JP2003304899A - 核酸の分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課 題】 核酸の抽出・増幅・解析を短時間かつ少
量サンプルで行うことができる核酸の分析方法および装
置を提供する。 【解決手段】 生物から採取した核酸を含有する検体を
核酸抽出装置に付して検体から核酸を抽出し、この核酸
を核酸増幅装置に付して増幅し、ついで増幅された核酸
を電気泳動装置に付して核酸解析することを特徴とする
迅速な核酸の抽出・増幅・解析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば、哺乳類動
物、魚類、爬虫類、植物などの生物から採取した、例え
ば、血液などの核酸を含有する検体からの核酸を抽出・
増幅および解析する核酸の分析方法及び装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムなどの
核酸の実用的な分析において、サンプルの調製並びに分
析は重要であるが、従来は長時間を要し、さらに多量の
検体を必要とするものであった。近年、ヒトゲノム計画
（Human Genomic Project（HGP））により、さらに検体
量を減らし、迅速な核酸分析技術の開発に対する要望が
高まってきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸の抽出
・増幅および解析を迅速にかつ少量のサンプルで行うこ
とができる核酸、ゲノムなどの分析方法及び装置を提供
することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々検討
を重ねた結果、例えば、ジェネレーションキャプチャー
ディスク（Generation Capture Disk、株式会社フナコ
シ製）などの核酸抽出装置を用いて生物から核酸を抽出
し、該核酸を、例えば、ライトサイクラー（Light Cycl
er、米国、ロシュ社製）などの核酸増幅装置に付して増
幅し、ついで増幅された核酸を、例えば、アジレント２
１００バイオアナライザー（Agilent 2100 Bioanalyze
r、米国、Agilent社製）または日立ＳＶ１２１０マイク
ロチップ電気泳動（日立製作所製）などの電気泳動装置
に付することにより、核酸の抽出・増幅および解析を非
常に迅速に行うことができることを知見し、本発明を完
成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１） 生物から採
取した核酸を含有する検体を核酸抽出装置に付して検体
から核酸を抽出し、この核酸を核酸増幅装置に付して増
幅し、ついで増幅された核酸を電気泳動装置に付して核
酸解析することを特徴とする迅速な核酸の抽出・増幅・
解析方法、（２） 核酸抽出装置がジェネレーションキ
ャプチャーディスク（GenerationCapture Disk、株式会
社フナコシ製）であり、核酸増幅装置がライトサイクラ
ー（Light Cycler、米国、ロシュ社製）であり、電気泳
動装置がアジレント２１００バイオアナライザー（Agil
ent 2100 Bioanalyzer、米国、Agilent社製）または日
立ＳＶ１２１０マイクロチップ電気泳動（日立製作所
製）であることを特徴とする前記（１）に記載の抽出・
増幅・解析方法、（３） 核酸がヒトゲノムβ−グロブ
リン領域を含有することを特徴とする前記（１）または
（２）に記載の核酸の抽出・増幅・解析方法。（４）
所要時間が２０分以内であることを特徴とする前記
（１）から（３）のいずれかに記載の核酸の抽出・増幅
・解析方法、（５） 核酸抽出手段、核酸増幅手段およ
び電気泳動手段を具備していることを特徴とする分析装
置を使用する核酸の抽出・増幅・解析方法、（６） 核
酸がＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする前記
（１）から（５）のいずれかに記載の核酸の抽出・増幅
・解析方法、（７） 抽出・増幅・解析の対象がゲノム
であることを特徴とする前記（１）から（６）のいずれ
かに記載の核酸の抽出・増幅・解析方法、（８） 生物
から採取した核酸を含有する検体から核酸を抽出する抽
出手段、抽出された核酸を増幅する増幅手段、増幅され
た核酸を分離する分離手段および分離された核酸を検出
する検出手段を具備することを特徴とする核酸の分析装
置、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の核酸の抽出・増幅・解析
方法においては、生物から採取した核酸を検体として用
いる。生物としては、例えば哺乳動物、魚類、貝類、爬
虫類を含む動物、昆虫、植物、糸状菌、酵母、細菌など
が挙げられる。哺乳動物としては、例えばヒト、犬、
猫、猿などが挙げられる。核酸は、例えば血液、臓器、
髪、毛、皮膚、爪、細胞など生物組織から採取できる。
核酸、ゲノムなどを採取する方法としては、例えば血液
においては、例えば採血針を指等に押し当て、動物の例
えば指等から採取される上記微量の血液を容器に滴下す
る方法、例えば髪、毛、爪においては、髪、毛、爪を細
切し、容器に添加する方法などにより検体の準備が行わ
れる。なお、核酸としてはＤＮＡ，ＲＮＡ、ゲノムなど
が挙げられる。

