JP2014132905A - 細胞および組織からのrna迅速抽出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物系(細胞、細胞断片、オルガネラ、組織、器官または生物)からRNAを抽出する方法であって、RNA含有溶液をRNAが結合できる基体と接触させる方法が提供される。RNAは、負圧を適用することにより、基体から回収される。30秒を超える遠心分離ステップを含まない。好ましくは、濾過の前にRNAが希釈され、また干渉物質を除去するために1以上の洗浄ステップを用いることができる。該方法の一態様ではDNA剪断および乾燥ステップは別として、抽出ステップ中には遠心分離が行われない。
【選択図】なし
Description
(a)生物系から細胞含有サンプルを取得するステップと、
(b)任意的に、該サンプルから問題のRNAを含まない細胞を除去して、作業サンプルを生成するステップと、
(c)該問題のRNAを含む細胞を溶解し、該細胞のホモジネートを生成するステップと、
(d)該ホモジネートを希釈するステップと、
(e)該湿潤した均質化した作業サンプルを、RNAが結合する物質を含有するか又は付着させる基体と接触させるステップと、
(f)該サンプルを該基体に結合させるステップと、
(g)混入物質および干渉物質を除去するステップと、
(h)該基体を乾燥するステップと、
(i)該基体からRNAを溶出させるステップと、
を有し、該方法は8分未満で行われる。
溶解/結合用緩衝液(4.5M塩酸グアニジウム,100mMリン酸ナトリウム),
洗浄用緩衝液I(5M塩酸グアニジウム中の37%エタノール,20mM Tris−HCl),
洗浄用緩衝液II(20mM NaCl中の80%エタノール,2mM Tris−HCl),
溶出用緩衝液,および
ヌクレアーゼを含まない無菌二重蒸留水。
本発明の実施例はリアルタイムPCRの使用に基づく。リアルタイムPCRにおいて、ポリメラーゼ連鎖反応の生成物は、終了時点の測定によるのではなく、PCRの対数期にリアルタイムでモニターされる。従って、DNAおよびRNAの定量は遥かに精度と再現性が高い。蛍光値が各サイクル中に記録され、増幅反応において当該時点までに増幅された生成物の量を表わす。反応の開始時に存在する鋳型が多いほど、蛍光信号が基準値(background)を上回る統計的に有意なものとして最初に記録される点に到達するのに要するサイクル数(これが(Ct)値の定義である)が少なくなる。閾値サイクル(Ct)の概念は、蛍光ベースのRT−PCRを用いた正確かつ再現性の高い定量を可能にする。PCR生成物の均一系測定は、2本鎖DNA結合性色素(例えばSYBRグリーン)、蛍光原性プローブ(例えばTaqManプローブ、分子ビーコン)および直接標識型プライマー(例えばAmplifluorプライマー)に基づくものなどを含む多数の異なる検出方法を用いて実行することができる。
この例では、2種の胸部リンパ節を Asterand Inc.(Detroit, MI) から購入した。1つの節は病理学により癌陽性であることが確認され(ALNC1)、第2の節は癌陰性であった(ALNN1)。
配列番号1: ATGACTGCCT TGCCTCCTCA GTA(PBGD)
配列番号2: GGCTGTTGCT TGGACTTCTC TAAAGA(PBGD)
配列番号3: CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA(ママグロビン)
配列番号4: TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA(ママグロビン)
配列番号5: GGCCAACAAA GCTCAGGACA ACA(PIP)
配列番号6: GCAGTGACTT CGTCATTTGG ACGTA(PIP)
この実験では、腺管癌を有する胸部腋窩節を使用した。試薬は全てQIAGEN RNeasy キット(カタログ番号74181, QIAGEN, Inc. Valencia Corporation)からのものを使用した。以下の備品と機材もQIAGEN INCより購入した:QIAvac24濾過装置(カタログ番号 19403),QIAシュレッダー(カタログ番号79656),QIAvacコネクタ(カタログ番号19409)およびVacコネクタ(カタログ番号19407)。他の試薬は全て例1に記載の供給源より購入した。
1. 700μLのホモジネートを QIAシュレッダーカラムに入れ、14,000RPMで2分間遠心分離した。
2. 該溶解物に等体積の70%エタノールを添加し、ピペット処理により混合した。遅滞なく次のステップを続けた。
3. 700μLのサンプルを、真空マニホールドに取り付けられた RNeasy miniカラムに適用した。12psi(約83kPa)で10秒間減圧を適用した。
4. 700μLのRWI緩衝液を該カラムに適用し、同じ減圧を同じ時間、適用した。
5. 500μLのRPE緩衝液を該カラム上にピペットで注ぎ、同じ減圧を同じ時間、適用した。別の500μLのRPE緩衝液を該カラムに添加し、同じ減圧を同じ時間、適用した。
6. 該カラムを収集チューブに入れ、14,000rpmで1分間遠心分離して、カラムを乾燥させた。
7. 該カラムを新たな1.5mlチューブに移した。RNA分解酵素を含まない25μLの水を膜上に直接にピペットで注いだ。
8. 膜を60秒間遠心分離して溶出させた。
1. 700μLのホモジネートを QIAシュレッダーカラムに入れ、14,000RPMで30秒間遠心分離した。
2. 該溶解物に等体積の70%エタノールを添加し、ピペット処理により混合した。遅滞なく次のステップを続けた。
3. 700μLのサンプルを、真空マニホールドに取り付けられた RNEasy miniカラムに適用した。12psi(約83kPa)で10秒間減圧を適用した。
4. 700μLのRWI緩衝液を該カラムに適用し、上記と同じ減圧を適用した。
5. 500μLのRPE緩衝液を該カラム上にピペットで注ぎ、上記と同じ減圧を適用した。別の500μLのRPE緩衝液を該カラムに適用し、上記と同じ減圧を適用した。
6. 該カラムを収集チューブに入れ、14,000rpmで30秒間遠心分離して、カラムを乾燥させた。
