CN108291222B - 用于从植物材料获得富含小rna的含水提取物的方法和源自该方法的提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法。本发明的特征在于其包括以下步骤，根据所述步骤：a)使植物材料与水接触；b)将乙二胺四乙酸(EDTA)四钠添加至a)中获得的10.5和11之间的pH的混合物中；c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；d)纯化c)中获得的混合物，以便除去植物材料并回收含水粗提取物；和e)检查pH并重新调节(如果必要)至6和8之间的值。本发明还涉及可以通过这种方法获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的植物材料的含水提取物，以及包含这种提取物的组合物，和其用于防治皮肤衰老迹象和用于改善皮肤的水合作用的美容用途。

Description

用于从植物材料获得富含小RNA的含水提取物的方法和源自 该方法的提取物
技术领域
本发明涉及从植物材料获得富含具有150个核苷酸(nt)的最大长度的小RNA(核糖核酸)的含水提取物的方法，源自这种方法的提取物以及包含此类提取物的组合物和它们的美容用途。
背景技术
在实验室中并且因此小规模进行的用于提取核糖核酸(RNA，低分子量RNA)的常规方案必须在化学罩下进行，因为这些方法涉及使用有毒且不被认为是化妆品溶剂的溶剂诸如苯酚和氯仿(Zumbo,P.2014"Phenol-chloroform Extraction,"2014)。将这些溶剂添加至裂解细胞或非常精细压碎的植物或动物组织的水相中，或者直接添加至在液氮存在的情况下产生的压碎制备物中。将因此获得的溶液在4℃下以近似10,000g的高速离心，以产生两个良好分离的相，含有蛋白质的有机相和含有总RNA的水相，中间相含有DNA。然后必须仔细回收水相，以避免无意收集中间相和有机相。用异丙醇进行沉淀RNA的步骤。然后用乙醇洗涤总RNA沉淀。然后将总RNA重新溶解于水中，并且必须在非常低的温度(-20℃且甚至更好-80℃)下储存。
为了仅获得低分子量RNA，可以使用含有纯化柱的试剂盒，诸如来自Sigma的试剂盒，mirPremierTMmicroRNA分离试剂盒。这些试剂盒可以仅在实验室测试规模上使用，因为所讨论的体积为约为1mL，因此不能适应于大规模的产品开发。
另外，所有这些提取和纯化方案都无法使得可能获得纯化的核酸级分。该RNA或DNA或小RNA核酸级分将不含任何其他目标分子，诸如次级代谢物、维生素、糖、肽等，其可以对皮肤具有有益效果并因此具有美容益处。
此外，例如，文献WO8403835是已知的，其描述了用于获得富含纯DNA的植物胚芽的含水提取物的方法。这种方法值得注意地使用在含有蔗糖、EDTA(0.05M)和氯化钠的pH9.5的缓冲提取溶液中压碎的小麦胚芽和/或大豆胚芽。过滤之后，将残余物在环境温度下在搅拌下重新悬浮于补充有阴离子去污剂的pH7.4的缓冲盐水Tris溶液中，随后在0℃下在搅拌下添加高氯酸钠，并添加氯仿和辛醇，然后在低温(4℃)和非常高的速度(25,000g)下离心。回收基本上含有DNA的水相，其具有少量RNA和氨基酸，可以有利地对其使RNA酶起作用。
因此，该文献公开了使用非常大量的处理，包括用阴离子去污剂和不同溶剂(包括氯仿和辛醇，其可以在产物中留下毒性痕迹并且因此不能用于化妆品中)处理，获得特异性富含DNA的植物胚芽的含水提取物。
文献FR2831168也是已知的，其描述了用于从植物材料(特别是具有高DNA或RNA含量的植物胚芽或种子)获得富含核酸(DNA和/或RNA)的提取物的方法。该方法在于在水性介质中在纤维素分解酶存在的情况下在9至13(在几分钟内向中性演变的pH(这些酶的作用的最佳pH))的起始pH下提取植物材料，然后分离植物材料以回收含水提取物，最后用蛋白酶处理提取物并分离不溶性物质以回收纯化的含水提取物。因此获得的冻干产物可以特别含有0.1-1重量％的DNA，0.2-1.5重量％的RNA，以及碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素B和脂质。
具体而言，基于该文献中描述的数据，因此获得的冻干产物似乎含有1至10mg/L的DNA和10至75mg/L的RNA。
发明内容
考虑到上述情况，本发明提出要解决的问题是开发用于从植物材料获得特异性富含小RNA且不包含DNA的含水提取物的方法，其对于在工业规模上实施是容易和廉价的，不强制要求使用纤维素分解酶(纤维素酶、半纤维素酶)或DNA酶，提供良好产量的小RNA，并且不具有所提及的现有技术方法的缺点，诸如例如使用去污剂和潜在地有毒溶剂。
因此获得的提取物可以直接用于化妆品中。
因此，本发明的第一主题是用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法，其包括以下步骤：
a)使植物材料与水接触；
b)将乙二胺四乙酸四钠(EDTA)添加至a)中获得的混合物中，所述混合物的pH在10.5和11之间；
c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；
d)纯化c)中获得的混合物，以便除去植物材料并回收含水粗提取物；和
e)对含水粗提取物进行至少一次的过滤以获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物，检查其pH，并且如果需要将其调整至6和8之间的值，优选6和6.5之间的值。
此外，本发明的第二个主题是通过根据本发明的方法获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的植物材料的含水提取物，其中它包含相对于提取物的总重量，以重量计，5至60g/kg干燥提取物和10至1000mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的小RNA，并且不包含DNA。
本发明的第三个主题是包含有效量的作为抗衰老活性剂的根据本发明的提取物和生理学上可接受的介质的组合物。
本发明的第四个主题是根据本发明的组合物用于防治皮肤衰老迹象的美容用途。
最后，本发明的第五个主题是根据本发明的组合物用于改善皮肤水合作用的美容用途。
附图说明
在阅读参考附图撰写的说明书和以下非限制性实施方案后，将更好地理解本发明和由此得到的优点，在附图中：
-图1A表示2％的琼脂糖凝胶上的电泳，其表明pH对根据本发明的实施例2(稻胚芽)的提取物中的低分子量RNA的提取的影响；
-图1B表示2％的琼脂糖凝胶上的电泳，其表明酶促水解对根据本发明的实施例2(稻胚芽)的提取物中的低分子量RNA的提取的影响；
-图2表示用
Figure GDA0003757590980000031
定量根据本发明的实施例3(小扁豆)的提取物的低分子量RNA；
-图3表示在用DNA酶处理之前和之后用
Figure GDA0003757590980000041
定量根据本发明的实施例4(小扁豆)的提取物的低分子量RNA；
-图4A表示根据实施例7、8和9的不同猴面包树(Adansiona digitata)的提取物对第8代(P8)人成纤维细胞上的透明质酸合酶2(HAS2)的表达的影响；和
-图4B表示根据实施例7、8和9的不同猴面包树(Adansiona digitata)的提取物对第32代(P32)人成纤维细胞上的透明质酸合酶2(HAS2)的表达的影响。
具体实施方式
除非另有说明，否则在本说明书中应该理解，当给出间隔时，它包括所述间隔的上限和下限。
本发明涉及经实施用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的方法。应该注意的是，本发明的方法可以在本领域技术人员已知的任何类型的初步提取步骤(化学水解，酶水解...)之后进行，使得可能例如预先消除对本发明的方法的正确运行可能有害的某些植物级分。
“小RNA”或“低分子量RNA”被理解为意指具有低分子量且具有150个核苷酸的最大长度的非编码RNA(核糖核酸)，诸如所有单链和/或双链非信使小RNA，例如，微RNA、干扰RNA、内含子、小核RNA或任何RNA片段。
通常，植物材料是植物，是植物界的活有机体，其特征在非常低的运动性，其以矿物质为食并吸收二氧化碳，包括其生命周期通常发生在水生环境中的植物，诸如藻类。
有利地，为了实施该方法，根据本发明的植物材料是全植物或优选植物部分(果实、叶、根、鳞茎、胚芽、种子…)，其可以以新鲜、干燥、发芽、完整、粉末状、冷冻的形式使用，但也可以以转化后获得的植物残渣(诸如油饼或糟)的形式使用。为了实现这一点，可以使用所提及的植物物种的所有部分来获得提取物，富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物。因此，为了举例说明且以非限制性方式给出关于植物的某些部分的实例。
有利地，可以考虑使用任何果实或果实部分作为起始植物材料用于获得富含低分子量RNA的含水提取物。例如，可以提及整个果实，碎片形式的果实，新鲜或冷冻的粉末形式的果实，糟形式的果实。可以提及西番莲科的果实，但也可以提及其他科的果实，诸如锦葵科(Malvaceae)的果实，诸如咖啡黄葵(Hibiscus esculentus)(秋葵)。还可以提及石榴科诸如石榴(Punica granatum)(石榴)的果实，猕猴桃科诸如猕猴桃(Actinidia chinensis)(猕猴桃)的果实，桃金娘科诸如番石榴(Psidum guajava)(番石榴)的果实，金丝桃科诸如柬埔寨藤黄(Garcinia cambodgia)(马拉巴罗望子树(Malabar tamarind))的果实，番木瓜科诸如番木瓜(Carica papaya)(番木瓜)的果实。也可以考虑使用属于Malphigiaceae科诸如Malphigia glabra(西印度樱桃(acerola))果实，浆果形式的果实，诸如杜鹃花科诸如欧洲越橘(Vaccinium myrtillus)(欧洲越橘)的果实以及茶藨子科诸如黑果茶藨(Ribesnigrum)(黑醋栗)的果实。或者可以考虑茄科(Solanaceae)的任何果实，诸如宁夏枸杞(Lycium barbarum)(枸杞)。
富含低分子量RNA的含水提取物也可以从任何花获得，所述花呈整个形式，新鲜或冷冻的粉末形式，例如蔷薇科(Rosaceae)，诸如玫瑰，以及芸香科(Rutaceae)，诸如酸橙(Citrus aurantium)(酸橙花)的整个形式，新鲜或冷冻的粉末形式。还可以提及使用其他科的花，诸如木犀科(Oleaceae)诸如Jasminum officinalis(茉莉花)的花或菊科(Asteraceae)诸如矢车菊(Centaurea cyanus)(矢车菊)的花。
种子也可以用作起始植物材料用于获得富含低分子量RNA的含水提取物。任何种子都可以使用，以整个或以粉末(发芽或未发芽)的形式使用。为了信息和以非限制性方式，这些种子可以源自藜科(Chenopodiaceae)，诸如昆诺藜(Quinoa chenopodium)，豆科或蝶形花科(Fabaceae)，诸如小扁豆(Lens esculenta)(小扁豆)，或属于禾本科(Poaceae)，诸如水稻(Oryza sativa)(水稻)的植物。它们也可以来自葫芦科(Cucurbitaceae)、诸如南瓜(Cucurbita pepo)(南瓜)或唇形科(Lamiaceae)的植物。也可用于本发明的是芸香科(Rutaceae)或蔷薇科(Rosaceae)的小种子或果仁或产生含有果仁或结石的果实的任何其他物种。
植物的地下部分，诸如根或根茎，鳞茎也可以被认为是用于获得富含低分子量RNA的含水提取物的起始植物材料。这些地下部分可以呈整个形式，呈粉末(新鲜、干燥或冷冻)的形式。为了信息和以非限制性方式，根或鳞茎或根茎源自百合科(Liliaceae)，例如白百合(Lilium candidum)或卷丹百合(Lilium tigrinum)，但对于本发明，还可以考虑使用来自鸢尾科(Iridaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、葱科(Alliaceae)的任何植物物种。
其也可以考虑作为用于获得富含低分子量RNA的含水提取物的起始植物材料，其为任何类型的整个形式的叶子，粉末(新鲜或冷冻)的形式；可以提及五加科或薯蓣科的植物或具有发育的叶系统的任何其他类型的植物科。
实施例中使用的植物优选选自禾本科(原为禾本科)，被称为豆科植物的豆科，锦葵科，木棉科，葫芦科，藜科或假谷科，蔷薇科，芸香科，百合科，西番莲科。
作为非限制性说明性实例，植物材料选自以下物种：咖啡黄葵(Hibiscusesculentus)(秋葵)、Adansonia digitata(猴面包树)、昆诺藜(Chenopodium quinoa)(昆诺藜)、小扁豆(Lens esculenta)(小扁豆)、水稻(Oryza sativa)(稻)、南瓜(Cucurbitapepo)(南瓜)、洋蔷薇(Rosa centifolia)(玫瑰)、酸橙(Citrus aurantium)(苦橙树)、白百合(Lilium candidum)(百合)、卷丹百合(Lilium tigrinum)(卷丹百合)、翅茎西番莲(Passiflora alata)(翅茎西番莲)。
