CN108473980B - 包含小rna卷丹提取物的局部用组合物及用于减少皮肤老化迹象的美容护理方法 - Google Patents

包含小rna卷丹提取物的局部用组合物及用于减少皮肤老化迹象的美容护理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物的局部用组合物。本发明还涉及一种美容护理方法，该方法包括局部施用一种包含生理上可接受的介质中的百合(卷丹(Lilium tigrinum)提取物的组合物，以减少老化和光老化的皮肤迹象。本发明还涉及美容治疗方法以改善细胞活力、改善细胞防护颗粒物和DNA损伤，并减少细胞衰老。

Description

包含小RNA卷丹提取物的局部用组合物及用于减少皮肤老化 迹象的美容护理方法
技术领域
本发明属于化妆品领域，并且更具体地涉及用于减少老化的皮肤迹象的局部用组合物和方法的领域。
本发明涉及包含富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物的局部用组合物。
本发明还涉及一种美容护理方法，该方法包括局部施用一种组合物，该组合物包含生理上可接受的介质中的小RNA百合(卷丹(Lilium tigrinum)提取物，以减少老化和光老化的皮肤迹象。
背景技术
小RNA和microRNA是在植物和哺乳动物中发现的调节生理过程的细胞成分。在该皮肤中，主要的生理过程受microRNA调节，充当皮肤稳态(表皮更新、皮肤色素沉着调节、真皮基质表达、防止氧化应激)的控制者。
在实验室中进行的用于提取核糖核酸(RNA，低分子量RNA)的经典实验方法涉及使用溶剂例如苯酚和氯仿，但是这些是有毒的并且不被认为是合适的化妆溶剂(Zumbo,P.2014“Phenol-chloroform Extraction”,2014；kit Sigma,mirPremierTM microRNAIsolation Kit)。
文献WO8403835是已知的例如，并且描述了用于获得富含纯DNA的植物胚的含水提取物的方法，该方法包括许多处理步骤，包括用阴离子去污剂和包括氯仿和辛醇的各种溶剂进行处理，这可能在获得的该产品中留下有毒痕迹，因此不能用于化妆品。
美国专利申请2003/0092168和FR2831168也是已知的，并且这些描述了从植物材料，特别是富含DNA或RNA的植物胚或种子获得富含核酸(DNA和/或RNA)的提取物的方法。该方法包括在起始pH为9至13的含水介质中，在存在纤维素分解酶的情况下提取植物材料，其中该pH趋于中性，用蛋白酶处理提取物并分离不溶物质以回收纯化的含水提取物。以这种方式获得的该冻干产品除了碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素B和脂质外尤其还可含有0.1重量％-1重量％的DNA、0.2重量％-1.5重量％的RNA。根据所述文献中提供的数据，由此获得的该冻干产物似乎特别含有1mg/L至10mg/L DNA和10mg/L至75mg/L RNA。
在上述情况中，本发明旨在解决的问题是提供用于局部施用的新组合物，该组合物仅包含核酸形式的RNA，并且通过提供植物小RNA或microRNA来改善皮肤内稳态和保护，从而为对抗皮肤老化提供益处。
前面的介绍仅仅是为了更好地理解本领域所面临的问题的性质，并且不应该以任何方式解释为对现有技术的承认，并且本文中任何参考文献的引用都不应被解释为承认这样的参考文献构成本申请的“现有技术”。
该发明人确实证明，富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))的鳞茎提取物可以减少老化和光老化的皮肤迹象。更具体地说，它们可以显示该提取物可以改善细胞活力、细胞防护颗粒物和DNA损伤、改善皮肤细胞外基质并减少细胞衰老。
发明内容
本发明的主要方面涉及一种局部用组合物，该组合物在生理学上可接受的介质中包含富含最大长度为150个核苷酸的低分子量RNA(核糖核酸)的百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物。
另一方面，本发明涉及一种治疗皮肤以减少老化和光老化的皮肤迹象的方法，该方法包括施用局部用组合物，该组合物包含生理上可接受的介质中的有效量的富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物。
又一个方面，本发明还涉及改善细胞活力、改善细胞防护颗粒物和DNA损伤、改善皮肤细胞外基质和减少细胞衰老的方法，该方法包括施用局部用组合物，该组合物包含生理上可接受的介质中的有效量的富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物。
