CN108517345A - 一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法，该方法包括如下步骤：(1)先将酿酒酵母菌在中温,酸性条件下进行一次或多次发酵，对酵母菌进行增菌；(2)等酵母菌处于对数生长期后期再将温度升高后，接种嗜热栖热菌并在碱性条件下进行第二次发酵，获得发酵产物。利用本发明的方法，可以显著提高嗜热栖热菌的一些活性成分，特备是一些运用到化妆品上的活性成分的含量得到增加或者活性得以提高。

Description

一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法
技术领域
本发明属于化妆品发酵原料领域，特别涉及嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法以及应用。
背景技术
生物发酵原料在化妆品领域的应用越来越多，近两年酵素化妆品受到了消费者的追捧。发酵是纯生物的过程，中间没有任何化工成分的添加。发酵让活性物质更加容易溶出，通过发酵将全部活性成分提取出来，会产生新的营养素，让营养成分更加均衡，使营养成分小分子化，活性更强，可被皮肤快速吸收。发酵微生物中本身含有很多酶类和微量元素，有补充增效作用。符合消费者对于“天然、健康、高效”护肤品的期待。
酵母菌是目前应用在化妆品发酵原料领域最多的菌株，酵母提取物具有天然、安全、强效的保湿功效。酵母细胞中含有丰富的天然保湿因子(NMF)，如氨基酸、肽类、钠、钾、镁等矿物元素。其中，氨基酸占天然保湿因子(NMF)的40％，钠、钾、镁等矿物元素占天然保湿因子(NMF)的12％。酵母细胞壁主要成分包括酵母β-(1,3)/(1,6)-葡聚糖和甘露聚糖M60。酵母β-(1,3)/(1,6)-葡聚糖含有大量的亲水基团，可以吸收水分或锁住皮肤角质层水分。酵母甘露聚糖M60特有的分子结构能锁住水分子，达到长效保湿的作用。例如中国专利申请公开CN105434319A，CN107184411A，CN10655182A的中国专利公开了采用酵母发酵产物作为化妆品的原料进行制作化妆品。
嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus)是一种耐热菌，能产生热稳定性的超氧化物歧化酶(SOD)和B族维生素。超氧化物歧化酶可以将02－氧化成H202，避免生物体被氧化损伤，起到皮肤抵抗自由基侵害，延缓衰老的功效。B族维生素可以减轻皮肤炎症反应，抵抗日光的损害，促进细胞再生，B族维生素还是很多酶和辅助酶分子结构的一部分，可促进氨基酸的代谢以保持皮肤健康。在中国专利申请号:2017107329367中也揭示了采用嗜热栖热菌的发酵产物作为护肤基质，但是该护肤基质除了嗜热栖热菌的发酵产物外，还包括重组人源胶原蛋白，但是该申请仅仅提到嗜热栖热菌的发酵产物，但是没有披露如何发酵。在例如，在中国专利申请，申请号200710031387中也披露了生物酶防晒组合物，其中该组合物中包括嗜热栖热菌生物酶而且提供了比例问题。但是，一般嗜热栖热菌都是通过发酵而生产的，酶的活性或者酶的产量并没有披露，而且这种酶在和其它成分组合的时候，稳定性也是一个重要因素，毕竟防晒产品中含有酶，酶在紫外光下是否失活，是否具有酶的活性也不确定。
现有传统技术中心，都是单菌种进行分别完成发酵后，再进行两种发酵液进行勾兑后，不同的菌群和酶类，溶解到一起发生的抵消反应，会损失大量的菌群和酶类，往往实际效果并不理想。这就需要对现有发酵方法和产物进行改进，希望获得更多活性物质，而且减少单独发酵产物混合相互效果抵消效果。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵工艺，以达到提高嗜热栖热菌发酵产物的生物活性，丰富嗜热栖热菌发酵产物的应用功效，特别是提高嗜热栖热菌发酵产物在温和消炎方面的功效，满足人们对化妆品“天然、健康、高效”的追求。
本发明小组意外发现，多菌共生发酵将多种菌进行可控性发酵，不仅可以发酵出种类更多的有益酶，还能使每类酶产出的数量是普通单菌种发酵数量的多倍，酶越多，对人体的催化保健功能越强，尽管市场上已经出现了酵母提取物和嗜热栖热菌发酵产物，但是都是作为单一产品添加到化妆品中，开拓酵母菌和嗜热栖热菌进行组合发酵使用于化妆品是一个新课题。
本发明小组意外的发现，让酵母和嗜热菌共同培养，经过特殊的培养工艺，可以让酵母对嗜热菌的培养起到诱导活化的作用，比单独培养嗜热菌所得的产物的活性有显著的提高，而酵母本身的培养产品的活性没有太大的影响。这样就增强了嗜热菌的活性物质的释放，或者活性物质的活性增强。
虽然嗜热菌单独培养可以产生一些有益的活性物质，但是这种活性物质的量很少，而且活性不高。如果让酵母和嗜热菌共同培养，经过特殊的培养方法，发现，可以显著提高嗜热菌的活性物质的产品，特别是一些活性物质的活性。
一方面，本发明提供培养嗜热菌的发酵产物的方法，该方法包括如下步骤：
(1)先将酿酒酵母菌在中温,酸性条件下进行一次或多次发酵，对酵母菌进行增菌；
(2)等酵母菌处于对数生长期后期再将温度升高后的0天或者1天后，接种嗜热栖热菌并在碱性条件下进行第二次发酵，获得发酵产物。
在一些优选的方式中，对酵母进行至少两次增菌培养，或者至少3次或者至少4次、5次、6次的增菌培养，从而让酵母处于对数生长期。
在一些优选的方式中，对嗜热栖热菌在进行混合发酵前也进行一次或者多次增菌培养。
在一些优选的方式中，该方法还包括步骤(3)，对步骤(2)发酵液进行除菌，脱色祛味，过滤去杂，得到嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物。
