21 à 51 ans, pool PF2) et utilisé, soit au gène passage (fibroblastes normaux), soit après vieillissement artificiel du même échantillon de peau en utilisant le modèle de sénescence réplicatif de Hayflic (fibroblastes vieillis) (Hayflick, L., Clin Geriatr Med , 1985 ; Hayflick, L. How and Why We Age, Ballantine Books, 1994) et d'un échantillon de peau d'enfant (pool de 5 donneurs de 3 à 5 ans) (fibroblastes jeunes). Les fibroblastes adultes normaux sont utilisés comme témoin. Le protocole mis en oeuvre dans cette étude est identique à celui décrit dans l'exemple 1. Les anticorps primaires contre l'intégrine humaine a5 (CD49e) et la fibronectine humaine proviennent respectivement d'IMMUNOTECH et de SIGMA.

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 Protéine Type de FS (um2) Ecart-type % du fibroblastes témoin humains TNS1 Normaux 0,225 0,032 100 Vieillis 0,153 0,026 68 (p<0, 01) Jeunes 0,23 0,022 101 Intégrine a5 Normaux 0,449 0,072 100 Vieillis 0,317 0,016 71 (p<0, 05) Jeunes 0,459 0,032 102 Fibronectine Normaux 1814 111 100 r-- jVieillis 1367 34 75 (p<0,01) Jeunes 1921 125 101 On observe ainsi que le taux des trois protéines 5 précitées est réduit d'environ 30% dans les cellules vieillies, par rapport à la peau humaine normale.

Ces résultats mettent ainsi en évidence que l'expression de la tensine 1 dans la peau humaine diminue avec l'âge. Exemple 3 : Evaluation par RT-QPCR de l'expression de la tensine 1 dans différents échantillons de peau

Protocole : 15 Après culture, les cellules préparées comme décrit à l'Exemple 1 ont. été lavées pour éliminer le sérum et l'ARN total a été extrait avec un Tri-Reagent (SIGMA) selon le protocole standard. Des échantillons (triplicats) ont été 20 collectés et traités par la DNAse en utilisant le système 10 DNA-free (AMBION). L'analyse qualitative et quantitative de l'ARN a été réalisée en utilisant un Bio-Analyseur (AGILENT). Les transcriptions inverses (RT ; Enzyme Superscipt II , INVITROGEN) ont été réalisées sur 1 pg d'ARN total sans ADN et 10 ng d'ADNc ont été finalement utilisés en vue de l'analyse par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel (PCR quantitative ou QPCR). Les analyses de QPCR ont été effectuées en utilisant l'appareil Light Cycler 480 avec détection par mélange SYBR Green I Master . Les amorces suivantes ont été sélectionnées à partir des séquences GENBANK suivantes: G3PDH (NM 002046), TNS1 (NM 022648) et ITGA5 (NM 002205). Tous les fragments amplifiés étaient uniques et ont été séquencés pour vérification d'identité. Les valeurs d'expression ont été rapportées à l'expression du gène domestique G3PDH dans des conditions de culture identiques. Les résultats sont exprimés en pourcentage des témoins respectifs.

Résultats : L'analyse RT-QPCR d'expression de TNS1 confirmait, après 48 heures de culture, les résultats obtenus par immunofluoresce:- 1ce dans l'Exemple 2. Les ARNm codant pour la tensine 1 (TNS1) et l'intégrine a5 (ITGA5) étaient réduits d'environ 50% pour les fibroblastes vieillis. L'augmentation de la durée de culture de 48 à 96 heures diminuait encore la quantité relative d'ARNm de TNS1 dans les fibroblastes vieillis, pour atteindre 30% de la valeur obtenue pour le témoin (échantillon de peaunormale). Au contraire, l'ARNm codant pour la tensine 1 représentait, pour les fibroblastes d'enfant, 140% de celui du témoin.

Cet essai confirme ainsi que l'expression de la tensine et de l'intégrine a5 diminue avec l'âge.

Exemple 4 : Effet de l'inactivation de la tensine 1 a) Essai d'inactivation partielle de TNS1 et effet sur l'expression et la localisation des marqueurs

On a transfecté les fibroblastes issus d'échantillons de 10 peau normale décrits dans l'Exemple 2 avec 90 nM au total d'ARN silenceur (SiRNA AMBION AM 16708A), complexé avec un réactif Lipofectamine LTX (INVITROGEN) dans un milieu OptiMEM (INVITROGEN), en suivant le protocole du fournisseur. On a testé trois ARN différents inactivant la TNS1 humaine (ref 15 50-52). On a utilisé comme témoins un ARN silenceur non pertinent et le réactif de transfection sans ADN. L'ARN silenceur ref. 52 (SiRNA ID 139898 ; séquence sens CCGAGGCAGGAUAGGAGUUtt) a été choisi à partir d'expériences préliminaires et utilisé pour l'inactivation ultérieure et 20 des études fonctionnelles. Après transfection, les cellules ont été traitées ou non avec 10 ng/ml de TGF(3. L'analyse de l'ARNm (RT-QPCR) et par immunofluorescence ont été réalisées après 48 heures et 72 heures, respectivement, comme dans les exemples 2 et 3. 25 L'ARN silenceur ref. 52 a donné les meilleurs résultats, dans la mesure où il réduisait de 60% l'expression de TNS1, mesurée par analyse quantitative du signal de fluorescence issu de l'analyse RT-QPCR. L'inactivation était encore plus 30 importante pour les cellules stimulées par TGF(3. Ce niveau d'inactivation était stable pendant au moins 72 heures. On notera en outre que les niveaux quantitatifs d'expression de l'intégrine a5 et de la fibronectine (qui participent5 également au processus d'adhésion focale) n'étaient pas affectés par l'ARN silenceur utilisé. Par contre, la répartition de la fluorescence de l'intégrine a5 et de la fibronectine est altérée en présence de l'ARN silenceur ref. 52. En effet, clans ce dernier cas, la fluorescence ne semble plus concentrée au niveau des sites d'adhésions focales. Par conséquent, l'inactivation (partielle) de la tensine 1 ne change pas le niveau d'expression de l'intégrine a5 et de la fibronectine mais change la répartition de ces marqueurs qui ne sont plus présents au niveau des sites d'adhésion.

