CN103952399A - 一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，属于核酸纯化技术领域。首先向恰当保存的组织材料中加入添加新型指示剂的酚胍盐裂解液，之后用匀浆器将样本粉碎均匀，加入氯仿使液体充分混匀后，离心转移上清至新管中，加入异丙醇沉淀核糖核酸，之后用75%的乙醇洗涤沉淀，最后用无核糖核酸酶的水溶解核糖核酸。本发明方法可用于提取动物、植物组织、细胞、血液、细菌以及病毒的总RNA，提取的RNA纯度高，基因组残留少，完整性好，适用于下游多种分子生物学实验。

Description

一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，属于核酸纯化技术领域。

背景技术

纯度高、完整性好的核糖核酸（RNA）的提取是分子生物学研究、临床以及生物技术应用的关键步骤。目前核糖核酸（RNA）提取常用的方法有：吸附法和酚仿抽提法。吸附法多见于硅基质膜吸附、离子交换树脂以及磁珠等材料，该法使得RNA在高盐条件下专一性的与吸附材料结合，蛋白等杂质不能结合而被洗脱，盐类则被乙醇漂洗去除，最后用去核糖核酸酶的水将核糖核酸洗脱下来；酚仿抽提法结合高浓度异硫氰酸胍盐类，可达到充分裂解组织样本并且强烈抑制核糖核酸酶（RNase）的目的，匀浆液分层：上层水相为核糖核酸（RNA），中间层为脱氧核糖核酸（DNA），下层有机相为蛋白质，之后经异丙醇将水相总核糖核酸沉淀下来，用75%的乙醇洗涤核糖核酸沉淀去除盐类即可，最后用去核糖核酸酶（RNase）的水溶解核糖核酸，所得核糖核酸完整性好，对于标准化RNA生产十分有用。但是此法经常由于操作原因将中间相脱氧核糖核酸一同转移，导致所得核糖核酸中脱氧核糖核酸残留较多，严重影响后续反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）实验，因此，一种界相分明的新型酚胍盐裂解液（TRIzol）的研发及其应用对于分子生物学实验的改进非常必要。

发明内容

本发明的目的是提出一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，利用含有指示剂的裂解液充分裂解组织样本，有效抑制核糖核酸酶（RNase）的活性，其中的指示剂用于明确分离不同界相，以保证提取过程的酸性环境，从而达到RNA的最大提取得率。

本发明提出的使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，包括以下各步骤：

（1）向30-50毫克动物组织或植物组织中加入1毫升含有指示剂的酚胍盐裂解液，用匀浆器匀浆样本，或液氮研磨，得到匀浆液；

（2）将匀浆液在室温下放置5分钟，使得核酸与蛋白充分分离；

（3）向步骤（2）的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离；

（4）经步骤（3）离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸（RNA）的无色水相，中间层为含有脱氧核糖核酸（DNA）的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中；

（5）在步骤（4）的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸（RNA），室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟；

（6）将步骤（5）离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸（RNA）沉淀，向核糖核酸沉淀中加入1毫升75%乙醇洗涤，进行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟；

（7）弃掉步骤（6）的上清液，加入去核糖核酸酶（RNase-free）的水，用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸（RNA）。

上述方法中，所述的含有指示剂的酚胍盐裂解液中的各组分为：

上述组分按量称重后，用冰醋酸调pH值至4-5，定容至1000毫升，所述的指示剂为中性红、甲基红中的任何一种。

本发明提出的使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，其优点是：本发明方法中使用的裂解液可以有效抑制核糖核酸酶的活性，保证所提核糖核酸的纯度以及完整性，并且对后续分子生物学实验没有抑制性，裂解液中的指示剂为红色，便于界相分明，没有加氯仿时，指示剂与裂解液（TRIzol）混合为单一相，没有分层，加入氯仿后，指示剂完全在有机相，水相为无色。本发明方法可以用于提取动物、植物组织、细胞、血液、细菌以及病毒的总RNA，本发明方法提取的RNA纯度高，基因组残留少，完整性好，可以用于反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（Real-timeRT-PCR）、核糖核酸印记杂交（Northern-blot）、点杂交（Dot blot）、芯片分析、体外翻译、核糖核酸酶保护分析、分子克隆等多种生物学实验。

附图说明

图1是根据本发明的实施例1，从40毫克大鼠肝脏组织中提取总核糖核酸的电泳检测图。

图2是根据本发明的实施例2，从100毫克玉米叶片组织中提取总核糖核酸的电泳检测图。

具体实施方式

本发明提出的使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，包括以下各步骤：

（1）向30-50毫克动物组织或植物组织中加入1毫升含有指示剂的酚胍盐裂解液，用匀浆器匀浆样本，或液氮研磨，得到匀浆液；

（2）将匀浆液在室温下放置5分钟，使得核酸与蛋白充分分离；

（3）向步骤（2）的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离；

（4）经步骤（3）离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸（RNA）的无色水相，中间层为含有脱氧核糖核酸（DNA）的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中；

（5）在步骤（4）的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸（RNA），室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟；

（6）将步骤（5）离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸（RNA）沉淀，向核糖核酸沉淀中加入1毫升75%乙醇洗涤，进行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟；