在一些优选的方式中，所述的酿酒酵母的菌株为CICC1596，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC1596。
在一些优选的方式中，本发明所使用嗜热栖热菌HB27购于美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号是BAA-163。
在一些方式中，对酵母进行低温培养，所述的温度为20℃-30℃。
在一些方式中，对酵母进行酸性培养，所述的PH值为4.0-5.0。
在一些方式中，酵母菌处于对数生长期后期0天或1天后开始升高温度。优选的，升高温度到55℃-75℃，或者60℃-65℃。或者60℃，65℃，70℃，58℃，61℃。从低温升高到高温的时间一般通过几分钟就可以达到，例如采用电加热的方法进行升温。
在一些方式中，升高温度0天或者1天后，后开始接种嗜热菌，同时或者接种后1天开始调节培养的PH值为碱性，PH值为7.0-8.5。
在一些方式中，二次发酵的条件是通气量维持在5m3/h/50L-10m3/h/50L,100rpm-200rpm，发酵的天数是1-3天。
在一些方式中，所述的酵母的扩大培养方法包括如下步骤：(1)在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm(每分钟转200转)，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期；(2)将处于对数生长期的菌体接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积百分数，200毫升步骤(1)的处于对数生长期的酵母培养液)，200rpm，30℃培养10h左右；(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级种子50L罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。(4)将30L菌液转移到装有300L的二级种子500L罐中。通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
在另一方面，本发明提供一种方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：分别对酿酒酵母菌和嗜热栖热菌进行增菌培养；
其中，酿酒酵母菌增菌方法如下：
(1)在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm(每分钟转200转)，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期；
(2)将处于对数生长期的菌体接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积百分数，200毫升步骤(1)的处于对数生长期的酵母培养液)，200rpm，30℃培养10h左右；
(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级种子50L罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右；
(4)将30L菌液转移到装有300L的二级种子500L罐中。通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右；
1.2嗜热栖热菌增菌方法如下：
在超净工作台上取嗜热栖热菌HB27冻存液2mL接入装有2L培养液(pH为7.8±0.2)的2.5L三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右，菌体处于对数生长期后，将30L菌液接种到300L培养液的500L二级500L种子罐中；
步骤2:对酵母的一次发酵方法如下：
对酵母的一次发酵方法如下：将300L的二级种子罐中(经过步骤(4)后的)的酵母菌培养液转移到装有2400L培养液(pH为4.8±0.2)的5000L发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养14h左右；
步骤3:二次发酵
将一次发酵(步骤2)培养液温度从30℃提升到65℃后，温度一旦升高到65℃后(0天)，立即将300L嗜热栖热菌增菌液转移到此发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
在一些优选的方式中，培养液的配方为：这里的培养液体的配方为：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L。不同量的培养液按照配比例进行缩小或放大。
另一方面，嗜热菌和酵母共同发酵培养的发酵产物在制作皮肤消炎或者皮肤保湿试剂上的用途，其中，所述的嗜热菌和酵母共同发酵方法包括：先对酵母进行低温，酸性下的进行一次或者多次液体增菌发酵，让其处于指数生长期，然后让发酵液的温度从低温变为高温后的0天或者1天后，添加嗜热栖热菌进行二次发酵，发酵的条件为碱性条件。
优选的，所述的发酵方法为前述任一种发酵方法。
在一些优选的方式中，所述的试剂为化妆品试剂，例如护肤试剂中的用途。
另一方面，本发明体用一种试剂，该试剂可以降低皮肤的经皮水分流，该试剂包括由本发明的方法所获得的发酵产物的混合物。
在一些优选的方式中，所述的用途或者试剂，嗜热菌为嗜热栖热菌HB27购于美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号是BAA-163。