【０００７】本発明の核酸の抽出・増幅・解析方法は、
核酸抽出装置、核酸増幅装置および電気泳動装置を用い
て行う。本発明で用いられる核酸抽出装置、核酸増幅装
置および電気泳動装置は、特に限定されない。核酸抽出
装置としては、好ましくは、ジェネレーションキャプチ
ャーディスク（Generation Capture Disk、株式会社フ
ナコシ製）などを用いる。核酸増幅装置としては、好ま
しくは、ライトサイクラー（Light Cycler、米国、ロシ
ュ社製）などを用いる。なお、核酸増幅装置としては、
ライトサイクラー（Light Cycler、米国、ロシュ社製）
などのＰＣＲ装置の他に、ＲＴ−ＰＣＲ装置、常温での
核酸増幅装置などを用いることができる。電気泳動装置
としては、好ましくは、アジレント２１００バイオアナ
ライザー（Agilent 2100 Bioanalyzer、米国、Agilent
社製）または日立ＳＶ１２１０マイクロチップ電気泳動
（日立製作所製）などを用いる。なお、核酸を抽出・増
幅・解析するための（イ）核酸抽出装置、（ロ）核酸増
幅装置および（ハ）電気泳動装置は特に限定されること
なく、それぞれが（イ）抽出手段、（ロ）増幅手段、
（ハ）分離手段および検出手段を含む解析手段を具備す
るものならどのようなものであってもよい。本発明の分
析装置はこれらの手段を具備する一体型の自動分析装置
であってもよい。〔図１〕は、そのような全自動分析装
置の一例を示すブロック図である。該図で図示されるよ
うに、生物から採取した核酸を含有する検体を試料と
し、抽出手段によって試料から核酸を抽出し、抽出され
た核酸を増幅手段によって増幅し、増幅された核酸を分
離手段によって分離し、分離された核酸を検出すること
により、自動的に分析が行われ、少量のサンプルで分析
結果が迅速に得られうる。特に、核酸の抽出について
は、マイクロリットルオーダーの血液をディスク上に抽
出することができ、細胞から出てきたＤＮＡなどの核酸
が、ディスクに抽出されるまでの距離が短くなり、従来
のミリリッターあるいはサブミリリッターの量のサンプ
ルを抽出していた場合より高速化が達成できる。核酸の
増幅については、核酸の増幅のために、約９４℃から約
６８℃の温度設定を約３０回ほど繰り返すことが好まし
い。この温度の上昇と下降に要する時間が従来は長くか
かっていたが、本発明の実施態様は、サンプル量をマイ
クロリットルオーダーにすることができ、最大約１秒間
に約２０℃の速度で変化させることができるようにな
り、核酸増幅反応全体の時間を短縮できる。核酸の解析
については、核酸を電気泳動で解析する際に、マイクロ
メーターサイズのチップを使用することにより、従来よ
り高い電場を印加することが可能になり、高速化を達成
することができる。これは、従来の電気泳動では、高電
場印加に付随して発生する熱が大きく、高電圧を印加で
きなかったが、マイクロ化により熱の発生が押さえられ
ることに加えて、体積に対する比表面積がマイクロ化に
より大きくなり、熱の発散が効率的になったことによ
る。

