JP2019187409A - サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法 - Google Patents
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Abstract
Description
サッカロマイセス・セレビシエを中温、酸性条件において1回または複数回発酵させ、酵母菌を増殖させるステップ(1)と、酵母菌が後期対数増殖期になってから温度を昇温させた後の0日または1日後に、サーマス・サーモフィラスを接種し、アルカリ条件において第2回発酵を行い、発酵生成物を得るステップ(2)と、を含む。
(ステップ1)
サッカロマイセス・セレビシエおよびサーマス・サーモフィラスに対してそれぞれ増殖培養を行う。
ここで、サッカロマイセス・セレビシエの増殖方法は下記の通りである。
(1)クリーンベンチに試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエCICC1596を1ループ取り、50mlの培養液(pH4.8±0.2)が入った250mlの三角フラスコに入れ、200rpm(1分間ごとに200回転)、30℃で10hほど培養し、菌体を対数増殖期にさせる;
(2)対数増殖期にある菌体を2L(pH4.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、接種量を10%(体積百分率、200ミリリットルのステップ(1)の対数増殖期にある酵母培養液)とし、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(3)ステップ(2)で培養された3Lの菌種を30Lの発酵液(pH4.8±0.2)が入った一級種の50Lタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(4)30Lの菌液を300Lが入った二級種の500Lタンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する。
また、サーマス・サーモフィラスの増殖方法は下記の通りである。
クリーンベンチにサーマス・サーモフィラスHB27の凍結溶液を2ml取り、2Lの培養液(pH7.8±0.2)が入った2.5L三角フラスコに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpm、65℃で12hほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lタンクに接種する。
(ステップ2)
酵母に対する一次発酵方法は下記の通りである。
300Lの二級種タンク内の(ステップ(4)の後の)酵母菌培養液を2400Lの培養液(pH4.8±0.2)が入った5000Lの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で14hほど培養する。
(ステップ3)
2次発酵として、一次発酵(ステップ2)の培養液の温度を30℃から65℃に昇温させた後、温度が65℃に昇温した後(0日)、すぐ300Lのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養する。
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法(1)〕
材料は以下のとおりである。
<培養液の調製および成分>
20Lの培養液の配合は60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであり、pH値は酸またはアルカリ(塩酸または水酸化ナトリウム溶液)で調整および制御し、水で20Lまで補充し、異なる量の培養液は上記配合に応じて増減する。本発明は、特に指定されない限り、全ての実施例はいずれも上記配合の培地成分を採用して菌培養の培養液とする。当然ながら、実際の工業生産においては、異なる要求に応じて配合することができるが、このような配合成分はいずれも酵母および/またはサーマス・サーモフィラスを培養する一般的な配合成分である。
(ステップ1)
<1.1 サッカロマイセス・セレビシエの増殖>
(1)クリーンベンチにおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエCICC1596を1ループ取り、50mlの培養液(pH4.8±0.2)が入った250mlの三角フラスコに接種し、200rpm(1分ごとに200回転)、30℃で10hほど培養し、菌体は対数増殖期にある;
(2)対数増殖期にある菌体を2L(pH4.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、接種量を10%(体積百分率、200ミリリットルのステップ(1)の対数増殖期にある酵母培養液)とし、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(3)ステップ(2)で培養した3Lの菌種を30Lの発酵液(pH4.8±0.2)が入った一級種の50Lタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(4)30Lの菌液を300Lが入った二級種の500Lのタンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する。
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスHB27の凍結溶液を2ml取り、2Lの培養液(pH7.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpm、65℃で12hほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lタンクに接種する。
<一次発酵>
300Lの二級種タンク内の(ステップ(4)の後の)酵母菌培養液を2400Lの培養液(pH4.8±0.2)が入った5000Lの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で14hほど培養する。
<二次発酵>
一次発酵(ステップ2)培養液の温度を30℃から65℃に昇温させた後、温度が65℃達した後、すぐ300Lのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養する。
<遠心による除菌>
ステップ3の二次発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜(0.22um)にブロックし、発酵上清を得る。
