JP2016524921A - 核の保存方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、核を周囲温度で保存するのに使用され得る方法及びキットであって、機器費用及び運転費用を削減し、ワークフローを簡略化する利点を有する方法及びキットに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、核酸保存の分野に関し、特に、核の長期保存及び核酸の回収に関する。本発明は、核を捕捉して周囲温度で保存し、洗浄緩衝液による受動洗浄によって核酸を単離するのに使用され得る方法及びキットを提供する。本発明は、核酸の長期保存及び容易な処理に適用されるものであり、遺伝子型決定、診断及び科学捜査に特に有用である。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの遺伝子分析で使用するための形態でＤＮＡ又はＲＮＡを抽出及び単離する前に、ろ紙又は化学修飾マトリックス上で核酸を長期保存、輸送及び保管することは、遺伝物質を保存するための周知技術である。したがって、欧州特許出願公開第１５６３０９１号（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｗｈａｔｍａｎ）は、細胞又は細胞溶解物などのサンプルから核酸を保存するための方法に関する。核酸は単離され、多種多様なフィルタ及び他の種類の固体支持体又は固相媒体上において、室内温度及び室内湿度で長期間保存される。また、この文献には、チューブ、カラム又はマルチウェルプレート内の広範囲の固体支持体マトリックス上において、核酸含有サンプルを保存するための方法が記載されている。

国際公開第９００３９５９号（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）には、ＤＮＡ（結合ＤＮＡを含む）を保存するためのセルロース系固体支持体であって、マトリックス内に組み込まれているか、又はマトリックス上に吸着しているＤＮＡの分解を防ぐ化合物又は組成物を有する固体マトリックスを含むセルロース系固体支持体が記載されている。また、この文献には、固体媒体を使用してＤＮＡを保存するための方法、及びＤＮＡを回収するための方法、及びＤＮＡをインサイチューで使用するための方法が開示されている。

米国特許第５７０５３４５号（Ｌｕｎｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）には、細胞を含有するサンプルを溶解して核酸を放出させ、シクロデキストリンでサンプルを処理して抽出剤を中和する核酸調製方法が記載されている。この方法の利点は、溶解試薬を除去するのに必要な分離工程が不要なことである。

英国特許出願公開第２３４６３７０号（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）には、核酸を含有する細胞サンプルをフィルタに適用すること、細胞を溶解すること、次いで、混入物質を除去しながら核酸をフィルタ上に保持することを含む方法が開示されている。

国際公開第９６１８７３１号（Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ）には、サンプルを固体支持体に結合させ、サンプルを洗浄剤と接触させ、続いて、核酸を単離するための工程を実施する核酸単離方法が記載されている。

国際公開第００５３８０７号（Ｓｍｉｔｈ）には、遺伝物質を含有するサンプルを保存及び溶解するための媒体であって、溶出及び分析することができる媒体が開示されている。この媒体は、溶解試薬でコーティングされ、場合により、弱塩基、キレート剤、界面活性剤又は尿酸でコーティングされる。

生物学的サンプルの周囲保存は、低温保存の優れた代替方法と見られている。ＦＴＡ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、約１００〜２００ｎｇの小サンプルサイズのＤＮＡを保存するのに使用され得る。しかしながら、より多くのサンプル容量を周囲温度で保存する必要性が高まっている。いくつかの国際的な前向き研究では、生活環境とライフスタイルと疾患発症の遺伝的特徴との間の関連を調査するために、何千人もの参加者を募集している。例えば、食事及び癌に関するＥＰＩＣ前向き研究、並びにＣａｎａｄｉａｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ ｆｏｒ Ｔｏｍｏｒｒｏｗ Ｐｒｏｊｅｃｔ。これらの研究では、発症時における参加者の詳細な分析と、将来のいつかの時点における重大な致命的疾患の診断後のその後のＤＮＡ分析とに依拠している。大規模なコホート研究を行う場合、進化した現代の技術を使用してサンプルを遺伝子分析するためには、４ｍｌ以上の適度な血液量が必要である。理想的には、サンプルは、他の重要な分子（例えば、長い非コードＲＮＡ）のさらなる調査を可能にする材料を含有しなければならない。したがって、現在及び将来の分析研究のために、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び多数の他のタンパク質を含有する大量の細胞核を周囲温度で保存するための手段が必要である。