【０００８】上記の生物から採取した血液、臓器、髪、
毛、皮膚、爪、組織、細胞などから核酸を抽出する方法
としては、例えばジェネレーションキャプチャーディス
ク（Generation Capture Disk、株式会社フナコシ製）
を用いて行われる。例えばＤＮＡを抽出する手段とし
て、ジェネレーションキャプチャーディスクを用いる場
合のより好ましい具体的な手順としては、下記の（１）
〜（４）の手順の組み合わせが挙げられる。（１）例え
ば、健康な被験者から約２〜５μＬ、好ましくは約３μ
Ｌの血液を採取し、約２ｍＬの遠心チューブに挿入され
ている約３ｍｍのキャプチャーディスク上に滴下し、数
分間室温におく。（２）ジェネレーションキャプチャー
ディスクキットのＤＮＡ精製溶液約２００μＬを、キャ
プチャーディスク上の血液に添加し、室温で好ましくは
１分間インキュベートする。（３）約１５０００ｒｐｍ
で好ましくは約１０秒間遠心分離し、集積チューブに洗
浄液を集める。さらに、（４）工程（２）および（３）
を繰り返して全体で３回洗浄し、ＤＮＡが固定化された
ディスクを調製する。

【０００９】上記で調製されたＤＮＡが固定化されたデ
ィスクを幾つかの断片、好ましくは４つの断片に分離し
て増幅キャピラリーに挿入し、反応液に浸透させる。Ｄ
ＮＡの増幅はライトサイクラー（Light Cycler、米国、
ロシュ社製）を用いて行われるのが好ましい。

【００１０】ＰＣＲ反応液は４℃で調製するのが好まし
く、ＰＣＲ反応液の成分は例えば以下の濃度で、反応液
の総量が約１０μＬとなるよう調製するのが好ましい。 ＰＣＲ反応液： 成分 最終濃度 水 バッファー １μＬ（３ｍＭ Ｍｇ^２＋） ｄＮＴＰ混合物 ４００ｍＭ プライマー １．０ｍＭ Ｔａｋａｒａ Ｚ−Ｔａｑ ５Ｕ／１００ｍＬ ＢＳＡ １ｍｇ／１００ｍＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ １μＬヒトゲノムＤＮＡ ３．０ｎｇ／ｍＬ 合計 １０μＬ

【００１１】ＰＣＲ反応は、初期変性反応を約９４〜９
８℃程度で、約０〜３０秒間程度、変性反応を約９４〜
９８℃程度で、約０〜５秒間程度、アニーリングおよび
伸長反応を約６８〜７２℃程度で、約０〜２０秒間程
度、好ましくは５秒間行うのが好ましく、反応全体に要
する時間は約３００秒（６分）以内であるのが望まし
い。

【００１２】ＰＣＲ反応後、反応キャピラリーを３００
０ｒｐｍで約５秒間遠心分離し、次の分析に用いる溶液
を得る。

【００１３】上記ＰＣＲ反応で得られた産物を解析する
方法としては、例えばアジレント２１００バイオアナラ
イザー（Agilent 2100 Bioanalyzer、米国、Agilent社
製）または日立ＳＶ１２１０マイクロチップ電気泳動
（日立製作所製）を用いて行うのが好ましい。なお、核
酸の解析は、通常分離と解析を含む。アジレント２１０
０バイオアナライザー（Agilent 2100 Bioanalyzer、米
国、Agilent社製）を用いる場合は、ＰＣＲ産物の混合
物を約１０５秒内で分析するのが好ましい。日立ＳＶ１
２１０マイクロチップを分析に用いる場合は、例えば５
０ｍＭトリス−ホウ酸を含む約０．３％（ｗ／ｗ）ＭＣ
を篩分けマトリックスとして用いるのが好ましく、８つ
のＰＣＲ産物をそれぞれ同時に約１１５秒内で分析する
のが好ましい。