在一些优选的方式中，所述的酵母为CICC1596购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保存编号为CICC 1596。
在另一些优选的方式中，这里的试剂除了包括发酵产物外，还可以包括其他成分，例如其他化妆试剂的成分，例如添加其他成分，例如果油、硅油、硬脂酸甘油酯，汉生胶、去离子水等等。还例如，包括去离子水、Tween-80、丙二醇、防腐剂等配置成的精华液。
通过对本发明的发酵产物的混合物的一些体外和人体试验表面，本发明的发酵产物相对单独的酵母发酵产物和嗜热菌发酵产物以及发酵混合后的试剂具有显著的改善作用，这似乎说明，两种菌的共同培养具有相互促进作用，活性物质的活性的含量或者活性都大大的提高。
另一方面，本发明意外发现，当让酵母和嗜热栖热菌共同培养的时候，没有实质改变嗜热栖热菌产生B族维生素的产生量，但是促进了一些活性物质的产生，这些活性物质可以提高B族维生素的活性。所以，本发明提供酵母作为促进嗜热栖热菌产生B族维生素活性物质的上的新用途。所以，本发明提供一种用途，菌株为CICC1596的酿酒酵母菌作为提高HB27菌株的嗜热栖热菌产生促使B簇微生物增强的活性物质发酵增效试剂上的用途
有益效果
体外实验结果表明：嗜热栖热菌和酿酒酵母菌组合发酵产物与单一嗜热栖热菌发酵产物相比促进皮肤成纤维细胞增长的能力更强，在3％浓度能提高皮肤成纤维细胞20％生长率。
嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物较单一嗜热栖热菌发酵产物的消炎功效更强，皮肤角质细胞在炎性作用的刺激下，加入10％的嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物，炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8及TNF-α的分泌明显减少，与100ppm的地塞米松消炎效果相当，但是比地塞米松更温和，消炎效果明显优于10％单一嗜热栖热菌发酵产物或者单一的酵母发酵。
人体临床实验结果表明：含有1％的嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物的精华液，使用7天后，对于降低皮肤的经皮水分流失具有显著效果，说明该嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物具有修复和强化皮肤屏障功能的作用。含有10％的嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物的精华液，使用7天后，能显著降低皮肤的黄度，说明该嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物具有改善肤色，去除暗黄的作用。
具体实施方式
本发明通过具体的实施方式来进行说明本发明如何实现，这些说明仅仅是对本发明的精髓进行的说明，不能对本发明做任何限制。具体的保护范围以权力要求为准。
实施例子1：嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵方法(1)
材料：
培养液配制和成分：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱(盐酸或者氢氧化钠溶液)进行调节控制，水补足到20L，不同量的培养液按照配比例进行缩小或放大。本发明没有特备指明，所有实施例子都采用以上配比的培养基配方作为菌培养的培养液。当然，在实际工业生产中，可以根据不同的要求进行配比，这些配方都是培养酵母和/或嗜热栖热菌的普通配方。
酿酒酵母是CICC1596购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC1596(商业购买获得)。
嗜热栖热菌HB27购于美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号是BAA-163(商业购买获得)。
1.菌种扩大培养
步骤一：
1.1酿酒酵母菌增菌：
(1)在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm(每分钟转200转)，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期；
(2)将处于对数生长期的菌体接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积百分数，200毫升步骤(1)的处于对数生长期的酵母培养液)，200rpm，30℃培养10h左右；
(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级种子50L罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
(4)将30L菌液转移到装有300L的二级种子500L罐中。通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
1.2嗜热栖热菌增菌：
在超净工作台上取嗜热栖热菌HB27冻存液2mL接入装有2L培养液(pH为7.8±0.2)的2.5L三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右，菌体处于对数生长期后，将30L菌液接种到300L培养液的500L二级500L种子罐中。
这里的培养液体的配方为：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L。不同量的培养液按照配比例进行缩小或放大。
2.步骤二:
一次发酵
将300L的二级种子罐中(经过步骤(4)后的)的酵母菌培养液转移到装有2400L培养液(pH为4.8±0.2)的5000L发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养14h左右。
此时培养液的配方为：这里的培养液体的配方为：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L。不同量的培养液按照配比例进行缩小或放大。
3.步骤三:
二次发酵
将一次发酵(步骤二)培养液温度从30℃提升到65℃后，等到达65℃立即将300L嗜热栖热菌增菌液转移到此发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
此时培养液的配方为：这里的培养液体的配方为：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L。不同量的培养液按照配比例进行缩小或放大。
4.分离纯化
离心除菌：对经过步骤三的二次发酵的培养液，经过板框过滤，菌体被拦截在过滤膜(0.22um)上，获得发酵上清液。
净化：将发酵上清液加入活性炭吸附其中的杂质，祛除异味，再利用多层脱脂纱布及硅藻土过滤炭渣(活性炭的添加比例为6％，活性炭购买于环宇炭业)。
过滤：将净化的发酵液通过0.22um的滤膜进行过滤，获得嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物。
实施例子2：单独的酵母发酵的方法；
单独的酵母发酵产物的具体实施方式如下：
培养液配制：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L，不同量的培养液按照配比比例进行缩小或放大。
1.菌种扩大培养
(1)在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm(每分钟转200转)，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期；
(2)将处于对数生长期的菌体接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积百分数，200毫升步骤(1)的处于对数生长期的酵母培养液)，200rpm，30℃培养10h左右；
(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级种子50L罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
(4)将30L菌液转移到装有300L的二级种子500L罐中。通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
2.发酵
将300L的二级种子罐中的酵母菌培养液转移到装有2700L培养液(pH为4.8±0.2)的5000L发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养14h左右。
培养液配制：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L，不同量的培养液按照配比比例进行缩小或放大。
3.分离纯化
离心除菌：对经过步骤2发酵的培养液，经过板框过滤，菌体被拦截在过滤膜(0.22um)上，获得发酵上清液。
净化：将发酵上清液加入活性炭吸附其中的杂质，祛除异味，再利用多层脱脂纱布及硅藻土过滤炭渣(活性炭的添加比例为6％，活性炭购买于环宇炭业)。
过滤：将净化的发酵液通过0.22um的滤膜进行过滤，获得大单独的酵母菌发酵产物。
实施例子3：单独的嗜热菌的发酵方法
单独的嗜热栖热菌发酵产物的具体实施方式如下：
培养液配制：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L，不同量的培养液按照配比比例进行缩小或放大。
1.菌种扩大培养
在超净工作台上取嗜热栖热菌HB27冻存液2mL接入装有2L培养液(pH为7.8±0.2)的2.5L三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右，菌体处于对数生长期后，将30L菌液接种到300L培养液的500L二级500L种子罐中。
2.发酵
将300L嗜热栖热菌增菌液转移到含有2700L培养液的发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
3.分离纯化
离心除菌：对经过步骤2发酵的培养液，经过板框过滤，菌体被拦截在过滤膜(0.22um)上，获得发酵上清液。
净化：将发酵上清液加入活性炭吸附其中的杂质，祛除异味，再利用多层脱脂纱布及硅藻土过滤炭渣(活性炭的添加比例为6％，活性炭购买于环宇炭业)。
过滤：将净化的发酵液通过0.22um的滤膜进行过滤，获得单独的嗜热栖热菌发酵产物。
实施例子4：实施例子2和3的发酵产物混合获得的试剂
取实施例子2和3的发酵产物按照重量进行1:1比例混合而成的复合试剂。
实施例子5：酵母和嗜热菌共同培养方法(2)
嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物的具体实施方式如下：
培养液配制：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L，不同量的培养液按照配比比例进行缩小或放大。
1.菌种扩大培养
酵母菌增菌：
