CN102146374A

CN102146374A - 一种动物dna提取的细胞裂解液、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN102146374A
Application number: CN 201110030176
Authority: CN
Inventors: 胡耀东; 朱庆; 兰丹; 吴华莉; 邱芙寒
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2011-01-27
Filing date: 2011-01-27
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2031-01-27
Also published as: CN102146374B

Abstract

本发明提供了一种用于动物DNA提取的细胞裂解液、含有该裂解液的试剂盒及使用该试剂盒提取动物DNA的方法。本发明提供的细胞裂解液中包含Tris-base 20～30g/L、EDTA0.5～1.0g/L、SDS20～30g/L、NaCl 5～10g/L和尿素100～150g/L，余量为无菌水，用NaOH调pH值至8.0～9.0。本发明提供的动物DNA提取试剂盒比现有技术缩短提取时间至少半小时，避免使用毒性气味较高的氯仿，减少了操作过程中对操作人员健康的损害；而且提取的DNA产量高，纯度好。本发明方法快速简便、经济高效且重复性强；本发明结果相当稳定，成功率高，降低了提取成本，适合大规模提取DNA。

Description

一种动物DNA提取的细胞裂解液、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，具体涉及一种动物DNA提取的细胞裂解液、试剂盒和方法。

背景技术

自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得了空前的发展。我们对分子领域的研究已经渗透到生物学、医学、遗传学和动物学等各个方面，基因组DNA的提取是分子生物学研究的一项最基础技术，是后续试验成功的保证(参见《鸡基因组DNA不同提取方法的比较研究》，马新红等；江西农业大学学报，2010.32(001)：p.181-184)。同时，采用活体采血继而从血液中提取DNA，可以在不杀死动物的前提下对其基因组DNA进行多态性研究和早期选育，对于遗传育种工作者来讲是很好的有利工具。

现在伴随着高通量测序，各种基因芯片的大量上市，对于科研工作来讲，需要大规模的提取DNA，并且芯片对DNA的质量提出了很高的要求，许多常用的基因组DNA提取方法已经不能很好的适应这种要求。

目前基因组DNA的提取方法较多，部分提取方法因使用大量的氯仿，对实验人员的身心健康埋下了隐患。常用的DNA提取方法有：酚-氯仿法、高盐法、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS(十二烷基硫酸钠)法、盐酸胍法、蒸煮法和目前公认DNA提取效果最干净的试剂盒法。但是，试剂盒提取DNA两大缺点为：1)价格昂贵不适用于大量提取DNA；2)提取物中DNA量少且含量较低，一般不到100μl，DNA浓度在20～50ng/μl，比较适合后续的PCR扩增实验，但难以满足做芯片的最低要求(至少50ng/μl，50μl)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于动物DNA提取的细胞裂解液、含有该裂解液的试剂盒及使用该试剂盒提取动物DNA的方法，用以解决现有动物DNA提取方法成本高、提取物中DNA含量少且品质较差的问题。

为实现上述目的，本发明一种动物DNA提取的细胞裂解液、试剂盒和方法，优化了现有动物DNA提取的细胞裂解液、试剂盒和方法；该方法快速简便、经济高效且重复性强；避免使用毒性气味较高的氯仿，从而减少了操作过程中对操作人员健康的损害。具体地，本发明采用如下技术方案：

一种用于动物DNA提取的细胞裂解液，其包括：Tris-base20～30g/L、EDTA0.5～1.0g/L、SDS 20～30g/L、NaCl 5～10g/L和尿素100～150g/L，余量为无菌水，用NaOH调pH值，pH8.0～9.0；所述裂解液中优选Tris-base 24g/L、EDTA 0.7g/L、SDS 24g/L、NaCl 7.52g/L和尿素120g/L。

含有上述细胞裂解液的动物DNA提取试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括0.5g/ml的盐酸胍缓冲液、20mg/ml的蛋白酶K溶液和CB3吸附柱。

使用上述试剂盒提取动物DNA的方法，其包括如下步骤：

1)取ACD抗凝的血液样品或捣碎的组织样于离心管中，加入45℃预热的所述裂解液，反复吹打混匀，加入所述盐酸胍缓冲液，再加入所述蛋白酶K溶液，颠倒混匀3～5min，放入56℃水浴或金属浴2.5～30h，优选16～24h，期间将离心管中混合液颠倒数次；

2)再向上述离心管中加入0.8～1.2倍上述混合液体积的饱和酚，旋转混合5min使其完全混匀，12000～13000r/min离心5～6min，此时中间层和下层水相被固定，上层水相即上清液；