7. 該カラムを新たな1.5mlチューブに移した。RNA分解酵素を含まない25μLの水を膜上に直接にピペットで注いだ。
8. 膜を30秒間遠心分離して溶出させた。
この実験では、上記パートIIのステップ1、ステップ6およびステップ7において、VWR Scientific, West Chester, PAより購入したモデル10MVSS遠心分離器を10,000rpmで使用した。
負の対照として、パートIIに記載の手順からステップ6(パートII)を削除した実験を含ませた。
全体で16のH&E陽性節および15のH&E陰性胸部節サンプルをGenomics Collaborativeより購入した。各節から2つの30mg組織片を切り取った。
配列番号3: CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA
配列番号4: TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA
配列番号7: 6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC TTTGTG-TAMRA
配列番号8: CTGAGGCACC TGGAAGGAGG
配列番号9: CATCTTCATG CTGGGCAGGG
配列番号23: 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAGTGT-TAMRA
配列番号11: TCTGATAAAG GCCGTACAAT G
配列番号12: TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC
配列番号13: 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA
この例の目的はリンパ節組織の均質化後に QIAシュレッダーカラムを使用し得ること、および僅か30秒間のホモジネートの遠心分離により許容可能なRNA抽出が生じることを実証することである。
以下の例は、本発明の方法と従来技術の両方を用いた大腸組織からのRNAの抽出を比較するものである。20mgの大腸組織を600μlのRLT緩衝液に加え、例3に記載のように均質化した。均質化された大腸癌組織の1つのサンプルを例3Aに記載の迅速プロトコルに従って処理し、1つのサンプルを例3、パートBに記載のQIAGENプロトコルに従って処理した。両手順から得られたRNAをAgilent bioanalyerで試験した。
Claims (20)
- 生物系から採取されたRNA含有溶液を、RNAに結合する物質が付着された又は該物質を含有する基体と接触させるステップと、負圧を適用することによりRNAを回収するステップを含んでなる、生物系からのRNAの抽出方法であって、30秒を超える遠心分離ステップを含まない方法。
- 組織が組織グラインダーにより均質化される、請求項1に記載の方法。
- 生物系が組織であり、RNA含有溶液の粘度が該溶液と基体との接触前に低下させられる、請求項1に記載の方法。
- 負圧が11.6〜13.1psi(80.0〜90.3kPa)である、請求項1に記載の方法。
- RNAホモジネートを希釈するステップと、前記希釈されたRNAホモジネートを含有する溶液を、RNAに結合する物質が付着された又は該物質を含有する基体と接触させるステップと、負圧を適用することによりRNAを回収するステップを含んでなる、生物系からのRNAの抽出方法。
- 前記RNAホモジネートが8〜2mgホモジネート/ml希釈剤に希釈される、請求項5に記載の方法。
- 30秒を超える遠心分離ステップを含まない、請求項5に記載の方法。
- 生物系のサンプルから問題のRNAを含まない細胞を除去するステップと、RNAを含有する細胞を溶解させるステップと、該溶解物を、RNAが結合できる物質が付着された又は該物質を含有する基体と接触させるステップと、遠心分離の不在下で負圧を適用するステップと、該基体に結合したRNAを取り出すステップを含んでなる、生物系からのRNAの抽出方法であって、該方法が6分未満で行われる方法。
- 細胞がグアニジニウムチオシアネートを含有する物質で溶解され、基体がシリカゲル膜である、請求項8に記載の方法。
- 該溶解物を洗浄するステップを更に含む、請求項8に記載の方法。
- 基体との接触前または接触後に該溶解物を遠心分離するステップを更に含む、請求項8に記載の方法。
- (a)生物系から細胞含有サンプルを取得するステップと、 (b)該サンプルから問題のRNAを含まない細胞を除去して、作業サンプルを生成するステップと、 (c)問題のRNAを含む細胞を溶解するステップと、 (d)該作業サンプルを均質化するステップと、 (e)該均質化した作業サンプルを湿潤させるステップと、 (f)該湿潤した均質化した作業サンプルを、RNAが結合する物質に付着された又は該物質を含有する基体と接触させて、基体−RNA複合体を形成するステップと、 (g)該基体に負圧を適用して、RNAを抽出するステップと (h)該抽出されたRNAを洗浄するステップと、 (i)該基体−RNA複合体から水を除去するステップと、 (j)該RNAを溶出させるステップと、を含んでなる方法であって、該方法が6分未満で行われる方法。
- 問題のRNAを含まない細胞が除去される前に溶解される、請求項12に記載の方法。
- 該均質化した作業サンプルを希釈するステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 該作業サンプルが8〜2mgホモジネート/ml希釈剤に希釈される、請求項14に記載の方法。
- 該作業サンプルが約4mgホモジネート/ml希釈剤に希釈される、請求項15に記載の方法。
- 該希釈剤がRNA保存物質を含む、請求項14に記載の方法。
- 該物質がグアニジウムチオシアネートを含む、請求項17に記載の方法。
- ステップg,h,iまたはjの後に遠心分離ステップをさらに含むが、該遠心分離ステップが30秒を超えない、請求項12に記載の方法。
- 該基体がシリカゲル膜である、請求項12に記載の方法。
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