在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期；接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积比，这里接种处于对数生长期的200毫升)，200rpm，30℃培养10h左右；将3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级50L种子罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。将30L菌液转移到装有300L培养液的二级500L种子罐中。通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
嗜热栖热菌增菌：
在超净工作台上取嗜热栖热菌HB27冻存液2mL接入装有2L培养液(pH为7.8±0.2)的2.5L三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右，菌体处于对数生长期后，将30L菌液接种到300L培养液的500L二级500L种子罐中进行培养，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右。
2.发酵
将300L的二级种子罐中的酵母菌和300L二级种子罐中的嗜热栖热菌培养液转移到装有2400L培养液(pH为4.8±0.2)的5000L发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养14h左右。再将发酵液温度提升到65℃，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
3.分离纯化
离心除菌：对经过步骤2发酵的培养液，经过板框过滤，菌体被拦截在过滤膜(0.22um)上，获得发酵上清液。
净化：将发酵上清液加入活性炭吸附其中的杂质，祛除异味，再利用多层脱脂纱布及硅藻土过滤炭渣(活性炭的添加比例为6％，活性炭购买于环宇炭业)。
过滤：将净化的发酵液通过0.22um的滤膜进行过滤，获得嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物。
实施例子6：酵母和嗜热菌共同培养方法(3)
嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物的具体实施方式如下：
培养液配制：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，水补足到20L，不同量的培养液按照配比比例进行缩小或放大。
1.菌种扩大培养
酵母菌增菌：
在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期，接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积比)，200rpm，30℃培养10h左右，将3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级50L种子罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。将30L菌液转移到装有300L的二级500L种子罐中。通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右。
嗜热栖热菌增菌：
在超净工作台上取嗜热栖热菌HB27冻存液2mL接入装有2L培养液(pH为7.8±0.2)的2.5L三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右，菌体处于对数生长期后，将30L菌液接种到300L培养液的500L二级500L种子罐中。再将发酵液温度提升到65℃，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
2.发酵
将300L的二级种子罐中的酵母菌和300L二级种子罐中的嗜热栖热菌培养液同时转移到装有2400L培养液(pH为7.8±0.2)的5000L发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养18h左右。将发酵液温度降低到30℃，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm搅拌，用酸液将pH值调节到4.8±0.2，200rpm，30℃培养14h左右。
3.分离纯化
离心除菌：对经过步骤二次发酵的培养液，经过板框过滤，菌体被拦截在过滤膜(0.22um)上，获得发酵上清液。
净化：将发酵上清液加入活性炭吸附其中的杂质，祛除异味，再利用多层脱脂纱布及硅藻土过滤炭渣(活性炭的添加比例为6％，活性炭购买于环宇炭业)。
过滤：将净化的发酵液通过0.22um的滤膜进行过滤，获得嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物。
实施例子7：嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵方法(4)
与实施例子1不同之处在于：二次发酵中，将一次发酵(步骤二)培养液温度从30℃提升到65℃后，等到达65℃的1天后，将300L嗜热栖热菌增菌液转移到此发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
实施例子8：嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵方法(5)