附图说明
通过附图可以理解本发明的其他实施方案。
图1说明了本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对环境胁迫抗性的评估(通过剂量乳酸脱氢酶(LDH)活性测量的细胞活力)。
图2说明了本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对紫外线胁迫后的DNA损伤的评估(DNA损伤使用“彗星试验”定量)。
图3说明了通过细胞外基质评估(原弹性蛋白表达)，本发明的百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物对衰老的评估。
图4说明了本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对老化、衰老(β-半乳糖苷酶活性衰老标记)的评估。
图5说明了本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对抗光老化损伤的皮肤保存的评估(参与ECM结构的原纤维蛋白的评估)。
图6说明了本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对防止光老化损伤的皮肤保存的评估(参与ECM结构的弹性蛋白原的评估)。
图7说明了细胞培养和处理的实验方法。
图8说明了用本发明的卷丹提取物处理的19岁(19y)成纤维细胞中的弹性蛋白体积。
图9说明了用本发明的卷丹提取物处理的62岁(62y)成纤维细胞中的弹性蛋白体积。
图10说明了用本发明的卷丹提取物处理的19岁(19y)供体的成纤维细胞中的DNA片段化。
图11说明了用本发明的卷丹提取物处理的62岁(62y)供体的成纤维细胞中的DNA片段化。
发明详述
本文公开了本发明的详细实施方案；然而，应该理解，所公开的实施方案仅仅是可以以各种形式实施的本发明的说明。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是作为用于教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。
除非另有规定，否则本文所用的所有术语都旨在具有其普通含义。为了描述和要求保护本发明，定义了以下术语：
“老化和光老化的皮肤迹象”是指由于老化导致的皮肤外观的所有变化，例如，举例而言，皮肤变薄、下垂、水合丧失和弛缓、深度皱纹和细纹、弹性和色调丧失、真皮萎缩、肤色均匀性丧失，或由暴露于紫外线辐射、肝斑和老年斑导致的皮肤的任何其他内部退化。肝斑也被称为“日光性着色班”、“老年性雀斑样痣”、“老年斑”、“老年雀斑”，是与由于暴露于太阳紫外线辐射而导致的老化和光老化有关的皮肤上的瘢点。它们的颜色从浅棕色到红色或黑色并且位于最经常暴露于太阳的区域，特别是手、脸、肩膀、手臂和前额，以及头皮(如果秃顶的话)。
“抗衰老益处”抗衰老益处包括但不限于以下一种或多种：(a)治疗、减少和/或预防细纹或皱纹，(b)缩小毛孔大小，(c)改善皮肤厚度、丰满度和/或拉紧度；(d)改善皮肤柔韧度和/或柔软性；(e)改善皮肤色调、光泽和/或清澈性；(f)改善前胶原和/或胶原蛋白产生；(g)改善皮肤质地和/或促进重新组织化；(h)改善皮肤屏障修复和/或脑功能；(i)治疗和/或预防皮肤下垂或萎缩；(j)改善皮肤轮廓的外观；(k)恢复皮肤光泽和/或明亮度(l)补充皮肤中关键的营养物和/或组分；(m)改善因更年期减退的皮肤外观；(n)改善皮肤湿润和/或水合；以及(o)改善皮肤弹性和/或弹力和/或紧致度。
“生理上可接受的”意指根据本发明的活性剂或含有所述试剂的组合物适于与该皮肤或粘膜接触而不引起毒性或不耐受反应。
“生理上可接受的介质”意指或多或少的流体，其可以包括但不限于在化妆品领域中常用的任何添加剂或共溶剂以及其配制所必需的佐剂、湿润剂、表面活性剂、乳化剂等适合与该皮肤或粘膜接触而不引起毒性或不耐受反应。
“局部的”或“局部地”是指将包含本发明的卷丹提取物的组合物施用于该皮肤健康区域的表面。
“局部施用”是指本发明的肽或含有它的组合物在皮肤或粘膜表面上的施用或涂敷。
“小RNA”指低分子量非编码RNA(核糖核酸)，最大长度为150个核苷酸，包括任何类型的非信使小RNA，单链或双链，例如microRNA、干扰RNA、内含子RNA、核小RNA或核仁小RNA或任何RNA片段。
无论何时通过参考范围来识别术语，该范围将被理解为明确地公开其每个要素。作为非限制性实例，1-10％的范围将被理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％和在1和10％之间的所有值。