在根据本发明的方法的第一步骤a)中，使植物材料与水接触，优选以4至20％(重量/重量)的植物材料/水比率，更优选以5至15％的比率，例如，5、10或15％(重量/重量)的比率。
所用的水是蒸馏水、软化水或另外富含矿物盐和/或稀土元素的水，优选蒸馏水。
优选地，将植物材料在步骤a)中其与水接触之前被压碎。压碎是允许更好的提取的机械作用。机械压碎，随后在EDTA存在的情况下进行碱裂解，促进细胞膜、特别是核膜的完全解构。
然后，在步骤b)中，将EDTA四钠添加至a)中获得的混合物中。该步骤中的pH是碱性的，并且如果必要，必须通过添加氢氧化钠(NaOH)将其调节至10.5和11之间的值。在步骤b)中，将碱性pH维持在10.5和11之间是必要的。实际上，与EDTA的作用相关的该pH水平引起细胞膜(包括核膜)的解构，细胞的裂解，和DNA的变性(分离双螺旋的2条链)。步骤b)中的pH检查显示pH维持碱性并稳定在9和11之间。
EDTA四钠的浓度优选为2和15mM之间，更优选为10mM。
选择该浓度以便优化最终提取物中低分子量RNA的提取的产率。EDTA四钠将通过经由二价离子诸如钙离子(其在纤维素微原纤维周围的果胶分子之间形成离子桥)形成络合物的螯合而削弱和解构植物细胞的果胶-纤维素膜。其结果是促进提取期间细胞内容物的释放。用EDTA处理的步骤对于富集具有低分子量RNA的提取物是必要的。
用EDTA处理的步骤优选在20和80℃之间的温度下持续至少1小时。在该步骤期间，有利地搅拌a)中获得的混合物。
然后，在步骤c)中，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值。
例如，通过添加盐酸(HCl)溶液或与美容用途相容的能够调节pH的任何酸(诸如柠檬酸或乳酸)来调节pH。
该酸化步骤引起DNA的突然复性(双链体的重新配对)。然而，非常长的染色体DNA的重新配对并不完全发生，导致形成不溶性的缠结。相反，短得多的小RNA保留在溶液中。因此，DNA和小RNA分离为两个分开相，在其他组分间含有染色体DNA的固相和在其他组分间含有小RNA的液相。
在步骤d)中，纯化c)中获得的混合物，以便除去植物材料并回收含水粗提取物。可以使用本领域技术人员已知的任何方法。优选地，将c)中获得的混合物以低速(例如以4000g)离心至少10分钟，使得残留的植物材料沉降在沉淀中并且在上清液中回收含水粗提取物。
有利地，在步骤d)之前将浓度为10-20g/kg的硅藻土或二氧化硅添加至混合物中，以便在离心期间获得非常致密的沉淀，这使得可能获得不含不期望的固体物质的上清液。
在步骤e)中，检查pH并重新调节至6和8之间的值。优选地，将pH重新调节至6和6.5之间的值，甚至更优选至6.5。通过添加盐酸(HCl)或氢氧化钠(NaOH)的溶液来重新调节pH。
事实上，低于6的pH通常可以导致核酸的沉淀，并因此导致具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA的沉淀。根据本发明的方法的步骤e)中的pH调节步骤是对于低分子量RNA的最佳提取不可或缺的步骤。
有利地，在步骤e)的pH的重新调节之前，对d)中获得的含水粗提取物进行至少一次的过滤。优选地，通过将20至50μm的过滤截止值降低至0.1至0.3μm来进行依次过滤。
根据一个有利的实施方案，根据本发明的方法包括在步骤c)之前直接对b)中获得的混合物，或者对b)中获得的混合物的离心并除去植物材料之后的上清液进行额外水解步骤，通过选自碳水化合物酶、纤维素酶和/或蛋白酶、优选蛋白酶的至少一种酶在45至65℃的温度下且在根据所用的酶调节的pH、通常在6至8.5的pH下作用至少1小时。
当进行额外水解步骤时，然后将pH重新调节(如果必要)至6至8，优选6至6.5，以保留在前面步骤期间提取的低分子量RNA并防止其由于过度酸性的pH而沉淀。
在该有利的实施方案中，该方法还强制性地包括在65至80℃的温度下使酶失活至少1小时的步骤，该失活步骤直接在水解步骤之后或在e)中的2个依次过滤步骤之间进行。
本发明的第二个主题是可以通过上面所述的方法获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的植物材料的含水提取物。
在一个具体实施方案中，通过上面所述的方法获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物。
该提取物不含DNA(脱氧核糖核酸)。
这种富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物在稀释之前，相对于提取物的总重量，以重量计，包含5至60g/kg干燥提取物和10至1000mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的小RNA。可以通过根据本发明的方法获得的提取物还包含0.5至30g/kg的蛋白质片段和0.5至50g/kg的糖类。这种提取物还可以包含0.01至5g/kg的氨基酸和0.01至4g/kg的酚类化合物。
如此获得的提取物被认为是浓缩的。然后可以将其在用于美容用途的生理学上可接受的溶剂中稀释，使得然后将提取物的浓度调节至特定的目标干燥提取物重量。
作为生理学上可接受的溶剂的说明性和非限制性实例，可以提及水、甘油、乙醇、丙二醇以及其源自玉米的称为
Figure GDA0003757590980000091
的天然形式、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。
优选地，可以通过根据本发明的方法获得的提取物在溶剂诸如30％甘油和水中稀释，并且相对于提取物的总重量，以重量计，包含5至35g/kg干燥提取物和10-500mg/kg的具有150个核苷酸的最大长度的小RNA。该稀释的提取物还包含0.5至20g/kg的蛋白质片段和0.5至30g/kg的糖。这种稀释的提取物还可以包含0.01至3g/kg的氨基酸，0.01至2g/kg的酚类化合物。
为了举例说明，下面描述根据本发明的方法的优选实施方案实施例。
实施例1：制备富含小RNA的禾本科的稻胚芽(水稻)的提取物
从来自禾本科(原为禾本科)的稻(Oryza sativa)获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，将5％粉末状稻胚芽置于蒸馏水中，添加10mM EDTA四钠，或将50g稻胚芽粉末置于1kg蒸馏水中，并添加3.8g EDTA四钠。该步骤中的pH必须是碱性的，并且在10.5和11之间，用于最佳富集具有低分子量RNA的提取物。
将混合物在环境温度下搅拌2小时。
然后用相对于所用植物材料以各自2％添加的蛋白酶(由
Figure GDA0003757590980000092
(其为丝氨酸内肽酶)和菠萝蛋白酶组成)进行酶促水解，或者将1g各酶添加至混合物中。将pH调节至7.5和8之间。
然后将混合物在55℃下加热2小时，然后在80℃下加热2小时以使这些相同的酶失活。
然后将混合物用硅藻土(每1kg混合物10g)以4000g离心10分钟，以除去固体物质。
在该步骤之后，在任选的稀释之前检查pH，以使其达到6和6.5之间(如果必要)，并保留提取物的小RNA。
然后进行通过孔隙率渐降的过滤器的连续过滤，以便澄清植物提取物，直至在0.2μm的除菌过滤。
通常，稻胚芽的含水提取物具有淡黄色并滴定为20至50g/kg干重提取物，3至15g/kg蛋白质片段，5至30g/kg糖类，1.5至3g/kg氨基酸，300至750mg/kg酚类化合物，和50至400mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
尽管如此，对于来自水稻种的稻胚芽，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
更具体地，在本实施例中，获得滴定为23g/kg干重提取物的含水提取物。物理-化学分析显示，该提取物具有如下浓度：4.8g/kg蛋白质片段，8.2g/kg糖类，2.3g/kg氨基酸，328mg/kg酚类化合物，和132mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。随后可以将该提取物稀释于水中并通过添加化妆品溶剂诸如甘油和防腐剂诸如1.5％苯氧乙醇进行保存。
实施例2：研究pH和酶促水解在该方法的实施中的影响
为了研究pH在根据本发明的方法的实施中的影响，在不同的pH值下和对不同类型的植物进行提取测试。
这些提取尤其在稻胚芽上进行(如实施例1中所述)。通常可以针对根据本发明考虑且更具体地描述的所有类型的植物获得可相比的结果。
将5％稻胚芽粉末置于水中，或者添加1kg蒸馏水中的50g稻胚芽粉末和10mM EDTA四钠(或3.8g)。通过添加1至3mL浓氢氧化钠来将pH调节至7或11；然后将混合物在环境温度下搅拌2小时。
然后在提取方法期间进行样品收集，以便在该关键步骤之后观察每种提取物的低分子量RNA的富集。
因此进行2％琼脂糖凝胶上的电泳以显现低分子量RNA的存在(图1A)。
如图1A中所示，可以观察到，用于富集具有低分子量RNA的提取物的最佳pH为11的碱性pH；实际上，在pH 7，提取物不含低分子量RNA(不存在特征性条带)。
因此，在用EDTA处理步骤期间使用碱性pH值是实施根据本发明的方法的基本条件。
在第二步，用混合物中相对于所用植物材料各自2％的蛋白酶(由
Figure GDA0003757590980000111
和菠萝蛋白酶组成)或者1g各酶进行酶促水解。将pH调节至7.5和8之间，对于酶的活性而言是最佳pH，并且对于保持混合物中的低分子量RNA可溶是最佳的，因为小于6的pH引起其沉淀。
然后将混合物在55℃(酶的活性的最佳温度)下加热2小时，然后在80℃下加热2小时以使这些相同的酶失活。
然后将混合物用硅藻土(每1kg混合物10g)以4000g离心10分钟，以便除去固体物质。
在该步骤之后，在任选的稀释之前检查pH，以使其达到6和6.5之间，并保留提取物的小RNA。
然后进行通过孔隙率渐降的过滤器的连续过滤，以便澄清植物提取物，直至孔隙率0.2μm的除菌过滤。
通过在2％的琼脂糖凝胶上电泳来显现最终提取物(图1B)。
如图1B中所示，注意到酶的使用有利地改善了最终提取物中低分子量RNA的提取的产率。
在不同类型的植物提取物上观察到该结果。酶加强低分子量RNA的提取的事实可能是由于蛋白质经常与核酸结合的事实；通过破坏蛋白质的肽键的酶对蛋白质的降解，因此生成具有小尺寸(小于10kDa)的蛋白质片段，将使得能够解离与蛋白质结合的RNA并将其释放，因此增加其在提取物中的最终产率。
实施例3：制备富含小RNA的豆科的小扁豆(Lensesculenta)的提取物
从小扁豆获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，在提取方法的前一天使小扁豆发芽，即用蒸馏水覆盖40g小扁豆。
第二天，添加蒸馏水以获得提取方法中使用的4％当量的小扁豆。
然后将小扁豆(对于1kg蒸馏水足够量的40g)粉碎，并添加10mM EDTA四钠(或3.8g)。通过添加NaOH溶液将pH调节至11，并将混合物在环境温度下搅拌2小时。
有利地进行具有大孔隙率的过滤以除去固体碎片。
然后将蛋白酶(相对于所用植物材料，2％菠萝蛋白酶和2％
Figure GDA0003757590980000121
)添加至滤液中以进行酶促水解，注意在通过添加HCl溶液使pH调节至7.5和8之间之前使酶溶解。
将滤液在55℃下在搅拌下保持2小时，在此期间发生水解。
然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以澄清含水粗植物提取物。
然后将提取物在80℃下加热1小时以使酶失活。
继续过滤，直至0.3至0.4μm的孔隙率。
在提取方法的该步骤中，在任选稀释之前适当地检查pH以使其有利地处于6和6.5之间并保留提取物的小RNA是重要的。
通常，获得具有琥珀红色的小扁豆的水提取物，其滴定为15至25g/kg干重提取物，3至8g/kg蛋白质片段，2至8g/kg糖类，1至3g/kg氨基酸，300至750mg/kg酚类化合物，和50至150mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然而，对于相同种的小扁豆(Lens esculenta)，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
更具体地，在本实施例中，获得含水提取物，其滴定为15.4g/kg干重提取物，6.9g/kg蛋白质片段，2.1g/kg糖类，1.4g/kg氨基酸，400mg/kg酚类化合物，和96mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后将提取物稀释于水中或包含例如水和30％甘油的生理学上可接受的溶剂中，使得最终提取物调节至10g/kg干重提取物。
物理-化学分析显示，在稀释之后，该提取物具有以下浓度：5.1g/kg的蛋白质片段，1.5g/kg的糖类，0.8g/kg的氨基酸，280mg/kg的酚类化合物和70mg/kg的低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)，如图2中更具体地通过用
