JP2006501850A - 核酸精製システムの媒体上に核酸を保存するツールとして、化学物質を用いる方法および材料 - Google Patents

核酸精製システムの媒体上に核酸を保存するツールとして、化学物質を用いる方法および材料 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞試料または細胞溶解物などの、核酸を含有する試料から、核酸を単離および保存する方法に関する。核酸は、固相媒体上で単離され、その後、この固相媒体は乾燥される。そして、上記核酸は、種々のフィルターや他の固相媒体を含む、カラム、チューブ、および多穴プレート内で、数日間、数週間、および数カ月間を含む長期間、効果的に保存されうる。本発明は、試料から核酸を単離および保存する方法を提供するものである。当該方法は、固相媒体に試料を供し、細胞を固定し、細胞保持物を溶解し、上記固相媒体を乾燥させ、核酸を保持し、長期間、室温・室内湿度で、核酸を保存し、随意的に核酸を溶出するものである。本発明は、市販されている多くのチューブ、カラム、または多穴プレート内の、様々な固相媒体上で、核酸を含む試料を保存する方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、２００２年１０月４日に仮出願がなされた、米国仮出願特許第６０／４１６３５６に基づき優先権を主張するものである。なお、参考として、本明細書に、その内容を織り込む。
〔発明の分野〕
本発明は、核酸を含む試料、例えば、細胞試料、または細胞溶解物由来の核酸を保存する方法に関する。核酸を単離し、その核酸を、種々のフィルターおよびその他のタイプの固相媒体上で、長期間、室温・室内湿度で効率的に保存することができる。本発明は、一般的に利用されているチューブ、カラム、多穴プレート等の種々の固相媒体上で、核酸を含む試料を保存する方法を提供する。
〔発明の背景〕
遺伝子型の特徴づけ（genotyping）は、疾病に特有の対立遺伝子、および／または親からの遺伝の結果として発生する変異に関連するある個人の染色体を特定する専門の分野である。遺伝子型を特徴づける過程において、ヒトのゲノムＤＮＡを迅速に精製することは、必須要素の一部である。ある個人の上記ゲノムＤＮＡとは、発現しているすべての対立遺伝子の完全ＤＮＡ配列の構造単位である。
ヒトのＤＮＡの塩基配列決定は、複雑な作業である。変異部分や、疾病に特異的な配列を含む可能性のある染色体領域の塩基配列分析を行うためには、まず、ＰＣＲ法などで選択領域を増幅する。そして、その増幅産物を用いて塩基配列決定法が行われる。増幅される染色体の選択領域は、ＰＣＲによる増幅で用いられる特定配列を含むプライマーによって決定される。なお、このプライマーは、疾病を引き起こす配列が特定の染色体上にあることを調べるために、関連した研究で用いられるものである。遺伝子型の特徴づけに用いられるプライマーセットは、一般に市販されているもので、染色体の研究に用いられる代表的なものである。染色体の長さは長いので、一被験者からのゲノムＤＮＡテンプレートに対して、何回もＰＣＲ反応が行われる。
アガロースから種々の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ミトコンドリアや葉緑体のＤＮＡ、種々のＲＮＡなど）を精製する、比較的迅速で便利な方法が開発されている。しかしながら、より複雑な出発試料、例えば、細胞や細胞溶解物から直接、核酸を抽出することは、依然として困難な作業である。概して、細胞または細胞溶解物を含む、核酸を含有する試料から、核酸を精製するために、現在行われているほとんどの方法は、依然として多大な時間と労力とを要する。さらに、単離された核酸の保存では、通常、冷蔵庫、好ましくは冷凍庫内で、溶液の状態の核酸を入れた試薬ビンを保管する必要がある。したがって、長期間に渡り、多量の試料を保存するには、広大な保存専用の冷凍庫のスペースが必要となる。これらの保存に必要なものは、多大なエネルギーを消費することとなり、費用がかさむ。そのために、上記分野において、核酸の単離を行うことは、困難に、または、時としては不可能である。
そこで、複雑な試料から核酸を単離するために、従来用いられている方法において、困難で時間がかかる工程を最小限にする試みがなされている。そのような方法の１つが、欧州特許第０３８９０６３号で述べられている。欧州特許第０３８９０６３号に開示されている方法は、細胞試料、例えば、血液を、カオトロピック物質、並びにシリカまたはその誘導体を含む微粒子の核酸結合性固相と共に混合する工程を含んでいる。カオトロピック物質の存在下において、核酸は細胞より放出され、シリカベースの核酸結合性固相に結合することが知られている。続いて、核酸を有する固相を沈殿させるために、上記混合物を遠心分離する。そして、上清を捨てる。上記の沈殿した物質を、カオトロピック剤および有機溶媒を用いた数段階の洗浄工程にかける。最後に、ＤＮＡを低塩緩衝液で、上記固相から溶出する。