当两个或更多个取代基被指为“选自”一组列举的替代物时，其意指每个取代基可以是该组中的任何元素，而与其他取代基的身份无关。
“％”是指重量百分比，即除非另有规定，是指组分相对于组合物总重量(即包括任何载体、媒介物、溶剂、填料或在施用于皮肤之前添加的其他组分)的重量百分比。
本文所述的是获得在生理学上可接受的介质中富含最大长度为150个核苷酸的低分子量RNA(核糖核酸)的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物的方法。
小RNA包含影响细胞生物学所有方面的调控分子。小RNA并且尤其是microRNA是在植物和哺乳动物中发现的调节生理过程的细胞成分。在该皮肤中，主要的生理过程受microRNA调节，充当皮肤稳态(表皮更新、皮肤色素沉着调节、真皮基质表达、防止氧化应激)的控制者。含有特定植物小RNA和植物microRNA的卷丹提取物在化妆品领域是新颖的。富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))鳞茎提取物的预期益处是通过提供植物小RNA/microRNA来改善皮肤动态平衡和保护，从而提供皮肤抗衰老益处。
本发明涉及一种局部用组合物，该组合物包含在生理学上可接受的介质中的富含最大长度为150个核苷酸的低分子量RNA(核糖核酸)的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物。
制备这种植物提取物的方法在法国提交的专利申请号1502361中有描述。
制备富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))鳞茎提取物
从百合科(百合科)的百合(卷丹(Lilium tigrinum))获得富含小分子量小RNA(最大长度为150个核苷酸)的含水提取物。
在第一步中，在解冻和洗涤之后，将10％(w/w)的卷丹鳞茎与蒸馏水混合，例如将100g的鳞茎放入1kg的蒸馏水中，然后用10mM终浓度的四极EDTA粉碎鳞茎10分钟，对应于1kg最终体积3.8g。在此步骤中，将pH调节至10.5和11之间，对应于富含低分子量RNA的提取物的最佳pH。
然后将该溶液在80℃搅拌1小时。在这个阶段，温度可以在50℃和80℃之间变化，并且该搅拌时间也可以是30分钟直至1小时，对于该物种，80℃温度1小时是获得最优的最终提取物中低分子量RNA含量的最佳温度。在该步骤结束时，使用渐减的过滤器孔隙率(20-50μm至7-20μm)进行连续过滤，以除去固体原料，然后澄清该水性提取物。
在此步骤中，测量pH值，并且如果需要的话，调整至6和6.5之间以保留该提取物中的低分子量小RNA。酸性过大的pH可能会使小RNA沉淀。
然后进行过滤，直至0.2-0.3μm过滤器孔隙率的无菌过滤。最终的提取物可以通过加入30％甘油和1.5％苯氧乙醇来保存。
所获得的含水提取物为黄色，并含有10g/kg至25g/kg干物质，0.5g/kg至5g/kg蛋白质片段，5g/kg至20g/kg糖，100mg/kg至500mg/kg酚类化合物和10mg/kg至100mg/kg的最大核苷酸长度为150的低分子量RNA。
尽管如此，对于相同种类的卷丹(卷丹(Lilium tigrinum))，根据外部因素例如收获地点、作物年份、季节、气候条件等，获得的提取物在成分方面可呈现重要的变化性。
在该实施例中，我们更具体地获得了含有17.9g/Kg干重、2.1g/Kg蛋白质片段、11.4g/Kg糖、200mg/Kg酚类化合物和54mg/Kg最大长度为150个核苷酸的低分子量RNA。然后通过加入30％甘油和1.5％苯氧乙醇来稀释和保存该提取物以获得10g/kg至12g/kg的最终干重提取物、浓度为4g/Kg至8g/Kg的糖、浓度为0.5g/kg至1.5g/kg的蛋白质片段、浓度为50mg/kg至200mg/kg的酚类化合物，含量为15mg/kg至45mg/kg的最大长度为150个核苷酸的低分子量小RNA。
对最终提取物进行的物理化学分析显示，在本例子中，卷丹提取物具有10g/kg的干重，含有1g/kg蛋白质片段、5.8g/kg糖、100mg/kg酚类化合物和30mg/kg最大长度为150个核苷酸的低分子量RNA。用于分析该提取物的核酸含量的凝胶电泳显示该RNA的分子量等于或小于150个核苷酸长度，并且提取物完全不含DNA(脱氧核糖核酸)。