Figure GDA0003757590980000122
(Agilent)定量低分子量RNA所示。
Figure GDA0003757590980000123
是这样的设备，其使得可能运行微型化电泳，这是由于核酸的分析(诸如低分子量RNA的分析)特异性的电子芯片。其使得可能使用几微升来测定提取物中所含的尺寸和浓度。结果是具有纵坐标上的任意荧光单位(FU)和横坐标上的核苷酸数(nt)的图形的形式。向每个分析都添加内部标记物(图2中在4nt的峰)，并充当用于验证分析的正确运行的内部对照。
实施例4：关于根据实施例3的提取物中的DNA不存在的测试(小扁豆)
为了验证根据本发明的提取物中获得的核酸事实上是RNA并且更具体地是低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)而不是DNA，遵循供应商推荐的方案进行使用特异性降解DNA的DNA酶(OPTIZYMETMFisher Bioreagent)的测试。
制备含有500μg/mL鲑鱼DNA(Sigma,31149-10g-F)的对照溶液和含有500μg/mL源自圆酵母(Torula yeast)的低分子量RNA(Sigma R6625-25G)的另一种对照溶液。反应体积含有每1μg DNA或RNA，1μL RNA酶，1μL缓冲液10X，并用DEPC(焦碳酸二乙酯)水0.1％v/v补足至10μL。然后将反应混合物在37℃(DNA酶反应的最佳条件)下孵育30分钟。然后通过添加50mM EDTA四钠并通过在65℃下加热10分钟而使酶失活。
为了显现DNA酶作用之后对照溶液和根据实施例3的提取物的概况，在用DNA酶处理之前和之后用
Figure GDA0003757590980000131
定量小RNA。用或不用DNA酶处理植物提取物的情况下获得的概况是相同的，量保持相同或近似30mg/kg，如图3中所示。向每个分析都添加内部标记物(图3中在4nt的峰)，并充当用于验证分析的正确运行的内部对照。
用DNA酶(特异性降解DNA而不是RNA的酶)测试表明根据实施例3的提取物的核酸在用DNA酶处理之后仍然存在。因此其实际上是RNA，特别是具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA，而不是DNA。
实施例5：制备富含小RNA的锦葵科的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))的 提取物
从咖啡黄葵种(Hibiscus esculentus)的秋葵果实获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，解冻之后，将10％的咖啡黄葵在蒸馏水中混合，或者例如将100g果实在1kg蒸馏水中混合，然后将其粉碎10分钟，同时以10mM或3.8g/1kg的最终浓度添加EDTA四钠的情况下。该步骤中的pH在10.5和11之间，这是用于富集具有小RNA的提取物的最佳pH。
然后将该混合物在45°下搅拌2小时。即使在该阶段的温度可以从20℃变化至80℃，对于该物种，45℃的温度结果是使得可能在富集具有低分子量RNA的最终含水提取物的方面获得最好结果的温度。
2小时之后，以10g/kg的浓度添加硅藻土(或二氧化硅)，并将混合物再搅拌10分钟，随后以4000g离心10分钟。
然后收获上清液。该粗提取物具体地含有蛋白质片段、糖类和低分子量RNA。
添加蛋白酶(相对于所用植物材料的量，2％菠萝蛋白酶和2％
Figure GDA0003757590980000141
)，以便进行酶促水解，注意在使pH调节至7.5和8之间之前使酶溶解。
将粗溶液在55℃下在搅拌下保持2小时，在此期间发生水解。酶促水解将使得可能获得低分子量蛋白质片段(小于10kDa，高分子量蛋白质可能是致敏的)。而且，以该方式获得的此类蛋白质片段可以具有关于皮肤的令人感兴趣的生物学活性。
为了开始澄清粗提取物，然后使用具有20和50μm之间、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，随后为在80℃的高温下将提取物加热过夜的步骤。该步骤使得可能使蛋白酶失活，所述蛋白酶在强热作用下经历变性，然后变得失活。
然后继续过滤，直至0.1至0.3μm的除菌过滤。
然后植物提取物必须具有6和8之间的最终pH，以防止低分子量RNA沉淀。在提取方法的该步骤中，在任选的稀释之前，的确必须验证pH，以使其甚至更优选在6和6.5之间。
通常，获得具有淡黄色的含水提取物，其被滴定为10至20g/kg干重提取物，2至5g/kg蛋白质片段，2.5至5g/kg糖类，0.1至2g/kg氨基酸，0.2至3g/kg酚类化合物，和10至100mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
尽管如此，对于来自相同种(咖啡黄葵)的秋葵果实，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
在本实施例中，更具体地获得含水提取物，其滴定为13.3g/kg干重提取物，3.2g/kg蛋白质片段，3.9g/kg糖类，790mg/kg氨基酸，490mg/kg酚类化合物，和60mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后将提取物稀释于包含例如水和30％甘油的生理学上可接受的溶剂中，使得最终提取物调节至10g/kg干重提取物。
物理-化学分析显示，在稀释之后，该提取物具有如下浓度：2.5g/kg的蛋白质片段，2.7g/kg的糖类，520mg/kg的氨基酸，320mg/kg的酚类化合物，和35mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
实施例6：用EDTA处理的步骤在从秋葵(咖啡黄葵)提取小RNA的方法的实施中的作 用的证明
为了证明用EDTA处理在提取低分子量RNA中的作用的目的，通过修改根据本发明的方法的某些基本步骤来获得咖啡黄葵果实的提取物，使得不可能富集具有低分子量RNA的提取物。
将15％的解冻的咖啡黄葵果实与蒸馏水混合，然后将其粉碎，或将150g果实在1kg蒸馏水中粉碎。
然后依次添加蛋白酶：相对于所用的植物材料(或3g)，2％
Figure GDA0003757590980000151
在pH 8下在55℃(对于该酶的最佳条件)下2小时，然后2％菠萝蛋白酶(或3g)，在调节至4和4.5之间的值的pH下在55℃下2小时。
然后将该混合物离心以除去固体碎片。
为了开始澄清粗提取物，然后通过具有20和50μm之间、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，随后为在80℃的高温下将提取物加热过夜的步骤。
继续过滤，直至0.1至0.3μm的除菌过滤。
然后将获得的含水提取物稀释于包含例如水和30％甘油的生理学上可接受的溶剂中，以达到9.6g/kg干重提取物。最终提取物的pH在4和4.5之间。
物理-化学分析显示，最终植物提取物在稀释之后具有如下浓度：2.2g/kg的蛋白质片段，3.8g/kg的糖类，550mg/kg的氨基酸和243mg/kg的酚类化合物。
用
Figure GDA0003757590980000161
分析表明该提取物的低分子量RNA的浓度为零。该结果表明，基于没有用EDTA处理的步骤的提取方法获得的提取物不含低分子量RNA。因此，用EDTA处理的步骤对于获得富含根据本发明的低分子量RNA的提取物是必要的。
实施例7：制备富含小RNA的木棉科的猴面包树(Adansoniadigitata)的提取物
从猴面包树种(Adansonia digitata)的猴面包树获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，将5％猴面包树籽油饼(猴面包树(Adansonia digitata))干燥粉碎或直接在含有最终浓度为10mM的EDTA四钠的水中粉碎，或将50g猴面包树油饼在向其中添加3.8g EDTA四钠的1kg蒸馏水中粉碎。该步骤中的pH是碱性的，并且更具体地在10.5和11之间，用于富集具有低分子量RNA的提取物的最佳pH。
将混合物在58℃下搅拌2小时。
有利地，对于该物种，进行用蛋白水解酶的水解步骤：相对于所用的植物材料的量添加2％的木瓜蛋白酶(或1g)。如果必要，将混合物的pH调节至7和8之间，并将混合物在58℃(该酶的最佳条件)下搅拌2小时。
然后，将pH调节至8，然后将提取物以4000g离心10分钟以除去固体物质。
然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以澄清植物提取物。
然后将提取物在80℃下加热8至12小时以使酶热失活。
继续过滤，直至0.3至0.4μm的孔隙率。在提取方法的该步骤中，必须在任选的稀释之前适当地验证pH，以使其处于6和6.5之间并保留提取物的小RNA。通常，酸性pH可以导致核酸的沉淀并因此还导致低分子量RNA的沉淀。
通常，获得具有琥珀红色的猴面包树的水提取物，其滴定为15至25g/kg干重提取物，3至8g/kg蛋白质片段，2至8g/kg糖类，0.05至1g/kg氨基酸，0.05至1g/kg酚类化合物，和10至80mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然而，从物种猴面包树获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
在本实施例中，更具体地，获得含水提取物，其滴定为17g/kg干重提取物，5.3g/kg蛋白质片段，5.4g/kg糖类，650mg/kg氨基酸，441mg/kg酚类化合物，和57mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后将提取物稀释于水和30％甘油的混合物中，并添加1.5％苯氧乙醇，这使得可能获得12g/kg干重提取物的最终提取物。
物理-化学分析显示，在稀释之后，该提取物具有如下浓度：2.9g/kg的蛋白质片段，4g/kg的糖类，400mg/kg的氨基酸，310mg/kg的酚类化合物，和41mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
实施例8：用EDTA处理的步骤在从猴面包树(Adansonia digitata)提取小RNA的方 法的实施中的作用的证明
为了证明用EDTA处理的步骤在提取低分子量RNA中的作用的目的，通过修改根据本发明的方法的某些基本步骤来获得猴面包树(Adansonia digitata)的提取物，使得不可能富集具有低分子量RNA的提取物。
在第一步，将10％的猴面包树籽油饼(猴面包树(Adansonia digitata))粉碎，然后添加水，或将100g猴面包树饼在1kg蒸馏水中粉碎。
对于该物种，进行用蛋白水解酶水解：相对于所用的植物材料的量添加2％的木瓜蛋白酶，或2g。将pH调节至7和8之间，并将混合物在58℃(酶活性的最佳条件)下搅拌2小时。在该时段之后，将pH降低至4.5，常规用于化妆品成分的pH。
随后，将提取物以4000g离心10分钟以除去固体物质。然后将提取物在80℃下加热8至12小时，以通过高温使酶失活。
然后通过具有20和50μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器(然后直至0.3至0.4μm的孔隙率)进行依次过滤。
然后获得具有清楚黄色的提取物，其滴度为12.5g/kg干重提取物，5.8g/kg蛋白质片段，7.6g/kg糖类，540mg/kg氨基酸和440mg/kg酚类化合物。
然后将提取物稀释于水和甘油中，以便获得含有30％甘油的最终提取物，并将其调整至10g/kg干重提取物。
物理-化学分析显示，在稀释之后，植物提取物具有如下浓度：3.25g/kg的蛋白质片段，5.1g/kg的糖类，310mg/kg的氨基酸和250mg/kg的酚类化合物。在这些提取条件(不用EDTA处理)下，用
Figure GDA0003757590980000181
分析表明该提取物的低分子量RNA的浓度为零。该结果证实，使用不用EDTA处理(在碱性pH下)的提取方法获得的提取物不含低分子量RNA。用EDTA处理的步骤对于获得富含根据本发明的低分子量RNA的提取物是必要的。
实施例9：研究最终pH在制备秋葵(咖啡黄葵(Hibiscusesculentus))和猴面包树 (猴面包树(Adansoniadigitata))的提取物中的影响
除了最终的pH调节步骤之外，提取方法在与实施例5和7中相同的操作条件下进行，以便富集具有低分子量RNA的提取物。
该提取方法用EDTA四钠处理步骤进行，随后进行酶促水解步骤，但将提取物最终调节至4和4.5之间的酸性pH，而不是6和8之间的pH。
这导致低分子量RNA的沉淀，其结果通过用
Figure GDA0003757590980000182
分析证实，其对因此获得的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))和猴面包树(猴面包树(Adansoniadigitata))的提取物中的每一种给出零低分子量RNA的浓度。
实施例10：制备富含小RNA的葫芦科的南瓜(南瓜(Cucurbitapepo))的提取物