与实施例子1不同之处在于：二次发酵中，将一次发酵(步骤二)培养液温度从30℃提升到65℃后，等到达65℃的2天后，将300L嗜热栖热菌增菌液转移到此发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
实施例子9：嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵方法(6)
与实施例子1不同之处在于：二次发酵中，将一次发酵(步骤二)培养液温度从30℃提升到75℃后，等到达75℃的3天后，将300L嗜热栖热菌增菌液转移到此发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右。
实施例子10：细胞毒性实验
收集对数期细胞(人皮肤成纤维细胞和人皮肤角质细胞)，用培养液制成单个细胞悬液，调节细胞终浓度为40000cell/mL，96孔板中加入100uL细胞悬液，5％CO2，37℃孵育，细胞贴壁后，加入检测物(含实施例子1-9的各个发酵产物的细胞培养液),培养到80％到90％融合后，每孔加MTT溶液20uL.继续孵育3h，终止培养。小心吸去孔内培养基,每孔加入100uL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。用酶标仪测定各孔吸光度值，选择490nm波长，以630nm为参比波长。每个处理重复5次。
加入含实施例子1-9的各个发酵产物的高糖型DMEM细胞培养液，细胞培养为含3％发酵产物的高糖型DMEM细胞培养液，3％实施例子1(嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物)的人皮肤成纤维细胞生长率为131％，与3％实施例子3(单一嗜热栖热菌发酵产物)相比提高了20％，具体参见下表。
加入10％实施例子1(嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物)的人皮肤角质细胞生长率为101％，而加入100ppm地塞米松的人皮肤角质细胞生长率为89％。10％实施例子1(嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物)与100ppm地塞米松相比更加温和。结果如下表。
表1：各个实施例子获得的发酵产物对细胞毒性实验结果。
经过方差分析，实施例子1和7与实施例子,2-6,8-9的差异分别为P<0.01，达到极显著差异，而实施例子2-6,8-9之间无显著差异。这说明，本发明的实施例子1组合培养的方法可以显著促进人皮肤成纤维细胞生长率，而对于人皮肤角质细胞的也极显著促进作用，而且混合培养的效果最好，实施例子1或者实施例子7的混合作用效果最好。同时也说明，在进行混合培养的时候，混合的时机也是非常重要的，升高温度后立即进行混合或者1天后进行混合，效果最好，但是超过2天混合的效果对于成纤维细胞的效果急剧下降。类似的效果对于细胞的人皮肤角质细胞的生长率的影响类似。
实施例子8：消炎功效实验
收集对数期人皮肤角质细胞，用培养液制成单个细胞悬液，调节细胞终浓度为40000cell/mL，96孔板中加入100uL细胞悬液，5％CO2，37℃孵育24h，吸出培养液，用PBS洗一次，吸出，再加入20uL的PBS，进行UVB照射，辐射剂量控制为60mJ/cm2，换入检测物(实施例子1-9的各个发酵产物，用高糖型DMEM细胞培养液稀释，浓度为10％的各个发酵产物),培养24h后，收集培养液上清。检测炎症因子(IL-1a，IL-6，IL-8，TNF-a)的含量(按照成品试剂盒的说明书进行检测)。实验重复5次。
结果表明：加入含10％嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物(实施例子1)的高糖型DMEM细胞培养液，炎症因子含量IL-1α为110.12pg/mL、IL-6为16.23pg/mL、IL-8为1300.20pg/mL及TNF-α为42.25pg/mL，分泌量与10％单一嗜热栖热菌发酵产物相比明显减少，消炎效果明显(经过分析，显著降低了炎症因子含量)，与100ppm的地塞米松消炎效果相当。
表2：各个实施例子获得的发酵产物对炎症因子的实验结果。
这说明，本发明的培养方法获得的活性产物可以显著降低炎症因子的产生，相比单独发酵或者发酵混合物，经过方差分析，实施例子1,7与其它处理都达到极显著差异(具体实验数据略)。这说明，酵母和嗜热栖热菌共同培养，采用酵母一次培养，然后再进行二次混合培养，可以对两种菌的活性物质都有促进作用，而且活性也显著提高。相反，单独培养以及单独培养然后混合在一起，以及其它方式的混合培养，并不能获得这样的效果。这可能是因为嗜热栖热菌中含有B族维生素，而B族维生素主要的作用可能就是起到皮肤消炎，这似乎可以说明，两种不同菌共同培养后，可以提高嗜热栖热菌中B族维生素的活性，或者其他不明的物质让B族维生素获得更大的活性。
同时，本发明同时对9个处理中的B族维生素进行了常规方法的测量，发现各个处理中的每100克的发酵产物的B族维生素并没有明显的变化，这似乎说明，组合发酵对于一些让B族维生素具有更大活性的因子产生，从而提高了B族维生素的活性，从而具有更好的消炎作用。而这些具体的活性因子产生的机理，有待进一步的研究。
实施例子9：皮肤屏障修复测试
皮肤角质层具有良好的屏障功能，但由于受到温度、风、阳光等外界因素影响而受损，及时进行屏障修复是很重要的。本实验采用TEWL(Trans epidermal Water Loss,TEWL)并作为指标，TEWL越低显示皮肤屏障修复能力越高。其中，测试仪器为：德国CK公司皮肤水份流失(TEWL)测试探头TM300；测试条件为：受试者在温度为22℃±1℃，湿度为50％±5％的房间内静坐20min。