本发明的主要目的是用于局部施用的化妆品组合物，其包含生理上可接受的介质中的百合(卷丹(Lilium tigrinum))鳞茎的小RNA提取物，其中所述卷丹提取物包含在30％甘油和1.5％苯氧乙醇中的10g/kg至12g/kg的干重、浓度为4g/Kg至8g/Kg的糖，浓度为0.5g/kg至1.5g/kg的蛋白质片段，浓度为50mg/kg至200mg/kg的酚类化合物和含量为15mg/kg至45mg/kg的最大长度为150个核苷酸的RNA。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的小RNA卷丹提取物具有10g/kg的干重，含有1g/kg的蛋白质片段、5.8g/kg的糖、100mg/kg的酚类化合物和30mg/kg的最大长度为150个核苷酸的低分子量RNA。
在另一个实施方案中，本发明的富含低分子量RNA的百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物基于组合物的总重量以0.1％至5％，优选0.2％至2.5％的浓度存在于本发明的组合物中。
本发明的局部用组合物具体地可以为水溶液、水-醇溶液或油溶液的形式；水包油或油包水乳液或多重乳液；水性或无水凝胶；胶体。这些组合物也可以是适用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或皮肤附属物的乳霜、混悬剂或粉剂的形式。这些组合物可以或多或少地是流体并且呈乳霜、洗液、乳液、乳浆、润发油、乳霜、糊剂或泡沫。它们也可以是固体形式，如棒，或以气溶胶形式施用于皮肤。在一个实施方案中，本发明的组合物是美容护理组合物。
本发明的局部用组合物包括在化妆品领域中常用的任何添加剂以及其配制所必需的佐剂，例如共溶剂(乙醇、甘油、苯甲醇、湿润剂等)、增稠剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、颜料、填料、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、微量元素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物、化学或矿物过滤剂、水合剂或热水等。例如，可能引用天然型水溶性聚合物，例如多糖或多肽、甲基纤维素或羟丙基纤维素型纤维素衍生物或合成聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP和特别是由ISP公司销售的聚合物。
在任何情况下，本领域技术人员将确保选择这些佐剂以及它们的比例以不抵消在根据本发明的组合物中寻求的有利性质。这些佐剂例如可以以组合物总重量的0.01％至20％的浓度存在。当本发明的组合物是乳液时，相对于组合物的总重量，脂肪相可以占5重量％至80重量％，优选5重量％至50重量％。用于组合物中的乳化剂和辅助乳化剂将选自所考虑领域中常规使用的乳化剂和辅助乳化剂。例如，相对于组合物的总重量，它们可以以0.3重量％至30重量％的比例使用。
当然，本发明的卷丹的小RNA提取物可单独使用或与其他活性成分联合使用。例如，本发明的美容护理组合物还含有至少一种旨在改善皮肤生理功能的其他活性成分，例如再生、抗老化、抗皱纹、变厚、抗自由基、抗糖化、保湿、抗菌、抗真菌、角质层分离、肌肉放松、去角质和调色成分、刺激皮肤大分子或能量代谢合成的成分、调节皮肤分化、色素沉着或脱色素化的成分、刺激微循环的成分、防晒剂或金属蛋白酶抑制成分。
在一个实施方案中，除了本发明的卷丹的小RNA提取物之外，本发明的组合物还包含：
-遮光剂、遮紫外线和红外线剂
-抗自由基成分，
-DHEA(脱氢表雄酮)，
-脱氢乙酸(DHA)，
-天然或合成植物甾醇，
-α-羟基酸和β-羟基酸、硅烷醇，
-糖胺、葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺，
-多酚、异黄酮、类黄酮，例如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物，
-脂质例如神经酰胺或磷脂，
-动物油例如角鲨烯或角鲨烷，
-植物油，例如杏仁油、椰子油、蓖麻油、霍霍巴油、橄榄油、菜籽油、花生油、葵花籽油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉花油、苜蓿油、罂粟油、南瓜籽油、月见草油、小米油、大麦油、黑麦油、红花油、激情油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花籽油、乙氧基化植物油或牛油树脂，
上述化合物可以是天然的，例如植物的肽水解产物，或者也可以是合成的，例如肽化合物。