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用しシンダを濾過する(活性炭の添加比率は6%であり、活性炭は環宇炭業から購入)。
浄化された発酵液を0.22umの濾過膜によって濾過し、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得る。
〔単独で酵母発酵する方法〕
単独で酵母発酵することによる生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
20Lの培養液の配合が60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであるものについて、pH値を酸またはアルカリで調整および制御し、水を20Lまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
(1)クリーンベンチににおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエCICC1596を1ループ取り、50mlの培養液(pH4.8±0.2)が入った250mlの三角フラスコに接種し、200rpm(1分ごとに200回転)、30℃で10hほど培養し、菌体は対数増殖期にある;
(2)対数増殖期にある菌体を2L(pH4.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、接種量を10%(体積百分率、200ミリリットルのステップ(1)の対数増殖期にある酵母培養液)とし、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(3)ステップ(2)で培養した3Lの菌種を30Lの発酵液(pH4.8±0.2)が入った一級種の50Lタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(4)30Lの菌液を300Lが入った二級種の500Lのタンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する。
300Lの二級種タンク内の酵母菌培養液を2700Lの培養液(pH4.8±0.2)が入った5000Lの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で14hほど培養する。
20Lの培養液の配合が60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであるものについて、pH値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を20L補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
<遠心による除菌>
ステップ2の発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜(0.22um)にブロックし、発酵上清を得る。
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する(活性炭の添加比率は6%であり、活性炭は環宇炭業から購入)。
浄化した発酵液を0.22umの濾過膜によって濾過し、単一の酵母菌発酵生成物を得る。
〔単独で好熱性細菌を発酵させる方法〕
単一のサーマス・サーモフィラス発酵生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
20Lの培養液の配合が60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであるものについて、pH値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を20Lまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスHB27の凍結溶液を2ml取り、2Lの培養液(pH7.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpm、65℃で12hほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lタンクに接種する。
300Lのサーマス・サーモフィラスの増殖液を2700Lの培養液を含有する発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpmで撹拌し、pH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養する。
<遠心による除菌>
ステップ2の発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜(0.22um)にブロックし、発酵上清を得る。
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する(活性炭の添加比率は6%であり、活性炭は環宇炭業から購入)。
浄化した発酵液は0.22umの濾過膜によって濾過し、単一のサーマス・サーモフィラス発酵生成物を得る。
〔実施例2および3の発酵生成物を混合して得られた試薬〕
実施例2および3の発酵生成物を取り、重量比1:1で混合して複合試薬を得る。
〔酵母および好熱性細菌の共培養方法(2)〕
サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
20Lの培養液の配合が60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであるものについて、pH値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を20Lまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
<酵母菌の増殖>
クリーンベンチにおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエCICC1596を1ループ取り、50mlの培養液(pH4.8±0.2)が入った250mlの三角フラスコに接種し、200rpm、30℃で10hほど培養し、菌体は対数増殖期にある。2L(pH4.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、接種量を10%(体積比、ここで、対数増殖期にある200ミリリットルの酵母培養液を接種する)とし、200rpm、30℃で10hほど培養する。3Lの菌種を30Lの発酵液(pH4.8±0.2)が入った一級種の50Lタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpm、30℃で10hほど培養する。30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lタンクに移す。通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で10hほど培養する。