これまでの核捕捉デバイスには、Ｎｕｃｌｉｔｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；米国特許第５，４４７，８６４号，Ｋｅｎｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．に記載されている）が含まれていた。このデバイスは、最大１０ｍｌの新鮮な血液を処理するピペットのチップのマイクロフィラメントウィーブからなる。血液は、制御された溶解を受ける；細胞膜を溶解して、核膜の大部分を無傷にする。チップ内に入る前にサンプルがろ過されて、サンプル中に存在するＤＮＡ及び核がフィルタに結合するように、平面処理した膜をＮｕｃｌｉｔｉｐピペットチップの外側に配置して、チップの開口部を完全に覆う。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でピペットチップを洗浄して、混入物質を除去する。米国特許第５，４４７，８６４号には、ｎｕｃｌｉｔｉｐ法を使用して細胞の細胞成分を分離する方法と、−２０℃以下の膜上で長期間にわたって、及び４℃に維持する場合には短期間にわたって核を保存する可能性とが記載されている。しかしながら、この文献には、細胞核を周囲温度で長期保存することは開示も示唆もされていない。加えて、この文献では、核膜を溶解するために、標準的な核酸抽出技術を使用すること（界面活性剤の使用を含む）が示唆されている。

したがって、大量の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を捕捉して周囲温度で保存するための改善かつ簡略化された方法が必要である。本発明はこの問題に対処し、固体支持体、特にセルロース系支持体から核酸を単一工程で保存及び単離するのに使用され得る方法及びキットを提供する。

国際公開第２００４／０３３４７０号

本発明の第１の態様によれば、細胞核を保存するための方法であって、
ｉ）細胞サンプル中に存在する細胞質膜及び核膜の一部分を選択的に溶解して、細胞核の大部分を無傷にすること、
ｉｉ）細胞サンプルを固体支持体上に回収すること、
ｉｉｉ）固体支持体を洗浄すること、及び
ｉｖ）固体支持体上の無傷核を周囲温度で保存すること
を含む方法が提供される。

無傷核を周囲温度で１日間、１週間、１カ月間、２カ月間、６カ月間、１２カ月間、１年間、２年間、５年間、１０年間、１５年間又は２０年間保存し得る。

一態様では、無傷核は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含有する。

別の態様では、方法は、工程ｉｉｉ）の後かつ保存工程ｉｖ）の前に、固体支持体を有機溶媒に浸漬する工程をさらに含む。適切な有機溶媒としては、限定されないが、エタノール又はイソプロパノールなどのアルコールが挙げられる。

さらなる態様では、固体支持体は、工程ｉｖ）の前に、固体支持体を空気乾燥する。

一態様では、溶解試薬を固体支持体に追加し、続いて、インサイチューで乾燥して、核酸を保存する。

別の態様では、溶解試薬は、陰イオン界面活性剤又は洗浄剤を含む。陰イオン界面活性の例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム及びステアリン酸ナトリウムが挙げられる。

さらなる態様では、細胞サンプルは、１ｍｌ超の容量を有する。場合により、細胞のサンプルは、５ｍｌ超の容量を有し得る。場合により、細胞のサンプルは、１０ｍｌ超の容量を有し得る。

一態様では、固体支持体は、透過膜である。

別の態様では、固体支持体は、ポリエステル膜、ポリアミド膜、ポリカーボネート膜及びセルロース膜からなる群より選択される。

さらなる態様では、固体支持体は、ポリエステル膜である。

一態様では、固体支持体は、ピペットチップに取り付けられている。この態様では、固体支持体は、ポリエステル膜であり得る。

別の態様では、ピペットチップは、Ｎｕｃｌｉｔｉｐである。

さらなる態様では、方法は、例えば、膜上で核を溶解することによって、核から核酸を回収するさらなる工程ｖ）を含む。

一態様では、膜は、洗浄緩衝液による受動洗浄を受ける。

別の態様では、遠心分離によって核酸を回収する。

さらなる態様では、洗浄液を固体支持体に流すことによって、工程ｉｉｉ）を実施する。

本発明の第２の態様によれば、細胞核を周囲温度で保存するためのキットであって、固体支持体と、本明細書に記載される方法を行うための説明書とを含むキットが提供される。キットは、細胞質膜及び核膜を溶解するための溶解試薬を場合により含み得る。