本发明还涉及包含有效量的富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物的局部用组合物的美容用途，用于减少老化和光老化的皮肤迹象。
本发明还涉及治疗皮肤以减少老化和光老化的皮肤迹象的方法，该方法包括施用局部用组合物，该组合物包含生理上可接受的介质中的卷丹有效量的富含低分子量RNA的(卷丹(Lilium tigrinum))提取物。
本发明涉及改善细胞活力、改善细胞防护颗粒物和DNA损伤、和减少细胞衰老的方法，该方法包括施用局部用组合物，该组合物在生理上包含可接受的介质中的有效量的富含低分子量RNA的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种美容护理方法，以改善细胞防护污染和细胞防护颗粒物质。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种美容护理方法，以改善细胞防护UV诱导的DNA损伤。
考虑到为说明性和非限制性目的提供的以下例子，本发明的其他优点和特征将变得更清楚。
实施例1：小RNA百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对环境胁迫抗性的评估(细 胞活力)
本研究的目的是显示百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对环境胁迫后细胞活力的影响。环境胁迫是由污染颗粒物应用(PM<4μm；NIST2786)引起的。细胞活力通过乳酸脱氢酶(LDH)活性的剂量来测量。该LDH是催化乳酸盐中丙酮酸转化的氧化还原酶。其活性与组织和细胞中的损害和毒性的存在相关。
实验方法：将正常人角质形成细胞每天两次用根据本发明的百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物溶液处理48小时，该提取物溶液在培养基中以1/500eme稀释，使最终浓度为0.2％vol/vol。治疗结束前24小时，PM<4μm以70μg/ml应用。
处理后，根据供应商推荐的“乳酸脱氢酶活性测定试剂盒”(
Figure BDA0001663796900000091
MAK066)进行LDH活性测定。
结果：如图1所示，用0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物处理48小时对LDH活性没有任何影响，因此对细胞活力没有任何影响。70μg/ml的PM<4μm应用处理24小时引起该LDH活性的高度显著(t检验)增加，该LDH活性引起细胞活力显著下降。用0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物与PM<4μm应用并行处理48小时的处理显著降低由环境胁迫诱导的LDH活性。
结论：0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物减少了环境应激对角质形成细胞活力的影响。
实施例2：小RNA百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对紫外线胁迫后的DNA损伤 的评估
本研究的目的是显示百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对紫外线胁迫后DNA损伤的影响。使用以下对DNA损伤进行定量：“彗星试验”(也称为“单细胞凝胶电泳”(SCGE))；微电泳技术，其可以检测单个细胞中的单链和双链DNA断裂。
实验方法：将正常人成纤维细胞每天两次用根据本发明的百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物溶液处理48小时，该提取物溶液在培养基中以1/500eme稀释，使最终浓度为0.2％vol/vol。处理结束前24小时，用100mJ/cm2的UVB照射细胞。
处理后，将细胞包含在琼脂糖凝胶中并在含有去污剂和盐的缓冲液中裂解。将DNA变性并进行短电泳(25V、300mA、30分钟)。碘化丙啶染色后，未破裂的DNA看起来像一个直径为25-35μm的球体。损伤细胞的DNA与断裂数成比例地向阳极延伸。检测到的损伤包括链断裂和碱不稳定部位。Olive等人(1990)定义了“尾矩”参数，该参数考虑了彗星长度(μm)和其远端部分DNA的百分比。
结果：如图2所示，UV胁迫引起DNA损伤的高度显著增加(Wilcoxon试验)。用0.2％百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物与UV照射并行处理48小时的处理显著降低由UV引起的DNA损伤。