实验方法：
选择20名志愿者，年龄在22～55岁之间，无皮肤疾病或曾对某些药物、化妆品或一些化学物质有高度敏感情况。早晚两次连续半脸使用对照组和含有10％实施例子1-9发酵产物的精华液(精华液的主要成分有：去离子水、Tween-80、丙二醇、防腐剂以及10％的本发明实施例子1-9的发酵产物，其中10％的发酵产物采用的溶剂为PBS作为溶剂配置而成，PH＝7.1)，使用产品7天前后测试TEWL测试，并计算TEWL的变化率，TEWL的变化率的计算方式为：[(7天后的TEWL的值-7天前的TEWL的值)/7天前的TEWL的值]*100％；TEWL的变化率越低，对皮肤的屏障作用就会越好(每个实施例子进行5次重复)。结果见下表3。
表3：各个实施例子获得的发酵产物的皮肤屏障修复测试结果
经过显著性差异分析，实施例子1,7-8与实施例子2-6,9对于屏障修复效果达到极显著差异(具体实验数据略)，这说明，经过本发明的实施例子1的方法培养获得的共培养产物可以对皮肤角质层具有显著的修复功能，可能提高了修复皮肤角质层细胞的活性物质的活性或者产量，或者其他辅助因子的产量或者活性。
实施例子10：皮肤祛黄测试
CIEXYZ系统通过数学方法转换得到CIEL*a*b*颜色空间。该空间由一个亮度(L)和两个颜色(a、b)轴组成。亮度是一种表示灰度的尺度，它的值在0-100之间，0表示黑色，100表示白色。a*是从红色至绿色之间的颜色饱和度，其变化范围是+60到-60，正值表示红色强度的变化。b*表示黄色至蓝色之间的颜色饱和度，其变化范围是+60到-60，正值表示黄色强度的变化。皮肤的颜色也是用L*a*b*来表示，b*值越低说明祛黄效果越明显，△b*越小，祛黄效果也就越好。
实验方法：
选择20名志愿者，年龄在22～55岁之间，早晚两次连续半脸使用对照组和含有10％实施例子1-6发酵产物的精华液(精华液的主要成分有：去离子水、Tween-80、丙二醇、防腐剂)，连续使用7天。使用产品前、使用产品7天后进行VISIA拍照，每组计算平均△b*值。
其中，测试仪器为：LAB测试仪：spectrophotometer CM2600d(Minolta,Osaka,日本)，测试前受试者彻底清洁面部后用卫生纸擦干，在温度为22℃±1℃，湿度为50％±5％的房间内静坐20min。
表4：皮肤祛黄测试比较试验结果
经过我们方差分析，实施例子1的试剂和实施例子7的试剂与其它各个处理都存在极显著的差异，说明本发明的共同培养，对有利于去除老化的和色素沉积的活性物质增加，另外，特别的，对于共同培养具有合适的添加时间比较重要。而实施例子2-6,8-9之间不存在差异显著。
我们在人体皮肤细胞实验中发现，随着该原料(实施例子1或者7)添加量的增加而细胞活力增加(浓度1.25％-12％)，因此该原料提升了皮肤细胞的增殖更新能力。相反，对于同样的实施例子2-6,8-9的原料的同样浓度的添加，并没有增加细胞的活力，有些，例如实施例子8-9反而降低的细胞活力。这样合理的解释可能是：皮肤的正常更新周期为3-4周，加快细胞的增殖更新可以加快皮肤表皮层的新陈代谢，从而去除老化的和色素沉积的角质，使得皮肤外观具有祛黄的效果。至于提升皮肤细胞增殖更新能力的原因，经分析测试该原料中含有大量的多糖、多酚、氨基酸等细胞营养成分，这些营养成分有助于细胞的增殖和更新，提高细胞活力。
实施例子11：皮肤制剂的消炎测试
消炎有效率测试：选取3X160＝480名年龄在15～35岁的青春痘(痤疮级别为3-4级)患者进行试验，其中，每一组男、女各80名，对实施例1，8获得的发酵产物进行试验,。
使用方法为：洁面后，每天早晚两次使用实施例1，8的发酵产物(用无菌水配置的15％的发酵产物的皮肤制剂)，其中无菌水作为对照、连续使用10天，观察患处发红、肿胀、皮损程度，以专家打分为准(0-4分对痤疮严重程度分级，0-无痤疮，1-轻度痤疮，黑头粉刺散在及多发，有散在性炎症性皮损；2-中等痤疮，浅表性脓疱，炎症性皮损数目较多，仅限于面部；3-重度，加深在性炎症性皮损；4-重度，囊肿，易形成瘢痕)进行评估。
体数据如下：实施例子1的发酵产物可以显著降低痤疮的等级，其中女性有75名从使用前的3或者4级变化为使用10天后的0-1级，其中有50名女性变为0级；对于男性患者，有68名从使用前的4级变为使用后的1级。对于那些无明显变化的，可能是其它原因引起的痤疮没有效果。而采用同样的方法，对于实施例子2-6发酵产物的消炎效果来看，使用前和使用后，痤疮级别没有明显变化，使用实施例子3和4的患者，女性仅仅只有6名从等级3变为等级1，男性仅仅有4名从等级4变为等级1。对于采用实施例子8发酵产物的消炎效果来看，具有一定的消炎效果，但是效果并不明显，80名女性患者中仅仅只有7名从等级3变为等级1，80名男性患者仅仅有6名从等级4变为等级1。通过人体实验结果表明实施例1相比对比例2-6,8-9抑痘消炎效果更好，效果更加明显，与实施例子8中的消炎效果相互印证；而无菌水也没有明显的变化。
本文中用来描述方法的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意图使用这些术语和表达方式来排除描述本发明或者特征的任何相同意义的表达方式，我们认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一致。文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。

Claims (10)

1.一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法，该方法包括如下步骤：
