CN112522250A - 一种核酸纯化辅助剂及使用方法 - Google Patents
一种核酸纯化辅助剂及使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种核酸纯化辅助剂及使用方法,所述辅助剂为聚丙烯腈粉,其添加量为核酸提取液的3‑8%,可显著改进核酸纯化方法,其优点为:便于操作,提高得率和纯度,降低污染,同时减少了操作人员与有害苯酚的接触概率。
Description
技术领域
本发明属于核酸纯化技术领域,具体为一种核酸纯化辅助剂及使用方法。
背景技术
分子生物学实验室中,最常用的核酸纯化方法有两种,一种是使用苯酚抽提,另一种是基于silica的纯化方式。尽管后者被越来越到的实验室采用,但前者因操作简单、成本低廉和纯化质量高,而仍有较广泛的使用和发展空间。
在DNA纯化的步骤中,水相和有机相之间的蛋白层相对不稳定。在吸取水相的过程中,需要特别小心,避免吸到蛋白层。目前人们通常,将移液器枪头的末端剪掉1~2mm,以增大其口径,减少其单位面积上的吸力,进而更平缓地转移上层水相;或者,尽量少吸取一些水相,以牺牲得率为代价换取较高纯度的DNA,二者均不甚方便。
基于上述问题,目前需针对苯酚抽提的操作方法进行改进。
发明内容
(一)解决的技术问题
为解决现有的,苯酚抽提法核酸纯化不方便的问题,本发明提供一种辅助剂,可显著改进核酸纯化方法,其优点为:便于操作,提高得率和纯度,降低污染,同时减少了操作人员与有害苯酚的接触概率。
(二)技术方案
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种核酸纯化辅助剂,所述辅助剂为聚丙烯腈粉。
优选方案为,所述聚丙烯腈粉的添加量为核酸提取液的3-8%。
一种核酸纯化辅助剂的使用方法,包括如下步骤:
S1. 在核酸提取液中,加入终浓度为5%的辅助剂;
S2. 将步骤S1所得溶液按照核酸提取步骤,采用苯酚或苯酚-氯仿抽提,离心后其水相与有机相之间形成一层白色的(辅助剂+蛋白质)界面;
S3. 使用移液器将界面以下的有机相移除,无需更换试管;
S4. 加入氯仿抽提,以去除残余的苯酚;
S5. 吸取上层水相至新的试管或容器,加入乙醇或异丙醇沉淀核酸。
本发明的有益效果是:
1.方便操作,辅助剂的加入,可以加固水相和有机相之间的界面,并使该界面更加清晰,使操作更加简单。
2.因为中间界面更加清晰牢固,相比较传统方法中容易坍塌的界面,可以减少界面中蛋白的污染,并能提高核酸的回收得率。
3.清晰牢固的中间界面,减少了操作者接触有害有机相的机率,更利于健康。
附图说明
图1为聚丙烯腈对苯酚/氯仿抽提过程的辅助影响效果图;
图2为不同方法提取纯化的质粒DNA酶切比较图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例1:细菌基因组DNA的提纯,步骤如下:
S1. 转移1.5ml过夜培养(LB液体培养基)的E.coli培养物到1.5ml Eppendorf管,最大离心转速离心1分钟,收集细菌细胞,去上清;
S2. 加入600µl裂解液,重悬细胞;所述裂解液(10ml):包括9.34mL TE 缓冲剂600µL 10% SDS,60µl 蛋白酶K (20mg/mL),0.5g聚丙烯腈粉;37℃温育1小时;
S3. 加入等体积的苯酚/氯仿(1:1),充分混合,室温下离心5分钟,水相跟有机相之间会形成一层白色的(辅助剂+蛋白层)“界面”;
S4. 用移液器,将“界面”以下的有机相移除,无需更换试管;
S5. 为去除样品中残余的苯酚,加入等体积的氯仿(至上述移除有机相的试管),充分混匀后,最大转速离心5分钟;
S6. 转移上层水相至一个新的Eppondorf管,为沉淀纯化的DNA,加入2.5~3倍体积的-20℃的无水乙醇;放入-20℃,30分钟以上;
S7. 最高转速4℃离心15分钟,去上清,并用室温70%的乙醇洗涤DNA沉淀;最高转速离心2分钟,去上清,室温干燥DNA;
S8. 在TE中重悬溶解DNA。
实施例2:植物基因组DNA的提取与纯化,步骤如下:
S1. 取适当新鲜叶片放入1.5mL离心管中,加入500µL的裂解液,所述裂解液(10mL):包括1mL 10%SDS,0.5mL 0.5M EDTA,1mL 1M Tris盐酸,2mL 1M NaCl,5.5mLddH20,0.5g聚丙烯腈,pH=8.5);
S2. 加入2粒钢珠,振荡破碎仪上震荡1.5分钟,37℃,水浴30min;水浴过程中上下颠倒混匀;
S3. 加入500µL的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液,充分混匀,12000rpm,离心10min,水相跟有机相之间会形成一层白色的(辅助剂+蛋白层)界面;