从来自南瓜科的南瓜(南瓜(Cucurbita pepo))获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，将10％的南瓜籽油饼与水混合，并添加EDTA四钠以获得10mM的最终浓度，或将100g南瓜油饼添加至1kg蒸馏水和3.8g EDTA四钠中。
该步骤中的pH必须是碱性的，并且更具体地在10.5和11之间，用于最佳富集具有低分子量RNA的提取物。
将混合物在45℃下搅拌2小时。
然后用蛋白酶进行酶促水解：相对于所用的植物材料的量，2％
Figure GDA0003757590980000191
和4％木瓜蛋白酶，或者因此将2g
Figure GDA0003757590980000192
和4g木瓜蛋白酶添加至混合物中。将pH调节至7.5和8之间，这两种酶的活性的最佳pH，该pH对于保持低分子量RNA溶于混合物中也是最佳的，因为小于6的pH可以引起其沉淀。
然后将混合物在50℃(酶的活性的最佳温度)下加热2小时，然后在80℃下加热2小时以使这些相同的酶失活。
然后将混合物用硅藻土(每1kg混合物10g)以4000g离心10分钟，以便除去固体物质。
在该步骤之后，在任选的稀释之前检查pH，以使其(如果必要)达到6和6.5之间，并保留提取物的小RNA。
然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以澄清植物提取物。然后，继续过滤，直至0.2μm的除菌过滤。
通常，获得具有淡黄色的含水提取物，其滴定为20至50g/kg干重提取物，3至25g/kg蛋白质片段，1至10g/kg糖类，和50至250mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然而，对于相同种的南瓜(Cucurbita pepo)，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
在本实施例中，更具体地，获得含水提取物，其滴定为37.3g/kg干重提取物，18.4g/kg蛋白质片段，3.8g/kg糖类，和168mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后可以将提取物稀释于包含例如水和30％甘油的生理学上可接受的溶剂中。
实施例11：制备富含小RNA的藜科或假谷科的藜麦(昆诺藜(Chenopodium quinoa))的提取物
从来自藜科或假谷科的藜麦昆诺藜(Chenopodium quinoa)获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，将发芽的藜麦籽(最终重量的10％，或100g)用于提取过程中并在1kg蒸馏水中混合，然后粉碎，并添加EDTA四钠以获得10mM或3.8g的最终浓度。该步骤中的pH必须是碱性的并且在10.5和11之间，因此用NaOH调节pH，用于最佳富集含有具有150个核苷酸的最大长度的低分子RNA的根据本发明的提取物。将混合物在55℃下搅拌2小时。
然后用蛋白酶进行酶促水解：将2％
Figure GDA0003757590980000201
和2％菠萝蛋白酶添加至混合物中(相对于所用的材料)。将pH调节至7.5和8之间，这两种酶的活性的最佳pH，该pH对于保持低分子量RNA溶于混合物中也是最佳的，小于6的pH引起其沉淀。
将混合物在45℃(酶活性的最佳温度)下加热2小时。
然后将混合物用硅藻土(每1kg混合物10g)以4000g离心10分钟，以除去固体物质。
然后，将滤液在80℃下加热2小时以使这些酶失活。
然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以澄清植物提取物。
在该过滤步骤之后，可以优选在水和甘油中进行提取物的稀释，以便获得含有30％甘油的最终提取物。
然后，继续过滤，直至0.2μm的除菌过滤。
通常，获得具有淡黄色的提取物，其滴定为20至50g/kg干重提取物，3至15g/kg蛋白质片段，10至30g/kg糖类，0.5至5g/kg氨基酸，100至700mg/kg酚类化合物，和50至250mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
可以从未发芽的藜麦籽或从藜麦面粉获得类似的结果。
尽管如此，对于相同种的昆诺藜(Chenopodium quinoa)，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
更具体地，在本实施例中，获得含水提取物，其滴定为33g/kg干重提取物，9.5g/kg蛋白质片段，21.6g/kg糖类，1.8g/kg氨基酸，364mg/kg酚类化合物，和173mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后可以将提取物稀释于包含例如水和30％甘油的生理学上可接受的溶剂中。
实施例12.制备富含小RNA的蔷薇科的玫瑰(洋蔷薇(Rosa centifolia))的提取物
从来自蔷薇科的玫瑰(洋蔷薇(Rosa centifolia))获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。在本实施例中，使用整个鲜花。
在第一步，将10％的玫瑰在蒸馏水中混合，或者例如将100g花用蒸馏水补足至1kg，然后将其粉碎10分钟，同时以10mM或3.8g/1kg的最终浓度添加EDTA四钠的情况下。该步骤中的pH在10.5和11之间，这是用于富集具有小RNA的提取物的最佳pH。
然后将该混合物在80℃下搅拌1小时。即使在该阶段的温度可以从50℃变化至80℃，对于该物种，发现80℃的温度是使得可能在富集具有低分子量RNA的最终含水提取物的方面获得最好结果的温度。
该步骤之后，然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以除去固体物质，然后澄清植物提取物。
在该步骤中，检查pH，以使其(如果必要)达到6和6.5之间，并保留提取物的小RNA。
然后，继续过滤，直至0.2μm的除菌过滤。
通常，获得具有琥珀色的含水提取物，其滴定为5至20g/kg干重提取物，1至10g/kg蛋白质片段，1至10g/kg糖类，0.5至2g/kg酚类化合物，和20至200mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
尽管如此，对于相同种的玫瑰(洋蔷薇(Rosa centifolia))，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
在本实施例中，更具体地，获得含水提取物，其滴定为11.3g/kg干重提取物，5.1g/kg蛋白质片段，2.6g/kg糖类，1g/kg酚类化合物，和96mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后可以用例如30％甘油稀释提取物，这使得可能获得8g/kg干重提取物的最终提取物。
物理-化学分析显示，在稀释之后，该提取物具有如下浓度：4.6g/kg的蛋白质片段，2g/kg的糖类，280mg/kg的氨基酸，800mg/kg的酚类化合物，和83mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
实施例13：制备富含小RNA的芸香科的苦橙花(酸橙(Citrus aurantium))的提取 物
从来自芸香科的苦橙花(酸橙(Citrus aurantium))获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。在本实施例中，使用整个鲜花。
在第一步，将5％的苦橙花在蒸馏水中混合，或者例如将50g花用蒸馏水补足至1kg，然后将其粉碎5分钟，同时以10mM或3.8g/1kg的最终浓度添加EDTA四钠。该步骤中的pH在10.5和11之间，这是用于富集具有小RNA的提取物的最佳pH。
然后将该混合物在45℃下搅拌1小时。即使在该阶段的温度可以从25℃变化至50℃，对于该物种，发现45℃的温度是使得可能在富集具有低分子量RNA的最终含水提取物的方面获得最好结果的温度。
该步骤之后，然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以除去固体物质，然后澄清植物提取物。
在该步骤中，检查pH，以使其(如果必要)达到6和6.5之间，并保留提取物的小RNA。
然后继续过滤，直至0.3至0.5μm的孔隙率。
通常，获得具有琥珀色的含水提取物，其滴定为5至20g/kg干重提取物，1至10g/kg蛋白质片段，1至10g/kg糖类，200至1000mg/kg酚类化合物，和10至100mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
尽管如此，对于相同种的花(酸橙(Citrus aurantium))，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获时间、收获年份、季节、气候条件等因素。
在本实施例中，更具体地，获得含水提取物，其滴定为11.8g/kg干重提取物，4.5g/kg蛋白质片段，3.8g/kg糖类，560mg/kg酚类化合物，和20mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后可以将提取物稀释于生理学上可接受的溶剂诸如水或甘油中。
实施例14：制备富含小RNA的百合(白百合(Lilium candidum))的提取物
从来自百合科的白百合鳞茎(白百合(Lilium candidum))获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，将15％的百合鳞茎置于蒸馏水中，或者例如，将150g鳞茎置于含有最终浓度为10mM或3.8g/1kg的EDTA四钠的1kg蒸馏水中；然后将溶液的破碎进行5分钟。该步骤中的pH在10.5和11之间，这是用于富集具有小RNA的提取物的最佳pH。
然后将该混合物在65℃下搅拌30分钟。即使在该阶段的温度可以从50℃变化至80℃且搅拌时间可以从30分钟变化至1小时，对于该物种，发现65℃的温度持续30分钟构成使得可能在富集具有低分子量RNA的最终含水提取物的方面获得最好结果的条件。
该步骤之后，然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以除去固体物质，然后澄清植物提取物。
在该步骤中，检查pH，以使其(如果必要)达到6和6.5之间，并保留提取物的小RNA。
继续过滤，直至2至4μm的孔隙率。然后由于30％的甘油和1.5％的苯氧乙醇的添加，可以储存提取物。继续过滤，直至0.2至0.3μm的孔隙率。
通常，获得具有黄色的含水提取物，其滴定为10至25g/kg干重提取物，0.5至5g/kg蛋白质片段，2至15g/kg糖类，100至500mg/kg酚类化合物，和10至100mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
尽管如此，对于相同种的百合(白百合(Lilium candidum))，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
更具体地，在本实施例中，获得含水提取物，其滴定为16.3g/kg干重提取物，1.5g/kg蛋白质片段，5.3g/kg糖类，200mg/kg酚类化合物，和20mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后可以将提取物稀释于生理学上可接受的溶剂诸如水或甘油中。
实施例15：制备富含小RNA的百合科的百合(卷丹百合(Lilium tigrinum))的提取 物
从来自百合科的卷丹百合鳞茎(卷丹百合(Lilium tigrinum))获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，在洗涤和解冻之后，将10％的百合鳞茎在蒸馏水中混合，或者例如，将100g鳞茎在含有最终浓度为10mM或3.8g/1kg的EDTA四钠的1kg蒸馏水中混合，然后将混合物压碎5分钟。该步骤中的pH在10.5和11之间，这是用于富集具有小RNA的提取物的最佳pH。
然后将该混合物在80℃下搅拌1小时。即使在该阶段的温度可以从50℃变化至80℃且搅拌时间可以从30分钟变化至1小时，对于该物种，发现80℃的温度持续1分钟构成使得可能在富集具有低分子量RNA的最终含水提取物的方面获得最好结果的条件。
该步骤之后，然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以除去固体物质，然后澄清植物提取物。
在该步骤中，检查pH，以使其(如果必要)达到6和6.5之间，并保留提取物的小RNA。继续过滤，直至0.2至0.3μm的孔隙率。
通常，获得具有黄色的含水提取物，其滴定为10至25g/kg干重提取物，0.5至5g/kg蛋白质片段，5至20g/kg糖类，100至500mg/kg酚类化合物，和10至100mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