【００１４】本発明の抽出、増幅および分析を行うのに
要する時間は、約１０〜２０分間、好ましくは約１０分
以内であるのが望ましい。

【００１５】

【実施例】以下、本発明の実施例および試験例を説明す
るが、以下の開示は本発明の好ましい実施例および試験
例にすぎず、本発明の技術的範囲を何ら限定するもので
はない。

【００１６】〔実施例１〕 血液からのＤＮＡの抽出 １．採血および操作 実験のための血液は、健康な男性からシリンジを用いて
採取し、５ｍｌの遠心チューブに−２０℃で保存した。
使用に先立って、３７℃ですばやく溶かして、使用まで
氷上で保存した。

【００１７】２．ＤＮＡ精製 ａ）３μＬの血液をピペット（ギルソン社（Gilson, In
c.）、ミドルトン（Middleton）、WIUSA）を用いて遠心
チューブから取り出し、次いでジェネレーションキャプ
チャーディスクキット(ゲントラシステムズ社（Gentra
Systems）、ミネアポリス(Minneapolis)、ミネソタ(Min
nesota)、米国)の２ｍｌのスピンチューブに挿入されて
いる３ｍｍディスク上に滴下した。血液は、少なくとも
１分間室温で吸収させた。 ｂ）２００μＬジェネレーションＤＮＡ精製溶液をスピ
ンチューブに挿入されているディスク上に添加し、室温
で１分間インキュベートした。 ｃ）チューブを４℃、１５０００ｒｐｍ、１０秒間遠心
分離し（ベックマンミクロフュージ Ｒ（Beckmann Mic
rofuge R）、ベックマン クルーター(Beckmann Coulte
r)、米国）、集積チューブに洗浄液を集めた。 ｄ）ｂ）およびｃ）工程を繰り返しジェネレーションＤ
ＮＡキャプチャー溶液を用いて全体で３回洗浄した。 ｅ）集積チューブ中の洗浄液を捨てると、増幅のための
固定化されたＤＮＡが得られた。

【００１８】〔実施例２〕ＤＮＡの増幅 １．試薬 ヒトゲノムＤＮＡテンプレートは、ロッシュモレキュラ
ーバイオケミカル社(Roche Molecular Biochemicals)か
ら購入した。β−グロブリン（ヒト）プライマーセッ
ト、Ｚ−Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）、１０
×Ｚ−Ｔａｑバッファー（Ｍｇ^２＋含有、３０ｍＭ）お
よびｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ）は、宝酒造
株式会社（滋賀県、日本）から購入した。ＳＹＢＲ Ｇ
ｒｅｅｎＩ（１００００×）およびＢＳＡ（２．５ｍｇ
／ｍＬ）は、それぞれモレキュラープローブス社（（Mo
lecular Probes, Inc.)、ユーゲン(Eugene)、米国）お
よびアイダホテクノロジー社（(Idaho Technology In
c.)、ソルトレイクシティ(Solt Lake City)、米国）か
ら購入した。サンプルの作成に使用されるＤＮアーゼ
（ＤＮａｓｅ）およびＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含有
しない水はＩＣＮバイオメディカル社（(ICN Biomedica
ls, Inc.)、オーロラ(Aurora)、米国）から購入した。

【００１９】２．プライマーセットの詳細 ６つのプライマーから適当な２つの組み合わせにより、
８つの特定のフラグメントを増幅した。６つのプライマ
ーを下記表に示す。

【表１】 また、８つの特定のフラグメントのｂｐ（塩基対）を下
記表に示す。

【表２】 それぞれの市販のプライマーは５００ｐｍｏｌである。
これらは５０μＬのＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを含有
しない水の中に最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌとなるように
溶解した。