结论：应用0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物保护细胞免受UVB引起的DNA损伤。
实施例3：小RNA百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对老化(通过细胞外基质评 估)和衰老的评估
本研究的目的首先通过细胞外基质(ECM)评估显示百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物对老化的影响(关于原弹性蛋白表达)，并且使用β-半乳糖苷酶活性衰老标记显示卷丹提取物对衰老的影响。
实验方法：
原弹性蛋白的评估：
正常人成纤维细胞通过复制性衰老直至P15而老化。
将P6和P15中的细胞每天两次用根据本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物溶液处理48小时，该提取物溶液在培养基中以1/500eme稀释，使最终浓度为0.2％vol/vol。
为了通过抗原弹性蛋白抗体免疫标记，将该细胞洗涤并用冷甲醇固定。然后将细胞在特异性抗原弹性蛋白抗体(Abcam、ref.ab21605、兔多克隆)存在下温育，然后在荧光染料偶联的第二合适抗体存在下温育。在特定介质中装片后，通过落射荧光显微镜(ZeissAxiovert 200M显微镜)观察切片。通过使用
Figure BDA0001663796900000111
6.3.软件(PerkinElmer,Inc.)分析图像来量化荧光强度。
评估衰老：
正常人成纤维细胞通过复制性衰老直至P15而老化。
将处于P15的细胞每天两次用根据本发明的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物溶液处理48小时，该提取物溶液在培养基中以1/500eme稀释，使最终浓度为0.2％vol/vol。加入年轻对照未处理的P8。
对于SAβ-gal活性染色，首先洗涤并固定细胞。然后将它们与β-半乳糖苷酶染色溶液一起温育过夜。在特定介质中装片后，通过光学显微镜(Nikon Eclipse E600microscope)观察切片。通过使用
Figure BDA0001663796900000112
6.3.软件分析图像来量化蓝光强度。利用细胞数目进行标准化。
结果：
原弹性蛋白的评估(图3)：
用0.2％百合(卷丹(Lilium tigrinum))的溶液处理48小时的处理在成纤维细胞、非衰老(P6)和衰老(P15)中表现出原弹性蛋白表达显著高度增加(t-检验)。
衰老的评估(图4)：
正如预期的那样，与年轻细胞(P8)相比，复制性老化的成纤维细胞(P15)中β半乳糖苷酶活性增加。用0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物溶液处理48小时的处理显著降低(t检验)诱导的衰老。
结论：0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物，通过原弹性蛋白表达的刺激在非衰老和衰老细胞中保护ECM免于老化，并且减少复制性衰老。
实施例4：小RNA百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对抗光老化损伤的皮肤保 存的评估
本研究的目的是显示百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物对皮肤抗由紫外线诱导的光老化损伤的影响。评估参与ECM结构的原纤维蛋白和原弹性蛋白。
实验方法：直径6mm的正常人皮肤活检组织离体保持在特定培养基(1g/L的DMEM、HAMF12、胎牛血清等抗生素)中。将活检组织每天两次用根据本发明的百合(卷丹(Liliumtigrinum))提取物溶液处理48小时，该提取物溶液在PBS中以1/200eme和1/500eme稀释，使最终浓度分别为0.5％vol/vol和0.2％vol/vol。该控制条件用PBS 1X执行。在治疗结束前24小时，使用100mJ/cm2的UV全光谱灯(多端口601日光灯和co)照射活检组织。
原纤维蛋白的评估：
为了利用抗原纤维蛋白抗体进行免疫标记，将组织冷冻。然后切下冷冻皮肤活检组织，并将切片固定在冷丙酮中。使用特异性抗原纤维蛋白抗体(Abcam、ref.ab3090、小鼠单克隆)，接着用偶联有荧光染料的第二合适抗体。在特定介质中装片后，通过落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)观察切片。