尽管如此，对于相同种的百合(卷丹百合(Lilium tigrinum))，获得的提取物可以表现出相当大的变异性，这取决于诸如收获地点、收获年份、季节、气候条件等因素。
更具体地，在本实施例中，获得含水提取物，其滴定为17.9g/kg干重提取物，2.1g/kg蛋白质片段，11.4g/kg糖类，200mg/kg酚类化合物，和54mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后将提取物稀释于水、30％甘油和1.5％苯氧乙醇的混合物中，这使得可能获得10g/kg干物质的最终提取物。
物理-化学分析显示，在稀释之后，该提取物具有如下浓度：1.0g/kg的蛋白质片段，5.8g/kg的糖类，100mg/kg的酚类化合物，和30mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
实施例16：制备富含小RNA的西番莲科的西番莲果实(翅茎西番莲(Passiflora alata))的提取物
从来自西番莲科的西番莲果实(翅茎西番莲(Passiflora alata))获得富含低分子量RNA(具有150个核苷酸的最大长度)的含水提取物。
在第一步，将5％的果实粉末在蒸馏水中混合，或者例如将50g果实粉末用蒸馏水补足至1kg；然后将溶液搅拌5分钟，然后以10mM或3.8g/1kg的最终浓度添加EDTA四钠。该步骤中的pH在10.5和11之间，这是用于富集具有小RNA的提取物的最佳pH。
然后将该混合物在50℃下搅拌1小时。即使在该阶段的温度可以从25℃变化至80℃且搅拌时间可以从30分钟变化至1小时，对于该物种，发现50℃的温度持续60分钟构成使得可能在富集具有低分子量RNA的最终含水提取物的方面获得最好结果的条件。
在该步骤之后，将混合物以4000g离心10分钟以便除去固体物质。
然后通过具有20和50μm之间的尺寸、然后7和20μm之间的尺寸、直至2-4μm的尺寸的孔隙率渐降的过滤器进行依次过滤，以澄清植物提取物。
在该步骤中，检查pH，以使其(如果必要)达到6和6.5之间，并保留对酸性pH敏感的提取物的小RNA。
继续过滤，直至0.3至0.5μm的孔隙率。
通常，获得具有琥珀色的含水提取物，其滴定为10至30g/kg干重提取物，0.5至5g/kg蛋白质片段，2至15g/kg糖类，100至1500mg/kg酚类化合物，和10至100mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
然后由于以30％添加生理上可接受的溶剂诸如甘油，可以将提取物稀释或储存。
在本实施例中，在添加30％溶剂之后，获得含水提取物，其滴定为15g/kg干重提取物，2.3g/kg蛋白质片段，3.0g/kg糖类，200mg/kg酚类化合物，和35mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
根据本发明的第三个方面，根据本发明获得的富含小RNA的水性提取物有利地用于制备化妆品组合物，所述化妆品组合物包含作为活性抗衰老剂的有效量的这种根据本发明的小RNA的提取物和生理学上可接受的介质。
表达有效量表示对于获得提取物的活性、特别是美容活性且更具体地针对皮肤衰老迹象的活性或改善皮肤的水合作用所必需的根据本发明的提取物的最小量，该量没有毒性。
有利地，根据本发明的小RNA的提取物以其稀释形式使用，其中干重在5和35g/kg之间。
有利地，根据本发明的小RNA的提取物相对于组合物的总重量以0.1至5重量％的浓度、优选1至5重量％的浓度存在于组合物中。
生理上可接受的介质表示适合于与皮肤或粘膜的外层接触而没有毒性、刺激性、类似的过度致敏反应等或不耐受反应并且为了合理的优势/风险比例而分配的媒介物。
可以根据本发明使用的组合物可以通过任何合适的途径(特别是口服途径或外部局部途径)施用；并且组合物的制剂将由本领域技术人员调整。
优选地，根据本发明的组合物处于适合于通过局部途径应用的形式。因此这些组合物必须含有生理学上可接受的介质，也就是说与皮肤和附属物相容且在其应用期间没有不适风险的介质，并且覆盖所有合适的化妆品形式。
表述局部应用表示这样的事实，即将根据本发明的富含小RNA的含水提取物，更具体地含有提取物的组合物应用或涂布在皮肤或粘膜的表面上。
皮肤更具体地表示面部皮肤，特别是眼睛和嘴巴、鼻子、额头、脖子、手的轮廓，以及身体其他部位的皮肤。
用于实施本发明的组合物值得注意地可以呈含水、水-醇或油性溶液、水包油或油包水乳液或多重乳液的形式；它们也可以是悬浮液或粉末的形式，其适于应用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或毛发。
这些组合物可以或多或少是流体，并且它们也可以是霜剂、洗剂、乳、精华液、软膏、凝胶、糊剂或泡沫的形式。它们也可以呈固体形式，诸如棒，或者它们可以以气溶胶的形式应用于皮肤。
作为在所讨论的应用领域中通常使用的生理学上可接受的介质，可以提及例如制剂所需的佐剂，诸如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、染料、防晒过滤剂、自晒黑剂、色素、填料、防腐剂、香料、气味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。
在所有情况下，本领域技术人员将确保选择这些助剂以及它们的比例，使得它们不会对根据本发明的组合物的期望的有利特性有害。这些佐剂可以例如相当于组合物的总重量的0.01至20％。当根据本发明的组合物是乳液时，相对于组合物的总重量，油相可以占5-80重量％，优选5-50重量％。用于组合物中的乳化剂和助乳化剂选自在所讨论的领域中常规使用的那些。例如，相对于组合物的总重量，它们可以以范围为0.3至30重量％的比例使用。
根据本发明的另一个有利的实施方案，根据本发明的富含小RNA的含水提取物可以被包封或包括在化妆品载体，诸如用于化妆品领域中的脂质体或任何其他纳米胶囊或微胶囊中，或者可以被吸附至粉末状有机聚合物、矿物支持物诸如滑石和膨润土。
有利地，除了根据本发明的活性剂之外，根据本发明的组合物还可以包含至少一种具有与本发明的那些类似和/或对其补充的美容作用的其他活性剂。根据本发明，该活性剂被定义为“额外的活性剂”。
例如，额外的活性剂可以选自：抗衰老剂、皮肤紧致剂、增白剂、水合剂、排水剂、微循环促进剂、去角质剂、脱屑剂、刺激细胞外基质的试剂、活化能量代谢的试剂、抗细菌剂、抗真菌剂、镇定剂、抗自由基剂、抗UV剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、获得热感的试剂、获得新鲜感的试剂、减肥剂。
此类额外的活性剂可以选自：
-维生素A，特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯；
-维生素B3，更具体地烟酰胺、生育酚烟酸酯；
-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；
-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁和抗坏血酸磷酸钠；
-维生素E、F、H、K、PP、辅酶Q10；
-金属蛋白酶抑制剂或TIMP的活化剂；
-DHEA、其前体和衍生物；
-氨基酸，诸如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰化氨基酸化合物；
-天然或合成肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂衍生物，其异构衍生物，以及其与其他物质诸如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)络合的衍生物。作为实例，可以提及以名称
Figure GDA0003757590980000281
Figure GDA0003757590980000282
CHRONOGENTM、LAMINIXYL ISTM、PEPTIDEQ10TM、COLLAXYLTM(专利FR2827170,
Figure GDA0003757590980000283
)、PEPTIDE VINCI 01TM(专利FR2837098,
Figure GDA0003757590980000284
)、PEPTIDE VINCI 02TM(专利FR2841781,
Figure GDA0003757590980000285
)、ATPeptideTM(专利FR2846883,
Figure GDA0003757590980000286
)商业上已知的肽或由
Figure GDA0003757590980000287
以名称ATPeptideTM销售的具有序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽；
-卤虫藻(Artemia salina)的提取物，以名称GP4GTM(FR2817748,
Figure GDA0003757590980000288
)销售；
-植物肽提取物，诸如亚麻籽提取物(LipigénineTM,专利FR2956818,
Figure GDA0003757590980000289
)，大豆、斯佩耳特小麦、葡萄树、油菜籽、亚麻籽、稻米、玉米、豌豆的提取物；
-酵母提取物，例如DynagenTM,(专利FR2951946,
Figure GDA00037575909800002811
)或ActopontineTM(专利FR2944526，
Figure GDA00037575909800002810
)；
-脱氢乙酸(DHA)；
-合成或天然来源的植物甾醇；
-水杨酸及其衍生物，α-和β-羟基酸、硅烷醇；
-氨基糖、葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺；
-多酚、异黄酮、类黄酮的提取物，诸如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物；
-脂质诸如神经酰胺或磷脂，动物来源的油诸如角鲨烯或角鲨烷；植物油诸如甜杏仁、椰子核、蓖麻、荷荷巴油、橄榄、油菜籽、花生、葵花籽、小麦胚芽、玉米胚芽、大豆、棉花、苜蓿、罂粟、南瓜、月见草、小米、大麦、黑麦、红花、西番莲花、榛子、棕榈、杏仁籽、鳄梨和金盏花油；乙氧基化植物油、乳木果油；
-所有UV遮蔽剂和防晒霜；
-环AMP和其衍生物、腺苷酸环化酶活化剂和磷酸二酯酶抑制剂、积雪草(Centellaasiatica)的提取物、积雪草皂苷和积雪草酸、甲基黄嘌呤、咖啡碱、咖啡因及其衍生物、茶碱、可可碱、毛喉素、七叶苷和艾司考苷、ACE抑制剂、Val-Trp肽、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、银杏(Ginkgo biloba)的提取物、薯蓣属的提取物、芦丁、马黛茶提取物、瓜拉纳提取物、寡糖、多糖、肉毒碱、常春藤提取物、墨角藻提取物、夏枯草(Prunella vulgaris)的水解提取物、鸡冠花(Celosia cristata)的提取物、光滑果榆绿木(Anogeissus leiocarpus)的提取物、Manihot utilissima叶的提取物、棕榈酰肉毒碱、肌肽、牛磺酸、接骨木的提取物、藻类提取物诸如红海藻(Palmaria palmata)的提取物。
作为举例说明，下面提及含有根据本发明获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的含水提取物的化妆品组合物的制剂的实例：
实施例17：用于眼睛轮廓的香膏
Figure GDA0003757590980000291
Figure GDA0003757590980000301
制备方法：
1.将主容器中的A相均质化，直至其澄清；
2.在25℃下，洒入B相中并均质化10分钟，直至均匀；
3.在25℃下，在单独的烧杯中制备C相，混合直至均匀。洒入D相中并彻底混合直至均匀；
4.在25℃下，将C+D相添加至主容器并混合直至均匀；
5.在25℃下，将E相添加至主容器并混合直至均匀；
6.在25℃下，将F相预混合，将其添加至主容器并混合直至均匀；
7.在25℃下停止。
所述组合物呈具有5.70-6.20的pH和80,000–130,000cps的粘度(D0)(BrookfieldRVT/锭子C/5RPM/1分钟/25℃)的紫色珠光乳膏凝胶的形式。
实施例18：稠香膏
Figure GDA0003757590980000302
Figure GDA0003757590980000311
Figure GDA0003757590980000321
制备方法：
1.将主容器中的A相均质化并开始在75-80℃下加热；
2.在30℃下，洒入B相中并在加热的同时均质化；
3.在分开的烧杯中，制备C相，在75-80℃下加热直至均匀；
4.在75℃下，将C相添加至主容器并均质化10分钟；
5.使温度冷却并在65℃下添加D相。彻底混合以均质化10分钟；
6.将E相预混合，然后在将其添加至主容器；
7.在60℃下添加E相。彻底混合以均质化10分钟；
8.在35℃下，将F相预混合，然后将其添加并彻底混合；
9.将G相预混合，然后在将其添加至主容器；
10.在35℃下添加G相。彻底混合至均匀；