【００２０】３．増幅混合物の調整 全ての試薬は−２０℃で保存した。使用前に溶解し、氷
上で保存した。Ｚ−Ｔａｑバッファー、Ｚ−Ｔａｑポリ
メラーゼ、ＢＳＡおよびＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩは使用
に先立ってＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを含有しない水
でそれぞれ１０倍、５倍、１０倍および１０００倍に希
釈した。増幅混合物は４℃で水、Ｚ−Ｔａｑバッファ
ー、ｄＮＴＰ混合物、プライマー、ＢＳＡおよびＳＹＢ
Ｒ Ｇｒｅｅｎ Ｉの順序で添加することにより調整し
た。増幅混合物はよく混ぜ合わせた。これをピペットを
用いてＰＣＲキャピラリーチューブに移した。ＤＮＡテ
ンプレートは、市販の溶液またはディスク上で固定化さ
れたＤＮＡのいずれかの形態で、キャピラリーチューブ
に添加した。固定化されたＤＮＡをテンプレートとして
使用する場合、ディスクを８つの断片に分け、その１断
片のみをキャピラリー（外径３６５μｍ）を用いて、キ
ャピラリーチューブの増幅混合物の表面下に挿入した。
最後に、キャピラリーチューブを４℃、３０００ｒｐ
ｍ、５秒間遠心分離し、反応溶液中に泡を作った。

【００２１】４．ＰＣＲ反応 反応混合物が入っているキャピラリーチューブをサンプ
ルカルーセル（carousel）にセットした。ガラスキャピ
ラリーチューブはＰＣＲ産物のリアルタイムフルオリメ
トリック検知（real-time fluorimetric detection）の
ためのキュベットの役目もする。ＰＣＲは設定温度でラ
イトサイクラー（Light Cycler、米国、ロシュ社製）に
より行った。増幅が終了した後、キャピラリーチューブ
を取り出した。キャピラリーチューブの蓋を開け、逆さ
にして遠心チューブに移し、４℃、３０００ｒｐｍで５
秒間遠心分離した。次に、増幅産物溶液をチューブに集
めた。

【００２２】５．サンプルの再使用 増幅産物を遠心分離した後、固定化されたＤＮＡのディ
スクはまだキャピラリーチューブに残っている。２０μ
ＬのＤＮＡ精製溶液を添加し、１５０００ｒｐｍ、５秒
間遠心分離し、ディスクを溶液中に沈めた。次に、ディ
スクを室温で１分間インキュベートした。キャピラリー
チューブを１５０００ｒｐｍ、５秒間遠心分離し、溶液
を捨てた。この操作をもう一度繰り返し、全体で２回洗
浄した。固定化されたＤＮＡを有するディスクは次のＰ
ＣＲ反応に使用できる。

【００２３】〔実施例３〕 １．ＰＣＲ産物の分析 ＰＣＲ産物は、アジレント２１００バイオアナライザー
（Agilent 2100 Bioanalyzer、米国、Agilent社製）ま
たは日立ＳＶ１２１０マイクロチップ電気泳動（日立製
作所製）を使用して分析した。両装置のパラメーター比
較を下記表に示す。

【表３】

【００２４】２．日立ＳＶ１２１０マイクロチップ電気
泳動を使用するＰＣＲ産物の分析この装置は１２サンプ
ルまで同時に分析できる。本分析では、８つのＰＣＲフ
ラグメントが同時に分析できた。０．３％メチルセルロ
ース（ＭＣ）（ｗ／ｗ）ポリマー溶液は、ＭＣを沸騰し
ているダブル−脱イオン水に添加し、溶液が均一で透明
になるまでゆっくり攪拌することにより調整した。硝酸
とトリスをこの操作の間に添加し、最終濃度を５０ｍＭ
／Ｌとした。染料（日立ｉ−ＤＮＡ１２キットから提
供）をポリマー溶液に１：９９の割合で加え、次に分離
のためによく混ぜ合わせた。染料を含有するポリマー溶
液２０μＬをウェルＧ１の中に添加し、ＳＶ１１００−
０２ゲル充填システムによって１２チャンネルの全てに
充填した。Ｇ２とＧ３もそれぞれ２０μＬのポリマーを
充填した。サンプルをｇ１〜ｇ１２に添加し、Ｓ１−Ｓ
１２に１０μＬのポリマーを充填した。１０μＬのサン
プルはそれぞれウェルＳ１−Ｓ１２に添加した。次い
で、チップを操作用に用意した。サンプルをウェルｇ１
−ｇ１２に６００Ｖで６０秒間注入する。他のウェルは
アースしてある。分離の間の電圧は、ウェルｇ１−ｇ１
２およびウェルＳ１−Ｓ１２では３５０Ｖ、ウェルＧ１
では１１００Ｖである。なお、Ｇ２とＧ３はアースして
ある。分析結果を〔図２〕に示す。