原弹性蛋白的评估：
为了利用抗原弹性蛋白抗体进行免疫标记，将组织固定并包埋在石蜡中。然后切下包埋式皮肤活检组织并将切片脱蜡以及再水化。然后，在应用特异性抗原弹性蛋白抗体(Abcam、ref.ab3090、兔多克隆)并且然后应用与荧光染料偶联的第二合适抗体之前进行揭膜实验方案。在特定介质中装片后，通过落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)观察切片。
结果：
原纤维蛋白的评估(图5)：
在紫外线胁迫后，观察到原纤维蛋白纤维的破坏，如图5所示。用0.5％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物溶液与胁迫并行处理的处理明显降低了UV对纤维组织的影响。
原弹性蛋白的评估(图6)：
在紫外线胁迫后，观察到原弹性蛋白纤维的破坏，如图6所示。用0.2％和0.5％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物溶液与胁迫并行处理的处理明显降低了UV对纤维组织的影响。
结论：紫外线胁迫后，观察到原弹性蛋白和原纤维蛋白纤维的破坏。用百合(卷丹(Lilium tigrinum))提取物处理48小时的处理，通过减少该纤维组织改变来保护ECM免受UV胁迫，其中针对原纤维蛋白使用0.2％卷丹提取物并且针对原弹性蛋白使用0.2％和0.5％卷丹提取物。
实施例5：用小RNA卷丹(Lilium tigrinum)提取物处理的成纤维细胞中的弹性蛋 白体积的评估
实验方法：如图7所示的该实验方法的方案。将来自19岁供体的处于p10的和来自62岁供体的处于p8的正常人真皮成纤维细胞(NHDF)以每皿11,000个细胞的浓度接种在35mm玻璃底皿中并温育24小时。通过在5.2mL培养基(具有10％牛小牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM)中稀释1.3mL百合(卷丹(Lilium tigrinum))并且然后通过0.2μMPVDF过滤器过滤，制备百合(卷丹(Lilium tigrinum)的20％原液。通过将培养基中的该原液稀释至0.2％和2％来制备百合(卷丹(Lilium tigrinum))处理溶液。将细胞用百合(卷丹(Liliumtigrinum))处理24h。用PBS洗涤细胞一次，并用PBS(1mL)薄层覆盖。在
Figure BDA0001663796900000131
博士照射室中用10J/cm2 UVA+40mJ/cm2 UVB照射细胞。照射后，将细胞用百合(卷丹(Liliumtigrinum))处理24h。
处理结束时，将细胞用PBS冲洗，固定在PBS中制备的4％多聚甲醛中15分钟，并用PBS中制备的0.1％Triton穿孔5分钟。将细胞在由PBS中制备的5％山羊血清和0.1％Triton组成的块中封闭40分钟。针对弹性蛋白，通过将细胞在块中制备的1：100的抗原弹性蛋白抗原溶液(Abcam，cat#ab21600)中于4℃温育过夜，然后通过在块中制备的1：500的AlexaFluor 594山羊抗兔IgG(H+L)(Life Technologies，cat#A11012)中于室温温育1h，细胞被染色。针对肌动蛋白和细胞核，通过将细胞分别在PBS中制备的1：200的鬼笔环肽488(Life Technologies，cat#A12379)和1:36300的DAPI(Life Technologies cat#D3571)的溶液中于室温下温育20分钟，细胞被染色。将染色的细胞在4℃下储存在PBS中。用Nikon A1共焦显微镜和60x油浸物镜拍摄图像。通过使用体积测量工具Nikon Elements AR软件进行分析。
结果：百合(卷丹(Lilium tigrinum))在19岁和62岁的供体的未照射细胞中引起弹性蛋白的剂量依赖性增加(图8和9)。当使用2％百合(卷丹(Lilium tigrinum))时，在来自19岁和62岁供体的细胞中达到的最大增幅分别为67％和38％。百合(卷丹(Liliumtigrinum))也增加了来自两种年龄供体的经辐射细胞中的弹性蛋白，但是该效应不是剂量依赖性的。当使用0.2％百合(卷丹(Lilium tigrinum))时，来自19岁供体的细胞中最大增加是79％，当使用2％百合(卷丹(Lilium tigrinum))时，来自62岁供体的细胞中最大增加是46％。
结论：百合(卷丹(Lilium tigrinum))可增加来自年轻和老年供体的经照射和未照射细胞中的弹性蛋白。
