CN111117998A - 微生物核酸萃取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物核酸萃取方法，应用于生物分子领域，包含以下步骤：将一生物样本加入研磨装置中与洗涤缓冲液混合；对所述生物样本与所述洗涤缓冲液的混合液进行震荡处理；对所述经震荡处理后的混合液进行离心处理；于所述经离心处理后含微生物样品的下层沉淀物溶液加入裂解液，然后震荡处理；对所述经震荡处理后裂解液与含微生物样品的下层沉淀物溶液的混合液进行加热处理；对所述经加热处理后的混合液进行离心处理，收取上清液，获得萃取的核酸样品。本发明提供的微生物核酸萃取方法，同时结合物理和化学方式，仅需使用单管配合研磨装置、洗涤缓冲液及裂解液可快速且简易地萃取核酸，并无需经纯化步骤即可进行后续相关核酸试验。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子领域，尤其涉及微生物核酸的萃取方法。
背景技术
分子检测为近年新兴的检测方法，具有早期发现、快速筛检与 准确度高等特性，因此分子检测已成为检验的重要工具之一。所有 生物均以核酸为其遗传物质，不同物种所具有的核酸，于序列组成 及数量上，均有其特异性。核酸组成简单，相对而言，较为容易被侦测。而要对核酸进行检测，首先需要将生物样品中的核酸提取出 来。
核酸的提取一般包括核酸的释放及核酸的纯化。核酸的释放为 提取核酸首要步骤，核酸的释放一般包括机械法、物理法和化学法。 其中机械法实现核酸的释放的方法，为将生物样品用机械性的方法 溶出，例如利用研钵、研磨管、研磨罐或者研磨瓶、均质机等，将 生物样品放入内装研磨珠子的管、罐、瓶中配合研磨专用均质机进 行高能震荡将微生物细胞溶出。传统使用研钵研磨样品前，研钵需 使用化学药剂处理去除脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶 (RNase)等干扰因素，且研磨过程需使用液态氮进行，全程需要保持低温以避免回温潮解而造成核酸降解。虽均质机搭配研磨管、研磨 罐或者研磨瓶的操作方便且快速，但研磨均质机设备与传统研磨方 式相较，设备体积庞大、价格昂贵、取得不便、机动便利性不高等， 且在微生物细胞溶出后，如要将此核酸运用于后续实验，进入后续 实验前还需进行核酸纯化步骤。
核酸的纯化主要采用两大类溶剂进行。一种为有机溶剂，另一 种为非有机溶剂。有机溶剂纯化法，利用苯酚(phenol)及氯仿 (Chloroform)将细胞裂解，经过超高速离心使溶液分层，DNA会存 于水相层与其他RNA和蛋白等物质分开。用酒精或异丙醇沉淀，将 核酸清洗沉淀出，最后以缓冲液回溶。因此方法过程中会使用到大 量的有机溶剂，操作过程如未将有机溶剂去除，将会成为后续试验 的抑制剂，且苯酚及氯仿都具有高挥发性，容易影响操作者健康。
非有机溶剂纯化法，使用离子或非离子界面活性剂等缓冲液分 离核酸，利用离液盐(chaotropic agent)使核酸结合离心管柱(spin column)中的二氧化硅(silica)，反复进行清洗，减少试剂残留，最后 将结合于二氧化硅的核酸从离心管柱洗脱出。虽然此方法比传统法 快速，但操作上依然是繁锁的步骤，尤其当有大量的样品需要进行 核酸萃取纯化时，人为的误差影响会随之放大，产物的质量也变得 难以兼顾且有多种昂贵设备的需求。试剂的残留更是会影响后续的 DNA扩增。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种快速、简易萃取核酸的方法。
一种微生物核酸萃取方法，包括以下步骤：
将一生物样本加入研磨装置中与洗涤缓冲液混合；
对所述生物样本与所述洗涤缓冲液的混合液进行震荡处理；
对所述经震荡处理后的生物样本与洗涤缓冲液的混合液进行离 心处理；
于所述经离心处理后的置放于研磨装置中的下层溶液中加入裂 解液，然后对所述裂解液与下层溶液的混合液震荡处理；
对所述经震荡处理后裂解液与下层溶液的混合液进行加热处 理；
对所述经加热处理后的混合液进行离心处理，收取上清液，获 得萃取的核酸样品。
进一步地，所述洗涤缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷 (Tris(hydroxymethyl)aminomethane)、磷酸盐缓冲生理盐水 (Phosphate buffered saline)，所述洗涤缓冲液的浓度范围为 0.05mM-0.5M，所述洗涤缓冲液的pH值范围为6.5-9.2。
进一步地，所述裂解液包含界面活性剂、酵素、和盐类中的一 种或多种。
进一步地，所述界面活性剂为聚乙二醇单辛基苯基醚 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)、乙基苯基 聚乙二醇(NONIDET P40)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸钠 (Dodecyl sodium sulfate)中的一种或多种，所述界面活性剂的浓度范 围为0.01mM-0.5M。