【００２５】アジレント２１００バイオアナライザーに
よるＰＣＲ産物の分析 ２５μＬのＤＮＡ染料をＤＮＡゲルマトリックス（アジ
レントDNA 500分析キットにより提供）に添加した。混
合物をよく攪拌し、スピンフィルターに移し、次いで５
０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。８つのＰＣＲ産
物を分析に供するため２：１：０．４：１：０．４：
１：１：２の割合で混合した。新しいＤＮＡチップをチ
ッププライミングステーション（chip priming statio
n）上に置いた。９μＬのゲル染料ミックスをピペット
を用い周期的にＧの標示のあるウェルに加えた。これを
プライマーステーション（primer station）のプランジ
ャー（plunger）を６０秒間押圧することによって、チ
ャンネルに充填した。９μＬのゲル−染料ミックスをＧ
の標示のあるウェルにピペットで移し、５μＬのゲル−
染料ミックスをラダー（ladder）で標示したウェルに添
加した。５μＬのマーカー（キット中にある）をそれぞ
れ１２サンプルのウェルの全てに加え、１μＬのＤＮＡ
ラダー（ladder）（キット中にある）をラダー（ladde
r）で標示したウェルに添加した。１μＬのサンプルを
それぞれ全てのサンプルウェルに添加した。チップをア
ダプターに入れ、１分間ボルテックスにかけた。最後
に、チップをアジレント２１００バイオアナライザーに
セットした。分析結果を〔図３〕に示す。

【００２６】〔試験例１〕β−グロブリン領域の１１０
ｂｐ断片を用いてジェネレーションキャプチャーディス
クの性質を調べた。ディスクを同じような大きさの４つ
の断片にわけ、テンプレートとして各ディスク上に固定
化されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。結果を〔図
４〕に示す。ＰＣＲ産物の収量から、それぞれの断片の
間に明らかな差異はみられなかった。

【００２７】〔試験例２〕次に、血液が吸収される時間
が固定化されたＤＮＡ量、および結果としてＰＣＲ産物
に及ぼす影響について試験を行った。血液を１分、１０
分、３０分および６０分間、それぞれディスク上で吸収
させた。同じ増幅条件でＰＣＲを行った結果、吸収時間
が長いとＰＣＲ産物がやや増加するという傾向がみられ
たものの、明らかな差異はみられなかった。結果を〔図
５〕に示す。サンプルの調製にかける時間は短くするの
が重要であることから、サンプルの調製時間を１分とす
ることとした。

【００２８】〔試験例３〕プライマーの濃度は、０．１
２５〜１μＭの範囲でＰＣＲ産物が明らかに増加した。
結果を〔図６〕に示す。従って、プライマーの濃度は１
μＭとした。

【００２９】〔試験例４〕キャプチャーディスクの再生
能について調べた。増幅を行うごとに反応溶液を遠心分
離で取り除き、２０μＬのＤＮＡ精製溶液を反応キャピ
ラリーに加え、室温で１分間インキュベートした。次に
該キャピラリーを再度遠心分離した。この手順を３回繰
り返し、次に増幅された混合物をＰＣＲを行うために反
応キャピラリーに添加した。結果を〔図７〕に示す。こ
の試験結果により、分離されたキャプチャーディスクの
再生能は、２回であることがわかった。

