ES2898669T3 - Método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN a partir de un material vegetal y extractos obtenidos con dicho método - Google Patents

Método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN a partir de un material vegetal y extractos obtenidos con dicho método Download PDF

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Abstract

Método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos a partir de un material vegetal que comprende las siguientes etapas: a) el material vegetal, previamente molido, se pone en contacto con el agua; b) se añade ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tetrasódico a una concentración entre 2 y 15 mM, en la mezcla obtenida en a) a un pH entre 10,5 y 11, realizándose esta etapa con agitación durante un tiempo de al menos 1 hora y a una temperatura entre 20 y 80 °C; c) a continuación, se ajusta el pH de la mezcla obtenida en b) a un valor entre 6 y 8; d) la mezcla obtenida en c) se purifica para eliminar el material vegetal sólido residual y obtener un extracto crudo acuoso purificado; e) se controla el pH y, si es necesario, se reajusta a un valor entre 6 y 8, y se obtiene un extracto acuoso de materia vegetal, enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, que comprende en peso del peso total del extracto, 5-60 g/kg de extracto seco y 10-1000 mg/kg de pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, de 0,5 a 30 g/kg de fragmentos de proteínas y de 0,5 a 50 g/kg de azúcares y no comprende ADN, en el que la etapa e) está precedida por al menos una filtración del extracto acuoso crudo obtenido en d) y preferentemente por filtraciones sucesivas del extracto acuoso crudo bajando el umbral de filtración de 20-50 μm a 0,1-0,30 μm.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN a partir de un material vegetal y extractos obtenidos con dicho método
La invención se refiere a un método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN (ácidos ribonucleicos) con una longitud máxima de 150 nucleótidos a partir de un material vegetal, los extractos obtenidos con dicho método, así como las composiciones que comprenden dichos extractos y sus usos cosméticos.
Los protocolos convencionales de extracción de ácido ribonucleico (ARN, ARN de bajo peso molecular) que se llevan a cabo en el laboratorio, y por lo tanto a pequeña escala, deben realizarse bajo una campana química porque estos métodos implican el uso de disolventes como el fenol y el cloroformo que son tóxicos y no se consideran disolventes cosméticos (Zumbo, P. 2014 "Phenol-chloroform Extraction", 2014). Estos disolventes se añaden a una fase acuosa de células lisadas o de tejidos vegetales o animales muy finamente molidos, o directamente al material molido producido en presencia de nitrógeno líquido. La solución así obtenida se centrifuga a alta velocidad del orden de 10 000 g a 4 °C, con el fin de crear dos fases muy diferenciadas, una fase orgánica que contiene las proteínas y una fase acuosa que contiene el ARN total, la fase intermedia contiene el ADN. La fase acuosa debe entonces recuperarse con cuidado, para no tomar inadvertidamente la fase intermedia y orgánica. Se lleva a cabo una etapa de precipitación de ARN con isopropanol. A continuación, el sedimento de a Rn total se lava con etanol. Luego, los ARN totales se resolubilizan en agua y deben almacenarse a muy baja temperatura (-20 °C y mejor aún -80 °C).
Para obtener solo los ARN de bajo peso molecular, es posible usar kits que contienen columnas de purificación como el kit de Sigma, mirPremier™ microRNA Isolation Kit. Estos kits solo pueden usarse a escala de prueba de laboratorio porque los volúmenes considerados son del orden de mL y, por lo tanto, no pueden ser adecuados para el desarrollo de productos a gran escala.
Además, todos estos protocolos de extracción y purificación solo permitirán obtener la fracción de ácido nucleico purificada. Este ARN o ADN o fracción de ácido nucleico de pequeños ARN estará desprovisto de cualquier otra molécula de interés como metabolitos secundarios, vitaminas, azúcares, péptidos, etc. que pueden tener efectos beneficiosos para la piel y, por tanto, son de interés cosmético.
Además, conocemos por ejemplo el documento WO8403835 que describe un método para la obtención de un extracto acuoso de embriones vegetales enriquecidos en ADN puro. Un método de este tipo usa en particular embriones de trigo y/o soja molidos en una solución de extracción tamponada a pH 9,5 que contiene sacarosa, EDTA (0,05 M) y cloruro de sodio. Después de la filtración, el residuo se resuspende en una solución tris salina tamponada a pH 7,4 suplementada con detergente aniónico con agitación a temperatura ambiente, y luego adición de perclorato de sodio con agitación a 0 °C y adición de cloroformo y octanol antes de centrifugación a baja temperatura. (4 °C) y muy alta velocidad (25 000 g). Se recupera una fase acuosa que contiene esencialmente a Dn con una pequeña cantidad de ARN y aminoácidos, sobre la que puede hacerse actuar ventajosamente una ARNasa.
Por tanto, en este documento se da a conocer la obtención de un extracto acuoso de embriones vegetales específicamente enriquecidos en ADN mediante el uso de un gran número de tratamientos, incluidos tratamientos con un detergente aniónico y diversos disolventes como cloroformo y octanol que son capaces de dejar trazas tóxicas en los productos obtenidos y por tanto no pueden ser usados en cosmética.
También conocemos el documento FR2831168 que describe un método para obtener un extracto rico en ácidos nucleicos (ADN y/o ARN) a partir de un material vegetal, en particular embriones vegetales o semillas ricas en ADN o ARN. El método consiste en extraer el material vegetal en medio acuoso en presencia de enzimas celulolíticas a un pH inicial de 9 a 13, evolucionando el pH hacia la neutralidad (pH óptimo para la acción de estas enzimas) en unos minutos, separar luego el material vegetal para recuperar un extracto acuoso, y finalmente tratar el extracto con una proteasa y separar los insolubles para recuperar un extracto acuoso purificado. El producto liofilizado así obtenido puede contener en particular de 0,1 a 1 % en peso de ADN, de 0,2 a 1,5 % en peso de ARN así como carbohidratos, proteínas, minerales, vitamina B y lípidos.
Por tanto, según los datos descritos en este documento, el producto liofilizado obtenido parece contener en particular de 1 a 10 mg/L de ADN y de 10 a 75 mg/L de ARN.
Teniendo en cuenta lo anterior, un problema que la invención se propone resolver es desarrollar un método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido específicamente en pequeños ARN y que no comprenda ADN, a partir de un material vegetal, que sea fácil y económico de implementar a escala industrial, no requiriendo necesariamente el uso de enzimas celulolíticas (celulasa, hemicelulasa) o ADNasa, que ofrezcan buenos rendimientos de pequeños ARN, y no tengan las desventajas de los métodos del citado estado de la técnica, como por ejemplo el uso de detergentes y disolventes potencialmente tóxicos.
El extracto así obtenido puede entonces usarse directamente en cosmética.
El primer objetivo de la invención es, por tanto, un método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos a partir de un material vegetal que comprende las siguientes etapas:
a) el material vegetal se pone en contacto con el agua;
b) se añade ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tetrasódico a la mezcla obtenida en a), estando el pH de la mezcla entre 10,5 y 11;
c) a continuación, se ajusta el pH de la mezcla obtenida en b) a un valor entre 6 y 8;
d) la mezcla obtenida en c) se purifica para eliminar el material vegetal y recuperar un extracto acuoso crudo; y e) se realiza al menos una filtración del extracto acuoso crudo para obtener el extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, cuyo pH se controla y, si es necesario, se reajusta a un valor entre 6 y 8, preferentemente entre 6 y 6,5.
Además, un segundo objetivo de la invención es un extracto acuoso de materia vegetal, enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos obtenido por el método de acuerdo con la invención, caracterizado porque comprende en peso del peso total del extracto, de 5 a 60 g/kg de extracto seco y de 10 a 1000 mg/kg de pequeños ARN de una longitud máxima de 150 nucleótidos y no incluye ADN.
El tercer objetivo de la invención es una composición que comprende, como agente activo antienvejecimiento, una cantidad eficaz de un extracto de acuerdo con la invención y un medio fisiológicamente aceptable.
Un cuarto objetivo de la invención es el uso cosmético de una composición de acuerdo con la invención para combatir los signos del envejecimiento cutáneo.
Finalmente, un quinto objetivo de la invención es el uso cosmético de una composición de acuerdo con la invención para mejorar la hidratación de la piel.
La invención y las ventajas que se derivan de la misma se comprenderán mejor con la lectura de la descripción y las realizaciones no limitativas que siguen, elaboradas con referencia a las figuras adjuntas en las que:
• La Figura 1A representa una electroforesis sobre un gel de agarosa al 2 % que demuestra el efecto del pH sobre la extracción de los ARN de bajo peso molecular en extractos de acuerdo con el Ejemplo 2 (brotes de arroz) de la invención.
• La Figura 1B representa una electroforesis sobre un gel de agarosa al 2 % que demuestra el efecto de una hidrólisis enzimática sobre la extracción de los ARN de bajo peso molecular en extractos de acuerdo con el Ejemplo 2 (brotes de arroz) de la invención;
• la Figura 2 representa la cuantificación con el Bioanalyseur® de los ARN de bajo peso molecular de un extracto de acuerdo con el Ejemplo 3 (lentejas) de la invención;
• la Figura 3 representa la cuantificación mediante un Bioanalyseur® de los ARN de bajo peso molecular del extracto de acuerdo con el Ejemplo 4 (lentejas) de la invención antes y después del tratamiento con ADNasa;
• la Figura 4A muestra el efecto de diferentes extractos de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9, sobre la expresión de hialuronano sintasa 2 (HAS2) en fibroblastos humanos con 8 pases (P8); y
• La Figura 4B muestra el efecto de diferentes extractos de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9, sobre la expresión de hialuronano sintasa 2 (HAS2) en fibroblastos humanos con 32 pases (P32).
En esta descripción, a menos que se indique lo contrario, se entiende que, cuando se da un intervalo, incluye los límites superior e inferior de dicho intervalo.
La invención se refiere a un método implementado para obtener un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos a partir de un material vegetal. Cabe señalar que el método de la invención puede ir precedido de cualquier tipo de etapa de extracción preliminar conocido por los expertos en la técnica (hidrólisis química o enzimática, etc.) que permita, por ejemplo, eliminar previamente determinadas fracciones de planta que podrían perjudicar la correcta realización del método de la invención.
Por "pequeños ARN" o "ARN de bajo peso molecular" se entiende ARN (ácidos ribonucleicos) no codificantes de bajo peso molecular, con una longitud máxima de 150 nucleótidos, como todos los tipos de pequeños ARN no mensajeros, simples y/o bicatenarios, por ejemplo, microARN, ARN de interferencia, intrones, ARN nucleares pequeños o incluso cualquier fragmento de ARN.
Un material vegetal es generalmente una planta, un organismo vivo que forma parte del reino vegetal caracterizado por una motilidad muy baja, que se alimenta de sustancias minerales y absorbe dióxido de carbono, e incluye plantas cuyo ciclo de vida generalmente tiene lugar en el medio ambiente acuático como las algas.
Ventajosamente, para la implementación del método, el material vegetal de acuerdo con la invención es una planta completa o preferentemente una parte de una planta (frutos, hojas, raíces, bulbos, brotes, semillas...), que puede usarse en fresco, seco, germinado, entero, en polvo, congelado, pero también en forma de residuo vegetal obtenido después de la transformación como las tortas, o los granos usados. Para hacerlo todas las partes de las especies vegetales mencionadas pueden usarse para obtener un extracto extracto acuoso enriquecido con pequeños ARN de una longitud máxima de 150 nucleótidos. De esta forma, los ejemplos relacionados con determinadas partes de la planta se dan a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Cualquier fruta o parte de una fruta puede considerarse ventajosamente como material vegetal de partida para obtener un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular. Pueden citarse, por ejemplo, frutas enteras, en trozos, en formas de polvo, frescas o congeladas, en forma de granos usados. Pueden citarse los frutos de la familia de Passifloraceae, pero también frutos de otras familias, como los de la familia de Malváceas igual que Hibiscus esculentus (quimbombó). También pueden citarse frutos de la familia de Punicaceae igual que Punica granatum (la granada), los de la familia de Actinidiaceae igual que Actinidia chinensis (el kiwi), de la familia de Myrtaceae igual que Psidum guajava (guayaba), los frutos de la familia de Clusiaceae igual que Garcinia cambodgia (el tamarindo malabar), de la familia de Caricaceae igual que Carica papaya (papaya). Pero aún los frutos pertenecientes a la familia de Malphigiaceae igual que Malphigia glabra (acerola), los frutos en forma de bayas como los de la familia de Ericaceae igual que Vaccinium myrtillus (el arándano) y la familia de Grossulariaceae igual que Ribes nigrum (grosella negra). O aún fruto de la familia de Solanáceas, tal que Lycium barbarum (bayas de Goji).