进一步地，所述酵素为蛋白酶K(proteinase K)，所述酵素的浓 度范围为1mg/ml-50mg/ml。
进一步地，所述盐类为乙二胺四乙酸 (Ethylenediaminetetraacetic acid)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris(hydroxymethyl)aminomethane)中的一种或多种，所述盐类的浓度范围为0.05mM-0.5M。
进一步地，所述加热处理为水浴，加热的温度范围为35-105℃。
进一步地，所述研磨装置包含研磨管与微粒，所述研磨管为聚 丙烯螺旋管或微量离心管，所述微粒为矿物质微粒、陶瓷微粒、玻 璃微粒、金属微粒中的一种或多种。
进一步地，所述生物样本为含微生物的样品，具体为痰液、尿 液、血液、胸膜腔液、支气管抽洗液，或者已分离出的微生物样品。
进一步地，生物样本与洗涤缓冲液的混合液进行离心处理后分 为上层清液与下层溶液，该离心处理后还包括移除该上层清液，以 保留该下层溶液的步骤。
本发明提供的微生物核酸萃取方法，仅需使用单管配合研磨装 置、洗涤缓冲液及裂解液可快速且简易地萃取核酸，并无需经纯化 步骤即可进行后续相关核酸试验的核酸萃取改良方法，其避免使用 传统技术所采用的离液盐及乙醇或异丙醇等会抑制后续DNA增幅 的试剂，无需经过二氧化硅(silica)管柱萃取，也无需使用研磨专用 的均质机，本发明可短时间将萃取出的核酸直接进行后续DNA增 幅、侦测等应用。
附图说明
图1为本发明一实施例的微生物核酸的萃取方法流程图。
图2为本发明芯片测试比对图，其中，图2中的(a)图为未经过预 处理的样品芯片测试结果，图2中的(b)图为经过预处理的样品芯片 测试结果。
图3为本发明吸收光谱测试图。
图4为本发明进行聚合酶连锁反应(PCR)后的结果比对图。
图5为本发明使用Roche
MTB Test进行平 行比对的比对结果。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术 方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明 一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本 领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本 发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明 的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是 旨在于限制本发明。
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本 发明进行详细阐述。
本发明提供的微生物核酸的萃取方法，包括生物样本的预处理 与核酸的萃取，该生物样本的预处理即为核酸的释放，该预处理包 括如下步骤S1至S3，具体的包括以下步骤：
步骤S1，将一生物样本加入研磨装置中与洗涤缓冲液混合。其 中，所述生物样本可以是痰液、尿液、血液、胸膜腔液、支气管抽 洗液等含微生物或已分离出的微生物的样品。所述研磨装置包含研 磨管与微粒，所述研磨管可以是聚丙烯螺旋管或微量离心管等可供 研磨处理的容器。所述微粒可以为矿物质微粒、陶瓷微粒、玻璃微 粒、金属微粒中的一种或多种。其中，所述洗涤缓冲液包含三羟甲 基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)、磷酸盐缓冲生理盐 水(Phosphate buffered saline)等。所述洗涤缓冲液的浓度范围为 0.05mM-0.5M，所述洗涤缓冲液的pH值范围为6.5-9.2。所述研磨可 以是采用美国Scientific Industries的SI Vortex-Genie 2涡旋振荡器或 漩涡混匀仪(VortexMixer(LMS))等进行研磨。
步骤S2，对所述生物样本与所述洗涤缓冲液的混合液进行震荡 处理，以使生物细胞从痰液样品中溶出。
步骤S3，对所述经震荡处理后的生物样本与洗涤缓冲液的混合 液进行离心处理。离心转速大于13000rpm，离心处理时间为5-10min， 以将所述混合液分为上下两层，移除上层清液，留下下层含微生物 样品沉淀物溶液于所述研磨装置中。