欧州特許第０３８９０６３号に述べられている方法には、手作業による部分が多く、たくさんの工程が含まれるという不都合がある。また、この方法には、遠心分離工程および容器に移し変える工程が多く含まれることから、自動化には不適当である。さらに、溶出されたＤＮＡは、やはり溶液で、低温度下に保存する必要がある。
米国特許第５１８７０８３号および第５２３４８２４号には、それぞれ、細胞を含む生物学的試料から、相当に純度の高いＤＮＡを迅速に得る方法が述べられている。これらの方法には、高分子状態のゲノムＤＮＡを含む細胞溶解物を得るために、穏やかに細胞膜を溶解する工程が含まれる。その後、高分子のＤＮＡを選択的にフィルター上に捕捉するために、上記溶解物を多孔性フィルターに通す。その後、水溶液を用いて、ＤＮＡをフィルターから遊離させる。
種々の方法を用いて、ヒトのゲノムＤＮＡの精製を容易にする試みが行われている（Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989)）。その結果、多くの商用キット製造業者が、これらの方法に用いられる製品を提供している。その例として、AmpReadyTM （Promega, Madison, Wisconsin）、 DNeasyTM （Qiagen, Valencia, California）、Split SecondTM （Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana）が挙げられる。これらの製品は、ゲノムＤＮＡ分子の単離を迅速に行うために、専用のマトリクスや緩衝液システムを使用しなければならない。
最近では、多数の核酸と同様に、ゲノムＤＮＡを精製するツールとして、微細多孔性フィルターをベースにした技法を用いる試みがなされている。このフィルターベースのマトリクスの利点は、チューブ、スピンチューブ、シート、および多穴プレートを含む多くの規格に合わせることができるということである。精製の補助マトリクスとしての微細多孔性フィルター膜は、上記技術において、その他の利点も有する。上記フィルター膜を用いることで、小型で取り扱いが簡単なシステムを提供することができる。さらに、上記システムは、所望の分子の捕捉と流体相（fluid phase）の不要物質の除去を、カラムクロマトグラフィーを用いてできるよりもよりハイスループット（high throughput）で、かつより短い処理時間で行うことを可能とする。これは、フィルター膜上では、高い拡散速度が実現できるからである。
通常、単純な吸着を通して、またはフィルター膜上あるいはフィルターに結合したリガンド上に存在する相補的な反応基との間で化学反応し、上記リガンドと上記所望の核酸との間で共有結合を形成することによって、核酸分子は、フィルター膜上に捕捉される。
非共有結合的に核酸を固定するために用いられる多孔性フィルター膜の材料には、ナイロン、ニトロセルロース、疎水性のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、およびガラスミクロ繊維のような物質が含まれる。また、オリゴヌクレオチドやプライマーなどの核酸を、固相支持体上に直接結合させるための方法および試薬が、たくさん開発されている。ＤＮＡのＵＶ架橋形成（Church et al. , PNAS, vol. 81, page 1991,1984）、Generation Capture Column Kit（Gentra Systems, Minneapolis, MN）、およびＲＮＡのナイロン膜への吸着もまた、報告されている。