Ｎ１及びＮ２は、マイクロ遠心機で短時間スピンすることによって、Ｎｕｃｌｉｔｉｐから回収した高分子量ＤＮＡであり、Ｍは、ＤＮＡ分子量マーカーであり、Ｓ１及びＳ２は、プロテアーゼ消化後かつ穏やかな洗浄前に、上記各Ｎｕｃｌｉｔｉｐの膜から取り出した溶液である。Ｓ１及びＳ２では、ごくわずかな核酸（エチジウムブロミドの蛍光）が見られることに留意すべきであり、これは、消化中に、高分子量ＤＮＡが膜上に保持されたことを実証している。穏やかな洗浄は有効であり、保持されたＤＮＡを除去しない。マイクロ遠心機で短時間高速スピンすることは、レーンＮ１及びＮ２に示されている粘性の高分子量ＤＮＡを除去するのに有効である。 図２は、本発明に記載されるｎｕｃｌｉｔｉｐ法を使用して処理したＮ１及びＮ２ ＤＮＡサンプルの両方の結果を示す。写真は、未切断ＤＮＡ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍＨ１で消化したＲｏｃｈｅ対照ＤＮＡ、並びにＮ１及びＮ２サンプルを示す。示されている結果は、ゲノムサンプルを損なわずに、濃縮した濃縮核を室温で保存することが可能であることを実証している。

定義
特許請求の範囲に記載されている主題をより明確かつ簡潔に説明及び指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語について、以下の定義を提供する。本明細書を通して、特定の用語の例示は、非限定的な例としてみなされるべきである。

本明細書で使用される語句「保存」は、核酸を安定状態で維持又は保存する過程を説明するために使用される。

用語「溶解」は、本明細書では、核膜を含む細胞膜又は小細胞膜などの構造を破裂、変性又は穿刺する過程を説明するために使用される。

本明細書で使用される用語「細胞サンプル」は、本明細書では、細胞物質を含有する液体サンプルを指すために使用される。細胞物質は、核を含有する任意の適切な真核生物、例えばヒト、動物、植物、鳥類、昆虫及び魚類に由来し得る。細胞物質は、例えば、血液、唾液、尿、血漿であり得る。

本明細書で使用される用語「周囲温度」は、１０℃〜３０℃、好ましくは１５℃〜２６℃、より好ましくは１８℃〜２３℃の範囲内の温度を意味する。

本明細書で使用される用語「固体支持体」は、限定されないが、セルロースベース系製品、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ポリエステル、ポリアミド及びポリカーボネート又はそれらの任意の組合せを含む。本発明の固体支持体は、多孔性であり得る。

本明細書で使用される「核酸」は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）及びＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）並びに組換えＲＮＡ及びＤＮＡ分子、又はヌクレオチド類似体を使用して作製するＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体、又はそれらの混合物のすべての形態を指す。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。
使用した化学物質及び材料
化学物質及びその供給業者のリストを以下に示す：
ＥＤＴＡチューブに採取されたヒト全血（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ）。

下記成分を混ぜ合わせることによって、スクロース／ｔｒｉｔｏｎ赤血球溶解緩衝液（１００ｍｌ）を調製し、滅菌蒸留水で１００ｍｌにした：
−スクロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓ７９０３）−１１．０ｇ
−１０ｍＭトリスｐＨ８．０（１０ｍｌ／Ｌの１Ｍ原液）（Ｓｉｇｍａ，Ｔ３０３８）−１ｍｌ
−５ｍＭ ＭｇＣｌ２（１．０２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ）（Ｍｅｒｃｋ，１．０５８３３）−１００ｍｇ
−１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（１０ｇ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ，Ｔ９２８４）−１ｇ；
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＡＡ，Ｈ１５−００２）；
Ｎｕｃｌｉｔｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；
Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８−９０４２−７４）；トリスＥＤＴＡ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及び１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｔ９２８５−１００ｍｌ）；０．８％アガロース／ＴＡＥゲル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ｐａｒｔ ＃７５８１７）；エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ，Ｅ１５１０）；対照ゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ，１１６９１１１２００１）；Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢａｍ Ｈ１制限エンドヌクレアーゼと各制限緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０１０４Ｔ及びＲ０１３６Ｔ）；限定ではなく例示として、以下の実験結果及び実施例を示す：
実験結果
ゲル電気泳動を使用したｎｕｃｌｉｔｉｐからのＤＮＡ測定。