所述核酸的萃取包括如下步骤S4～S6。其中步骤S4为，于所述 经离心处理后的置放于研磨装置中的下层含微生物样品沉淀物溶液 中加入裂解液，然后对所述裂解液与下层含微生物样品沉淀物溶液 的混合液震荡处理，震荡时间5-10min。所述裂解液包含界面活性剂， 酵素和盐类的一种或其混合液。其中界面活性剂的溶度范围为 0.001％-5％。酵素的浓度范围为1mg/ml-50mg/ml。盐类的浓度范围 为0.05mM-0.5M。所述界面活性剂可以为聚乙二醇单辛基苯基醚 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethyleneglycol)、乙基苯基 聚乙二醇(NONIDET P40)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸钠 (Dodecyl sodiumsulfate)的一种或其混合液，所述界面活性剂用于溶 解细胞质和细胞膜。所述酵素可以为蛋白酶K(proteinase K)，用于 分解蛋白质。所述盐类可以为乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris(hydroxymethyl)aminomethane)的一种或者其混合液，用于稳定 核酸。
步骤S5，对所述经震荡处理后裂解液与下层含微生物样品沉淀 物溶液的混合液进行加热处理，以使蛋白质变性，细胞破裂，核酸 释出。加热处理方式为水浴，加热温度为35-105℃，优选95-105℃。
步骤S6，对所述经加热处理后的混合液进行离心处理，离心转 速大于13000rpm，优选14000rpm，离心处理时间为5-10min，以将 所述混合液分为上下两层，上层清液为核酸，移出含有核酸的上层 清液，得到萃取后核酸，以备检测。
本发明的微生物核酸的萃取方法的实施例，具体以一痰液样品 为例，所述具体实施例包括以下步骤：
将一洗涤缓冲液加入含微粒的研磨装置中，然后将一痰液样品 于研磨装置中与洗涤缓冲液进行混合。所述痰液样品的体积为 100-200ul，其中，所述痰液样品与洗涤缓冲液的体积比为1:1，所述 洗涤缓冲液的成分为Tris(hydroxymethyl)aminomethane，浓度范围为 1-100mM，pH值为6.5-8.5。对所述痰液样品与所述洗涤缓冲液的 混合液进行震荡处理，震荡时间为10秒，以使生物细胞从痰液样品 中溶出。
对所述经震荡处理后的痰液样品与洗涤缓冲液的混合液进行离 心处理，离心转速为14000rpm，离心处理时间为5-10min，以将所述 混合液分为上下两层，移除上层清液，留下下层溶液在所述研磨装 置中。
在所述经离心处理后的置放于研磨装置中的下层溶液中加入裂 解液，然后对所述裂解液与下层溶液的混合液进行震荡处理，震荡 时间为5-10min。所述裂解液为聚乙二醇单辛基苯基醚 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)，浓度范围 为0.01～10％。
对上述经震荡处理后的裂解液与下层溶液的混合液进行加热处 理，加热处理方式为沸水浴，加热时间为15min，加热温度为95-105 ℃。
对所述经沸水浴处理后的混合液进行离心处理，离心转速为 14000rpm，离心处理时间为5-10min，以将所述混合液分为上下两层， 移出上层清液为核酸，移出所述含核酸的上层清液，得到萃取后的 核酸。
参阅图2，将经过本实施例的所述萃取方法即经过预处理步骤得 到的核酸样品，与其他萃取方法即未经过预处理获得的核酸样品进 行芯片测试，其他萃取方法所萃取的样品的测试结果相较于本发明 实施例所萃取的样品出现了多处非预期的侦测点，说明本实施例所 萃取的样品有效减低了非预期侦测点，避免了后续直接运用于核酸 实验造成干扰。
参阅图3，以相同样品，使用5种不同浓度，3种方法进行平行比 对。A为单纯采用研磨装置萃取的样品、B为单纯采用裂解液萃取的 样品、与C为本实施例的萃取方法即微粒研磨装置结合缓冲液，并 搭配结合裂解液所萃取的样品，进行吸收光谱测试，以分光亮度计量测的波长分别260nm与280nm来测试方法A、B、C所萃取的核酸吸 收光谱，从而测定萃取核酸的浓度。在三种核酸萃取方法中，以微 粒研磨装置结合缓冲液，并搭配结合裂解液得到的核酸浓度最高， 单使用研磨装置，无法有效释出大部分核酸，仅使用裂解液可得到 比单使用研磨装置多的核酸，而研磨装置配合裂解液可至少增加 1.25倍的核酸萃取量。
参阅图4，为本实施例萃取方法的核酸样品与测试方法A、B所 萃取的核酸样品利用聚合酶连锁反应(PCR)进行分析确认，其中，M 表示100bp DNA marker，以研磨装置配合裂解液所萃取的核酸可得 到最显著的核酸条带，次之为经裂解液萃取的核酸，最不显著的为 仅用研磨装置萃取的核酸，同时使用
Respiratory SpecimenPreparation Kit(D)作为对照组比对，结果研磨装置配合裂 解液所萃取的核酸条带与强度与
Respiratory Specimen Preparation Kit(D)相当。
参阅图5，为本实施例所使用的C萃取方法的核酸和 
Respiratory Specimen Preparation Kit(D)分别使用 Roche
MTB Test进行平行比对评估，样品C与D 相比，在样品C的109件检体当中，34件阳性(+)，阳性率为 31.2％(34/109)；无效检体分别为11件与7件。以10倍稀释后重测， 结果皆为阴性(-)，于总计109件检体最终比对结果，一致性达100％。