核酸のような分子をフィルター膜上に固定するために、多くの化学的手法が用いられている。例えば、活性紙（activated paper） (TransBindTM, Schleicher & Schuell Ltd., Keene, N.H.)、カルボジイミダゾール活性化ヒドロゲルコーティングＰＶＤＦ膜（carbodimidazole-activated hydrogel-coated PVDF membrane） (Immobilin-IAVTM, Millipore Corp., Bedford, Mass.)、ＭＡＰ紙（MAP paper） (Amersham, Littlechalfont Bucks, Wisconsin)、活性ナイロン（activated nylon） (BioDyne, Pall Corp., (Glen Cove, N. Y. )、DVS-および臭化シアン−活性化ニトロセルロース（cyanogen bromide-activated nitrocellulose）が挙げられる。特定のリガンドと結合した膜としては、ビオチン化した分子のストレプトアビジンに対する親和性に基づいて、ビオチン化した分子に結合するSAM2 Biotin Capture Membrane (Promega)、または、MAC affinity membrane system (protein A/G) (Amicon, Bedford, Massachusetts)などが知られている。活性化した膜に生体分子を共有結合により結合させることには、以下のような不利点がある。
（ａ）分子の固定がゆっくりであることが多く、反応が終了するまでに、２０分から１８０分が必要である。
（ｂ）固定を短時間で行うには、リガンドと生体分子が高濃度である必要がある。
（ｃ）固定反応中に、一定の撹拌が必要とされるが、この撹拌により生体分子が変性および不活性化する恐れがある。
（ｄ）ひとたび、固定反応が終了すれば、残存する共有結合形成能を除去するために、ブロッキング工程（キャップ形成工程）を行う必要があることがよくある。
（ｅ）共有結合した分子は、フィルター膜から取り除くことができない。
法医学などの様々な特定分野では、危険な化学反応や、長時間におよぶ反応時間を必要とせずに、高い特異性で膜上に固定化することが可能な、核酸固定媒体および方法が必要とされる。このような方法は、犯罪現場での血液試料の保管や、その他の関連した使用法に用いられる。特に、法医学の分野においては、フィルター膜マトリクス上の流体相の混合物から核酸を捕捉および分離する必要がある。
種々の用途において、フィルター膜マトリクス上に結合した核酸を、保存または保管することができる方法（ability）に特に注目が注がれている。また、流動体の形状を必要とする用途においては、核酸を抽出することができる膜が用いられる。なお、本発明においては、これら両方のタイプの実施形態が記載されている。
米国特許第５４９６５６２号、第５７５６１２６号、および第５８０７５２７号に基づくと、核酸または遺伝物質を、セルロースベースの乾燥した固体支持体またはフィルター（ＦＴＡ（登録商標）フィルター）に固定できることが示されている。
そこで述べられている固体支持体は、いくつかの機能を発揮することかできる化学化合物を用いて、調整されている。上記機能とは、（ｉ）接触により無傷な細胞材料を溶解し、遺伝物質を放出させる機能、（ｉｉ）（通常は、機械的およびカオトロピック物質の組み合わせによって）固体支持体への遺伝物質の固定を容易にする状態を作りだす機能、（ｉｉｉ）分解、エンドヌクレアーゼ活性、紫外線の干渉、および微生物の攻撃により、遺伝物質が損傷することなく、安定した状態に、固定化された遺伝物質を維持する機能、および（ｉｖ）いかなる後続の処理中にも、上記固体支持体から除去されることがない支持体結合分子として、遺伝物質を維持する機能である（Del Rio et al (1995) BioTechniques. vol. 20: 970-974）。
ＦＴＡ（登録商標）フィルターを用いると、核酸を長期間にわたり、安定して保存することができる。例えば、ＦＴＡ（登録商標）カードを用いると、室温で長期間に渡り、ＤＮＡ試料を保管することができる。いわゆる、米国特許第５４９６５６２号、第５７５６１２６号、および０７５２７号で述べられているＦＴＡ（登録商標）セルロース系フィルター材料の有用性は、様々な核酸技法、例えば、細菌のリボタイプ（ribotyping）(Rogers, C. & Burgoyne, L. (1997) Anal. Biochem., vol. 247: 223-227)、ウィルスＤＮＡとヒトＤＮＡとの１塩基の違いの検出、(Ibrahim et al. (1998) Anal. Chem., vol. 70: 2013-2017)、ＤＮＡのデータベース化（DNA databasing） (Ledray et al. (1997) J. Emergency Nursing., vol. 23, No. 2 156-158)、ＳＴＲ電気泳動のための自動化されたプロセシング（automated processing） (Belgrader, B. & Marino, M. (1996) L. R. A. , vol. 9: 3-7 Belgrader et al. (1995) BioTechniques., vol. 19, No. 3: 427-432)、および診断学のためのオリゴヌクレオチドライゲーション検定(Baron et al. (1996) Nature Biotech., vol. 14: 1279-1282)で実証されている。