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスHB27の凍結溶液を2ml取り、2Lの培養液(pH7.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpm、65℃で12hほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lタンクに接種して培養し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpm、65℃で12hほど培養する。
300Lの二級種タンク内の酵母菌および300Lの二級種タンク内のサーマス・サーモフィラス培養液を2400Lの培養液(pH4.8±0.2)が入った5000Lの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で14hほど培養する。さらに、発酵液の温度を65℃まで昇温させ、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、65℃で18hほど培養する。
<遠心による除菌>
ステップ2の発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜(0.22um)にブロックし、発酵上清を得る。
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、さらに複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する(活性炭の添加比率は6%であり、活性炭は環宇炭業から購入)。
浄化した発酵液を0.22umの濾過膜によって濾過し、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得る。
〔酵母および好熱性細菌の共培養方法(3)〕
サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
20Lの培養液の配合が60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであるものについて、pH値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を20Lまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
<酵母菌の増殖>
クリーンベンチにおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエCICC1596を1ループ取り、50mlの培養液(pH4.8±0.2)が入った250mlの三角フラスコに接種し、200rpm、30℃で10hほど培養し、菌体は対数増殖期にあり、2L(pH4.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、接種量を10%(体積比)であり、200rpm、30℃で10hほど培養し、3Lの菌種を30Lの発酵液(pH4.8±0.2)が入った一級種の50Lタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で10hほど培養する。30Lの菌液を300Lが入った二級種の500Lタンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で10hほど培養する。
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスHB27の凍結溶液を2ml取り、2Lの培養液(pH7.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpm、65℃で12hほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lタンクに接種する。さらに、発酵液の温度を65℃に昇温させ、通気量を5m3/h/50Lに維持し、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養する。
300Lの二級種タンク内の酵母菌および300Lの二級種タンク内のサーマス・サーモフィラス培養液を同時に2400Lの培養液(pH7.8±0.2)が入った5000Lの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpm、65℃で18hほど培養する。発酵液の温度を30℃に低下させ、通気量を5m3/h/50Lに維持し、200rpmで撹拌し、酸液でpH値を4.8±0.2に調整し、200rpm、30℃で14hほど培養する。
<遠心による除菌>
ステップ2の二次発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜(0.22um)にブロックし、発酵上清を得る。
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、さらに複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する(活性炭の添加比率は6%であり、活性炭は環宇炭業から購入)。
浄化した発酵液を0.22umの濾過膜によって濾過し、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得る。
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法(4)〕
実施例1との相違点は、二次発酵において、一次発酵(ステップ2)の培養液の温度を30℃から65℃に昇温させた後、65℃に達してから1日後に、300Lのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養することにある。
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法(5)〕