3)将上述上清液倒入另一干净离心管中，加入0.8～1.2倍该上清液体积的-20℃预冷异丙醇，缓慢摇动离心管1min，可见有白色或淡黄色的絮状或丝状物质，将该含絮状或丝状物的水相倒入置于另一干净离心管内的CB3吸附柱中，12000～13000r/min离心3min，倒掉管中废液，将CB3吸附柱放回管内；

4)向上述离心管内CB3吸附柱中加入0.8～1.2ml的-20℃预冷95％乙醇，倒掉管中废液，将该吸附柱放回管内，换用0.8～1.2ml的-20℃预冷72％乙醇加入该吸附柱以12000～13000r/min离心3min，倒掉管中废液，将该吸附柱放回管内；

5)将该离心管置于真空干燥器或35℃烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向该离心管内CB3吸附柱中加入100～200μl 40℃预热的洗脱缓冲液TE，充分溶解DNA至少2h，期间颠倒数次，12000～13000r/min离心1min，洗脱含DNA的溶液于离心管中，取出吸附柱，然后将装有DNA溶液的离心管于-20℃冰箱中长期保存。

根据本发明，所述ACD抗凝的血液样品样品与裂解液的体积比为1∶35～70，所述ACD抗凝的血液样品与盐酸胍缓冲液的体积比为1∶4～8，所述ACD抗凝的血液样品与所述蛋白酶K溶液的体积比为1∶1～2。

进一步地，上述ACD抗凝的血液用量可为10～20μl。

根据本发明，所述捣碎的组织样与裂解液的质量体积比为1g∶250～300μl，所述捣碎的组织样与盐酸胍缓冲液的质量体积比为1g∶30～40μl，所述捣碎的组织样与蛋白酶K溶液的质量体积比为1g∶5～8μl。

进一步地，上述组织样可为肌肉组织、肝脏组织或心脏组织。

还进一步地，上述述组织样的用量可为2～3g。

本发明具有如下优点：

1)细胞裂解液中添加适量NaCl、尿素和NaOH，更有利于细胞裂解，提取DNA的效果更佳，并且缩短提取时间至少半小时；

2)简化操作步骤，本发明提取方法步骤2)中产生的上清液可直接倒出，避免了用移液枪吸取上清液，简单快捷，节省工时、节约枪头费用；

3)避免使用毒性气味较高的氯仿，减小对操作人员的健康伤害；

4)提取物中DNA产量高、含量也较高，特别是结合了CB3吸附柱的使用，使DNA中的蛋白质和盐去除得很干净，提高了所提取DNA的品质；

5)结果相当稳定，成功率高，适合大规模提取DNA；

6)成本略高于经典的酚-氯仿法，大批量提取DNA时，成本和酚-氯仿法差不多，但远远低于现有的试剂盒法。

附图说明

图1为相同样品以不同提取方法获得的DNA提取物0.8％琼脂糖电泳检测效果图；其中1、2、3孔为酚-氯仿法(比较例1)提取的DNA，4、5、6孔为现有的试剂盒法(比较例2)提取的DNA，7、8、9孔为本发明方法(实施例5)提取的DNA，10孔为空白对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

按照以下配方制备提取动物DNA的细胞裂解液：

Tris-base 24g/L、EDTA 0.7g/L、SDS 24g/L、NaCl 7.52g/L、尿素120g/L，余量为无菌水，用NaOH调pH值至8.0。

实施例2

按照以下配方制备提取动物DNA的细胞裂解液：

Tris-base 20g/L、EDTA 1.0g/L、SDS 30g/L、NaCl 5g/L、尿素150g/L，余量为无菌水，用NaOH调pH值至8.5。

实施例3

按照以下配方制备提取动物DNA的细胞裂解液：

Tris-base 30g/L、EDTA 0.5g/L、SDS 20g/L、NaCl 10g/L、尿素100g/L，余量为无菌水，用NaOH调pH值至9.0。

实施例4

按照以下配方制备动物DNA提取的试剂盒：

实施例1的细胞裂解液，0.5g/ml的盐酸胍缓冲液，20mg/ml的蛋白酶K溶液，饱和酚，异丙醇，95％乙醇，72％乙醇，洗脱缓冲液TE溶液，2ml离心管和CB3吸附柱。

实施例5

使用实施例4的试剂盒按照以下步骤提取动物DNA：

1)对于200只二郎山山地鸡(一个地方品种，生长在四川天全县二郎山)的200个血液样本，分别用微量加样枪取ACD抗凝的血液10μl于2ml离心管中，加入45℃预热的裂解液690μl，用加样枪反复吹打混匀，加入0.5g/ml的盐酸胍缓冲液70μl，再加入20mg/ml的蛋白酶K溶液15μl，颠倒混匀3min，放入56℃水浴过夜，期间将离心管颠倒数次；