ごく最近になって、ガラスミクロ繊維は、種々の核酸を含む原料由来の核酸に、特異的に、かつとても効率よく、結合することが示された（Itoh et al (1997) Simple and rapid preparation of plasmid template by filtration method using microtiter filter plates. NAR, vol. 25, No. 6: 1315-1316; Andersson, B. et al. (1996) Method for 96-well M13 DNA template preparations for large-scale sequencing. BioTechniques vol. 20: 1022-1027などを参照）。適切な塩条件および緩衝状態下において、核酸は、高い特異性でもって、ガラスまたはシリカへと結合する。ＦＴＡ（登録商標）などの結合剤およびコーティング剤をできる限り含む、フィルター形状のガラスミクロ繊維マトリクスは、核酸の単離および溶出に使用されるかもしれない。
また、フィルター形状ではない、シリカ、シリカゲル、ガラス粒子、またはガラス混合物は、懸濁液に懸濁されて、カラムやスピンチューブなどに充填されてもよい。カラム充填剤は、除去結合剤（removal binder）を有する、ガラス繊維またはガラスミクロ繊維を均質化し、その後、「半固体（sludge）」、「樹脂（resin）」、「スラリー（slurry）」として懸濁することにより得られる（米国特許第５６５８５４８号を参照）。
タンパク質分画カラムのような、この種のタイプのカラムは、常に湿潤させておらねばならず、乾燥させることは許されず、乾燥したカラムに捕捉された核酸およびタンパク質は、しばしば溶出されないことが技術的によく知られている。このような制限のため、乾燥を防ぐ条件下で、充填カラムを注意深く保管することを余儀なくされる。例えば、空気との接触を防ぐために密閉し、できる限り低温室または冷蔵庫に保管するといった具合である。さらに、上記の制限のために、末端部またはカラム内部の気泡によりカラムが乾燥しないように、注意深く、かつ一定の警戒をしながら、比較的短時間のタイムフレームで、単離実験を行う必要がある。たいへん長い単離実験の場合、長時間に渡り、頻繁に緩衝液を加えるために、低温室中で作業する必要がある。
カラム内の様々なタイプの媒体を使って、核酸を含む試料を保存する方法を提供することは有益である。上記方法は、試料から核酸を単離した後、媒体上に捕捉された上記試料を含むカラムを乾燥させ、当該カラムを、室温かつ室内湿度で、数日間、数週間または数カ月間保存するものである。
〔発明の概要〕
本発明の一態様において、以下の工程を含む、核酸を単離および保存する方法が提供される。上記の核酸を単離および保存する方法は、
（ａ）固相媒体を用意する工程と、
（ｂ）核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
（ｃ）細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
（ｄ）界面活性剤、または洗剤を含む溶液と、上記細胞保持物とを接触させる工程と、
（ｅ）細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、核酸を含む細胞溶解物を形成させる工程と、
（ｆ）核酸を含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
（ｇ）上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を保存する工程とを含む。
本発明のさらなる一態様において、以下の工程を含む、核酸を単離および保存する方法が提供される。すなわち、上記の核酸を単離および保存する方法は、
（ａ）固相媒体を用意する工程と、
（ｂ）核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
（ｃ）細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
