CN102690805A - 一种快速提取禽类血液基因组dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法，包括以下步骤：(1)取抗凝血，将其与细胞裂解液混合形成混合液，向混合液中加入蛋白酶K；(2)在55-65℃的温度下，水浴消化3-5小时；(3)加预冷的乙醇，充分混匀；(4)加双蒸水ddH2O溶解沉淀；10000rpm离心5min，吸上清液到干净的离心管中；(5)加入4mol/L的NaAc和预冷的乙醇，充分混匀；10000rpm离心5min，弃上清液，加75％的预冷乙醇，出现白色絮状沉淀，即基因组DNA。本方法进行禽血基因组DNA提取主要试剂是乙醇，没有用到酚、氯仿、异戊醇等有毒有害试剂，对操作者和环境都没有污染。另外，提取方法简单，结果可靠，采用本发明的方法的提取过程所需要时间在1h以内。

Description

一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种动物基因组DNA的提取方法，尤其涉及一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法。
背景技术
基因组DNA提取是分子生物学研究最基本的技术，DNA可以从各种样品材料中获得，包括抗凝血，凝固血，裂解血，软层细胞，毛囊等。目前常用的提取方法是酚-氯仿抽提法，该方法利用SDS破解细胞膜，释放细胞所含的蛋白质；再利用蛋白酶K分解释放的蛋白质，多余的没有被蛋白酶K分解的蛋白质被酚-氯仿抽提除去；剩余的基因组DNA用乙醇沉淀。该方法可以得到高纯度的基因组DNA，但需要的化学试剂也多，尤其用到了对皮肤有腐蚀作用的化学试剂——酚，对试验操作人员存在相当大的危险；此外，用到的酚、氯仿、异戊醇等试剂容易挥发，对实验室及其周边环境也会造成一定污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全的快速提取禽类血液基因组DNA的方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(1)取抗凝血，将其与细胞裂解液按1∶50混合(体积比)，向混合液中加入蛋白酶K；
(2)在55-65℃的温度下，水浴消化3-5小时；
(3)加预冷的乙醇，充分混匀，乙醇使溶液中的DNA和部分蛋白一起沉淀；10000rpm离心5min，弃上清液；
(4)加双蒸水ddH2O溶解沉淀，乙醇使蛋白发生不可逆变性，沉淀中的蛋白不能溶解，而DNA可以再次溶解；10000rpm离心5min，吸上清液到干净的离心管中；
(5)加入4mol/L的NaAc和预冷的乙醇，充分混匀；10000rpm离心5min，弃上清液，加75％的预冷乙醇，出现白色絮状沉淀，即基因组DNA。
所述的细胞裂解液的组成是：0.5M EDTA 35-45ml，1M Tris·HCl 6-12ml，5M NaCl 2-6ml，10％SDS 8-12ml。
所述的抗凝血与细胞裂解液的体积比为1∶50，蛋白酶K的加入量与混合液的比为1∶125。
步骤(3)中乙醇的加入量占总体积的70％以上。
步骤(5)中使NaAc的含量为0.1-0.2mol/L，预冷的乙醇的浓度达到70％-90％。
本发明的方法针对酚-氯仿抽提法提取基因组DNA的缺点，结合禽血红细胞中含有细胞核，基因组DNA含量丰富的特点，提出了用乙醇进行两次沉淀，代替酚-氯仿抽提进行禽血基因组DNA提取的方法。本方法仅需10ul抗凝血，加入细胞裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K消化溶液里的蛋白质，然后用乙醇沉淀基因组DNA和剩余的未被消化的蛋白质，弃上清液，将沉淀用ddH2O溶解，由于乙醇使蛋白发生不可逆变性，所以沉淀中的蛋白不能溶解，而DNA可以再次溶解；转移上清液(含有基因组DNA)到新的1.5ml离心管中，第二次向溶液中加入高浓度乙醇，基因组DNA就可以再次沉淀，从而得到高纯度的基因组DNA。本方法快速、高效、无毒、经济，所得到的基因组DNA可以进行下一步的PCR、酶切等分子生物学分析。本发明的方法具有操作安全，没有环境污染；本方法进行禽血基因组DNA提取主要试剂是乙醇，没有用到酚、氯仿、异戊醇等有毒有害试剂，对操作者和环境都没有污染。另外，提取方法简单，结果可靠，基因组DNA提取过程中没有用到氯仿等溶剂，不出现液面分层和移上清液等难度较大的操作，因此，也不存在有机溶剂残留在提取的基因组DNA里，影响下面的操作(如PCR扩增、酶切)等问题。采用本发明的方法的提取过程所需要时间在1h以内。
附图说明
图1为本发明的方法提取的鹌鹑基因组DNA经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测图。电泳条件：取4ul基因组DNA加1ul 6×Loading buffer点样，8v/cm电泳30min后拍照。
图2为用本方法提取的北京鸭基因组DNA用多对引物进行PCR扩增，扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测的照片。电泳条件：取4ul PCR产物加1ul6×Loading buffer点样，8v/cm电泳30min后拍照。
具体实施方式
具体实施的方法如下：
所用到的缓冲液和试剂如下：
细胞裂解液：分别取0.5M EDTA 40ml，1M Tris·HCl 10ml，5M NaCl 4ml，10％SDS 10ml，定容至100ml。实际浓度为200mM EDTA，pH值8.0；100mM Tris·HCl，pH值8.0；200mM NaCl，2％SDS。
蛋白酶K：取100mg蛋自酶K溶于5ml灭菌ddH2O，-20℃保存4mol/L的NaAc：称量54.4g NaAc·3H2O置于100ml烧杯中，加入40ml的ddH2O搅拌溶解，加入冰醋酸调节pH值至5.2，定容至100ml，高压灭菌。
TE缓冲液：取1M Tris-HCl(PH＝8.0)5ml、0.5M EDTA(PH＝8.0)1ml，定容到500ml，高压灭菌。
75％乙醇：75ml乙醇(分析纯)加入25ml的ddH2O，混匀。
100％乙醇：分析纯
具体步骤如下：
(1)取10ul抗凝的鹌鹑血，加500ul细胞裂解液，再加4ul蛋白酶K，充分混匀；
(2)在60℃的温度下，水浴消化3-4h；
(3)加1000ul预冷的乙醇(分析纯)，充分混匀，溶液中出现沉淀；
(4)10000rpm离心5min，弃上清液；
(5)加300ul ddH2O，上下剧烈颠倒，溶解沉淀，沉淀不会完全溶解，因为沉淀中的蛋白质已经发生不可逆变性，不能再次溶解；而沉淀中的基因组DNA可以再次溶解；
(6)10000rpm离心5min，吸上清液(约300ul)到干净的离心管中；加50ul 4mol/L的NaAc，900ul预冷的乙醇(分析纯)，上下缓慢颠倒，充分混匀，出现白色絮状沉淀(基因组DNA)；
(7)10000rpm离心5min，弃上清液，加75％的预冷的乙醇700ul，上下缓慢颠倒混匀；
(8)10000rpm离心5min，弃上清液，用200ul移液器吸干离心管底部的液体，室温干燥5～10min；
(9)加50～200ul TE溶解，用移液器反复吹打数次，室温放置10min，以溶解基因组DNA。