2)再向上述离心管中加入饱和酚625μl，旋转混合5min使其完全混匀，12500r/min离心5min，此时中间层和下层水相被固定，短时间如，20min内不会流动，所以可直接将上层水相(500～900μl)即上清液倒出，该上清液可直接用作PCR反应的DNA样品；

3)将上述上清液倒入另一干净2ml离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇1ml，缓慢摇动离心管1min，可见有白色或淡黄色的絮状或丝状物质，将该含絮状或丝状物的水相倒入置于另一干净2ml离心管内的CB3吸附柱中(购自天根生化科技(北京)有限公司)，12500r/min离心3min，倒掉管中废液，将CB3吸附柱放回管内；

4)向上述离心管内CB3吸附柱中加入-20℃预冷的95％乙醇1ml，倒掉管中废液，将该吸附柱放回管内，换用-20℃预冷的72％乙醇1ml加入该吸附柱以12500r/min离心3min，倒掉管中废液，将该吸附柱放回管内；

5)将该离心管置于真空干燥器或35℃烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向离心管内CB3吸附柱中加入40℃预热的洗脱缓冲液TE100μl，充分溶解DNA至少2h，期间颠倒数次，12000r/min离心1min，洗脱含DNA的溶液于离心管中，取出吸附柱，然后将装有DNA溶液的离心管于-20℃冰箱中长期保存。

实施例6

使用实施例4的试剂盒按照以下步骤提取动物DNA：

1)对于200只二郎山山地鸡的200个胸肌组织样，分别取2g，加入45℃预热的裂解液690μl，尽力捣碎，用加样枪反复吹打混匀，加入0.5g/ml的盐酸胍缓冲液70μl，再加入20mg/ml的蛋白酶K溶液15μl，颠倒混匀5min，放入56℃金属浴过夜，期间将离心管颠倒数次；

2)再向上述离心管中加入饱和酚625μl，旋转混合5min使其完全混匀，13000r/min离心6min，此时中间层和下层水相被固定，短时间如20min内不会流动，所以可直接将上层水相(500～900μl)即上清液倒出，该上清液可直接用作PCR反应的DNA样品；

3)将上述上清液倒入另一干净2ml离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇1ml，缓慢摇动离心管1min，可见有白色或淡黄色的絮状或丝状物质，将该含絮状或丝状物的水相倒入置于另一干净2ml离心管内的CB3吸附柱中(购自天根生化科技(北京)有限公司)，12000r/min离心3min，倒掉管中废液，将CB3吸附柱放回管内；

4)向上述离心管内CB3吸附柱中加入-20℃预冷的95％乙醇1ml，倒掉管中废液，将该吸附柱放回管内，换用-20℃预冷的72％乙醇1ml加入该吸附柱以13000r/min离心3min，倒掉管中废液，将该吸附柱放回管内；

5)将该离心管置于真空干燥器或35℃烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向离心管内CB3吸附柱中加入40℃预热的洗脱缓冲液TE200μl，充分溶解DNA至少2h，期间颠倒数次，13000r/min离心1min，洗脱含DNA的溶液于离心管中，取出吸附柱，然后将装有DNA溶液的离心管于-20℃冰箱中长期保存。

比较例1

对于200只二郎山山地鸡的200个血液样本，分别使用酚-氯仿法提取DNA(参见《外周血基因组DNA提取方法比较》，闫晓华，高立芬，续力云；山东医学高等专科学校学报，2008.30(003)：p.175-177)。

比较例2

对于200只二郎山山地鸡的200个血液样本，分别使用现有的试剂盒法进行基因组DNA提取，试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，严格按照说明操作。

实验例

对于上述实施例5、比较例1和比较例2所得到的DNA提取物进行DNA质量检测：

1)紫外分光光度计测定OD值

由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处，故可用260nm波长进行分光测定DNA浓度；双链DNA的260nmOD值为1.0时所对应的DNA浓度为50μg/ml(参见《禽类全血DNA不同提取方法的比较》，柯柳玉等；福建畜牧兽医，2008.30(002)：p.4～6)。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度；优质DNA的OD260/OD280比值为1.70～2.0(参见《鸡基因组DNA不同提取方法的比较研究》，马新红等；江西农业大学学报，2010.32(001)：p.181-184)，若比值较高说明含有RNA，比值小于1.80，说明存在蛋白质或酚等杂质(参见《从鸡血中提取高质量DNA的研究》，王慧、陈永洪；中国家禽，1997(002)：p.5-7)。OD230/OD260比值应在0.4～0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

根据所测样本的OD值计算DNA纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀比值)、DNA杂质含量(OD₂₆₀/OD₂₃₀比值)和DNA浓度(50μg/ml×OD₂₆₀×稀释倍数/1000)，并用Excel建立数据库，利用SAS 8.0对DNA含量做单因素方差分析，结果如下：