(1)先将酿酒酵母菌在中温,酸性条件下进行一次或多次发酵，对酵母菌进行增菌；(2)等酵母菌处于对数生长期后期再将温度升高后，接种嗜热栖热菌并在碱性条件下进行第二次发酵，获得发酵产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，对酵母进行至少两次、至少3次、至少4次、5次或者6次的增菌培养，从而让酵母处于对数生长期。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中，向酵母培养液中接种嗜热栖热菌前，对嗜热栖热菌进行一次或者多次增菌培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括步骤(3)，对步骤(2)的发酵液进行除菌，脱色祛味，过滤去杂，得到嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵产物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的酿酒酵母的菌株为CICC1596，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC1596；所使用嗜热栖热菌HB27购于美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号是BAA-163。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，对酵母进行低温培养，所述的温度为20℃-30℃；对酵母进行酸性培养，所述的PH值为4.0-5.0；酵母菌处于对数生长期后期0-1天开始升高温度；其中，升高温度到55℃-70℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，升高温度0或者1天后开始接种嗜热菌，同时或者接种后1天开始调节培养的PH值为碱性，PH值为7.0-8.5。
8.一种嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：分别对酿酒酵母菌和嗜热栖热菌进行增菌培养；
其中，酿酒酵母菌增菌方法如下：
(1)在超净工作台上取试管斜面上的酿酒酵母CICC1596一环，接入装有50mL培养液(pH为4.8±0.2)的250mL三角瓶中，200rpm(每分钟转200转)，30℃培养10h左右，菌体处于对数生长期；
(2)将处于对数生长期的菌体接种到装有2L(pH为4.8±0.2)的2.5L三角瓶中，接种量为10％(体积百分数，200毫升步骤(1)的处于对数生长期的酵母培养液)，200rpm，30℃培养10h左右；
(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L发酵液(pH为4.8±0.2)的一级种子50L罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右；
(4)将30L菌液转移到装有300L的二级种子500L罐中；通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养10h左右；
其中，嗜热栖热菌增菌方法如下：在超净工作台上取嗜热栖热菌HB27冻存液2mL接入装有2L培养液(pH为7.8±0.2)的2.5L三角瓶中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右，菌体处于对数生长期后，将30L菌液接种到300L培养液的500L二级500L种子罐中；，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm，65℃培养12h左右；步骤2:对酵母的一次发酵方法如下：
对酵母的一次发酵方法如下：将300L的二级种子罐中(经过步骤(4)后的)的酵母菌培养液转移到装有2400L培养液(pH为4.8±0.2)的5000L发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,200rpm，30℃培养14h左右；
步骤3:二次发酵
将一次发酵(步骤2)培养液温度从30℃提升到65℃后的0天或者1天后，将300L嗜热栖热菌增菌液转移到此发酵罐中，通气量维持在5m3/h/50L,150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，150rpm，65℃培养18h左右；
其中，培养液的配方为：20L培养液的配比为60g蛋白胨、4g麦芽汁、7g无水硫酸镁、2.4g磷酸二氢钾、40g硫酸铵、1g无水氯化铁、5g氯化钠，pH值用酸或碱进行调节控制，其余为水。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述的酿酒酵母的菌株为购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC1596的菌株；所使用嗜热栖热菌为购于美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号是BAA-163的菌株。
10.酿酒酵母的菌株为购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CICC1596的菌株在作为促进美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号是BAA-163的嗜热栖热菌菌株产生B簇微生物活性物质的用途。
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