２ｍｌの血液を採取し、等量の赤血球溶解緩衝液に追加した。サンプルを旋回させ、短時間回転混合し、ベンチ上に３分間放置した。複数のｎｕｃｌｉｔｉｐを使用してサンプルを採取し、核を捕捉した。膜全体のあらゆる場所にポンピングされる際の溶解血液の吸引及び排出を遅らせることによって、ポリエステル膜の閉塞が明白になるまで、血液を採取した。

ピペットのプランジャーを押し下げ、膜がヘムを実質的に含まなくなるまで、膜全体のあらゆる場所に液体をポンピングすることによって、新鮮なリン酸緩衝生理食塩水でチップを順次洗浄した。

洗浄液を排出し、ピペットからチップを取り外し、ベンチトップマイクロ遠心機（１２００ｒｐｍ、半径約７ｃｍ）で簡単に１０秒間スピンして、残った液体を除去した。次いで、さらに乾燥するために、チップをデシケーターキャビネットに一晩入れた。

翌日、核を含有する３つの乾燥チップを１．５ｍｌマイクロ遠心チューブにそれぞれ直接保存し、１００ｕｌの無水エタノールで他の３つのチップを処理し、膜上に直接ピペッティングした。チューブの蓋を閉めて、チューブを実験室の戸棚に周囲温度（約１５℃〜２５℃）で６０日間保存した。
ｎｕｃｌｉｔｉｐの長期保存後のサンプル処理。

デカント及びパルススピンして膜を乾燥することによって、エタノールに浸漬したチップからエタノールを除去した。

Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｋｉｔの溶解溶液Ｉを使用して、エタノール処理チップ及び乾燥処理チップの両方の膜に捕捉されている乾燥した核から、ゲノムＤＮＡを溶解、消化及び除去した。

凍結乾燥プロテイナーゼＫ（３ｍｇ）を１．５ｍｌの滅菌蒸留水に溶解して、２０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ溶液を調製し、この溶液２０ｕｌを１００ｕｌの溶解１緩衝液に追加した。溶解緩衝液を含有する５０ｕｌのプロテアーゼをＮｕｃｌｉｔｉｐの乾燥膜上に直接ピペッティングした。次いで、チューブを閉じて、５５℃の水浴に３０分間入れた。

次いで、チューブを開けて約３００μｌのＴＥ^-1緩衝液を、チューブのスライドの下部及びチップのバレルの内部に追加して、溶解緩衝液及び消化ペプチドを洗い流した。チューブをベンチ上に２分間放置してから、洗浄溶液をデカントした。この過程を２回繰り返してから、５０μｌのＴＥ^-1緩衝液を各チューブに追加し、最大速度（１２，０００ｒｐｍ）のマイクロ遠心機で１分間スピンして、ゲノムＤＮＡを収集した。

各デバイスから回収したＤＮＡ溶液は、約７０μｌの高粘性の無色透明溶液であった。第１の洗浄溶液を追加する前に、消化後の膜の上側の溶液を吸引保持した。回収したｇＤＮＡサンプルのサンプルと一緒に、０．８％アガロース／ＴＡＥゲル上でこの溶液を泳動し、エチジウムブロミドで染色した（図１）。サンプルＳ１及びサンプルＳ２については、ごくわずかな核酸の染色が検出され、タンパク質分解中に、ごくわずかな核酸が膜から放出された。穏やかに洗浄した後、マイクロ遠心機で短時間高速スピンすることによって、精製された高分子量ＤＮＡを回収することができたことから、Ｎ１及びＮ２について、ゲル上におけるエチジウムブロミドの強い蛍光によって示されているように、記載の方法は、膜から核酸の大部分を収集するのに有効であった。