表1：同一血样不同提取方法结果比较

注：结果以平均数±标准差的形式表示，同列肩注小写字母不同者表示差异显著(P＜0.05)，同列肩注字母相同者表示差异不显著(P＞0.05)；同列肩注大写字母不同者差异极显著(P＜0.01)。(统计分析常用的表示方法，P值代表显著水平)

表1结果表明，所提取DNA的浓度(肩注为大写字母)，本发明方法(实施例5)低于经典的酚-氯仿法(比较例1)，但比现有的试剂盒法(比较例2)高100ng/μl(P＜0.01)；所提取DNA的纯度，本发明方法(实施例5)和现有的试剂盒法(比较例2)相当，都显著高于经典的酚-氯仿法(比较例1)(P＜0.05)；本方法(实施例4)的DNA杂质含量为0.51，显著低于酚-氯仿法(比较例1)(P＜0.05)；因此，本发明所提取的DNA完全符合做DNA芯片检测的浓度和纯度要求；另外，本发明方法的成本总和远低于现有的试剂盒法，一般现有的试剂盒为1000元左右提取200个样本，即提取成本5元/样本，而本发明提取成本不到0.8元/样本。本发明(实施例5)的成功率96％，略高于现有的试剂盒法(比较例2)的成功率92％，明显高于经典的酚-氯仿法(比较例1)的成功率88％。

2)琼脂糖凝胶电泳检测

对于上述实施例5、比较例1和比较例2所得的DNA提取物每个样品取4ul，于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶含有Gold view染色，120V电压，电泳30分钟；结果如图1，其中1、2、3孔为酚-氯仿法(比较例1)提取DNA的效果图，4、5、6孔为现有的试剂盒法(比较例2)提取DNA效果图，7、8、9孔为本发明方法(实施例5)电泳检测结果，10孔为空白对照。

从图1可以看出，经典的酚-氯仿法(比较例1)提取的DNA较亮(在排除干扰的情况下，一般亮度高即表明DNA浓度高)，但1、2、3孔内杂质也比较多(孔内被染色的蛋白质发出亮光)；本发明方法(实施例5)和试剂盒法(比较例2)提取的DNA孔内较干净、无杂质，但本发明方法(实施例5)提取的DNA亮度明显高于试剂盒法(比较例2)提取的DNA。

Claims

1.一种用于动物DNA提取的细胞裂解液，其包括：Tris-base20～30g/L、EDTA0.5～1.0g/L、SDS 20～30g/L、NaCl 5～10g/L和尿素100～150g/L，余量为无菌水，用NaOH调pH值至8.0～9.0。

2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，Tris-base24g/L、EDTA0.7g/L、SDS 24g/L、NaCl 7.52g/L和尿素120g/L。

3.含有权利要求1或2所述细胞裂解液的动物DNA提取试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括0.5g/ml的盐酸胍缓冲液、20mg/ml的蛋白酶K溶液和CB3吸附柱。

5.使用权利要求4所述试剂盒提取动物DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取ACD抗凝的血液样品或捣碎的组织样于离心管中，加入45℃预热的所述裂解液，反复吹打混匀，加入所述盐酸胍缓冲液，再加入所述蛋白酶K溶液，颠倒混匀3～5min，放入56℃水浴或金属浴2.5～30h，期间将离心管中混合液颠倒数次；

2)再向上述离心管中加入0.8～1.2倍上述混合液体积的饱和酚，旋转混合5min使其完全混匀，12000～13000r/min离心5～6min；

3)将离心后的上清液直接倒入另一干净离心管中，加入0.8～1.2倍该上清液体积的-20℃预冷异丙醇，缓慢摇动离心管1min，可见有白色或淡黄色的絮状或丝状物质，将该含絮状或丝状物的水相倒入置于另一干净离心管内的CB3吸附柱中，12000～13000r/min离心3min，倒掉管中废液，将CB3吸附柱放回管内；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，装有混合液的离心管放入56℃水浴或金属浴16～24h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ACD抗凝的血液样品与裂解液的体积比为1∶35～70，所述ACD抗凝的血液样品与盐酸胍缓冲液的体积比为1∶4～8，所述ACD抗凝的血液样品与所述蛋白酶K溶液的体积比为1∶1～2。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ACD抗凝的血液用量为10～20μl。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述捣碎的组织样与裂解液的质量体积比为1g∶250～300μl，所述捣碎的组织样与盐酸胍缓冲液的质量体积比为1g∶30～40μl，所述捣碎的组织样与蛋白酶K溶液的质量体积比为1g∶5～8μl。

10.根据权利要求5或9所述的方法，其特征在于，所述组织样为肌肉组织、肝脏组织或心脏组织，所述组织样用量为2～3g。