11.在分开的烧杯中，制备H相：在环境温度下将NatrosolTM洒入水中，并在60℃下加热的同时将整个制备物均质化；
12.在30℃下添加H相。彻底混合至均匀；
13.在25℃下停止。
所述组合物因此呈具有4.90-5.40的pH和160,000–210,000cps的粘度(D0)(Brookfield RVT/锭子D/5RPM/1分钟/25℃)的粉红色奶油乳膏的形式。
实施例19：面部精华液
Figure GDA0003757590980000322
Figure GDA0003757590980000331
制备方法：
1.在环境温度下的烧杯中，称量A相的成分并混合。洒入B相并均质化；
2.在环境温度下，洒入C相并继续均质化整个制备物；
3.在环境温度下，向将D相添加至ABC相并继续均质化；
4.在环境温度下，添加E相并均质化；
5.在环境温度下，添加F相并均质化整个制备物；
6.在环境温度下，添加G相并混合直至均匀；
7.在25℃下停止。
所述组合物因此呈具有6.30-7.10的pH和10,000–15,000cps的粘度(D0)(Brookfield RVT/锭子B/5RPM/1分钟/25℃)的光滑、半透明、膏状黄色凝胶的形式。
实施例20：抗衰老面膜
Figure GDA0003757590980000332
Figure GDA0003757590980000341
制备方法
1.在25℃下，在主容器中将A相均质化；
2.在25℃下，洒入B相中并彻底混合直至均匀；
3.在25℃下，添加C相并彻底混合直至均匀；
4.在分开的烧杯中将D相预混合，并在25℃下添加至主容器；
5.在25℃下，将E相添加至主容器并彻底混合；
6.将F相预混合并将其缓慢添加。彻底混合直至均匀；
7.在分开的烧杯中将G相预混合，并添加至主容器直至均匀；
8.在25℃下停止。
所述组合物因此呈具有5.30-5.80的pH和70,000–100,000cps的粘度(D0)(Brookfield RVT/锭子C/5RPM/1分钟/25℃)的具有闪烁绿色效果的凝胶霜的形式。
实施例21：精华液
Figure GDA0003757590980000342
Figure GDA0003757590980000351
制备方法：
1.将水添加至主容器并开始用高-低螺旋叶片混合；
2.相继添加剩余成分，同时在每次添加之间混合。
所述组合物因此呈具有5.75-6.25的pH和1100–1400cps的粘度(D0)(BrookfieldRVT/锭子3/20rpm/25℃/1分钟)的光滑半不透明精华液的形式。
根据第四个方面，本发明涉及根据本发明的组合物用于防治皮肤衰老迹象的美容用途。
表述“皮肤老化迹象”被理解为意指由于衰老引起的皮肤外观的任何改变，诸如例如皱纹和小皱纹、裂纹、眼睛下的小袋、眼睛下的黑眼圈、皱缩、皮肤的弹性、硬度和/或色调的丧失，还有并未系统地反映在改变的外观中的皮肤的任何内部改变，诸如例如皮肤的变薄或连续受到环境应激、诸如污染和UV辐射的皮肤的任何内部退化。
对皮肤的胶原表达的研究是评价本发明的抗衰老作用的一种方式。事实上，由皮肤的成纤维细胞合成的胶原具有重要的生物学作用。其负责组织诸如皮肤的凝聚，并且其为皮肤赋予抗性和柔韧性的特性。
本发明还涉及根据本发明的组合物用于改善皮肤水合作用的美容用途。
改善皮肤的水合作用被理解为意指由于脱水、诸如例如干燥、紧密和不适而导致的皮肤的外观改变的任何改善。
对透明质酸和参与透明质酸合成的酶的表达的研究是评价本发明的水合作用的一种方式。事实上，透明质酸是真皮的细胞外基质的主要组分，且也存在于表皮中，并且参与皮肤水合作用。
在这方面，下面通过所进行的测试的不同结果来举例说明本发明。
对于该效果，用含有根据本发明的具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的其他含水提取物获得与以下实施例22至25中表示的结果相似(未表示)的结果，所述其他含水提取物获得自植物材料，更具体地昆诺藜(Chenopodium quinoa)(昆诺藜)、小扁豆(Lensesculenta)(小扁豆)、水稻(Oryza sativa)(稻胚芽)或南瓜(Cucurbita pepo)(南瓜)。
实施例22：通过研究胶原I和III评估根据实施例5、6和9的秋葵(咖啡黄葵 (Hibiscus esculentus))的提取物对真皮的细胞外基质的影响
该研究的目的是比较秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))的三种提取物对真皮的细胞外基质的影响。根据实施例5获得的富含低分子量RNA的第一提取物、根据实施例6获得的第二提取物(不用EDTA处理)和根据实施例9在沉淀后获得的最终提取物。
该研究的目的是评估这三种咖啡黄葵提取物对参与细胞外基质的结构的I型和III型胶原的表达的影响。胶原对于维持皮肤的弹性和紧致度非常重要。
方案：
将具有6mm的直径的人皮肤的活检组织在特定培养基(DMEM 1g/L、HAMF12、SVF和抗生素)存在的情况下在6孔板中沉积的插入物中离体培养。将活检组织培养48小时，并且每天接受根据实施例5、6和9的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))的提取物的2次应用，所述提取物分别在PBS中被稀释至1/100或3/100，或最终浓度分别为1％和3％体积/体积。借助于PBS 1X实现对照条件。以在活检组织的表面上沉积的约20μL的液滴的形式进行应用。然后将活检组织固定在甲醛中，然后包埋在石蜡中。然后制备具有4μm的厚度的皮肤切片。在通过微波孵育、随后用胰蛋白酶处理将特定位点去掩蔽之后进行胶原I和III的标记。借助于胶原I特异性的兔多克隆抗体(Rockland,参考600-401-103-0.5)、胶原III特异性的兔多克隆抗体(Rockland,参考600-401-105-0,5)、然后与荧光染料偶联的抗兔二抗(Invitrogen,参考A21206)进行免疫标记。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查活检组织。基于获得的照片借助于软件
Figure GDA0003757590980000361
图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)进行荧光的定量。
结果：
用1％和3％的根据实施例5获得的富含小RNA的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscusesculentus))的提取物处理使得可能观察到与用PBS 1X处理的对照条件相比且与用根据实施例6(没有EDTA处理)和9(在沉淀之后获得)获得的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscusesculentus))的提取物处理相比的胶原I和III的表达的显著增加，用于离体研究。
胶原I的表达(％) 胶原III的表达(％)
未处理 100 100
1％的根据实施例5的咖啡黄葵的提取物 116.3 136.2
3％的根据实施例5的咖啡黄葵的提取物 112.7 179.2
1％的根据实施例6的咖啡黄葵的提取物 101.6 115.6
3％的根据实施例6的咖啡黄葵的提取物 102.9 100
1％的根据实施例9的咖啡黄葵的提取物 114.5 118.9
3％的根据实施例9的咖啡黄葵的提取物 100.5 116.8
结论：
与1％和3％的未富含小RNA的两种咖啡黄葵(Hibiscus esculentus)的提取物(实施例6和9)相比，1％和3％的富含小RNA的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))的提取物(实施例5)更多地刺激人离体皮肤中的胶原I和III的表达。
实施例23：通过研究胶原I和III评估根据实施例7、8和9的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物对真皮的细胞外基质的影响
该研究的目的是比较猴面包树(Adansiona digitata)的三种提取物对真皮的细胞外基质的影响。根据实施例7获得的富含低分子量RNA的第一提取物、根据实施例8获得的第二提取物(不用EDTA处理)和根据实施例9在沉淀后获得的最终提取物。
该研究的目的是评估这三种猴面包树(Adansiona digitata)的提取物对参与细胞外基质的结构的I型和III型胶原的表达的影响。胶原对于维持皮肤的弹性和紧致度非常重要。
方案：
将具有6mm的直径的人皮肤的活检组织在特定培养基(DMEM 1g/L、HAMF12、SVF和抗生素)存在的情况下在6孔板中沉积的插入物中离体培养。将活检组织培养48小时，并且每天接受根据实施例7、8和9的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物的2次应用，所述提取物分别在PBS中被稀释至1/100和3/100，或最终浓度分别为1％和3％体积/体积。借助于PBS1X实现对照条件。以在活检组织的表面上沉积的约20μL的液滴的形式进行应用。然后将活检组织固定在甲醛中，然后包埋在石蜡中。然后制备具有4μm的厚度的皮肤切片。在通过微波孵育、随后用胰蛋白酶处理将特定位点去掩蔽之后进行胶原I和III的标记。借助于胶原I特异性的兔多克隆抗体(Rockland,参考600-401-103-0.5)、胶原III特异性的兔多克隆抗体(Rockland,参考600-401-105-0.5)、然后与荧光染料偶联的抗兔二抗(Invitrogen,参考A21206)进行免疫标记。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查活检组织。基于获得的照片借助于软件
Figure GDA0003757590980000381
图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)进行荧光的定量。
结果：
用1％的根据实施例7获得的富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理使得可能观察到与用PBS 1X处理的对照条件相比且与用1％的根据实施例8(没有EDTA处理)和9(在沉淀之后获得)获得的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理相比胶原I的表达的显著增加，用于离体研究。
用3％的根据实施例7获得的富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理使得可能观察到与用PBS 1X处理的对照条件相比且与用3％的根据实施例8(没有EDTA处理)和9(在沉淀之后获得)获得的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理相比胶原I和III的表达的显著增加，用于离体研究。
胶原I的表达(％) 胶原III的表达(％)
未处理 100 100
1％的根据实施例7的猴面包树的提取物 130 -
3％的根据实施例7的猴面包树的提取物 134.4 149
1％的根据实施例8的猴面包树的提取物 103.2 -
3％的根据实施例8的猴面包树的提取物 107.2 107.4
1％的根据实施例9的猴面包树的提取物 100 -
3％的根据实施例9的猴面包树的提取物 100 110.8
结论：
与1％的未富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物(实施例8和9)相比，1％的富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物(实施例7)更多地离体刺激人皮肤中的胶原I的表达。
与3％的未富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物(实施例8和9)相比，3％的富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物(实施例7)更多地离体刺激人皮肤中的胶原I和III的表达。
实施例24：通过研究透明质酸合酶2(HAS2)评估根据实施例7、8和9的猴面包树 (Adansiona digitata)的提取物对真皮的透明质酸的合成的影响
该研究的目的是比较猴面包树(Adansiona digitata)的三种提取物对HAS2(参与透明质酸的合成的酶)的表达的影响。根据实施例7获得富含低分子量RNA的第一提取物、根据实施例8获得第二提取物(不用EDTA处理)且根据实施例9在沉淀后获得最终提取物。
透明质酸是真皮的细胞外基质的主要组分，其参与皮肤的水合作用。在衰老期间，其更新被干扰，HAS2合成酶的表达也是如此(Rock等人，2014)。
方案：
将人成纤维细胞在特定培养基中培养并维持在培养物中用于长期处理(超过32代)。在每代，将一些细胞冷冻。然后选择两个相对的世代：第8代(年轻世代)和第32代(衰老世代)。解冻之后，将衰老或非衰老的成纤维细胞用根据实施例7、8和9的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理48小时(每天2次应用)，所述提取物在培养基中稀释至1/100或最终浓度为1％体积/体积。通过免疫标记观察用1％的根据实施例7、8和9的猴面包树(Adansiona digitata)的三种提取物处理或未处理的衰老或非衰老的成纤维细胞上的HAS2的表达的评估。