【００３０】〔試験例５〕コントロールテンプレートの
増幅条件の最適化について調べた。市販のＤＮＡテンプ
レートでヒトゲノムＤＮＡのβ−グロブリン領域のＰＣ
Ｒ条件の最適化を試みた。増幅混合物の成分と同様に、
温度およびそれぞれの増幅工程にかかる時間などの多く
の要素が最適化された。最適なＰＣＲ条件を選択するこ
とは、アジレント２１００バイオアナライザーを用いた
マイクロチップ電気泳動によるＰＣＲ産物を分析するこ
とにより行った。今回、２つの重要な結果を得た。結果
を以下に示す。 １．最短時間での増幅条件 初期変性反応 ９４℃ ０秒 変性反応 ９４℃ ０秒 アニーリングおよび伸長反応 ６８℃ ０秒 サイクル数 ３０ 反応全体の時間 ３３４秒 ＰＣＲ産物 β−グロブリン領域の２６８ｂｐ断片
１．６ｎｇ／μＬ ２．β−グロブリン領域の断片のＰＣＲプロトコール プロトコール成分 最終濃度 水 バッファー １μＬ（３ｍＭ Ｍｇ^２＋） ｄＮＴＰ混合物 ４００ｍＭ プライマー １．０ｍＭ Ｔａｋａｒａ Ｚ−Ｔａｑ ５Ｕ／１００ｍＬ ＢＳＡ １ｍｇ／１００ｍＬ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ １μＬヒトゲノムＤＮＡ ３．０ｎｇ／ｍＬ 合計 １０μＬ

【００３１】〔試験例６〕血液抽出方式について調べ
た。ジェネレーションキャプチャーディスクにつき検討
した。ディスク上の固定化されたＤＮＡ分布（これは、
次の実験でディスクを８つの断片に分割するためとても
重要である）、血液の吸収時間、増幅のためのプライマ
ー濃度（固定化されたＤＮＡ濃度はわからない）、固定
化されたＤＮＡを再利用する可能性などについて調べ
た。その結果、以下の結論を得た。 １．キャプチャーディスク上の固定化されたＤＮＡの分
布は均一化されていることが示された。 ２．血液の吸収時間は、吸収時間を長くしてもＰＣＲ産
物の収率において明らかな差異なかったため１分以下に
することができた。 ３．固定化されたＤＮＡを有するキャプチャーディスク
はＰＣＲ産物の収率を損なうことなく、２回目のＰＣＲ
のために再利用できた。

【００３２】〔試験例７〕血液から抽出されたＤＮＡの
増幅の迅速化を調べた。上記の性質に基づいて、血液か
ら抽出されたＤＮＡのＰＣＲの迅速化に成功した。固定
化されたＤＮＡ濃度はわからないけれども、適切なプラ
イマー濃度を調べたところ、１μＭが最適値であった。
しかしながら、固定化されたＤＮＡ濃度が低ければ、ア
ニーリングおよび伸長反応時間は充分な産物を得るため
に長くなる。アニーリングおよび伸長反応時間が１秒の
場合、０．３３ｎｇ／μＬでは全体の増幅時間は３５７
秒であった。しかしながら、非特定産物は特定産物と比
較して多かった。従って、アニーリングと伸長反応時間
の更なる延長が充分な量の特定産物を得るために必要で
ある。我々の実験結果は５秒が最適時間であることを示
した。１つのサンプルの増幅においては、全体の反応時
間は４９３秒である。８つのフラグメントを同時に増幅
するためには５３６秒である。これは、従来のゲル電気
泳動（一般に増幅に１時間かかる）と比較して大幅に速
い。

【００３３】〔試験例８〕マイクロチップ電気泳動によ
るＰＣＲ産物分析の迅速化について調べた。最近、マイ
クロチップ電気泳動が、多くの利点、特に早い分析速度
のためＤＮＡ分析において特に注目をあびている。我々
の実験では、マイクロチップ電気泳動で８つの増幅産物
の分析に成功した。日立ＳＶ１２１０では、５０ｍＭト
リス−ホウ酸を含む０．３％（ｗ／ｗ）ＭＣを篩分けマ
トリックスとして選択した。８つのフラグメントは１１
５秒以内で同時に分析できた。アジレントバイオアナラ
イザーでは、全ての増幅産物の混合物は１０５秒以内で
分析できた。