Claims (6)

1.一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取抗凝血，将其与细胞裂解液混合形成混合液，向混合液中加入蛋白酶K；
(2)在55-65℃的温度下，水浴消化3-5小时；
(3)加预冷的乙醇，充分混匀，乙醇使溶液中的DNA和部分蛋白一起沉淀；10000rpm离心5min，弃上清液；
(4)加双蒸水ddH2O溶解沉淀；10000rpm离心5min，吸上清液到干净的离心管中；
(5)加入4mol/L的NaAc和预冷的乙醇，充分混匀；10000rpm离心5min，弃上清液，加75％的预冷乙醇，出现白色絮状沉淀，即基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法，其特征在于：所述的细胞裂解液的组成是：0.5M EDTA 35-45ml，1M Tris·HCl6-12ml，5M NaCl 2-6ml，10％SDS 8-12ml。
3.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法，其特征在于：步骤(1)中抗凝血与细胞裂解液的体积比为1∶50。
4.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法，其特征在于：步骤(1)中蛋白酶K的加入量与抗凝血与细胞裂解液所形成混合液的比值为1∶125。
5.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法，其特征在于：步骤(3)中乙醇的加入量占总体积的70％-90％。
6.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法，其特征在于：步骤(5)中使NaAc的含量为0.1-0.2mol/L，预冷的乙醇的浓度达到70％以上。
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