（7）弃掉步骤（6）的上清液，加入去核糖核酸酶（RNase-free）的水，用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸（RNA）。

上述方法中，所述的含有指示剂的酚胍盐裂解液中的各组分为：

上述组分按量称重后，用冰醋酸调pH值至4-5，定容至1000毫升，所述的指示剂为中性红、甲基红中的任何一种。

以下介绍本发明的实施例。

实施例一：从大鼠肝脏中提取总核糖核酸（RNA）。

1、向40毫克大鼠肝脏组织中加入1毫升含有新型指示剂的酚胍盐裂解液（TRIzol），用匀浆器匀浆样本；

2、将步骤1组织研磨液室温放置5分钟，使得核酸与蛋白充分分离；

3、向步骤2的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离；

4、经步骤3离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸（RNA）的无色水相,中间层为含有脱氧核糖核酸（DNA）的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中；

5、在步骤4的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸（RNA），室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟；

6、将步骤5离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸（RNA）沉淀，向核糖核酸沉淀中加入1毫升75%乙醇洗涤，进行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟；

7、弃掉步骤6的上清液，加入去核糖核酸酶（RNase-free）的水，用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸（RNA）。

上述步骤中，所述的含有新型指示剂的酚胍盐裂解液（TRIzol）制备方法是：将异硫氰酸胍94.5克，异硫氰酸铵30.4克，苯酚500毫升，甘油60毫升，无水醋酸钠8.2克，中性红10毫克混匀，用冰醋酸调pH至4.4-4.5,定容至1升。上述组分中所描述的指示剂应为亲有机溶剂而疏水型的，加入氯仿后，指示剂在有机界相以保证所提核糖核酸的纯度以及避免对下游实验的抑制性发生。

实施例二：从玉米叶片组织中提取总核糖核酸（RNA）。

1、向100毫克液氮研磨的玉米叶片组织中加入1毫升含有新型指示剂的酚胍盐裂解液（TRIzol）；

2、将步骤1组织研磨液室温放置5分钟，使得核酸与蛋白充分分离；

3、向步骤2的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离；

4、经步骤3离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸（RNA）的无色水相,中间层为含有脱氧核糖核酸（DNA）的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中；

5、在步骤4的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸（RNA），室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟；

6、将步骤5离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸（RNA）沉淀，向核糖核酸沉淀中加入1毫升75%乙醇洗涤，进行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟；

7、弃掉步骤6的上清液，加入去核糖核酸酶（RNase-free）的水，用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸（RNA）。

上述步骤中，所述的含有新型指示剂的TRIzol制备方法是：将异硫氰酸胍94.5克，异硫氰酸铵30.4克，苯酚500毫升，甘油60毫升，无水醋酸钠8.2克，甲基红20毫克混匀，用冰醋酸调pH至4.4-4.5,定容至1升。上述组分中所描述的指示剂应为亲有机溶剂而疏水型的，加入氯仿后，指示剂在有机界相以保证所提核糖核酸的纯度以及避免对下游实验的抑制性发生。

图1是根据上述实施例1，从40毫克大鼠肝脏组织中提取总核糖核酸的电泳检测图，图1中，MIII：脱氧核糖核酸分子量标准（MarkerIII），泳道1：根据实施例1提取的总核糖核酸。

图2是根据上述实施例2，从100毫克玉米叶片组织中提取总核糖核酸的电泳检测图，图2中，MIII：脱氧核糖核酸分子量标准（MarkerIII），泳道1：根据实施例2提取的总核糖核酸。

Claims (2)

1.一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法，其特征在于该方法包括以下各步骤：

（1）向30-50毫克动物组织或植物组织中加入1毫升含有指示剂的酚胍盐裂解液，用匀浆器匀浆样本，或液氮研磨，得到匀浆液；

（2）将匀浆液在室温下放置5分钟，使得核酸与蛋白充分分离；

（3）向步骤（2）的匀浆液中加入0.2毫升氯仿，颠倒混匀15秒，使氯仿与匀浆液充分混匀，室温下放置3分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为15分钟，使水相与有机相彻底分离；

（4）经步骤（3）离心后的溶液分为三层，上层为含有核糖核酸（RNA）的无色水相，中间层为含有脱氧核糖核酸（DNA）的白色界相，下层为含有蛋白质的红色有机相，将上层含有核糖核酸的无色水相转移至试管中；

（5）在步骤（4）的试管中加入0.5毫升异丙醇沉淀核糖核酸（RNA），室温下保持10分钟，进行离心，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为10分钟；

（6）将步骤（5）离心后的上清液弃掉，保留核糖核酸（RNA）沉淀，向核糖核酸沉淀中加入1毫升75%乙醇洗涤，进行离心，离心分离的转速为8000转/分钟，离心分离的温度为4摄氏度，离心时间为5分钟；

（7）弃掉步骤（6）的上清液，加入去核糖核酸酶（RNase-free）的水，用移液枪反复吹打几次，溶解核糖核酸（RNA）。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的含有指示剂的酚胍盐裂解液中的各组分为：

上述组分按量称重后，用冰醋酸调pH值至4-5，定容至1000毫升，所述的指示剂为中性红、甲基红中的任何一种。