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular también puede obtenerse de cualquier flor en forma entera, en polvo, fresca o congelada, por ejemplo, de la familia Rosáceas como rosas o la familia de Rutaceae igual que Citrus aurantium (flor de naranja amarga). También puede citarse el uso de flores de otras familias como las flores de la familia de Oleáceas igual que Jasminum officinalis(jazmín) o aún las flores de la familia de Asteraceae como Centaurea cyanus (el aciano).
Las semillas también pueden usarse como material vegetal de partida para obtener un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular. Cualquier semilla, entera en polvo, germinada o no germinada. A título indicativo y no restrictivo, las semillas pueden provenir de plantas de la familia de Chenopodiaceae como Quinoa chenopodium, de la familia de las leguminosas o Fabaceae igual que Lens esculenta (la lenteja) o aún perteneciente a la familia de Poaceae igual que Oryza sativa(el arroz). O aún, de la familia de Cucurbitáceas como la Cucurbita pepo (la calabaza), o incluso de Lamiaceae. También usables para la invención, las pequeñas semillas o pepitas de la familia de Rutaceae, o Rosáceaso cualquier otra especie que produzca frutos que contengan semillas o huesos. Las partes subterráneas de una planta como las raíces, o los rizomas, los bulbos también pueden considerarse como material vegetal de partida para obtener un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular. Estas partes subterráneas pueden estar enteras, en polvo, frescas, secas o congeladas. A título indicativo y no restrictivo las raíces o bulbos o rizomas, proceden de la familia de Liliáceas como Lilium candidum o Lilium tigrinum, pero también pueden ser consideradas para la invención todas las especies vegetales de la familia de Iridaceae, Amaryllidaceae, Alliaceae.
Cualquier tipo de hoja en forma entera, en polvo, fresca o congelada también puede considerarse como material vegetal de partida para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular, pueden citarse las plantas de la familia de Araliaceae o Dioscoreaceaeo cualquier otro tipo de familia de plantas que posea un sistema foliar desarrollado.
Las plantas usadas en los ejemplos se eligen preferentemente de la familia de Poaceae (antes gramíneas), Fabaceae comúnmente llamadas legumbres, Malvaceae, Bombacaceae, Cucurbitaceae, Chenopodiaceae o pseudocereal, Rosaceae, Rutaceae, liliaceae, Passifloraceae.
A modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, el material vegetal se elige entre las especies Hibiscus esculentus (quinbombó), Adansonia digitata (baobab),Chenopodium quinoa (quinua), Lens esculenta (lenteja), Oryza sativa (arroz), Cucurbita pepo (calabaza),Rosa centifolia (rosa), Citrus aurantium (naranja amarga), Lilium candidum (lirio), Lilium tigrinum (lirio tigre), Passiflora alata (granadilla).
En una primera etapa a) del método de acuerdo con la invención, el material vegetal se pone en contacto con agua, preferentemente en una relación material vegetal/agua de 4 a 20 % en peso/peso, más preferentemente en una relación de 5 a 15 %, por ejemplo, en una relación de 5, 10 o 15 % peso/peso.
El agua usada es agua destilada, desmineralizada o también agua rica en sales minerales y/o oligoelementos, preferentemente agua destilada.
Preferentemente, el material vegetal se muele antes de colocarlo en presencia de agua en la etapa a). El molido es una acción mecánica que permite una mejor extracción. El molido mecánico, seguido de lisis alcalina en presencia de EDTA promueve la desestructuración completa de la membrana celular y, en particular, de la membrana nuclear.
A continuación, se añade EDTA tetrasódico en la etapa b) a la mezcla obtenida en a). El pH en esta etapa es básico y debe ajustarse, si es necesario, aun valor entre 10,5 y 11 mediante la adición de hidróxido de sodio (NaOH). Durante la etapa b) es fundamental mantener el pH básico entre 10,5 y 11. De hecho, este nivel de pH, asociado a la acción del EDTA, provoca la desestructuración de la membrana celular, incluida la membrana nuclear, la lisis de las células y la desnaturalización del ADN (las 2 hebras de la doble hélice están separadas). El control del pH durante la etapa b) muestra que permanece básico y se estabiliza entre 9 y 11.
La concentración de EDTAtetrasódico está preferentemente entre 2 y 15 mM, y más preferentemente 10 mM.
Esta concentración se elige para optimizar el rendimiento de extracción de los ARN de bajo peso molecular en el extracto final. El EDTA tetrasódico debilitará y desestructurará las membranas pectocelulósicas de las células vegetales secuestrando por complejación los iones divalentes como los iones calcio que forman puentes iónicos entre las moléculas de pectina que rodean las microfibrillas de celulosa. La consecuencia de esto es promover la liberación del contenido celular durante la extracción. La etapa de tratamiento con EDTA es esencial para enriquecer el extracto en ARN de bajo peso molecular.
La etapa de tratamiento con EDTA dura preferentemente al menos 1 hora, a una temperatura entre 20 y 80 °C. Durante esta etapa, la mezcla obtenida en a) se agita ventajosamente.
A continuación, en una etapa c), el pH de la mezcla obtenida en b) se ajusta a un valor entre 6 y 8.
Por ejemplo, el pH se ajusta añadiendo una solución de ácido clorhídrico (HCl) o incluso cualquier ácido capaz de regular el pH compatible con el uso cosmético, como el ácido cítrico o láctico.
Esta etapa de acidificación provoca la renaturalización repentina del ADN (emparejamiento de las hebras del dúplex). Sin embargo, el ADN cromosómico, que es muy largo, no logra volver a emparejarse por completo y forma ovillos insolubles. Por el contrario, los pequeños ARN, mucho más cortos permanecen en solución. De esta forma, el ADN y los pequeños ARN se separan en dos fases distintas; una fase sólida que contiene, entre otras cosas, ADN cromosómico y una fase líquida que contiene, entre otras cosas, pequeños a Rn .
En una etapa d) se purifica la mezcla obtenida en c) para eliminar el material vegetal y recuperar un extracto acuoso crudo. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Preferentemente, la mezcla obtenida en c) se centrifuga a baja velocidad, por ejemplo, durante al menos 10 min a 4000 g, para sedimentar el material vegetal residual en el pellet y recuperar un extracto acuoso crudo en el sobrenadante.
Ventajosamente, antes de la etapa d) se añaden a la mezcla tierra de diatomeas o sílice a una concentración de 10 a 20 g/kg para obtener un pellet muy compacto durante la centrifugación, lo que permite obtener un sobrenadante libre de sólidos indeseados.
En la etapa e) se comprueba el pH y se reajusta a un valor entre 6 y 8. Preferentemente, el pH se reajusta a un valor entre 6 y 6,5, incluso más preferentemente a 6,5. El pH se reajusta añadiendo una solución de ácido clorhídrico (HCl) o hidróxido de sodio (NaOH).
De hecho, un pH por debajo de 6 puede conducir a la precipitación de ácidos nucleicos en general y, por tanto, de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
La etapa de ajuste del pH en la etapa e) del método de acuerdo con la invención es una etapa esencial para la extracción óptima de los ARN de bajo peso molecular.
Ventajosamente, el reajuste del pH de la etapa e) está precedido por al menos una filtración del extracto acuoso bruto obtenido en d). Preferentemente, las filtraciones sucesivas se llevarán a cabo bajando el umbral de filtración de 20 a 50 |jm y luego de 0,1 a 0,3 jm .
De acuerdo con una realización ventajosa, el método de acuerdo con la invención comprende una etapa adicional de hidrólisis realizada antes de la etapa c), bien directamente sobre la mezcla obtenida en b), o bien sobre el sobrenadante tras centrifugación de la mezcla obtenida en b) y eliminación del material vegetal, por la acción de al menos una enzima elegida entre una carbohidrasa, una celulasa y/o una proteasa, preferentemente una proteasa, durante al menos 1 hora, a una temperatura entre 45 y 65 °C y a un pH ajustado en función de la(s) enzima(s) usada(s), generalmente entre 6 y 8,5.
Cuando se lleva a cabo una etapa de hidrólisis adicional, el pH se reajusta si es necesario entre 6 y 8 y preferentemente entre 6 y 6,5 para preservar los ARN de bajo peso molecular extraídos durante las etapas anteriores y evitar que precipiten debido a un pH excesivamente ácido.
En esta realización ventajosa, el método comprende necesariamente además una etapa de desactivación de la enzima a una temperatura entre 65 y 80 °C durante al menos 1 hora, realizándose esta etapa de desactivación directamente después de la etapa de hidrólisis o entre 2 de las etapas de filtraciones sucesivas en e).
El segundo objetivo de la invención es un extracto acuoso de material vegetal, enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos de la invención, que puede obtenerse mediante el método descrito anteriormente.
En una realización particular, el extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos de la invención se obtiene mediante el método descrito anteriormente.
Este extracto no contiene ADN (ácido desoxirribonucleico).
Dicho extracto acuoso enriquecido con pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos comprende, antes de la dilución, en peso del peso total del extracto, de 5 a 60 g/kg de extracto seco y de 10 a 1000 mg/kg de pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos. El extracto obtenible mediante el método de acuerdo con la invención comprende además de 0,5 a 30 g/kg de fragmentos de proteínas y de 0,5 a 50 g/kg de azúcares. Dicho extracto puede comprender además de 0,01 a 5 g/kg de aminoácidos y de 0,01 a 4 g/kg de compuestos fenólicos.
El extracto así obtenido se considera concentrado. A continuación, puede diluirse en un disolvente fisiológicamente aceptable para uso cosmético, de modo que la concentración del extracto se ajuste entonces a un peso de extracto seco particular de interés.
A modo de ejemplos ilustrativos y no limitativos de disolventes fisiológicamente aceptables, pueden citarse agua, glicerol, etanol, propanodiol, así como su versión natural denominada Zemea® obtenida a partir de maíz, butilenglicol, dipropilenglicol, diglicoles etoxilados o propoxilados, polioles cíclicos o cualquier mezcla de estos disolventes.
Preferentemente, el extracto susceptible de ser obtenido por el método de acuerdo con la invención se diluye en un disolvente tal como 30 % de glicerol y agua, y comprende, en peso del peso total del extracto, de 5 a 35 g/kg de extracto seco y de 10 a 500 mg/kg de pequeños a Rn con una longitud máxima de 150 nucleótidos. Este extracto diluido comprende además de 0,5 a 20 g/kg de fragmentos de proteína y de 0,5 a 30 g/kg de azúcares. Un extracto diluido de este tipo también puede comprender de 0,01 a 3 g/kg de aminoácidos, de 0,01 a 2 g/kg de compuestos fenólicos.
A modo de ilustración, se describen a continuación ejemplos preferidos de realización del método de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1 : Preparación de un extracto de brotes de arroz (Oryza sativa) de la familia de Poaceae, enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene del arroz (Oryza sativa) de la familia de Poaceae (antes gramíneas).
En una primera etapa, se coloca en agua destilada el 5 % de los brotes de arroz en polvo y se añaden 10 mM de EDTAtetrasódico, es decir, 50 g de brote de arroz en polvo en 1 kg de agua destilada y 3,8 g de EDTAtetrasódico. El pH en esta etapa debe ser básico y entre 10,5 y 11 para un enriquecimiento óptimo del extracto en ARN de bajo peso molecular.
La mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente.
A continuación, se lleva a cabo la hidrólisis enzimática con proteasas (alcalasa® que es una endopeptidasa de serina y bromelina) añadidas al 2 % cada una con respecto al material vegetal involucrado, es decir, se añade 1 g de cada enzima a la mezcla. El pH se ajusta entre 7,5 y 8.
A continuación, la mezcla se calienta durante 2 horas a 55 °C, luego 2 horas a 80 °C para desactivar estas mismas enzimas.
A continuación, la mezcla se centrifuga con tierra de diatomeas (10 g por 1 kg de mezcla), 10 min a 4000 g, para eliminar el material sólido.
Al final de esta etapa, se comprueba el pH, antes de una posible dilución, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto.
A continuación, se realizan filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente para clarificar el extracto vegetal hasta la filtración esterilizante a 0,2 pm.