（ｄ）上記細胞保持物を、（ｉ）弱塩基と、（ｉｉ）キレート剤と、（ｉｉｉ）陰イオン性の、界面活性剤または洗剤とを含む溶液と、接触させる工程と、
（ｅ）細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、核酸を含む細胞溶解物を形成させる工程と、
（ｆ）核酸を含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
（ｇ）上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を保存する工程と、
（ｈ）上記固相媒体から、上記核酸を溶出する工程とを含む。
ある実施形態においては、工程ｄの溶液は、さらに、尿酸または尿酸塩を含んでいる。
本発明のさらに別の一態様においては、以下の工程を含む、ＤＮＡを単離および保存する方法が提供される。すなわち、上記ＤＮＡを単離および保存する方法は、
（ａ）固相媒体（なお、上記固相媒体は、多数の繊維を含むフィルターを含有し、上記繊維は、（ｉ）ガラスまたはシリカベースの繊維、（ｉｉ）プラスチックベースの繊維、または（ｉｉｉ）ニトロセルロースまたはセルロースベースの繊維を含む）を用意する工程と、
（ｂ）核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
（ｃ）細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
（ｄ）上記細胞保持物を、（ｉ）弱塩基と、（ｉｉ）キレート剤と、（ｉｉｉ）陰イオン性の、界面活性剤または洗剤とを含む溶液と、接触させる工程と、
（ｅ）細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、ＤＮＡを含む細胞溶解物を形成させる工程と、
（ｆ）ＤＮＡを含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
（ｇ）上記のＤＮＡを保持する乾燥した固相媒体を、５℃〜４０℃の温度で、保存する工程と、
（ｈ）上記固相媒体と共に、上記ＤＮＡを加熱し、６５℃〜１２５℃の高温にする工程と、
（ｉ）上記固相媒体から、上記ＤＮＡを溶出する工程とを含む。
ある実施形態においては、工程ｄの溶液は、さらに、尿酸または尿酸塩を含んでいる。
〔発明の詳細な説明〕
図１Ａは、凍結されたヒトの全血液より抽出され、室温・室内湿度で１日間保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図１Ｂは、凍結されたヒトの全血液より抽出され、室温・室内湿度で５日間保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図２は、凍結されたヒトの全血液より抽出され、室温・室内湿度で２０日間保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図３は、凍結されたヒトの血液より抽出され、室温・室内湿度で３．５カ月保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図４は、室温・室内湿度で、ガラス繊維GF/L-6TMおよびＤＢＳTM媒体（Whatman）上に、１カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡと、ＦＴＡ処理されたＤＮＡとで比較した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図５は、室温・室内湿度で、ガラス繊維ＧＦ／ＬTM GenFastカラム媒体（Whatman）上に、３．５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡ（下側）と、ＦＴＡ（登録商標）処理されたＤＮＡ（上側）とで比較した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図６は、室温・室内湿度で、ガラス繊維GF/L-6TM媒体（Whatman）上に、５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡと、ＦＴＡ（登録商標）様溶液（FTA（登録商標）-treated）処理されたＤＮＡとで比較した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。図７は、室温・室内湿度で、シリカゲルQiaAmp Mini Kitカラム（Qiagen）上に、３．