【００３４】

【発明の効果】本発明の抽出・増幅・解析方法および装
置を用いることにより、サンプルの使用量を少なくする
ことが可能となり、また従来の技術に要した時間と比べ
て極めて短時間のうちに核酸の抽出・増幅・解析を行う
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 抽出手段、増幅手段、分離手段および検出手
段から構成されている自動分析装置において、試料を抽
出手段に付して分析結果が分析手段から得られることを
示すブロック図である。

【図２】 日立ＳＶ１２１０によるＰＣＲ産物の分析を
示す。ピークは前方から後方に向かってそれぞれ１１
０、１６７、２０５、２５０、２６８、３２５、３４
５、４０８ｂｐである。

【図３】 アジレント２１００バイオアナライザーを使
用する、ＰＣＲ産物の混合物の分析結果を示す。

【図４】 β−グロブリン領域の１１０ｂｐ断片を用い
たジェネレーションキャプチャーディスクの性質を示
す。

【図５】 血液が吸収される時間が固定化されたＤＮＡ
量によりＰＣＲ産物に影響を及ぼすか否かについて行っ
た試験の結果を示す。

【図６】 最適なプライマー濃度を調べた結果を示す。

【図７】 キャプチャーディスクの再生能について調べ
た結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＺＮＡＭ 33/483 37/00 １０１ 33/53 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｇ０１Ｎ 37/00 １０１ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｅ (72)発明者 張 麗華 徳島県徳島市庄町１丁目27−８ コーポい ずみ16号室 Ｆターム(参考） 2G045 BB10 BB14 BB50 DA13 FB05 JA07 4B024 AA11 CA02 CA11 HA11 4B029 AA07 BB20 FA15 4B063 QA01 QA11 QQ42 QR08 QR14 QR48 QR62 QR82 QS25

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物から採取した核酸を含有する検体を
   核酸抽出装置に付して検体から核酸を抽出し、この核酸
   を核酸増幅装置に付して増幅し、ついで増幅された核酸
   を電気泳動装置に付して核酸解析することを特徴とする
   迅速な核酸の抽出・増幅・解析方法。
2. 【請求項２】 核酸抽出装置がジェネレーションキャプ
   チャーディスク（Generation Capture Disk、株式会社
   フナコシ製）であり、核酸増幅装置がライトサイクラー
   （Light Cycler、米国、ロシュ社製）であり、電気泳動
   装置がアジレント２１００バイオアナライザー（Agilen
   t 2100 Bioanalyzer、米国、Agilent社製）または日立
   ＳＶ１２１０マイクロチップ電気泳動（日立製作所製）
   であることを特徴とする請求項１に記載の抽出・増幅・
   解析方法。
3. 【請求項３】 核酸がヒトゲノムβ−グロブリン領域を
   含有することを特徴とする請求項１または２に記載の核
   酸の抽出・増幅・解析方法。
4. 【請求項４】 所要時間が２０分以内であることを特徴
   とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸の抽出・
   増幅・解析方法。
5. 【請求項５】 核酸抽出手段、核酸増幅手段および電気
   泳動手段を具備していることを特徴とする分析装置を使
   用する核酸の抽出・増幅・解析方法。
6. 【請求項６】 核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであることを
   特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の核酸の抽
   出・増幅・解析方法。
7. 【請求項７】 抽出・増幅・解析の対象がゲノムである
   ことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の核
   酸の抽出・増幅・解析方法。
8. 【請求項８】 生物から採取した核酸を含有する検体か
   ら核酸を抽出する抽出手段、抽出された核酸を増幅する
   増幅手段、増幅された核酸を分離する分離手段および分
   離された核酸を検出する検出手段を具備することを特徴
   とする核酸の分析装置。