为了实现这一点，将细胞冲洗并用冷甲醇固定5分钟。在用1％的牛血清白蛋白饱和非特异性位点15分钟之后，将细胞与HAS2特异性鼠单克隆抗体(Thermo Fisher，参考MAS-17087)的溶液孵育，然后与和荧光染料偶联的抗小鼠二抗(Invitrogen，参考A21202)的溶液孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查细胞。基于获得的照片借助于软件
Figure GDA0003757590980000391
图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)进行荧光的定量。
结果：
如图4A中所示，对第8代(被认为年轻的世代)的成纤维细胞用1％的根据实施例7获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理使得可能观察到与未处理的对照相比且还与用1％的根据实施例8(没有EDTA处理)和9(在沉淀之后获得)获得的Adansiona digitata的提取物处理相比HAS2的表达的显著增加。
此外，与文献一致，如图4B中所示，在第8代成纤维细胞(P8)和第32代成纤维细胞(P32)(衰老)之间观察到HAS2表达的显著降低。
对衰老成纤维细胞用1％(体积/体积)的根据实施例7获得的根据本发明的富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理，使得可能观察到HAS2表达的维持。对于分别用根据实施例8(没有EDTA处理)和9(在沉淀之后获得)获得的Adansiona digitata的提取物处理的细胞没有观察到这种维持。
结论：
与未处理的条件相比且与根据实施例8(没有EDTA处理)和9(在沉淀之后获得)获得的Adansiona digitata的提取物相比，1％的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物(实施例7)在成纤维细胞中更多地刺激HAS2的表达。
此外，在衰老成纤维细胞上，1％的根据本发明(实施例7)的富含小RNA的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物使得可能维持在非衰老成纤维细胞上观察到的HAS2的表达水平。1％的其他未富含小RNA的提取物(实施例8和9)不能允许这种维持。
实施例25：根据实施例5的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))提取物和根据 实施例7的猴面包树(Adansiona digitata)的提取物对透明质酸的表达水平的影响的评估
本研究的目的是通过标记显现分别根据实施例5和7获得的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))和猴面包树(Adansiona digitata)的提取物对透明质酸的表达的影响，所述提取物富含具有150个核苷酸的最大长度的低分子量RNA。
透明质酸是真皮的细胞外基质的主要组分，且参与皮肤的水合作用。
方案：
将具有6mm的直径的人皮肤活检组织在特定培养基(DMEM 1g/L、HAMF12、SVF和抗生素)存在的情况下在6孔板中沉积的插入物中离体培养。将活检组织培养48小时并每天接受PBS中以1％(体积/体积)稀释的根据实施例5和7(分别)的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscusesculentus))的提取物或猴面包树(Adansiona digitata)的提取物或PBS 1X(用于对照条件)的2次应用。以在活检组织的表面上沉积的约20μL的液滴的形式进行应用。然后将活检组织固定在甲醛中，然后包埋在石蜡中。然后制备具有4μm的厚度的皮肤切片。将切片在透明质酸特异性生物素化蛋白(Coger，参考：400-763-1A)存在的情况下孵育，然后在与荧光染料偶联的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen，参考：S32354)存在的情况下孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查活检组织。基于获得的照片借助于软件
Figure GDA0003757590980000411
图像分析软件(PerkinElmer,Inc.)进行荧光的定量。
结果：
与用PBS 1X处理的对照条件相比，用1％的分别根据实施例5和7获得的富含小RNA的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))的提取物或猴面包树(Adansiona digitata)的提取物处理使得可能观察到表皮或真皮中的透明质酸的表达的显著增加。
透明质酸的表达 在表皮中(％) 在真皮中(％)
未处理 100 100
1％的根据实施例5的咖啡黄葵的提取物 156 127
1％的根据实施例7的猴面包树的提取物 159 124
结论：
与用PBS 1X处理的对照条件相比，1％的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的秋葵(咖啡黄葵(Hibiscus esculentus))的提取物或猴面包树(Adansionadigitata)的提取物(根据实施例5和7)离体刺激人皮肤中的透明质酸的表达。
当然，本发明不限于上述实施方案和实施例，并且本领域技术人员可以由于常规操作来实现其他实施方案，所述实施方案没有被明确地描述并且被本发明的宽范围涵盖。

Claims (19)

1.用于从植物材料获得富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA且不包含DNA的含水提取物的方法，其包括以下步骤：
a)使植物材料与水接触；
b)在pH为10.5和11之间，将浓度为2和15mM之间的乙二胺四乙酸(EDTA)四钠添加至a)中获得的混合物中，在搅拌下在20至80℃的温度下进行至少1小时的时间；
c)然后，将b)中获得的混合物的pH调节至6和8之间的值；
d)纯化c)中获得的混合物，以便除去残余固体植物材料并获得纯化的含水粗提取物；和
e)检查pH并如果必要重新调节至6和8之间的值，
其中在进行步骤e)之前通过将过滤截止值从20-50μm降低至0.1-0.30μm来依次过滤d)中获得的含水粗提物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤e)中，检查pH并调节至6和6.5之间的值。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，使植物材料与水以4至20％(重量/重量)的植物材料/水比率接触。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤d)中，将c)中获得的混合物离心。
5.根据权利要求1所述的方法，其中其包括在步骤c)之前直接对b)中获得的混合物，或者对b)中获得的混合物的离心并除去剩余的植物材料之后的上清液进行额外水解步骤，通过选自纤维素酶和/或蛋白酶的至少一种酶在45至65℃的温度下且在6至8.5的pH下作用至少1小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其中其包括在65至80℃的温度下使酶失活至少1小时的步骤，该失活步骤直接在水解步骤之后或在步骤e)之前依次过滤步骤之间进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤d)之前将浓度为10至20g/kg的硅藻土或二氧化硅添加至所述混合物中。
8.根据权利要求1所述的方法，其中EDTA四钠的浓度为10mM。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中与水接触之前，将植物材料压碎。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料是选自种子、果实、鳞茎、花、叶、根、胚芽或选自油饼和糟的植物部分。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料选自西番莲科(Passifloraceae)、锦葵科(Malvaceae)、石榴科(Punicaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、金丝桃科(Clusiaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、Malphigiaceae、杜鹃花科(Ericaceae)、茶藨子科(Grossulariaceae)、茄科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、木棉科(Bombacaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、芸香科(Rutaceae)、百合科(Liliaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、葱科(Alliaceae)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物材料选自以下物种：咖啡黄葵(Hibiscus esculentus)、猴面包树(Adansonia digitata)、昆诺藜(Chenopodiumquinoa)、小扁豆(Lens esculenta)、水稻(Oryza sativa)、南瓜(Cucurbita pepo)、洋蔷薇(Rosa centifolia)、酸橙(Citrus aurantium)、白百合(Lilium candidum)、卷丹百合(Lilium tigrinum)、翅茎西番莲(Passiflora alata)。
13.通过根据权利要求1的方法获得的富含具有150个核苷酸的最大长度的小RNA的植物材料含水提取物，其中其包含相对于提取物的总重量，以重量计，5-60g/kg干燥提取物和10-1000mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的小RNA，0.5-30g/kg蛋白质片段和0.5-50g/kg糖类，并且不包含DNA。
14.根据权利要求13所述的提取物，其中所述提取物在溶剂中稀释并且相对于提取物的总重量，以重量计，包含5-35g/kg干燥提取物，0.5-20g/kg蛋白质片段，0.5-30g/kg糖类，和10-500mg/kg具有150个核苷酸的最大长度的小RNA。
15.组合物，其包括有效量的作为抗衰老活性剂的权利要求14中任一项的提取物和生理学上可接受的介质。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述提取物以1重量％至5重量％的浓度存在，以所述组合物的总重量计。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物被配制为用于局部应用于皮肤。
18.根据权利要求15所述的组合物用于防治皮肤衰老迹象的美容用途。
19.根据权利要求15所述的组合物用于改善皮肤水合作用的美容用途。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3043695B1 (fr) * 2015-11-17 2019-10-25 ISP Investments LLC. Procede d'obtention d'un extrait aqueux enrichi en petits arn a partir d'une matiere vegetal et extraits issus du procede
CN110167521A (zh) * 2016-11-09 2019-08-23 Elc 管理有限责任公司 用于刺激皮肤细胞中的mir-146a的局部组合物和方法
KR102041867B1 (ko) * 2018-02-23 2019-11-06 주식회사 위노바 오크라, 퀴노아, 석류, 들깨, 편백 추출 혼합물과 프로폴리스 및 합성펩타이드를 함유하는 피부화장료 조성물
TWI746917B (zh) * 2018-12-22 2021-11-21 大江生醫股份有限公司 代代花萃取物用於減緩皮膚老化及減少細胞中脂肪含量的用途
KR102237543B1 (ko) * 2019-02-22 2021-04-07 (주)모아캠 알로에 속 식물 유래 dna의 제조방법, 및 알로에 속 식물 유래 dna를 유효성분으로 포함하는 항노화 및 항염증용 조성물