En general, se obtiene un extracto acuoso de brotes de arroz de color amarillo claro que contiene de 20 a 50 g/kg de extracto de peso seco, de 3 a 15 g/kg de fragmentos proteicos, de 5 a 30g/kg de azúcares, de 1,5 a 3 g/kg de aminoácidos, 300 a 750 mg/kg de compuestos fenólicos y 50 a 400 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para los brotes de arroz de la especie Oryza sativa, los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 23 g/kg de extracto en peso seco. El análisis físico-químico muestra que este extracto tiene una concentración de 4,8 g/kg de fragmentos proteicos, 8,2 g/kg de azúcares, 2,3 g/kg de aminoácidos, 328 mg/kg de compuestos fenólicos y 132 mg/kg de ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos. Este extracto puede diluirse posteriormente en agua y conservar mediante la adición de un disolvente cosmético como la glicerina y un conservante como el 1,5 % de fenoxietanol.
Ejemplo 2 : Estudio de la influencia del pH y la hidrólisis enzimática en la implementación del método.
Para estudiar la influencia del pH en la implementación del método de acuerdo con la invención, se llevaron a cabo pruebas de extracción a diferentes pH y para diferentes tipos de plantas.
Estas extracciones se llevaron a cabo en particular sobre el brote de arroz (como se describe en el Ejemplo 1). Pueden obtenerse resultados comparables en general para todos los tipos de plantas consideradas y más particularmente descritas de acuerdo con la invención.
Se coloca un 5 % de polvo de botes de arroz en agua, es decir, 50 g de polvo de brotes de arroz en 1 kg de agua destilada, y se añaden 10 mM de EDTA tetrasódico (es decir 3,8 g). El pH se ajustó a 7 o a 11 añadiendo entre 1 y 3 mL de hidróxido de sodio concentrado, luego la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente.
Entonces, se toman muestras durante el método de extracción para observar el enriquecimiento en ARN de bajo peso molecular para cada extracto después de esta etapa clave.
Se realiza así una electroforesis en gel de agarosa al 2 % para visualizar la presencia de los ARN de bajo peso molecular (Figura 1A).
Como se ilustra en la Figura 1A, puede observarse que el pH óptimo para enriquecer el extracto en ARN de bajo peso molecular es un pH básico de 11; de hecho, a pH 7, el extracto no contiene ARN de bajo peso molecular (ausencia de bandas característica).
El uso de un pH básico durante la etapa de tratamiento con EDTA es por tanto una condición esencial para la implementación del método de acuerdo con la invención.
En segundo lugar, la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con proteasas (alcalasa® y bromelina) al 2 % cada una con respecto al material vegetal involucrado, es decir, 1 g de cada enzima, en la mezcla. El pH se ajusta entre 7,5 y 8, el pH óptimo para la actividad enzimática y el óptimo para mantener los ARN de bajo peso molecular solubles en la mezcla, un pH por debajo de 6 hace que precipiten.
A continuación, se calienta la mezcla durante 2 horas a 55 °C, la temperatura óptima para la actividad de las enzimas, luego 2 horas a 80 °C para desactivar estas mismas enzimas.
A continuación, la mezcla se centrifuga con tierra de diatomeas (10 g por 1 kg de mezcla), 10 min a 4000 g, para eliminar el material sólido.
Al final de esta etapa, se comprueba el pH, antes de una posible dilución, para situarlo entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto.
A continuación, se realizan filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente para clarificar el extracto vegetal hasta la filtración esterilizante con una porosidad de 0,2 pm.
El extracto final se visualiza mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2 % (Figura 1B).
Como se ilustra en la Figura 1B, ventajosamente, se observa que el uso de enzima(s) mejora el rendimiento de extracción de los ARN de bajo peso molecular en el extracto final.
Este resultado se observó en diferentes tipos de plantas extraídas. El hecho de que las enzimas potencien la extracción de los ARN de bajo peso molecular podría deberse al hecho de que las proteínas a menudo se unen a los ácidos nucleicos; la degradación de proteínas por enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas creando fragmentos proteicos de pequeño tamaño (menos de 10 kDa), permitiría disociar los ARN unidos a las proteínas y liberarlos aumentando así su rendimiento final en el extracto.
Ejemplo 3 : Preparación de un extracto de lentejas (Lens esculenta) de la familia de Fabaceae enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene de lentejas (Lens esculenta).
En una primera etapa, las lentejas se hacen germinar el día anterior al método de extracción, es decir, 40 g de lentejas cubiertas con agua destilada.
Al día siguiente, se añade agua destilada para obtener el equivalente al 4 % de las lentejas usadas en el método de extracción.
A continuación, se muelen las lentejas (40 g c.s.p. 1 kg de agua destilada) y se añaden 10 mM de EDTA tetrasódico (es decir, 3,8 g). El pH se ajusta a 11 mediante la adición de una solución de NaOH y la mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente.
Ventajosamente, se lleva a cabo una filtración de gran porosidad para eliminar los residuos sólidos.
Las proteasas (2 % de bromelina y 2 % de alcalasa® en relación con el material vegetal involucrado) se añaden entonces al filtrado para realizar la hidrólisis enzimática, teniendo cuidado de permitir que las enzimas se disuelvan antes de ajustar el pH entre 7,5 y 8 añadiendo una solución de HCl.
El filtrado se mantiene bajo agitación durante 2 horas a 55 °C, mientras tiene lugar la hidrólisis.
A continuación, se llevan a cabo filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaños entre 20 y 50 |jm y luego entre 7 y 20 jm para clarificar el extracto vegetal acuoso crudo.
A continuación, el extracto se calienta durante 1 hora a 80 °C para desactivar las enzimas.
Se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 0,3 a 0,4 jm .
En esta etapa del método de extracción, es importante controlar bien el pH, antes de una posible dilución, para situarlo ventajosamente entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto.
En general, se obtiene un extracto acuoso de lentejas de color rojo ámbar que contiene de 15 a 25 g/kg de extracto de peso seco, de 3 a 8 g/kg de fragmentos de proteína, de 2 a 8 g/kg de azúcares, de 1 a 3 g/kg de aminoácidos, 300 a 750 mg/kg de compuestos fenólicos y 50 a 150 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para lentejas de la misma especie (Lens esculenta), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 15,4 g/kg de extracto de peso seco, 6,9 g/kg de fragmentos proteicos, 2,1 g/kg de azúcares, 1,4 g/kg de aminoácidos, 400 mg/kg de compuestos fenólicos y 96 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto se diluye en agua o en un disolvente fisiológicamente aceptable que comprende, por ejemplo, agua y 30 % de glicerol, de modo que el extracto final se ajusta a 10 g/kg de extracto en peso seco.
El análisis físicoquímico muestra que después de la dilución este extracto tiene una concentración de fragmentos proteicos de 5,1 g/kg, de azúcares de 1,5 g/kg, de aminoácidos de 0,8 g/kg, de compuestos fenólicos de 280 mg/kg y de 70 mg/kg en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) como se ilustra más particularmente en la Figura 2 mediante la cuantificación de los ARN de bajo peso molecular en Bioanalyseur® (Agilent).
El Bioanalyseur® es un dispositivo que permite llevar a cabo una electroforesis miniaturizada mediante chips electrónicos específicos para el análisis de ácidos nucleicos como el de los ARN de bajo peso molecular. Permite determinar el tamaño y la concentración contenida en un extracto de unos pocos microlitros. El resultado se presenta en forma de gráfico con una unidad de fluorescencia arbitraria en ordenadas (FU) y en abscisas el número de nucleótidos (nt). Se añade un marcador interno a cada análisis (pico a 4 nt en la Figura 2), y sirve como control interno para validar el buen progreso del análisis.
Ejemplo 4 : Ensayo relativo a la ausencia de ADN en el extracto de acuerdo con el Ejemplo 3 (lentejas)
Para verificar que el ácido nucleico obtenido en los extractos de acuerdo con la invención es efectivamente ARN, y más particularmente ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos), y no ADN, un ensayo mediante el uso de una ADNasa (OPTIZYME™ Fisher Bioreagent) que degrada específicamente el ADN se llevó a cabo siguiendo el protocolo recomendado por el proveedor.
Se ha realizado una solución de control que contiene 500 jg/m L de ADN de salmón (Sigma, 31149-10g-F) y otra solución de control que contiene 500 jg/m L de los ARN de bajo peso molecular de levadura Torula (Sigma R6625 25G). El volumen de reacción contiene para 1 |jg de ADN o ARN, 1 jL de ARNasa, 1 jL de tampón 10X y se completa hasta 10 jL con agua DEPC (dietilpirocarbonato) al 0,1 % v/v. A continuación, la mezcla de reacción se incuba durante 30 minutos a 37 °C, condición óptima para la reacción de la ADNasa. A continuación, la enzima se desactiva añadiendo 50 mM de EDTAtetrasódico y calentando durante 10 minutos a 65 °C.
Para visualizar el perfil de las soluciones de control y del extracto de acuerdo con el Ejemplo 3 después de la acción de la ADNasa, se cuantificaron los pequeños ARN con el Bioanalyseur®, antes y después del tratamiento con ADNasa. Los perfiles obtenidos con o sin tratamiento con ADNasa del extracto vegetal son idénticos, permaneciendo igual la cantidad, es decir, aproximadamente 30 mg/kg, como se ilustra en la Figura 3. Se añade un marcador interno a cada análisis (pico a 4 nt en la Figura 3), y sirve como control interno para validar el buen progreso del análisis.
La prueba de ADNasa, una enzima que degrada específicamente el ADN y no el ARN, demuestra que el ácido nucleico del extracto de acuerdo con el Ejemplo 3 todavía está presente después del tratamiento con ADNasa. Por tanto, es de hecho ARN, en particular ARN de bajo peso molecular, con una longitud máxima de 150 nucleótidos, y no ADN. Ejemplo 5 : Preparación de extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) de la familia de Malváceas, enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene a partir de frutos de quimbombó de la especie Hibiscus esculentus.
En una primera etapa, después de descongelar, el 10 % de fruta Hibiscus esculentus se mezclan en agua destilada, por ejemplo 100 g de fruta en 1 kg de agua destilada, luego se muelen durante 10 minutos con la adición de EDTA tetrasódico hasta una concentración final de 10 mM, es decir, 3,8 g para 1 kg. El pH en esta etapa está entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto con pequeños ARN.
A continuación, esta mezcla se agita durante 2 horas a 45 °C. Incluso si bien la temperatura en esta etapa puede variar de 20 °C a 80 °C, para esta especie una temperatura de 45 °C resulta ser la temperatura que permite obtener los mejores resultados en términos de enriquecimiento del extracto acuoso final en ARN de bajo peso molecular. Al final de las 2 horas, se añade tierra de diatomeas (o sílice) a una concentración de 10 g/kg y la mezcla se agita durante 10 minutos más, seguido de centrifugación a 4000 g durante 10 minutos.
A continuación, se recoge el sobrenadante. Este extracto crudo contiene en particular fragmentos de proteínas, azúcares y ARN de bajo peso molecular.
Se añaden proteasas (2 % de bromelina y 2 % de alcalasa® respecto a la cantidad de material vegetal involucrado) para realizar la hidrólisis enzimática, cuidando que las enzimas se disuelvan antes de ajustar el pH entre 7,5 y 8. La solución cruda se mantiene en agitación durante 2 horas a 55 °C, mientras tiene lugar la hidrólisis. La hidrólisis enzimática permitirá obtener fragmentos proteicos de bajo peso molecular (menos de 10 kDa, las proteínas de alto peso molecular pueden ser alergénicas). Tales fragmentos de proteína así obtenidos también pueden exhibir una interesante actividad biológica a nivel de la piel.
Para iniciar la clarificación del extracto crudo, se realizan entonces filtraciones secuenciales en filtros de porosidad decreciente de tamaños entre 20 y 50 jm luego 7 y 20 jm , seguido de una etapa de calentamiento a alta temperatura del extracto a 80 °C durante la noche. Esta etapa permite desactivar las proteasas que bajo la acción de un fuerte calor se desnaturalizan y se vuelven entonces inactivas.
A continuación, se continúan las filtraciones hasta una filtración esterilizante de 0,1 a 0,3 jm .
El extracto vegetal debe tener un pH final de entre 6 y 8 para evitar la precipitación de los ARN de bajo peso molecular. En esta etapa del método de extracción, es necesario comprobar el pH, antes de una posible dilución, para situarlo aún más preferentemente entre 6 y 6,5.