実施例1との相違点は、二次発酵において、一次発酵(ステップ2)の培養液の温度を30℃から65℃に昇温させた後、65℃に達してから2日後に、300Lのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養することにある。
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法(6)〕
実施例1との相違点は、二次発酵において、一次発酵(ステップ2)の培養液の温度を30℃から75℃に昇温させた後、75℃に達してから3日後に、300Lのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養することにある。
<細胞毒性試験>
対数期細胞(ヒト皮膚線維芽細胞およびヒト皮膚角質細胞)を収集し、培養液で単一の細胞懸濁液を製造し、最終的な細胞濃度を40000cell/mLに調整し、96ウェルプレートに100uLの細胞懸濁液を加え、5%CO2、37℃で孵化し、細胞が壁に接着した後、試験物質を加え(実施例1〜9の各発酵生成物を含む細胞培養液)、80%〜90%に培養し融合させた後、各ウェルにMTT溶液20uLを加え3h孵化し続け、培養を終了する。慎重にウェル内の培地を吸い取り、各ウェルに100uLのDMSOを加え、10min振動することにより、結晶物を十分に融解させる。マイクロプレートリーダで各ウェルの吸光度の値を測定し、490nmの波長を選択し、630nmを参照波長とする。各処理を5回繰り返す。
<消炎効果試験>
対数期のヒト皮膚角質細胞を収集し、培養液で単一の細胞懸濁液を製造し、最終的な細胞濃度を40000cell/mLに調整し、96ウェルプレートに100uLの細胞懸濁液を加え、5%CO2、37℃で24時間孵化し、培養液を吸出し、PBSで1回洗い、吸出し、さらに20uLのPBSを加え、UVBを照射し、輻射量を60 mJ/cm2に制御し、試験物質に入れ替え(実施例1〜9の各発酵生成物を、高糖質のDMEM細胞培養液で希釈し、濃度が10%である各発酵生成物)、24h培養した後、培養液の上清を収集する。炎症因子(IL−1a、IL−6、IL−8、TNF−a)の含有量(完成品試薬キットの説明書に従って検出する)を検出する。試験を5回繰り返す。
<皮膚のバリア修復試験>
皮膚角質層は優れたバリア機能を有するが、温度、風、太陽光などの外部要因の影響を受けて損傷するため、適時にバリア修復を行うことは非常に重要である。本試験では、TEWL(Trans epidermal Water Loss、TEWL)を指標として採用し、TEWLが低いほど皮膚のバリア修復能力が高い。ここで、試験機器は、ドイツCK社の皮膚水分流出(TEWL)試験プローブTM300であり、試験条件は、被験者が温度22℃±1℃、湿度50%±5%の室内で20min間静座することである。
年齢が22〜55歳、無皮膚疾患または過去ある薬物、化粧品または一部の化学物質に対し深刻なアレルギーがあった20名のボランティアを選ぶ。朝晩2回連続して、顔の半分に対照群および10%の実施例1〜9の発酵生成物を含有するセラム(セラムの主要成分には、脱イオン水、Tween−80、プロピレングリコール、防腐剤および10%の本発明の実施例1〜9の発酵生成物があり、10%の発酵生成物に採用された溶媒はPBSを溶媒として調製されており、pHは7.1である)を使用し、製品を7日間ほど使用した後TEWL試験を行い、TEWLの変化率を計算する。TEWLの変化率の計算方式は、 [(7日後のTEWL値−7日前のTEWL値)/7日前のTEWL値]*100%であり、TEWLの変化率が低いほど、皮膚に対するバリア作用がよい(各実施例において5回繰り返す)。結果は表3のとおりである。
<皮膚黄み消去試験>
CIEXYZシステムを利用し、数学的方法によって変換しCIEL*a*b*色空間を得る。該空間は1つの輝度(L)および2つの色相(a、b)軸により構成される。輝度はグレースケールを表示する尺度であり、その値は0〜100の間であり、0は黒を表示し、100は白を表示する。a*は赤から緑の間の彩度であり、その変化範囲は+60〜−60であり、正の値は赤の強さの変化を表示する。b*は黄色から藍の間の彩度を示し、その変化範囲は+60〜−60であり、正の値は黄色の強さの変化を表示する。皮膚の色もL*a*b*で表示し、b*値が低いほど黄み消去の効果が明らかであり、Δb*が低いほど、黄み消去の効果がよい。
年齢が22〜55歳であるボランティア20人を選び、朝晩2回連続して、顔の半分に対照群および10%の実施例1〜6の発酵生成物を含有するセラム(セラムの主要成分には、脱イオン水、Tween−80、プロピレングリコール、防腐剤がある)を使用し、連続に7日間使用する(試験を5回繰り返す)。製品を使用する前に、製品を7日間使用した後VISIA撮影を行い、各群の平均Δb*値を計算する。
〔皮膚製剤の消炎試験〕
<消炎効果試験>
年齢15〜35歳のにきび(にきびレベル3〜4)がある患者3×160=480名(各グループに男女それぞれ80名)を選んで試験し、実施例1、8により得られた発酵生成物に対して試験を行った。
洗顔後、毎朝晩2回に分けて実施例1、8の発酵生成物を使用し(滅菌水で調製した15%の発酵生成物の皮膚製剤)、滅菌水を対照として、10日間連続して使用し、患部の発赤、腫れ、皮膚損傷の度合いを観察し、専門家の採点を基準として(0〜4点でにきびの深刻程度をつけ、0−にきびが認められない、1−軽いにきびがあり、ブラックヘッドが散在且つ多発し、散在性炎症性にきびがある;2−中間程度のにきびがあり、表在膿疱、炎症性にきびの箇所が多く、顔に限られている;3−重度、深在性炎症性にきびが認められる;4−重度、嚢胞、瘢痕が形成されやすい)評価した。
Claims (10)
- サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法であって、
まず、サッカロマイセス・セレビシエを中温、酸性条件において1回または複数回発酵させ、酵母菌を増殖させるステップ(1)と、
酵母菌が対数増殖期後期になってからさらに温度を昇温させた後、サーマス・サーモフィラスを接種し、アルカリ条件において第2回発酵させ、発酵生成物を得るステップ(2)と、