AU2020231725B9 (en) * 2019-03-04 2023-04-27 Mitsui Chemicals, Inc. Method for determining whether organism having cell wall exists and method for identifying organism having cell wall
JP7356808B2 (ja) * 2019-03-04 2023-10-05 株式会社ノエビア 皮膚外用剤
FR3106754B1 (fr) * 2020-02-04 2022-01-07 Isp Investments Llc Procede d’obtention d’un extrait aqueux de lavande, compositions comprenant un tel extrait et leurs utilisations cosmetiques
FR3116438B1 (fr) 2020-11-23 2022-10-14 Isp Investments Llc Procede d’obtention d’extraits aqueux de feuilles de thes, compositions comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmetiques
FR3125425B1 (fr) 2021-07-22 2024-09-13 Isp Invest Llc Extrait de feuilles de the noir, compositions le comprenant et ses utilisations cosmetiques
EP4134439A1 (en) * 2021-08-11 2023-02-15 Valagro S.p.A. Plant extract and uses thereof in agriculture
CN114058665A (zh) * 2021-12-02 2022-02-18 浙江宜格企业管理集团有限公司 一种复合花肽的制备方法及其在制备化妆品中的应用
FR3132436A1 (fr) * 2022-02-08 2023-08-11 Isp Investments Llc Procede d’obtention d’extraits vegetaux comprenant une etape d’autofermentation, compositions comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmetiques
KR102682937B1 (ko) * 2023-08-11 2024-07-09 주식회사 바이오에프디엔씨 식물세포로부터 pdrn 생산 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102146374A (zh) * 2011-01-27 2011-08-10 四川农业大学 一种动物dna提取的细胞裂解液、试剂盒和方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1540597C3 (de) 1965-11-29 1975-01-16 Siemens Ag, 1000 Berlin Und 8000 Muenchen Hochspannungsdurchführung
FR2543438B1 (fr) 1983-03-30 1987-07-31 Duraffourd Alain Composition pour la regeneration des cellules et des tissus de la peau et son procede d'obtention
US6270780B1 (en) 1997-07-25 2001-08-07 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco Cosmetic compositions containing resveratrol
DE19820629A1 (de) * 1998-05-08 1999-11-11 Forschungsanstalt Geisenheim Schnellextraktionsverfahren zur Gewinnung von DNA und RNA aus holzigen und krautigen Teilen verholzender und nichtverholzender Pflanzen
FR2817748B1 (fr) 2000-12-13 2003-01-17 Seporga Composition cosmetique et/ou dermatologique contenant un extrait d'artemia salina
ATE324376T1 (de) * 2001-01-16 2006-05-15 Invitrogen Corp Reagenz zur isolierung von rna
FR2827170B1 (fr) 2001-07-13 2004-07-16 Soc Extraction Principes Actif Utilisation de peptides pour augmenter l'adhesion cellulaire
FR2831168B1 (fr) 2001-10-22 2004-02-06 Rocher Yves Biolog Vegetale Procede d'obtention d'un extrait riche en acides nucleiques a partir d'une matiere vegetale
FR2837098B1 (fr) 2002-03-18 2004-05-28 Vincience Composition cosmetique ou pharmaceutique comprenant des peptides, procedes de traitement et utilisations
AU2003255621A1 (en) * 2002-06-03 2003-12-19 L'oreal Topical use of at least one double-stranded rna oligonucleotide (ds rna)
FR2840217B1 (fr) 2002-06-03 2005-06-24 Oreal Compositions cosmetiques comprenant au moins un oligonucleotide d'arn double brin (dsrna)et leurs utilisations
FR2841781B1 (fr) 2002-07-03 2005-12-16 Utilisation de peptides pour favoriser la regeneration cutannee
FR2846883B1 (fr) 2002-11-08 2004-12-24 Vincience Composition cosmetique comprenant, comme ingredient actif, au moins un peptide et utilisation de ce peptide
AU2003278682B2 (en) * 2002-11-18 2007-07-19 Agency For Science, Technology And Research Method and system for cell and/or nucleic acid molecules isolation
US20050074521A1 (en) * 2003-10-01 2005-04-07 Sensient Flavors Inc. Method for the production of natural botanical extracts
US9139850B2 (en) * 2005-05-19 2015-09-22 L'oreal Vectorization of dsRNA by cationic particles and topical use
FR2885808B1 (fr) * 2005-05-19 2007-07-06 Oreal Vectorisation de dsrna par des particules cationiques et utilisation topique.
JP5025253B2 (ja) * 2006-03-31 2012-09-12 日生バイオ株式会社 基礎化粧品用配合剤及び基礎化粧品
US20080161229A1 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Nissei Bio Co., Ltd. Compounding ingredients for basic cosmetics and basic cosmetics
FR2912313B1 (fr) * 2007-02-13 2012-07-06 Rocher Yves Biolog Vegetale Composition d'extrait de ble et d'esculine et utilisation en cosmetique.
CN101601635A (zh) * 2008-06-13 2009-12-16 殷勤伟 小rna/dna美白产品的配方和制造方法
FR2940112B1 (fr) * 2008-12-22 2011-03-25 Rocher Yves Biolog Vegetale Procede d'extraction de composes presents au sein d'un materiau vegetal frais par cryobroyage et enzymolyse
FR2951946B1 (fr) 2009-11-03 2012-05-11 Isp Investments Inc Utilisation d'un hydrolysat peptidique de levure en tant qu'agent actif pour renforcer le cheveu
FR2944526B1 (fr) 2009-04-15 2013-05-10 Isp Investments Inc Composition cosmetique et/ou pharmaceutique comprenant un hydrolysat peptidique capable de renforcer la fonction barriere
JP2011016760A (ja) * 2009-07-09 2011-01-27 Noevir Co Ltd ユリ属植物の球根及び／又はカルス抽出物を有効成分とする皮膚外用剤、経口用剤、保湿剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤
FR2956818B1 (fr) 2010-02-26 2012-07-20 Isp Investments Inc Utilisation d'un hydrolysat peptidique de lin dans une composition pour apaiser la peau
CN103211728B (zh) * 2011-09-27 2015-09-16 浙江欧诗漫生物股份有限公司 一种含雪莲花及白花百合花提取物的焕颜修容霜组合物
CN102776174A (zh) * 2012-08-21 2012-11-14 昆明理工大学 一种从百合组织中同时提取dna和rna的方法
CN103705392B (zh) * 2012-09-29 2015-02-18 黄兵 一种小核酸美白祛斑霜及其制备方法
CN104138346B (zh) * 2014-08-07 2016-09-21 广州雅纯化妆品制造有限公司 一种抗皱化妆品组合物及其制备方法
FR3043695B1 (fr) * 2015-11-17 2019-10-25 ISP Investments LLC. Procede d'obtention d'un extrait aqueux enrichi en petits arn a partir d'une matiere vegetal et extraits issus du procede

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102146374A (zh) * 2011-01-27 2011-08-10 四川农业大学 一种动物dna提取的细胞裂解液、试剂盒和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Extraction of double-stranded RNA from plant tissues without the use of organic solvents;DEPAULO J J;《 PLANT DISEASE》;19950101;摘要 *

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