En general, se obtiene un extracto acuoso de color amarillo pálido que contiene de 10 a 20 g/kg de extracto de peso seco, 2 a 5 g/kg de fragmentos proteicos, 2,5 a 5 g/kg de azúcares, 0,1 a 2 g/kg de aminoácidos, 0,2 a 3 g/kg de compuestos fenólicos y 10 a 100 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para frutos de quimbombó de la misma especie(Hibiscus esculentus), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, obtenemos más particularmente un extracto acuoso que titula 13,3 g/kg de extracto de peso seco, 3,2 g/kg de fragmentos de proteína, 3,9 g/kg de azúcares, 790 mg/kg de aminoácidos, 490 mg/kg de fenólico compuestos y 60 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto se diluye en un disolvente fisiológicamente aceptable que comprende, por ejemplo, agua y glicerol al 30 %, de modo que el extracto final se ajusta a 10 g/kg de extracto en peso seco.
El análisis físico-químico muestra que después de la dilución el extracto tiene una concentración de fragmentos proteicos de 2,5 g/kg, de azúcares de 2,7 g/kg, de aminoácidos de 520 mg/kg, de compuestos fenólicos de 320 mg/kg y 35 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos
Ejemplo 6 : Demostración del papel de una etapa de tratamiento con EDTA en la implementación de un método para extraer pequeños ARN del quimbombó (Hibiscus esculentus)
Para demostrar el papel de una etapa de tratamiento con EDTA durante la extracción de los ARN de bajo peso molecular, se obtuvo, un extracto de frutas de Hibiscus esculentus modificando ciertas etapas esenciales del método de acuerdo con la invención, no permitiendo que el extracto se enriqueciera en ARN de bajo peso molecular.
Se mezclan 15 % de frutas descongeladas de Hibiscus esculentus con agua destilada y luego se muelen, es decir, 150 g de frutas en 1 kg de agua destilada.
A continuación, las proteasas se añaden secuencialmente: 2 % de alkalase® en relación con el material vegetal usado (es decir, 3 g) a pH 8 durante 2 horas a 55 °C (condición óptima para esta enzima), luego 2 % de bromelina (es decir, 3 g) a pH ajustado a un valor entre 4 y 4,5 durante 2 horas a 55 °C.
Entonces, esta mezcla se centrifuga para eliminar los residuos sólidos.
Para iniciar la clarificación del extracto crudo, se realizan entonces filtraciones secuenciales en filtros de porosidad decreciente de tamaños entre 20 y 50 pm luego 7 y 20 pm, seguido de una etapa de calentamiento a alta temperatura del extracto a 80 °C durante la noche.
Se continúan las filtraciones hasta una filtración esterilizante de 0,1 a 0,3 pm.
A continuación, el extracto acuoso obtenido se diluye en un disolvente fisiológicamente aceptable que comprende, por ejemplo, agua y glicerol al 30 %, hasta alcanzar 9,6 g/kg de extracto de peso seco. El pH del extracto final está entre 4 y 4,5.
El análisis físico-químico muestra que el extracto vegetal final, después de la dilución, tiene una concentración de fragmentos proteicos de 2,2 g/kg, de azúcares de 3,8 g/kg, 550 mg/kg de aminoácidos y 243 mg/kg de compuestos fenólicos.
El análisis con un Bioanalyseur® indica que la concentración en los ARN de bajo peso molecular es cero para este extracto. Este resultado demuestra que un extracto obtenido de un método de extracción que no tiene una etapa de tratamiento con EDTA no contiene ARN de bajo peso molecular. Por tanto, la etapa de tratamiento con EDTa es fundamental para obtener un extracto rico en a Rn de bajo peso molecular de acuerdo con la invención.
Ejemplo 7 : Preparación de un extracto de baobab(Adansonia digitata)de la familia de Bombacaceae enriquecido con pequeños ARN
A partir de baobab de la especie Adansonia digitata se obtiene un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos).
En una primera etapa, el 5 % de la torta de semillas de baobab (Adansonia digitata)) se muelen en seco o directamente en agua que contiene EDTA tetrasódico a una concentración final de 10 mM, es decir, 50 g de torta de baobab en 1 kg de agua destilada con 3,8 g de EDTA tetrasódico. El pH en esta etapa es básico y más particularmente entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto en ARN de bajo peso molecular.
La mezcla se agita durante 2 horas a 58 °C.
Para esta especie, ventajosamente se lleva a cabo una etapa de hidrólisis con una enzima proteolítica: Se añade un 2 % de papaína en relación con la cantidad de material vegetal involucrado (es decir, 1 g). El pH de la mezcla se ajusta entre 7 y 8 si es necesario y se agita durante 2 horas a 58 °C, condiciones óptimas para esta enzima.
A continuación, el pH se ajusta a 8 y luego el extracto se centrifuga durante 10 minutos a 4000 g para eliminar la materia sólida.
A continuación, se realizan filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 pm y luego entre 7 y 20 pm para clarificar el extracto vegetal.
A continuación, el extracto se calienta a 80 °C entre 8 y 12 horas para desactivar térmicamente la enzima.
Se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 0,3 a 0,4 |jm. En esta etapa del método de extracción, es necesario comprobar el pH, antes de una posible dilución, para situarlo entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto. Un pH ácido puede conducir a la precipitación de ácidos nucleicos en general y por tanto también de los ARN de bajo peso molecular.
En general, se obtiene un extracto acuoso de baobab de color rojo ámbar que contiene de 15 a 25 g/kg de extracto de peso seco, de 3 a 8 g/kg de fragmentos de proteína, de 2 a 8 g/kg de azúcares, de 0,05 a 1 g/kg de aminoácidos, de 0,05 a 1 g/kg de compuestos fenólicos y de 10 a 80 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, los extractos obtenidos de la especie Adansonia digitata puede exhibir una variabilidad significativa dependiendo de factores como la ubicación de la cosecha, el año de la cosecha, la temporada, las condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, obtenemos más particularmente un extracto acuoso que titula 17 g/kg de extracto de peso seco, 5,3 g/kg de fragmentos de proteínas, 5,4 g/kg de azúcares, 650 mg/kg de aminoácidos, 441 mg/kg de compuestos fenólicos y 57 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto se diluye en una mezcla de agua a la que se añaden 30 % de glicerol y 1,5 % de fenoxietanol, lo que permite obtener un extracto final a 12 g/kg de extracto seco.
El análisis físico-químico muestra que después de la dilución este extracto tiene una concentración de fragmentos proteicos de 2.9 g/kg, de azúcares de 4 g/kg, de aminoácidos de 400 mg/kg, de compuestos fenólicos de 310 mg/Kg, y de 41 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Ejemplo 8 : Demostración del papel de una etapa de tratamiento con EDTA para la implementación de un método para extraer pequeños ARN de baobab (Adansonia digitata)
Para demostrar el papel de una etapa de tratamiento con EDTA durante la extracción de los ARN de bajo peso molecular, de un extracto de baobab (Adansonia digitata) también se obtuvo, modificando ciertas etapas esenciales del método de acuerdo con la invención, no permitiendo que el extracto se enriqueciera en ARN de bajo peso molecular.
En una primera etapa, el 10 % de la torta de semillas de baobab (Adansonia digitata) se muele y luego se añade agua, es decir, 100 g de torta de baobab en 1 kg de agua destilada.
Para esta especie, se lleva a cabo la hidrólisis con una enzima proteolítica: Se añade un 2 % de papaína en relación con la cantidad de material vegetal involucrado, es decir, 2 g. Se ajusta el pH entre 7 y 8 y se agita la mezcla durante 2 horas a 58 °C, condiciones óptimas para la actividad de la enzima. Después de este período, el pH se bajó a 4,5, un pH comúnmente usado para ingredientes cosméticos.
A continuación, el extracto se centrifuga durante 10 minutos a 4000 g para eliminar la materia sólida. A continuación, el extracto se calienta a 80 °C entre 8 y 12 horas para desactivar la enzima a alta temperatura.
A continuación, se llevan a cabo filtraciones secuenciales en filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 jm y luego hasta una porosidad de 0,3 a 0,4 jm .
Se obtiene entonces un extracto acuoso de color amarillo claro que contiene 12,5 g/kg de extracto de peso seco, 5,8 g/kg de fragmentos de proteína, 7,6 g/kg de azúcares, 540 mg/kg de aminoácidos y 440 mg/kg de compuestos fenólicos.
A continuación, el extracto se diluye en agua y glicerol para obtener un extracto final al 30 % de glicerol y se ajusta a 10 g/kg de extracto de peso seco.
El análisis físico-químico muestra que después de la dilución el extracto vegetal tiene una concentración de fragmentos proteicos de 3,25 g/kg, de azúcares de 5,1 g/kg, de aminoácidos de 310 mg/kg y de compuestos fenólicos de 250 mg/kg. . En estas condiciones de extracción (sin tratamiento con EDTA), el análisis con un Bioanalyseur® indica que la concentración en los ARN de bajo peso molecular es cero para este extracto. Este resultado confirma que un extracto obtenido de un método de extracción en ausencia de tratamiento con EDTA (a pH básico) no contiene ARN de bajo peso molecular. La etapa de tratamiento con EDTA es fundamental para obtener un extracto rico en ARN de bajo peso molecular de acuerdo con la invención.
Ejemplo 9 : Estudio de la influencia del pH final en la preparación de extractos de quimbombó (Hibiscus esculentus) y de baobab (Adansonia digitata)
El método de extracción se realiza en las mismas condiciones operativas que los Ejemplos 5 y 7, para enriquecer un extracto en ARN de bajo peso molecular, además de la etapa final de ajuste del pH.
Este método de extracción se realiza con una etapa de tratamiento con EDTA tetrasódico, seguida de la etapa de hidrólisis enzimática, pero con un ajuste final del extracto a un pH ácido entre 4 y 4,5 en lugar de un pH entre 6 y 8. Esto genera la precipitación de los ARN de bajo peso molecular, resultados confirmados por el análisis del Bioanalyseur® que da una concentración cero en los ARN de bajo peso molecular para cada uno de los extractos de quimbombó (Hibiscus esculentus) y de baobab (Adansonia digitata) así obtenido.
Ejemplo 10 : Preparación de un extracto de calabaza (Cucúrbita pepo)de la familia de Cucurbitáceas enriquecido con pequeños ARN
Se obtiene un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular(con una longitud máxima de 150 nucleótidos) a partir de la calabaza (Cucurbita pepo) de la familia de las Cucurbitáceas.
En una primera etapa, se mezcla el 10 % de la torta de pepitas de calabaza con agua y se añade EDTA tetrasódico para obtener una concentración final de 10 mM, es decir, 100 g de torta de calabaza en 1 kg de agua destilada y 3,8 g de EDTA tetrasódico.
El pH en esta etapa debe ser básico y más particularmente entre 10,5 y 11 para un enriquecimiento óptimo del extracto en ARN de bajo peso molecular.
La mezcla se agita durante 2 horas a 45 °C.
A continuación, se lleva a cabo la hidrólisis enzimática con proteasas: Se añaden así a la mezcla 2 % de alcalasa® y 4 % de papaína en relación con la cantidad del material vegetal involucrado, es decir, 2 g de alcalasa® y 4 g de papaína. El pH se ajusta entre 7,5 y 8, que es el pH óptimo de actividad para estas dos enzimas, permaneciendo este pH óptimo para mantener los ARN de bajo peso molecular solubles en la mezcla, un pH por debajo de 6 puede hacer que precipiten.
A continuación, se calienta la mezcla durante 2 horas a 50 °C, temperatura óptima para la actividad de las enzimas, luego durante 2 horas a 80 °C para desactivar estas mismas enzimas.
A continuación, la mezcla se centrifuga con tierra de diatomeas (10 g por 1 kg de mezcla), 10 min a 4000 g, para eliminar el material sólido.
Al final de esta etapa, se comprueba el pH, antes de una posible dilución, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto.
A continuación, se realizan filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 |jm y luego entre 7 y 20 jm para clarificar el extracto vegetal. Luego, se continúan las filtraciones hasta esterilizar con la filtración a 0,2 jm .
En general, se obtiene un extracto acuoso de color amarillo claro que contiene de 20 a 50 g/kg de extracto seco, de 3 a 25 g/kg de fragmentos proteicos, de 1 a 10 g/kg de azúcares y de 50 a 250 mg/kg. de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para calabazas de la misma especie (Cucurbita pepo), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 37,3 g/kg de extracto de peso seco, 18,4 g/kg de fragmentos de proteína, 3,8 g/kg de azúcares y 168 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto puede diluirse en un disolvente fisiológicamente aceptable que comprenda, por ejemplo, agua y glicerol al 30 %.