ＤＮＡの濃度及び品質を決定するために、長時間ボルテックス（粘性を解消するため）した後に各チューブから少量のサンプルを取り出し、ＮａｎｏＶｕｅ Ｐｌｕｓ分光光度計で読んだ。結果は以下の表１に示されており、存在する核酸の品質及び濃度が高いことを実証している。Ｎ１のゲノムＤＮＡの濃度は１３４ｎｇ／ｕｌであり、Ｎ２のゲノムＤＮＡの濃度は８６ｎｇ／ｕｌであった。

乾燥保存した核から回収したゲノムＤＮＡの酵素消化。

２０ｕｌの総容量において、４０単位のＢａｍＨ１又はＨｉｎｄ ＩＩＩエンドヌクレアーゼのいずれかで１０ｕｌの各サンプルＮ１（１．５ｕｇ）及びＮ２（１ｕｇ）並びに対照サンプルＲｏｃｈｅ ＤＮＡ（２ｕｇ）を消化し、３７℃で３時間保存した。図２に見られるように、０．８％アガロース／ＴＡＥゲル上で、既知分子量のＤＮＡマーカーに対して、切断ＤＮＡ及び未切断ＤＮＡを泳動し、エチジウムブロミドで染色した。示されている結果は、ゲノムサンプルを損なわずに、濃縮した濃縮核を室温で保存することが可能であることを実証している。開発した方法によって、濃度が５０ｎｇ／ｕｌ超であり、ほぼ１．８のＡ２６０：Ａ２８０吸光度比を有し、制限エンドヌクレアーゼ消化のような下流の操作に適切である高品質な高分子量ゲノムＤＮＡを生産することができる。

本発明の好ましい例示的な実施形態を説明したが、当業者であれば、限定ではなく例示目的で示した記載されている実施形態以外によって、本発明を実施し得ることを認識するであろう。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (23)

1. 細胞核を保存するための方法であって、
   ｉ）細胞サンプル中に存在する細胞質膜及び核膜の一部分を選択的に溶解して、細胞核の大部分を無傷にすること、
   ｉｉ）細胞サンプルを固体支持体上に回収すること、
   ｉｉｉ）固体支持体を洗浄すること、及び
   ｉｖ）固体支持体上の無傷核を周囲温度で保存すること
   を含む、方法。
2. 無傷核が核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｉｉｉ）の後かつ保存工程ｉｖ）の前に、固体支持体を有機溶媒に浸漬する工程をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 工程ｉｖ）の前に、固体支持体を空気乾燥する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
5. 溶解試薬を固体支持体に追加し、続いて、インサイチューで乾燥して、核酸を保存する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
6. 溶解試薬が陰イオン界面活性剤又は洗浄剤を含む、請求項５に記載の方法。
7. 陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項６に記載の方法。
8. 細胞サンプルが１ｍｌ超の容量を有する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. 細胞サンプルが５ｍｌ超の容量を有する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 細胞サンプルが１０ｍｌ超の容量を有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の方法。
11. 固体支持体が透過膜である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 固体支持体が、ポリエステル膜、ポリアミド膜、ポリカーボネート膜及びセルロース膜からなる群より選択される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 固体支持体がポリエステル膜である、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 固体支持体がピペットチップに取り付けられている、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 固体支持体がポリエステル膜である、請求項１４に記載の方法。
16. ピペットチップがＮｕｃｌｉｔｉｐ（商標）である、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
17. 核から核酸を回収するさらなる工程ｖ）を含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 膜上で核を溶解することによって、核酸を回収する、請求項１６に記載の方法。
19. 膜が、洗浄緩衝液による受動洗浄を受ける、請求項１７に記載の方法。
20. 遠心分離によって核酸を回収する、請求項１６乃至請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 洗浄液を固体支持体に流すことによって、工程ｉｉｉ）を実施する、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 細胞核を周囲温度で保存するためのキットであって、固体支持体と、請求項１乃至請求項２１のいずれか１項に記載の方法を行うための説明書とを含む、キット。
23. 溶解試薬をさらに含む、請求項２２に記載のキット。