实施例6：用小RNA卷丹(Lilium tigrinum)提取物处理的成纤维细胞中的DNA片段 化的评估
实验方法：将来自19岁供体的处于p10的和来自62岁供体的处于p8的NHDF以每皿80,000个细胞的浓度接种在60mm皿中并温育24小时。用PBS洗涤细胞一次，并用PBS(2mL)薄层覆盖。在
Figure BDA0001663796900000141
博士照射室中用10J/cm2 UVA+40mJ/cm2 UVB照射细胞。照射后，细胞用0.2％或2％的如实施例5所述制备的百合(卷丹(Lilium tigrinum))处理6h。
将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤并以1x105细胞/mL悬浮于PBS中。然后将细胞在37℃下以1:10的比例分散在熔化的琼脂糖中。将75μl细胞/琼脂糖混合物均匀地移液到彗星切片的每个点上，然后在4℃下温育10分钟。将切片浸入冷裂解溶液(Trevigen，cat#4250-050-01)中4℃过夜。从该裂解溶液中取出切片，并在室温下置于碱性溶液(300mMNaOH、1mM EDTA、pH>13)中30分钟。然后将切片置于在冰中冷却的电泳装置中，使它们与电极等距离。将冷碱性电泳溶液(300mM NaOH、1mM EDTA、pH>13)倒入装置中，使其刚好覆盖切片。电泳在23V下运行30分钟。电泳后，将切片在H2O中漂洗并浸入70％EtOH中5分钟。将切片从该EtOh溶液中取出并置于毛巾上风干过夜。将SYBR金(Thermo，cat#11494)在TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH7.5)中1:30000稀释。将100μl稀释的SYBR金移液至每个点。将切片在室温下温育30分钟。然后从切片上除去多余的SYBR绿并在H2O中冲洗后，使切片再次干燥。使用具有20倍物镜的FITC滤光片，用EVOS显微镜拍摄图像。尾矩由Tri Tek的CometScore软件确定。
结果：用任一剂量的百合(卷丹(Lilium tigrinum))的处理减少19岁供体细胞中UV诱导的DNA片段化(图10)。当使用0.2％的百合(卷丹(Lilium tigrinum))时，最大的降幅为32％。只有2％剂量的百合(卷丹(Lilium tigrinum))能够减少来自62岁老年供体的细胞中UV诱导的DNA片段化(图11)。DNA片段化减少了42％。
结论：百合(卷丹(Lilium tigrinum))能够减少来自两种年龄供体的细胞中UV诱导的DNA片段化，但需要较高剂量的百合(卷丹(Lilium tigrinum))使其在老年供体的细胞中有效。

Claims (8)

1.一种用于局部施用的化妆品组合物，其包含卷丹(Lilium tigrinum)鳞茎提取物和生理上可接受的介质，
其中所述卷丹鳞茎提取物通过包括以下步骤的方法获得：
解冻和洗涤后，将10％w/w的卷丹鳞茎与蒸馏水混合，
然后用最终浓度为10mM的乙二胺四乙酸EDTA粉碎10分钟，
将pH值调整至10.5至11之间，
然后将溶液在50℃到80℃的温度搅拌30分钟到1小时，
在该步骤结束时，使用20-50μm至7-20μm的渐减的过滤器孔隙率进行连续过滤，以除去固体原料，然后澄清该水性提取物，
在此步骤中，测量pH值，并且若需要的话，将pH调整至6至6.5，
其中所述卷丹提取物具有10g/kg至12g/kg的干重、浓度为4g/Kg至8g/Kg的糖，浓度为0.5g/kg至1.5g/kg的蛋白质片段，浓度为50mg/kg至200mg/kg的酚类化合物和浓度为15mg/kg至45mg/kg的最大长度为150个核苷酸的RNA，其中所述卷丹鳞茎提取物完全不含DNA。
2.如权利要求1所述的化妆品组合物，其中所述卷丹鳞茎提取物基于该组合物的总重量以0.1％至5％的浓度存在于该组合物中。
3.如权利要求2所述的化妆品组合物，其中所述卷丹鳞茎提取物基于该组合物的总重量以0.2％至2.5％的浓度存在于该组合物中。
4.一种美容护理方法，其包括局部施用如权利要求1所述的组合物以减少老化和光老化的皮肤迹象。
5.一种美容护理方法，其包括局部施用如权利要求1所述的组合物以改善细胞活力。
6.一种美容护理方法，其包括局部施用如权利要求1所述的组合物以改善细胞防护污染和细胞防护颗粒物。
7.一种美容护理方法，其包括局部施用如权利要求1所述的组合物以改善细胞防护UV诱导的DNA损伤。
8.一种美容护理方法，其包括局部施用如权利要求1所述的组合物以减少细胞衰老。
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