Ejemplo 11 : Preparación de un extracto de quinua (Chenopodium quinoa), de la familia de las quenopodiáceas o pseudocereales, enriquecido con pequeños ARN
Se obtiene un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) a partir de quinua Chenopodium quinoa, de la familia de las quenopodiáceas o pseudocereales.
En una primera etapa, las semillas de quinua germinadas (10 % del peso final, es decir, 100 g) se usan en el método de extracción y se mezclan en 1 kg de agua destilada, luego se muelen y se añade EDTA tetrasódico para obtener una concentración final de 10 mM, es decir 3,8 g. El pH en esta etapa debe ser básico y estar comprendido entre 10,5 y 11, ajustándose así el pH con NaOH, para un enriquecimiento óptimo del extracto de acuerdo con la invención en ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos. La mezcla se agita durante 2 horas a 55 °C.
A continuación, se lleva a cabo la hidrólisis enzimática con proteasas: Se añaden a la mezcla 2 % de alcalasa® y 2 % de bromelina (en relación con el material usado). El pH se ajusta entre 7,5 y 8, el pH óptimo para la actividad de estas dos enzimas, permaneciendo este pH óptimo para mantener los ARN de bajo peso molecular solubles en la mezcla, un pH por debajo de 6 hace que precipiten.
La mezcla se calienta durante 2 horas a 45 °C, temperatura óptima para la actividad de las enzimas.
A continuación, la mezcla se centrifuga con tierra de diatomeas (10 g por 1 kg de mezcla), 10 min a 4000 g, para eliminar el material sólido.
Luego, el filtrado se calienta durante 2 horas a 80 °C para desactivar estas enzimas.
A continuación, se realizan filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 |jm y luego entre 7 y 20 jm para clarificar el extracto vegetal.
Después de esta etapa de filtración, es posible diluir el extracto preferentemente en agua y glicerol para obtener un extracto final que contenga 30 % de glicerol.
Luego, se continúan las filtraciones hasta esterilizar con la filtración a 0,2 jm .
En general, se obtiene un extracto de color amarillo claro que contiene de 20 a 50 g/kg de extracto de peso seco, de 3 a 15 g/kg de fragmentos de proteína, de 10 a 30 g/kg de azúcares, de 0,5 a 5 g/kg de aminoácidos, 100 a 700 mg/kg de compuestos fenólicos y 50 a 250 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Pueden obtenerse resultados similares con semillas de quinua no germinadas o con harina de quinua.
Sin embargo, para quinua de la misma especie (Chenopodium quinoa), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 33 g/kg de extracto de peso seco, 9,5 g/kg de fragmentos proteicos, 21,6 g/kg de azúcares, 1,8 g/kg de aminoácidos, 364 mg/kg de compuestos fenólico y 173 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto puede diluirse en un disolvente fisiológicamente aceptable que comprenda, por ejemplo, agua y glicerol al 30 %.
Ejemplo 12 : Preparación de un extracto de rosa (Rosa centifolia) de la familia de Rosáceas enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene de rosa (Rosa centifolia) de la familia de las Rosáceas. En este ejemplo, se usa toda la flor fresca.
En una primera etapa, se mezcla el 10 % de las rosas en agua destilada, por ejemplo 100 g de flores se complementa con 1 kg de agua destilada, luego se muelen durante 10 minutos con la adición de EDTA tetrasódico hasta una concentración final de 10 mM, es decir, 3,8 g por 1 kg. El pH en esta etapa está entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto con pequeños ARN.
A continuación, esta mezcla se agita durante 1 hora a 80 °C. Incluso si bien la temperatura en esta etapa puede variar de 50 °C a 80 °C, para esta especie una temperatura de 80 °C resulta ser la temperatura que permite obtener los mejores resultados en términos de enriquecimiento del extracto acuoso final en ARN de bajo peso molecular.
Al final de esta etapa, se realizan entonces filtraciones secuenciales en filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 pm luego 7 y 20 pm para eliminar el material sólido y luego clarificar el extracto vegetal.
En esta etapa, se controla el pH, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto. Luego, se continúan las filtraciones hasta esterilizar con la filtración a 0,2 jm .
En general, se obtiene un extracto acuoso de color ámbar que contiene de 5 a 20 g/kg de extracto seco, de 1 a 10 g/kg de fragmentos proteicos, de 1 a 10 g/kg de azúcares, de 0,5 a 2 g/kg de compuestos fenólico y de 20 a 200 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para rosas de la misma especie (Rosa centifolia), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, obtenemos más particularmente un extracto acuoso que contiene 11,3 g/kg de extracto seco, 5,1 g/kg de fragmentos proteicos, 2,6 g/kg de azúcares, 1 g/kg de compuestos fenólicos y 96 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto puede diluirse con, por ejemplo, glicerol al 30 %, lo que permite obtener un extracto final a 8 g/kg de extracto de peso seco.
El análisis físico-químico muestra que después de la dilución este extracto tiene una concentración de fragmentos proteicos de 4,6 g/kg, de azúcares de 2 g/kg, de aminoácidos de 280 mg/kg, de compuestos fenólicos de 800 mg/kg y 83 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Ejemplo 13 : Preparación de un extracto de flores de naranja amarga (Citrus aurantium) de la familia de Rutaceae enriquecido con pequeños ARN
A partir de flores de naranja amarga (Citrus aurantium) de la familia Rutaceae, se obtiene un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) En este ejemplo, se usa toda la flor fresca.
En una primera etapa, el 5 % de las flores de naranja agria se mezclan en agua destilada, es decir, por ejemplo, 50 g de flores se complementa con 1 kg de agua destilada, luego se muelen durante 5 minutos con la adición de EDTA tetrasódico a una concentración final de 10 mM, es decir, 3,8 g por 1 kg. El pH en esta etapa está entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto con pequeños ARN.
A continuación, esta mezcla se agita durante 1 hora a 45 °C. Incluso si bien la temperatura en esta etapa puede variar de 25 °C a 50 °C, para esta especie una temperatura de 45 °C resulta ser la temperatura que permite obtener los mejores resultados en términos de enriquecimiento del extracto acuoso final en ARN de bajo peso molecular.
Al final de esta etapa, se realizan entonces filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 pm luego 7 y 20 pm, para eliminar el material sólido y luego clarificar el extracto vegetal.
En esta etapa, se controla el pH, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto.
A continuación, se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 0,3 a 0,5 pm.
En general, se obtiene un extracto acuoso de color ámbar que contiene de 5 a 20 g/kg de extracto de peso seco, 1 a 10 g/kg de fragmentos proteicos, 1 a 10 g/kg de azúcares, 200 a 1000 mg/Kg de compuestos fenólicos y de 10 a 100 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para flores de la misma especie (Citrus aurantium), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 11,8 g/kg de extracto de peso seco, 4,5 g/kg de fragmentos proteicos, 3,8 g/kg de azúcares, 560 mg/kg de compuestos fenólicos y 20 mg/kg de ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto puede diluirse en un disolvente fisiológicamente aceptable, como agua o glicerol.
Ejemplo 14 : Preparación de un extracto de lirio (Lilium candidum) enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene del bulbo de lirio blanco (Lilium candidum) de la familia Liliaceae.
En una primera etapa, 15 % de los bulbos de lirio se colocan en agua destilada, por ejemplo 150 g de bulbos en 1 kg de agua destilada que contiene EDTA tetrasódico a una concentración final de 10 mM, es decir,3.8 g para 1 kg, luego la solución se muele durante 5 minutos. El pH en esta etapa está entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto con pequeños ARN.
A continuación, esta mezcla se agita durante 30 minutos a 65 °C. Incluso si bien la temperatura en esta etapa puede variar de 50 °C a 80 °C y el tiempo de agitación de 30 minutos a 1 hora, para esta especie una temperatura de 65 °C durante 30 minutos resultan ser las condiciones que permiten obtener los mejores resultados en términos de enriquecimiento del extracto acuoso final en ARN de bajo peso molecular.
Al final de esta etapa, se realizan entonces filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 pm luego 7 y 20 pm, para eliminar el material sólido y luego clarificar el extracto vegetal.
En esta etapa, se controla el pH, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto. Se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 2 a 4 pm. A continuación, el extracto puede conservarse añadiendo un 30 % de glicerol y un 1,5 % de fenoxietanol. Se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 0,2 a 0,3 pm.
En general, se obtiene un extracto acuoso de color amarillo que contiene de 10 a 25 g/kg de extracto de peso seco, 0,5 a 5 g/kg de fragmentos proteicos, 2 a 15 g/kg de azúcares, 100 a 500 mg/kg de compuestos fenólicos y de 10 a 100 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para lirios de la misma especie (Lilium candidum), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 16,3 g/kg de extracto seco en peso, 1,5 g/kg de fragmentos proteicos, 5,3 g/kg de azúcares, 200 mg/kg de compuestos fenólicos y 20 mg/Kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto puede diluirse en un disolvente fisiológicamente aceptable, como agua o glicerol.
Ejemplo 15 : Preparación de un extracto de lirio (Lilium tigrinum) de la familia de las Liliáceas enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene del bulbo del lirio tigre (Lilium tigrinum) de la familia Liliaceae.
En una primera etapa, después de lavar y descongelar, se mezcla el 10 % de los bulbos de lirio en agua destilada, por ejemplo 100 g de bulbos en 1 kg de agua destilada que contiene EDTA tetrasódico a una concentración final de 10 mM, es decir,3.8 g para 1 kg, luego la mezcla se muele durante 5 minutos. El pH en esta etapa está entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto con pequeños ARN.
A continuación, esta mezcla se agita durante 1 hora a 80 °C. Incluso si bien la temperatura en esta etapa puede variar de 50 °C a 80 °C y el tiempo de agitación de 30 minutos a 1 hora, para esta especie una temperatura de 80 °C durante 1 hora da como resultado las condiciones que permiten obtener los mejores resultados en términos de enriquecimiento del extracto acuoso final en ARN de bajo peso molecular.
Al final de esta etapa, se realizan entonces filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 pm luego 7 y 20 pm, para eliminar el material sólido y luego clarificar el extracto vegetal.
En esta etapa se controla el pH, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto. Se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 0,2 a 0,3 pm.
En general, se obtiene un extracto acuoso de color amarillo que contiene de 10 a 25 g/kg de extracto de peso seco, 0,5 a 5 g/kg de fragmentos proteicos, 5 a 20 g/kg de azúcares, 100 a 500 mg/kg de compuestos fenólicos y de 10 a 100 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Sin embargo, para lirios de la misma especie (Lilium tigrinum), los extractos obtenidos pueden presentar una variabilidad significativa en función de factores como lugar de cosecha, año de cosecha, época, condiciones climáticas, etc.
En este ejemplo, se obtiene más particularmente un extracto acuoso que contiene 17,9 g/kg de extracto de peso seco, 2,1 g/kg de fragmentos proteicos, 11,4 g/kg de azúcares, 200 mg/kg de compuestos fenólicos y 54 mg/kg de ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto se diluye en una mezcla de agua, 30 % de glicerol y 1,5 % de fenoxietanol, lo que permite obtener un extracto final a 10 g/kg de materia seca.
El análisis físico-químico muestra que después de la dilución este extracto tiene una concentración de fragmentos proteicos de 1.0 g/kg, de azúcares de 5.8 g/kg, de compuestos fenólicos de 100 mg/kg, y de 30 mg/kg de ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
Ejemplo 16 : Preparación de un extracto de maracuyá (Passiflora alata) de la familia de las Passifloraceae enriquecido con pequeños ARN
Un extracto acuoso enriquecido en ARN de bajo peso molecular (con una longitud máxima de 150 nucleótidos) se obtiene de la maracuyá (Passiflora alata) de la familia Passifloraceae.
En una primera etapa, se mezcla el 5 % de fruta en polvo en agua destilada, es decir, por ejemplo, 50 g de fruta en polvo se complementa con 1 kg de agua destilada, luego la solución se agita durante 5 minutos y luego se añade EDTA tetrasódico a una concentración final de 10 mM, es decir, 3,8 g por 1 kg. El pH en esta etapa está entre 10,5 y 11, el pH óptimo para enriquecer el extracto con pequeños ARN.