を含むことを特徴とするサーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法。 - ステップ(1)において、酵母に対し少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、5回または6回の増殖培養を行うことにより、酵母を対数増殖期にさせることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ステップ(2)において、酵母培養液にサーマス・サーモフィラスを接種する前に、サーマス・サーモフィラスに対し1回または複数回の増殖培養を行うことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ステップ(2)の発酵液に対し除菌、脱色および脱臭、濾過による不純物除去を行い、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得るステップ(3)をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記サッカロマイセス・セレビシエの菌株はCICC1596であり、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入されたもので、保存番号はCICC1596であり、使用されるサーマス・サーモフィラスHB27はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から購入されたもので、保存番号はBAA−163である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 酵母に対し低温培養を行い、温度は20℃〜30℃であり、酵母に対し酸性培養を行い、pH値は4.0〜5.0であり、酵母菌が対数増殖期後期になって0〜1日から温度は昇温させるが、温度は55℃〜70℃に昇温される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 温度を0または1日昇温させた後、好熱性細菌を接種し、同時または接種後1日から培養のpH値をアルカリ性に調整し、pH値は7.0〜8.5である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法であって、
サッカロマイセス・セレビシエおよびサーマス・サーモフィラスに対しそれぞれ増殖培養を行うステップ1と、
ここで、前記サッカロマイセス・セレビシエの増殖方法は、
(1)クリーンベンチに試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエCICC1596を1ループ取り、50mlの培養液(pHは4.8±0.2)が入った250mlの三角フラスコに接種し、200rpm(1分ごとに200回転)、30℃で10hほど培養し、菌体は対数増殖期にある;
(2)対数増殖期にある菌体を2L(pHは4.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、接種量を10%(体積百分率、200ミリリットルのステップ(1)の対数増殖期にある酵母培養液)とし、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(3)ステップ(2)で培養した3Lの菌種を30Lの発酵液(pHは4.8±0.2)が入った一級種の50Lタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で10hほど培養する;
(4)30Lの菌液を300Lが入った二級種の500Lのタンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で10hほど培養する;
であり、
ここで、サーマス・サーモフィラスの増殖方法は、クリーンベンチにサーマス・サーモフィラスHB27の凍結溶液を2ml取り、2Lの培養液(pHは7.8±0.2)が入った2.5Lの三角フラスコに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpm、65℃で12hほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、30Lの菌液を300Lの培養液が入った二級種の500Lのタンクに接種し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpm、65℃で12hほど培養する;
次のように一次発酵方法により酵母を一次発酵させるステップ2と、
すなわち、300Lの二級種タンク内の前記(4)の後の酵母菌培養液を2400Lの培養液(pHは4.8±0.2)が入った5000Lの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、200rpm、30℃で14hほど培養することであり、
次のように二次発酵方法を実施するステップ3と、
すなわち、一次発酵であるステップ2の培養液の温度を30℃から65℃に昇温させてから0日〜1日後、300Lのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を5m3/h/50Lに維持させ、150rpmで撹拌し、アルカリ液でpH値を7.8±0.2に調整し、150rpm、65℃で18hほど培養する、
ここで、前記培養液の配合成分は、20Lの培養液の配合が60gのペプトン、4gの麦芽汁、7gの無水硫酸マグネシウム、2.4gのリン酸二水素カリウム、40gの硫酸アンモニウム、1gの無水塩化鉄、5gの塩化ナトリウムであり、pH値は酸またはアルカリで調整し制御され、残りは水である、
を含むことを特徴とするサーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法。 - 前記サッカロマイセス・セレビシエの菌株は、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入されたもので、保存番号がCICC1596である菌株であり、使用されるサーマス・サーモフィラスはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から購入されたもので、保存番号がBAA−163である菌株である、ことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- サッカロマイセス・セレビシエの菌株は、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入されたもので、保存番号がCICC1596である菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)の保存番号がBAA−163であるサーマス・サーモフィラス菌株がB群微生物を生成することを促進する活性物質としての用途。
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