S4. 用移液器,小心地将“界面”以下的有机相移除,无需更换试管;
S5. 加入500µL体积氯仿:异戊醇(24:1)溶液,至上述移除有机相的试管,充分混匀,12000rpm,离心10min;
S6. 吸取450µL的上清液至一干净的1.5ml离心管,加入450µL的异丙醇,轻轻混匀,-20℃放置30min;12000rpm,离心10min;弃上清,加入600µL的75%乙醇溶液,洗涤两次;12000rpm离心10min;
S7. 弃上清液,用移液器吸尽残留乙醇溶液,室温干燥(约5min),加入100µL的1×TE或ddH2O溶解;采用紫外分光光度计法检测DNA的含量及纯度,1%琼脂糖凝胶检测DNA的质量。
实施例3:细菌质粒DNA的提取与纯化,步骤如下:
S1. 转移1.5mL过夜培养(LB液体培养基)的E.coli培养物到1.5mL离心管,5000rpm离心5分钟,收集细菌细胞;倒掉上清液,加入100µl溶液Ⅰ ,充分悬浮;加入200µl溶液Ⅱ,轻轻地颠倒离心管混匀;加入150µl 冰预冷的溶液Ⅲ,轻轻地颠倒离心管混匀,置于冰上5min,12000rpm离心10分钟;吸取上清液至一新的1.5mL离心管。
S2. 加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液,涡旋震荡混匀,12000rmp离心10分钟;
S3. 小心移除下层有机相,不用转移至新的离心管,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)溶液,至上述移除有机相的试管,涡旋震荡混匀,12000rmp离心10分钟,
S4. 吸取上清转移至一新的1.5mL离心管,加入两倍体积的无水乙醇沉淀质粒DNA;12000rmp离心20分钟,倒掉上清, 加入800µL的75%乙醇溶液,清洗两次;
S5. 弃上清液,用移液器吸尽残留酒精溶液,室温干燥(约5min),加入20µL的ddH2O溶解质粒DNA,测定质粒DNA的浓度。
所用试剂:
溶液I: 50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris(pH 8.0),10mmol/L EDTA。
溶液II: 0.2mol/L NaOH,0.1%SDS (新鲜配置)。
溶液III: 3mol/L 醋酸钾,2mol/L 醋酸,5%聚丙烯腈粉。
图例说明:
图1. 聚丙烯腈对苯酚/氯仿抽提过程的辅助影响效果图
A为传统的方法,不添加聚丙烯腈;
B为本申请方法,添加5%的聚丙烯腈。
I 为样品加入苯酚涡旋混匀后,高速离心5分钟后的情形。加入聚丙烯腈的样品B,形成一个稳定坚固的界面。
II 为去除下层苯酚有机相,重新加入氯仿抽提,离心并吸取上清后的情形。加入聚丙烯腈的样品B,可以吸取更多的水相样品,而界面仍稳定成型。未加聚丙烯腈的样品A,吸取一定水相上清后,界面坍塌,无法继续吸取。
图2. 不同方法提取纯化的质粒DNA酶切比较
1为传统的碱法提取配合苯酚-氯仿纯化获得质粒DNA酶切后的情况
2为传统的碱法提取配合加入辅助剂的苯酚-氯仿纯化获得质粒DNA酶切后的情况
3 为商业试剂盒(基于硅基质膜)提取纯化质粒DNA酶切后的情况
4 为DNA Marker。
实验中的质粒DNA大小为5Kb,含有两个HindIII位点,酶切后产生3.5kb和1.5kb大小的两个片段。说明改进后的方法提取的质粒DNA纯度与传统的方法和商业试剂盒的方法相当,均满足接下来相关分子生物学操作。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.一种核酸纯化辅助剂,其特征在于:所述辅助剂为聚丙烯腈粉。
2.根据权利要求1所述的一种核酸纯化辅助剂,其特征在于:所述聚丙烯腈粉的添加量为核酸提取液的3-8%。
3.根据权利要求1或2所述的一种核酸纯化辅助剂的使用方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1. 在核酸提取液中,加入终浓度为5%的辅助剂;
S2. 将步骤S1所得溶液按照核酸提取步骤,采用苯酚或苯酚-氯仿抽提,离心后其水相与有机相之间形成一层白色的(辅助剂+蛋白质)界面;
S3. 使用移液器将界面以下的有机相移除,无需更换试管;
S4. 加入氯仿抽提,以去除残余的苯酚;
S5. 吸取上层水相至新的试管或容器,加入乙醇或异丙醇沉淀核酸。
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