A continuación, esta mezcla se agita durante 1 hora a 50 °C. Incluso si bien la temperatura en esta etapa puede variar de 25 °C a 80 °C y el tiempo de agitación de 30 minutos a 1 hora, para esta especie una temperatura de 50 °C durante 60 minutos resultan ser las condiciones que permiten obtener los mejores resultados en términos de enriquecimiento del extracto acuoso final en ARN de bajo peso molecular.
Al final de esta etapa, la mezcla se centrifuga durante 10 min a 4000 g, para eliminar el material sólido.
Luego se realizan entonces filtraciones secuenciales sobre filtros de porosidad decreciente de tamaño entre 20 y 50 |jm luego 7 y 20 jm hasta 2-4 jm , con el fin de clarificar el extracto vegetal.
En esta etapa se controla el pH, para situarlo si es necesario entre 6 y 6,5 y conservar los pequeños ARN del extracto sensibles a un pH ácido.
Se continúan las filtraciones hasta una porosidad de 0,3 a 0,5 jm .
En general, se obtiene un extracto acuoso de color ámbar que contiene de 10 a 30 g/kg de extracto de peso seco, de 0,5 a 5 g/kg de fragmentos de proteína, de 2 a 15 g/kg de azúcares, de 100 a 1500 mg/kg de compuestos fenólico y de 10 a 100 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
A continuación, el extracto puede diluirse o conservar añadiendo un disolvente fisiológicamente aceptable, como glicerol al 30 %.
En este ejemplo, luego de añadir 30 % de solvente, se obtiene un extracto acuoso que contiene a 15 g/kg de extracto en peso seco, 2.3 g/kg de fragmentos proteicos, 3.0 g/kg de azúcares, 200 mg/kg de compuestos fenólicos y 35 mg/kg de los ARN de bajo peso molecular con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
De acuerdo a un tercer aspecto de la invención, los extractos acuosos enriquecidos en pequeños ARN obtenidos de acuerdo con la invención se usan ventajosamente en la preparación de composiciones cosméticas que comprenden, como agente activo antienvejecimiento, una cantidad eficaz de dicho extracto de pequeños ARN de acuerdo con la invención, y un medio fisiológicamente aceptable.
El término "cantidad eficaz" denota la cantidad mínima de extracto de acuerdo con la invención que es necesaria para obtener la actividad del extracto, en particular cosmética y más particularmente contra los signos del envejecimiento cutáneo o para mejorar la hidratación de la piel, sin que esta cantidad sea tóxica.
Ventajosamente, el extracto de pequeños ARN de acuerdo con la invención se usa en su forma diluida, con un peso seco de entre 5 y 35 g/kg.
Ventajosamente, el extracto de pequeños ARN de acuerdo con la invención está presente en la composición a una concentración del 0,1 al 5 %, preferentemente a una concentración del 1 al 5 % en peso con respecto al peso total de la composición.
Un medio fisiológicamente aceptable denota un vehículo adecuado para entrar en contacto con las capas externas de la piel o las membranas mucosas, sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica indebida y reacción similar o intolerancia, y proporcional a una relación riesgo/beneficio razonable.
La composición que puede usarse de acuerdo con la invención puede aplicarse por cualquier vía adecuada, en particular oral o tópica externa, y los expertos en la técnica adaptarán la formulación de las composiciones.
Preferentemente, las composiciones de acuerdo con la invención se proporcionan en una forma adecuada para aplicación tópica. Por tanto, estas composiciones deben contener un medio fisiológicamente aceptable, es decir compatible con la piel y los tegumentos, sin riesgo de molestias durante su aplicación y cubrir todas las formas cosméticas adecuadas.
El término "aplicación tópica" denota el hecho de aplicar o esparcir el extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN de acuerdo con la invención, y más particularmente una composición que lo contiene, sobre la superficie de la piel o de una mucosa.
La piel designa más particularmente la piel de la cara, en particular el contorno de los ojos y la boca, la nariz, la frente, el cuello, las manos, así como la piel del resto del cuerpo en su conjunto.
Las composiciones para poner en práctica la invención pueden proporcionarse en particular en forma de una solución acuosa, hidroalcohólica u oleosa, de una emulsión de aceite en agua, agua en aceite o emulsiones múltiples; también pueden proporcionar en forma de suspensiones, o incluso polvos, aptas para su aplicación en la piel, mucosas, labios y/o el cabello.
Estas composiciones pueden ser más o menos fluidas y también tener la apariencia de una crema, una loción, una leche, un suero, una pomada, un gel, una pasta o una espuma. También pueden estar en forma sólida, como una barra, o aplicarse a la piel en forma de aerosol.
Como medio fisiológicamente aceptable comúnmente usado en el campo de aplicación previsto, pueden mencionarse, por ejemplo, los adyuvantes necesarios para la formulación, tales como disolventes, espesantes, diluyentes, antioxidantes, colorantes, protectores solares, agentes, autobronceadores, pigmentos, rellenos, conservantes, perfumes, absorbentes de olores, aceites esenciales, vitaminas, ácidos grasos esenciales, tensioactivos, polímeros filmógenos, etc.
En todos los casos, un experto en la materia se asegurará de que estos adyuvantes, así como sus proporciones, se elijan de manera que no perjudiquen las propiedades ventajosas deseadas de la composición de acuerdo con la invención. Estos adyuvantes pueden corresponder, por ejemplo, al 0,01 al 20 % del peso total de la composición. Cuando la composición de acuerdo con la invención es una emulsión, la fase grasa puede representar del 5 al 80 % en peso y preferentemente del 5 al 50 % en peso con respecto al peso total de la composición. Los emulsionantes y coemulsionantes usados en la composición se eligen entre los usados convencionalmente en el campo considerado. Por ejemplo, pueden usarse en una proporción que oscila entre el 0,3 y el 30 % en peso con respecto al peso total de la composición.
De acuerdo con otra realización ventajosa de la invención, el extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN de acuerdo con la invención puede encapsularse o incluirse en un vector cosmético como liposomas o cualquier otra nanocápsula o microcápsula usada en el campo de la cosmética o adsorbida sobre polvos orgánicos polímeros, soportes minerales como talcos y bentonitas.
Ventajosamente, la composición de acuerdo con la invención puede comprender, además del agente activo de acuerdo con la invención, al menos otro agente activo que presente efectos cosméticos similares y/o complementarios a los de la invención. De acuerdo con la invención, este agente activo se define como un "agente activo adicional".
Por ejemplo, el o los agentes activos adicionales pueden elegirse entre: los agentes antienvejecimiento, reafirmante, aclarante, hidratante, drenantes, promotores de la microcirculación, exfoliantes, descamantes, estimulantes de la matriz extracelular, activadores del metabolismo energético, antibacterianos, antifúngicos, calmantes, anti-radicales, anti-UV, anti-acné, antiinflamatorio, anestésico, proporcionando sensación de calor, proporcionando sensación de frescor, adelgazante.
Tales agentes activos adicionales pueden elegirse entre los grupos que comprenden:
la vitamina A y en particular ácido retinoico, retinol, propionato de retinol, palmitato de retinol;
la vitamina B3 y más particularmente niacinamida, nicotinato de tocoferol;
la vitamina B5, vitamina B6, vitamina B12, pantenol;
la vitamina C, en particular ácido ascórbico, glucósido de ascorbilo, tetrapalmitato de ascorbilo, fosfato de ascorbilo de magnesio y sodio;
las vitaminas E, F, H, K, PP, coenzima Q10;
inhibidores de metaloproteinasas o un activador de TIMP;
la DHEA, sus precursores y derivados;
los aminoácidos tales como arginina, ornitina, hidroxiprolina, dipalmitato de hidroxiprolina, palmitoilglicina, hidroxilisina, metionina y sus derivados, compuestos de aminoácidos N-acilados;
• los péptidos naturales o sintéticos, que incluyen di-, tri, tetra-, penta- y hexapéptidos y sus derivados lipofílicos, isómeros y complejados con otras especies tales como iones metálicos (por ejemplo, cobre, zinc, manganeso, magnesio y otros). A modo de ejemplo, pueden citarse los péptidos conocidos comercialmente con el nombre de MATRIXYL®, ARGIRELINE®, CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™, COLLAXYL™ (patente FR2827170, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 01™ (patente FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02™ (patente FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide™ (patente FR2846883, ASHLAND®) o el péptido sintético con la secuencia Arg-Gly-Ser-NH2, comercializado con el nombre ATPeptide™ por ASHLAND®;
• el extracto de Artemia salina, comercializado con el nombre GP4G™ (FR2817748, ASHLAND®);
• los extractos de péptidos vegetales como extractos de lino (Lipigénine™, patente FR2956818, ASHLAND®), extractos de soja, espelta, vid, colza, lino, arroz, maíz, guisantes;
• los extractos de levadura, por ejemplo, Dynagen™, (patente FR2951946, ASHLAND®) o la Actopontine™ (patente FR2944526, ASHLAND®);
• el ácido deshidroacético (DHA);
• los fistosteroles de origen sintético o natural;
• el ácido salicílico y sus derivados, alfa y beta hidroxiácidos, silanoles;
• los aminoazúcares, glucosamina, D-glucosamina, N-acetil-glucosamina, N-acetil-D-glucosamina, manosamina, N-acetil manosamina, galactosamina, N-acetil-galactosamina;
• los extractos de polifenoles, isoflavonas, flavonoides, como extractos de uva, extractos de pino, extractos de aceituna;
• los lípidos como ceramidas o fosfolípidos, aceites de origen animal como escualeno o escualano; aceites vegetales, como almendra dulce, copra, ricino, jojoba, oliva, colza, maní, girasol, brote de trigo, brote de maíz, aceite de soja, algodón, alfalfa, amapola, calabaza, onagra, mijo, cebada, centeno, cártamo, pasiflora, avellana, palma, albaricoque, aguacate, caléndula; aceites vegetales etoxilados, manteca de karité;
• todas las pantallas UV y filtros solares;
• el AMP cíclico y sus derivados, agentes que activan la enzima adenilato ciclasa y agentes que inhiben la enzima fosfodiesterasa, el extracto de Centella asiática, asiaticosido y ácido asiático, metil xantinas, teína, cafeína y sus derivados, teofilina, teobromina, forskolina, esculina y esculoside, inhibidores de la ECA, el péptido Val-Trp, inhibidores del neuropéptido Y, encefalina, el extracto de Ginkgo biloba, el extracto de dioscorea, rutina, el extracto de yerba mate, el extracto de guaraná, oligosacáridos, polisacáridos, carnitina, el extracto de hiedra, extracto de fucus, extracto hidrolizado de Prunella vulgaris, el extracto hidrolizado de Celosia cristata, el extraer de Anogeissus leiocarpus, el extracto de hoja de Manihot utilissima, la palmitoilcarnitina, la carnosina, la taurina, el extracto de saúco, extractos de algas como el extracto de Palmaria Palmata.
A modo de ilustración, se mencionan a continuación ejemplos de formulaciones de una composición cosmética que contiene un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos obtenidos de acuerdo con la invención:
Ejemplo 17 : Bálsamo para los ojos
Figure imgf000019_0001
Método de preparación:
1. Homogeneizar la Fase A en el recipiente principal hasta que esté transparente;
2. A 25 °C, espolvorear en la Fase B y homogeneizar durante 10 minutos hasta que esté homogéneo;
3. A 25 °C, preparar la Fase C en un vaso de precipitados aparte, mezclar hasta que esté homogéneo. Espolvorear la Fase D y mezcle bien hasta que esté homogéneo;
4. A 25 °C, agregue la Fase C D al recipiente principal y mezcle hasta que esté homogéneo;
5. A 25 °C, agregue la Fase E al recipiente principal y mezcle hasta que esté homogéneo;
6. A 25 °C, mezclar previamente la Fase F, añadirla al recipiente principal y mezclar hasta que esté homogéneo; 7. Parar a 25 °C.
La composición se presenta así en forma de un gel crema violeta perlado, con un pH entre 5,70 y 6,20 y una viscosidad (DO) de 80000 - 130000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minuto/25 °C).