b) Essai de contraction de lattices de collagène

Les lattices ont été préparées dans des plaques à 6 puits, 7 x 10` cellules (normales, vieillies et d'enfant, telles que décrites à l'Exemple 2) étant mises en culture dans un milieu standard supplémenté avec 2,4 mg/puits de collagène I de queue de rat (J BOY INSTITUTE), en présence et en l'absence de 10 ng/ml de TGF(3. Les cellules transfectées par l'ARN silenceur ont été utilisées 48 h après transfection dans l'essai de contraction. Après 1 h de polymérisation, les équivalents dermiques (DE) ont été détachés manuellement de leur support et. maintenus flottants pendant 8 jours dans le milieu de culture. On a changé le milieu et effectué une analyse informatique d'image aux jours 1, 3, 6 et 8. Les surfaces ont été mesurées en utilisant un logiciel Lucia 3.0 (NIKKON).

Des essais préliminaires visant à analyser la capacité de contraction des lattices formées par les différentes populations de fibroblastes ont révélé que les fibroblastes d'enfant présentaient la plus grande capacité de contraction (1000 mm2 à 200 mm2). La contraction était considérablement inférieure dans les lattices de fibroblastes vieillis (1000 mm2 à 350 mm2).

Pour évaluer une possible implication de la tensine 1 dans le processus de contraction des lattices, on a préparé des lattices à partir de fibroblastes normaux et transfectés par l'ARN silenceur ref. 52 (TNS1 inactivée). Les lattices contenant les fibroblastes traités avec le mélange de transfection ont été utilisées comme témoins.

On a clairement observé que les fibroblastes à TNS1 inactivée présentaient une réduction importante de leur capacité à contracter la lattice de collagène (1000 mm2 à 380 mm2) par comparaison avec les témoins (1000 mm2 à 200 mm2). Cet essai montre donc que la tensine 1 est impliquée dans le processus de contraction des lattices de collagène.

Exemple 5 : Emulsion huile-dans-eau (H/E) 20 La composition suivante peut être préparée de façon classique pour l'homme du métier. Les quantités indiquées ci-dessous sont exprimées en pourcentages pondéraux. Les ingrédients en majuscules sont identifiés conformément à la 25 dénomination INCI. (4) BEHENETH-25 Extrait d'élémi (1) PALMITOYL OLIGOPEPTIDE - 30 PALMITOYL TETRAPEPTIDE-3 (2) Chlorhydrate de carcinine (3) Extrait de Chlorella vulgaris Tenseur 2.00 % 0.10 % 23 Emollients 15.00 % Filtres UV 0.50 % Acétate de tocophéryle 0.50 % CYCLOMETHICONE 5.00 % EDTA 0.05 % Glycérine 5.00 % Gélifiants 2.00 % Ajusteur de pH qs Conservateurs qs Eau qsp 100.00 % (1) préparé comme décrit à l'Exemple 1 (2) Matrixyl 3000 de SEDERMA (3) Alistin d' EXSYMOL (4) Dermochlorella D/DP de CODIF Cette composition peut être appliquée chaque matin sur le visage pour raffermir la peau.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Procédé cosmétique de soin de la peau, destiné à prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement, comprenant l'application topique sur la peau d'une composition renfermant au moins un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est destiné à prévenir et/ou lutter contre le relâchement cu-:ané.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre sur une peau âgée.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'actif est un extrait d'élémi ou de Canarium indicum L. ou de Canarium luzonicum ou de Canarium commune.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'actif est susceptible d'être obtenu selon un procédé comprenant : a) l'hydrodistillation de la gomme ou de la résine de la plante, b) l'élim__nation des huiles essentielles, c) l'extraction des résidus d'hydrodistillation à l'aide d'un solvant organique polaire autre que l'eau ayant un indice de polarité supérieur à 3,5, tel qu'un alcool, notamment le méthanol, l'éthanol ou 1'isopropanol. 25

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la composition renferme en outre au moins un actif additionnel stimulant la synthèse de macromolécules extracellulaires telles que le collagène IV et/ou le hyaluronane et/ou la fibronectine.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'actif additionnel est un oligopeptide acylé.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la composition renferme en outre au moins un actif choisi parmi les agents stimulant la synthèse d'élastine, les agents antiélastases et leurs mélanges.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'agent anti-élastase est un extrait de Chlorella vulgaris.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la composition renferme en outre au moins un agent antioxydant, de préférence hydrosoluble.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent anti-oxydant est le chlorhydrate de carcinine.

12. Utilisation cosmétique d'un actif capable de stimuler l'expression de la tensine 1 pour prévenir et/ou traiter au moins un signe cutané du vieillissement. 5

13. Extrait d'élémi ou de Canarium indicum L. ou de Canarium luzonicum ou de Canarium commune, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu selon le procédé décrit dans la revendication 5.

14. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un milieu cosmétiquement acceptable, au moins un extrait selon la revendication 13.