综上所述，本发明微生物核酸萃取方法同时结合物理和化学方 式，第一阶段的预处理步骤采用研磨装置加上洗涤缓冲液处理，短 时震荡可减低干扰物质对后续试验影响并将微生物细胞从生物样本 溶出，第二阶段的核酸萃取为加入裂解液配合研磨装置，使萃取管 中的微粒研磨该微生物样本，破坏组织细胞(壁)，再透过高温条件 下使蛋白质变性，细胞破裂，核酸释出，其释出的核酸留在上清液 体中。因此，本发明微生物核酸萃取方法，仅需使用单管配合研磨 装置、洗涤缓冲液及裂解液可快速且简易地萃取核酸，并无需经纯化步骤即可进行后续相关核酸试验，避免了使用传统技术所采用的 离液盐及乙醇或异丙醇等会抑制后续DNA增幅的试剂，无需经过 silica管柱萃取，也无需使用研磨专用的均质机，可短时间将萃取出 的核酸直接进行后续DNA增幅、侦测等应用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照 较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离 本发明技术方案的精神和实质。
Claims (10)
1.一种微生物核酸萃取方法，其特征在于，包括以下步骤：
将一生物样本加入研磨装置中与洗涤缓冲液混合；
对所述生物样本与所述洗涤缓冲液的混合液进行震荡处理；
对所述经震荡处理后的生物样本与洗涤缓冲液的混合液进行离心处理；
于所述经离心处理后的置放于研磨装置中的下层溶液中加入裂解液，然后对所述裂解液与下层溶液的混合液震荡处理；
对所述经震荡处理后裂解液与下层溶液的混合液进行加热处理；
对所述经加热处理后的混合液进行离心处理，收取上清液，获得萃取的核酸样品。
2.如权利要求1所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)、磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphatebuffered saline)，所述洗涤缓冲液的浓度范围为0.05mM-0.5M，所述洗涤缓冲液的pH值范围为6.5-9.2。
3.如权利要求1所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述裂解液包含界面活性剂、酵素、和盐类中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述界面活性剂为聚乙二醇单辛基苯基醚(4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)、乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Polyethylene glycolsorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸钠(Dodecyl sodium sulfate)中的一种或多种，所述界面活性剂的浓度范围为0.01mM-0.5M。
5.如权利要求3所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述酵素为蛋白酶K(proteinase K)，所述酵素的浓度范围为1mg/ml-50mg/ml。
6.如权利要求3所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述盐类为乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)、三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)中的一种或多种，所述盐类的浓度范围为0.05mM-0.5M。
7.如权利要求1所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述加热处理为水浴，加热的温度范围为35-105℃。
8.如权利要求1所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述研磨装置包含研磨管与微粒，所述研磨管为聚丙烯螺旋管或微量离心管，所述微粒为矿物质微粒、陶瓷微粒、玻璃微粒、金属微粒中的一种或多种。
9.如权利要求1所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，所述生物样本为含微生物的样品，具体为痰液、尿液、血液、胸膜腔液、支气管抽洗液，或者已分离出的微生物样品。
10.如权利要求1所述的微生物核酸萃取方法，其特征在于，生物样本与洗涤缓冲液的混合液进行离心处理后分为上层清液与下层溶液，该离心处理后还包括移除该上层清液，以保留该下层溶液的步骤。
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