Ejemplo 18 : Crema rica
Figure imgf000020_0001
Método de preparación:
1. Homogeneizar la Fase A en el recipiente principal y comenzar a calentar a 75-80 °C ;
2. A 30 °C, espolvorear en la Fase B y homogeneizar mientras se calienta ;
3. En un vaso de precipitados aparte, preparar la Fase C, calentar a 75-80 °C hasta que esté homogéneo ;
4. A 75 °C, añadir la Fase C al recipiente principal y homogeneizar durante 10 minutos ;
5. Dejar enfriar la temperatura y añadir la Fase D a 65 °C. Mezclar bien para homogeneizar durante 10 minutos ; 6. Mezcle previamente la Fase E antes de añadirla al recipiente principal;
7. Añadir la Fase E a 60 °C. Mezclar bien para homogeneizar durante 10 minutos ;
8. A 35 °C, premezclar la Fase F antes de añadirla y mezclar bien ;
9. Mezcle previamente la Fase G antes de añadirla al recipiente principal;
10. Añadir la Fase G a 35 °C. Mezclar bien para homogeneizar;
11. En un vaso de precipitados aparte, preparar la Fase H: espolvorear Natrosol™ en agua a temperatura ambiente y homogeneizar mientras se calienta a 60 °C ;
12. Añadir la Fase H a 30 °C. Mezclar bien para homogeneizar;
13. Parara 25 °C.
La composición se presenta así en forma de crema de mantequilla rosa, con un pH entre 4,90 y 5,40 y una viscosidad (D0) de 160000 - 210000 cps (Brookfield RVT/Spindle D/5 RPM/1 minuto/25 °C).
Ejemplo 19 : Suero facial
Figure imgf000021_0001
Método de preparación:
1. En un vaso de precipitados a temperatura ambiente, pesar los ingredientes de la Fase A y mezclar. Espolvorear la Fase B y homogeneizar;
2. A temperatura ambiente, espolvorear la Fase C y seguir homogeneizando el conjunto ;
3. A temperatura ambiente, agregue la Fase D a la Fase ABC y continúe homogeneizando;
4. A temperatura ambiente añadir la Fase E y homogeneizar;
5. A temperatura ambiente añadir la Fase F y homogeneizar el conjunto;
6. A temperatura ambiente, agregue la Fase G y mezcle hasta que esté homogéneo;
7. Parar a 25 °C.
La composición se presenta así en forma de gel suave, translúcido, de color amarillo cremoso, con un pH entre 6,30 y 7,10 y una viscosidad (DO) de 10000 - 15000 cps (Brookfield RVT/Spindle B/5 RPM/1 minuto/25 °C).
Ejemplo 20 : Mascarilla anti-envejecimiento
Figure imgf000022_0001
Método de preparación:
1. A 25 °C, homogeneizar la Fase A en el recipiente principal;
2. A 25 °C, espolvorear en la Fase B y mezclar bien hasta obtener una mezcla homogénea ;
3. A 25 °C, añadir la Fase C y mezclar bien hasta obtener una mezcla homogénea ;
4. Mezclar previamente la Fase D en un vaso de precipitados aparte y añadir al recipiente principal a 25 °C ;
5. A 25 °C, agregue la Fase E al recipiente principal y mezcle bien ;
6. Mezclar previamente la Fase F y añadirla lentamente. Mezcle bien hasta obtener una mezcla homogénea ; 7. Mezcle previamente la Fase G en un vaso de precipitados aparte y agregue al recipiente principal hasta obtener una mezcla homogénea ;
8. Parar a 25 °C.
La composición se presenta así en forma de gel crema con efecto verde centelleante, con un pH entre 5,30 y 5,80 y una viscosidad (DO) de 70000 - 100000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minuto/25 °C ).
Ejemplo 21 : Suero
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Método de preparación:
1. Agregue agua al recipiente principal y comience a mezclar con una pala de hélice hi-lo ;
2. Agregue el resto de los ingredientes, uno tras otro, mientras mezcla entre cada adición.
La composición se presenta así en forma de suero suave, semiopaco, con un pH entre 5,75 y 6,25 y una viscosidad (DO) de 1100 - 1400 cps (Brookfield RVT/spindle 3/20 rpm/25 °C/1 minuto ).
De acuerdo con un cuarto aspecto, la invención se refiere al uso cosmético de la composición de acuerdo con la invención para combatir los signos del envejecimiento cutáneo.
Por "signos de envejecimiento cutáneo" se entiende cualquier cambio en el aspecto externo de la piel debido al envejecimiento, como, por ejemplo, líneas finas y arrugas, grietas, bolsas debajo de los ojos, ojeras, marchitamiento, pérdida de la elasticidad, firmeza y/o tono de la piel, pero también cualquier cambio interno en la piel que no resulte sistemáticamente en una apariencia externa modificada como, por ejemplo, adelgazamiento de la piel, o cualquier degradación interna de la piel de tensiones ambientales como la contaminación y la radiación ultravioleta.
El estudio de la expresión de colágenos en la piel es un medio para juzgar el efecto anti-envejecimiento de la invención. De hecho, el colágeno sintetizado por los fibroblastos de la piel tiene un papel biológico importante. Es responsable de la cohesión de tejidos como la piel y confiere propiedades de resistencia y flexibilidad a la piel.
La invención también se refiere al uso cosmético de la composición de acuerdo con la invención para mejorar la hidratación de la piel.
Se entiende por "mejorar de la hidratación cutánea" cualquier mejora en las modificaciones del aspecto externo de la piel por deshidratación como, por ejemplo, sequedad, tirantez y malestar.
El estudio de la expresión del ácido hialurónico así como de la enzima implicada en la síntesis del ácido hialurónico es un medio para juzgar el efecto hidratante de la invención. De hecho, el ácido hialurónico es un componente importante de la matriz extracelular de la dermis, también presente en la epidermis, y participa en la hidratación de la piel.
Como tal, la invención se ilustra a continuación, mediante los diversos resultados de las pruebas realizadas.
Para ello, se obtuvieron resultados similares (no mostrados) a los mostrados en los Ejemplos 22 a 25 a continuación con otros extractos acuosos enriquecidos en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos de acuerdo con la invención, obtenidos a partir de material vegetal, y más particularmente de Chenopodium quinoa (quinua), Lens esculenta (lenteja), Oryza sativa (brotes de arroz), o Cucúrbita pepo(calabaza).
Ejemplo 22 : Evaluación de los efectos de los extractos de quimbombó (Hibiscus esculentus) de acuerdo con los ejemplos 5, 6 y 9 sobre la matriz extracelular de la dermis mediante el estudio de colágenos I y III
El objetivo de este estudio es comparar los efectos sobre la matriz extracelular de la dermis de tres extractos de quimbombó (Hibiscus esculentus). El primer extracto enriquecido en ARN de bajo peso molecular, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 5, el segundo extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 6 (sin tratamiento con EDTA) y el último extracto obtenido después de la precipitación de acuerdo con el Ejemplo 9.
El objetivo de este estudio es evaluar los efectos de estos tres extractos de Hibiscus esculentus sobre la expresión de proteínas de colágeno I y III implicadas en la estructura de la matriz extracelular. El colágeno es muy importante para mantener la elasticidad y firmeza de la piel.
Protocolo:
Se mantienen en cultivo biopsias de piel humana de 6 mm de diámetro ex vivo en presencia de un medio específico (DMEM 1 g/L, HAMF12, SVF y antibióticos) en insertos colocados en placas de 6 pocillos. Las biopsias se cultivan durante 48 horas y reciben 2 aplicaciones por día de un extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) de acuerdo con los Ejemplos 5, 6 y 9 diluidos a 1/100 o 3/100 en PBS, es decir, a la concentración final de 1 % y 3 % volumen/volumen, respectivamente. La condición de control se realiza mediante el uso de PBS 1X. Las aplicaciones se realizan en forma de gota de aproximadamente 20 pl depositada sobre la superficie de la biopsia. A continuación, las biopsias se fijan en formaldehído y luego se incrustan en parafina. A continuación, se realizan cortes de piel de 4 pm de grosor. El marcaje de los colágenos I y III se realiza después de desenmascarar los sitios específicos mediante incubación en el microondas y luego mediante tratamiento con tripsina. La inmunotinción se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo policlonal de conejo específico para colágeno I (Rockland, Referencia 600-401-103-0.5), un anticuerpo policlonal de conejo específico para colágeno III (Rockland, Referencia 600-401-105-0.5), luego un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a un fluorocromo (Invitrogen, RefA21206). A continuación, las biopsias se examinan con un microscopio de epifluorescencia (microscopio Zeiss Axiovert 200M). La cuantificación de la fluorescencia se realizó, a partir de las fotografías obtenidas, mediante el uso del software de análisis de imágenes Volocity® (PerkinElmer, Inc.).
Resultados:
Los tratamientos con extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) enriquecido en pequeños ARN, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 5, al 1 % y al 3 % permiten observar un aumento significativo en la expresión de colágenos I y III en comparación con la condición de control tratada con PBS 1X y en comparación con los tratamientos con extractos de quimbombó Hibiscus esculentus) obtenidos de acuerdo con los Ejemplos 6 (ausencia de tratamiento con EDTA) y 9 (obtenido después de la precipitación), para el estudio ex vivo.
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Conclusiones:
El extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) enriquecido en pequeños ARN (Ejemplo 5) al 1 y 3 % estimula aún más la expresión de colágenos I y III en la piel humana ex vivo en comparación con los dos extractos de Hibiscus esculentus no enriquecido en pequeños ARN (Ejemplos 6 y 9) al 1 % y al 3 %.
Ejemplo 23 : Evaluación de los efectos de los extractos de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9 sobre la matriz extracelular de la dermis mediante el estudio de colágenos I y III
El objetivo de este estudio es comparar los efectos sobre la matriz extracelular de la dermis de tres extractos de baobab (Adansiona digitata). El primer extracto enriquecido en ARN de bajo peso molecular, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 7, el segundo extracto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 8 (sin tratamiento con EDTA) y el último extracto obtenido después de la precipitación de acuerdo con el ejemplo 9.
El objetivo de este estudio es evaluar los efectos de estos tres extractos de baobab (Adansiona digitata) sobre la expresión de proteínas de colágeno I y III implicadas en la estructura de la matriz extracelular. El colágeno es muy importante para mantener la elasticidad y firmeza de la piel.
Protocolo:
Las biopsias de piel humana de 6 mm de diámetro se mantienen en cultivo ex vivo en presencia de un medio específico (DMEM 1 g/L, HAMF12, SVF y antibióticos) en insertos colocados en placas de 6 pocillos. Las biopsias se cultivan durante 48 horas y reciben 2 aplicaciones diarias de un extracto de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9 diluidos a 1/100 o 3/100 en PBS, es decir, a la concentración final de 1% y 3% volumen/volumen, respectivamente. La condición de control se realiza mediante el uso de PBS 1X. Las aplicaciones se realizan en forma de gota de aproximadamente 20 pl depositada sobre la superficie de la biopsia. A continuación, las biopsias se fijan en formaldehído y luego se incrustan en parafina. A continuación, se realizan cortes de piel de 4 pm de grosor. El marcaje de los colágenos I y III se realiza después de desenmascarar los sitios específicos mediante incubación en el microondas y luego mediante tratamiento con tripsina. La inmunotinción se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo policlonal de conejo específico para colágeno I (Rockland, Referencia 600-401-103-0.5), un anticuerpo policlonal de conejo específico para colágeno III (Rockland, Referencia 600-401-105-0.5), luego un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a un fluorocromo (Invitrogen, Referencia A21206). A continuación, las biopsias se examinan con un microscopio de epifluorescencia (microscopio Zeiss Axiovert 200M). La cuantificación de la fluorescencia se realizó, a partir de las fotografías obtenidas, mediante el uso del software de análisis de imágenes Volocity® (PerkinElmer, Inc.).
Resultados:
El tratamiento con extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 7, al 1 % permite observar un aumento significativo en la expresión de colágeno I en comparación con la condición de control tratada con PBS 1X y en comparación con los tratamientos al 1 % con los extractos de Adansiona digitata obtenido de acuerdo con los Ejemplos 8 (ausencia de tratamiento con EDTA) y 9 (obtenido después de la precipitación), para el estudio ex vivo.
El tratamiento con extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 7, al 3 % permite observar un aumento significativo en la expresión de colágenos I y III en comparación con la condición de control tratada con PBS 1X y en comparación con los tratamientos al 3 % con extractos de baobab (Adansiona digitata) obtenido de acuerdo con los Ejemplos 8 (ausencia de tratamiento con EDTA) y 9 (obtenido después de la precipitación), para el estudio ex vivo.
Figure imgf000026_0001
Conclusiones:
El extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN (Ejemplo 7) al 1 % estimula aún más la expresión de colágeno I en la piel humana ex vivo en comparación con extractos de Adansiona digitata no enriquecido en pequeños ARN (Ejemplos 8 y 9) al 1 %.
El extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN (Ejemplo 7) al 3 % estimula aún más la expresión de colágenos I y III en la piel humana ex vivo en comparación con extractos de Adansiona digitata no enriquecido en pequeños ARN (Ejemplos 8 y 9) al 3 %.
Ejemplo 24 : Evaluación de los efectos de los extractos de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9 sobre la síntesis de ácido hialurónico en la dermis mediante el estudio de la hialuronano sintasa 2 (HAS2)
El objetivo de este estudio es comparar los efectos de tres extractos de baobab (Adansiona digitata) sobre la expresión de HAS2, una enzima involucrada en la síntesis de ácido hialurónico. El primer extracto enriquecido en ARN de bajo peso molecular se obtiene de acuerdo con el Ejemplo 7, el segundo extracto se obtiene de acuerdo con el Ejemplo 8 (sin tratamiento con EDTA) y el último extracto se obtiene después de la precipitación de acuerdo con el Ejemplo 9.
El ácido hialurónico es un componente importante de la matriz extracelular de la dermis, involucrado en la hidratación de la piel. Durante el envejecimiento se altera su renovación, así como la expresión de su enzima de síntesis HAS2 (Rock yotros, 2014).
Protocolo:
Los fibroblastos humanos se cultivan en un medio específico y se mantienen en cultivo en un tratamiento prolongado (durante más de 32 pases). En cada pase, se congela parte de las células. Luego, se eligen dos pases opuestos: el pase 8 (pase joven) y el pase 32 (pase senescente). Después de la descongelación, los fibroblastos senescentes o no senescentes se tratan con extractos de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9 diluido a 1/100 en medio de cultivo, es decir, a la concentración final de 1 % volumen/volumen, 48 horas (2 aplicaciones por día). La evaluación de la expresión de HAS2 en fibroblastos, senescentes o no, tratados o no con los tres extractos de Adansiona digitata de acuerdo con los Ejemplos 7, 8 y 9, al 1 % se observa por inmunotinción.
Para hacer esto, las células se enjuagan y se fijan con metanol frío durante 5 minutos. Después de saturar los sitios inespecíficos con albúmina de suero bovino al 1 % durante 15 minutos, las células se incuban con una solución de anticuerpo monoclonal de ratón específico para HAS2 (Thermo Fisher, Referencia MAS-17087),y luego con una solución de anticuerpos secundario anti-ratón acoplado a un fluorocromo (Invitrogen, Referencia A21202). A continuación, las células se examinan con un microscopio de epifluorescencia (microscopio Zeiss Axiovert 200M). La cuantificación de la fluorescencia se realizó, a partir de las fotografías obtenidas, mediante el uso del software de análisis de imágenes Volocity® (PerkinElmer, Inc.).
Resultados:
Como se muestra en la Figura 4A, el tratamiento con extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 7 al 1 % en fibroblastos con 8 pases (pases considerados jóvenes) permite observar un aumento significativo en la expresión de HAS2 en comparación con la condición no tratada y también en comparación con los tratamientos con los extractos de Adansiona digitata al 1 % obtenidos de acuerdo con los Ejemplos 8 (ausencia de tratamiento con EDTA) y 9 (obtenido después de la precipitación).
Además, de acuerdo con la literatura, como se ilustra en la Figura 4B, se observa una disminución significativa en la expresión de HAS2 entre los fibroblastos con 8 pases (P8) y los de 32 pases (P32) (senescente).
El tratamiento con extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN de acuerdo con la invención, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 7 al 1 % (volumen/volumen) sobre fibroblastos senescentes, permite observar un mantenimiento de la expresión de HAS2. Este mantenimiento no se observa en las células tratadas con los extractos de Adansiona digitata obtenidos respectivamente de acuerdo con los Ejemplos 8 (ausencia de tratamiento con EDTA) y 9 (obtenido después de la precipitación).
Conclusión:
El extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido con pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos (Ejemplo 7) al 1 % estimula aún más la expresión de HAS2 en fibroblastos en comparación con la condición no tratada y en comparación con los extractos de Adansiona digitata obtenidos de acuerdo con los Ejemplos 8 (ausencia de tratamiento con EDTA) y 9 (obtenido después de la precipitación).
Además, en fibroblastos senescentes, el extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN de acuerdo con la invención (Ejemplo 7) al 1 % permite mantener el nivel de expresión de hAS2 observado en fibroblastos no senescentes. Los otros extractos de Adansiona digitata no enriquecidos en pequeños ARN (Ejemplos 8 y 9) al 1% no permiten este mantenimiento.
Ejemplo 25 : Evaluación de los efectos del extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) de acuerdo con el Ejemplo 5 y del extracto de baobab (Adansiona digitata) de acuerdo con el Ejemplo 7 sobre el nivel de expresión del ácido hialurónico
El objetivo de este estudio es visualizar el efecto de los extractos de quimbombó (Hibiscus esculentus) y de baobab (Adansiona digitata) obtenidos respectivamente de acuerdo con los Ejemplos 5 y 7, (extractos enriquecidos en ARN de bajo peso molecular con una longitud de como máximo 150 nucleótidos), sobre la expresión de ácido hialurónico por marcaje.
El ácido hialurónico es un componente importante de la matriz extracelular de la dermis e interviene en la hidratación de la piel.
Protocolo:
Se mantienen en cultivo biopsias de piel humana de 6 mm de diámetro ex vivo en presencia de un medio específico (DMEM 1 g/L, HAMF12, SVF y antibióticos) en insertos colocados en placas de 6 pocillos. Las biopsias se cultivan durante 48 horas y reciben 2 aplicaciones por día del extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) o del extracto de baobab(Adansiona digitata) de acuerdo con los Ejemplos 5 y 7 (respectivamente) diluidos al 1 % (volumen/volumen) en PBS o PBS 1X para la condición de control. Las aplicaciones se realizan en forma de gota de aproximadamente 20 |jl depositada sobre la superficie de la biopsia. A continuación, las biopsias se fijan en formaldehído y luego se incrustan en parafina. A continuación, se realizan cortes de piel de 4 pm de grosor. Los cortes se incuban en presencia de una proteína biotinilada específica para ácido hialurónico (Coger, Referencia: 400-763-1A), luego en presencia de estreptavidina acoplada a un fluorocromo (Invitrogen, Referencia: S32354). A continuación, las biopsias se examinan con un microscopio de epifluorescencia (microscopio Zeiss Axiovert 200M). La cuantificación de la fluorescencia se realizó, a partir de las fotografías obtenidas, mediante el uso del software de análisis de imágenes Volocity® (PerkinElmer, Inc.).
Resultados:
El tratamiento con extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus) o extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecido en pequeños ARN obtenidos respectivamente de acuerdo con los Ejemplos 5 y 7, al 1% permite observar un aumento significativo en la expresión de ácido hialurónico en la epidermis y en la dermis en comparación con la condición de control tratada con PBS 1X.
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Conclusión:
El extracto de quimbombó (Hibiscus esculentus)y el extracto de baobab (Adansiona digitata) enriquecidos en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos (de acuerdo con los ejemplos 5 y 7) al 1 % estimulan la expresión de ácido hialurónico en la piel humana ex vivo en comparación con la condición de control tratada con PBS 1X.
Por supuesto, la invención no se limita a las realizaciones y a los ejemplos presentados anteriormente y la persona experta en la técnica, en virtud de operaciones de rutina, puede ser requerida para llevar a cabo otras realizaciones no descritas explícitamente, que entran dentro del amplio alcance de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Método para la obtención de un extracto acuoso enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos a partir de un material vegetal que comprende las siguientes etapas:
a) el material vegetal, previamente molido, se pone en contacto con el agua;
b) se añade ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tetrasódico a una concentración entre 2 y 15 mM, en la mezcla obtenida en a) a un pH entre 10,5 y 11, realizándose esta etapa con agitación durante un tiempo de al menos 1 hora y a una temperatura entre 20 y 80 °C;
c) a continuación, se ajusta el pH de la mezcla obtenida en b) a un valor entre 6 y 8;
d) la mezcla obtenida en c) se purifica para eliminar el material vegetal sólido residual y obtener un extracto crudo acuoso purificado;
e) se controla el pH y, si es necesario, se reajusta a un valor entre 6 y 8, y se obtiene un extracto acuoso de materia vegetal, enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, que comprende en peso del peso total del extracto, 5-60 g/kg de extracto seco y 10-1000 mg/kg de pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, de 0,5 a 30 g/kg de fragmentos de proteínas y de 0,5 a 50 g/kg de azúcares y no comprende ADN,
en el que la etapa e) está precedida por al menos una filtración del extracto acuoso crudo obtenido en d) y preferentemente por filtraciones sucesivas del extracto acuoso crudo bajando el umbral de filtración de 20-50 |jm a 0,1-0,30 jm .
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa a) el material vegetal se pone en contacto con agua en una relación material vegetal/agua del 4 al 20 % (peso/peso).
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2caracterizado porque en la etapa e) se controla el pH y, si es necesario, se reajusta a un valor entre 6 y 6,5.
4. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porqueen la etapa d) se centrifuga la mezcla obtenida en c).
5. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a la 4, caracterizado porque comprende una etapa adicional de hidrólisis realizada antes de la etapa c), ya sea directamente sobre la mezcla obtenida en b), o sobre el sobrenadante tras centrifugación de la mezcla obtenida en b) y eliminación del material vegetal residual, mediante la acción de al menos una enzima elegida entre una carbohidrasa, una celulasa y/o una proteasa, durante al menos 1 hora, a una temperatura entre 45 y 65 °C y a un pH entre 6 y 8,5.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende una etapa de desactivar la enzima a una temperatura entre 65 y 80 °C durante al menos 1 hora, realizándose esta etapa de desactivación directamente después de la etapa de hidrólisis o entre 2 de las etapas de filtración sucesivas que preceden a la etapa e).
7. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque a la mezcla se añade tierra de diatomeas o sílice a una concentración de 10 a 20 g/kg antes de la etapa d).
8. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de EDTA tetrasódico es de 10 mM.
9. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el material vegetal es una parte de una planta elegida entre semillas, frutos, bulbos, flores, hojas, raíces, brotes o incluso tortas y granos usados.
10. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el material vegetal se elige entre las familias de Passifloraceae, Malvaceae, Punicaceae, Actinidiaceae, Myrtaceae, Clusiaceae, Caricaceae, Malphigiaceae, Ericaceae, Grossulariaceae, Solanaceae, Poaceae, Fabaceae, Malvaceae, Bombacaceae, Cucurbitaceae, Chenopodiaceae, Rosaceae, Rutaceae, Liliaceae, Iridaceae, Amaryllidaceae, Alliaceae.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el material vegetal se elige entre las especies Hibiscus esculentus (quimbombó), Adansonia digitata (baobab), Chenopodium quinoa (quinua), Lens esculenta (lenteja), Oryza sativa (brote de arroz), Cucurbita pepo (calabaza), Rosa centifolia (rosa), Citrus aurantium (naranja amarga), Lilium candidum (lirio), Lilium tigrinum (lirio tigre), Passiflora alata (granadilla).
12. Extracto acuoso de material vegetal, enriquecido en pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos obtenido por el método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque comprende en peso del peso total del extracto, 5-60 g/kg de extracto seco y 10-1000 mg/kg de pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos, de 0,5 a 30 g/kg de fragmentos de proteínas y 0,5 a 50 g/kg de azúcares y no incluye ADN.
13. Extracto de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se diluye en un solvente y comprende en peso del peso total del extracto, 5-35 g/kg de extracto seco, 0,5-20 g/kg de fragmentos de proteína, 0,5-30 g/kg de azúcares, y 10-500 mg/kg de pequeños ARN con una longitud máxima de 150 nucleótidos.
14. Composición que comprende, como agente activo antienvejecimiento, una cantidad eficaz del extracto de una de las reivindicaciones 12 o 13, y un medio fisiológicamente aceptable.
15. Composición de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque el extracto está presente en una concentración entre el 1 y el 5 % en peso del peso total de la composición.
16. Composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada porque está formulada para ser aplicada tópicamente sobre la piel.
17. Uso cosmético de la composición de una de las reivindicaciones 14 a 16 para combatir los signos del envejecimiento cutáneo.
18. Uso cosmético de la composición de una de las reivindicaciones 14 a 16 para mejorar la hidratación de la piel.
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