５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質のアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す。図８は、室温・室内湿度で、カラムベースに設計された親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に、３カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡと、ＦＴＡ（登録商標）処理されたＤＮＡと、改変したＦＴＡ（登録商標）処理されたＤＮＡとで比較した結果を示す（ＭＷ＝分子量スタンダード、レーン１〜２：コントロール、レーン３：試料無し（ブランク）、レーン４〜５：ＦＴＡ（登録商標）処理された試料、レーン４〜６：改変したＦＴＡ（登録商標）処理された試料）。
概して言うと、本発明は、どんな固相に基づいた核酸精製システム（商用キット、および自作（in-house）装置を含む）の媒体上でも、血液または生物学的試料由来の核酸（ＮＡ）を保存、および保管するための化合物（例えば、ＦＴＡ（登録商標）技術（Whatman社）の化合物）、およびそれを用いる方法を提供するものである。例えば、本発明のある実施形態においては、試料を負荷した後、または核酸抽出工程の後に、ＦＴＡ（登録商標）化学物質を、上記固相媒体に供し、上記固相媒体を乾燥させることで、核酸の単離および保存が行われる。
本発明は、さらに、核酸の精製システムには最良であると考えられる分量を遥かに超えて、核酸の保存量を増加させる化合物および方法を提供する。また、本発明は、ＦＴＡ（登録商標）技術の試料の保存手順に記載されている時間および温度に限定するものではない。
本発明の方法は、ＤＮＡを回収するために、たった数種の緩衝液（バッファー）と、単純な熱により溶出する工程しか必要としないために、作業が短時間ですむ。また、本発明の方法は、カオトロピック塩、イオン交換法、または親和抽出法に依存するものではない。
ある場合には、上記固相媒体は、物理的に保持物を捕捉する。しかし、別の場合には、上記保持物は、上記固相媒体と、化学的に相互作用する。また、吸着および吸収が組み合わさって、起こっても構わない。
本発明の方法は、これまでは核酸の保存には不適当と考えられてきた、種々の市販されている固相媒体を用いて、核酸を保存し、その後、単離する方法を提供する。上記方法は、迅速かつ簡便で、費用効率に優れた方法である。本発明の方法は、手作業の部分が少なく、また、技量に依存するものではない。さらに、有害な化学物質を利用しない。また、本発明に基づいて調製された核酸は、その後に行われる種々の処理に用いることが可能である。
本発明の一態様においては、以下の工程を含む、核酸の単離・保存方法が提供される。上記の核酸を単離および保存する方法は、
（ａ）固相媒体を用意する工程と、
（ｂ）核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
（ｃ）細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
（ｄ）界面活性剤、または洗剤を含む溶液と、上記細胞保持物とを接触させる工程と、
（ｅ）細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、核酸を含む細胞溶解物を形成させる工程と、
（ｆ）核酸を含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
（ｇ）上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を保存する工程とを含む。
好ましい実施形態においては、さらに、
（ｈ）上記固相媒体から、上記核酸を溶出する工程を含む。
ある好適な実施形態においては、乾燥する工程、すなわち工程ｆに先立ち、上記固相媒体に核酸を保持している間に、不純物を除去するために、核酸を保持する固相媒体を洗浄する。
別の好適な実施形態においては、溶出する工程、すなわち工程ｈに先立ち、上記固相媒体に核酸を保持している間に、不純物を除去するために、核酸を保持する乾燥した固相媒体を洗浄する。
ある好適な実施形態では、工程ｇにおける核酸を保持する乾燥した固相媒体は、実質的に５℃〜４０℃の範囲内の温度で維持される。
工程ｇの核酸の保存期間は、少なくとも１週間であることが好ましく、少なくとも１カ月間であることがより好ましい。上記保存期間は、少なくとも３カ月間であることがさらに好ましく、少なくとも５カ月間であることが特に好ましい。
ある好適な実施形態においては、上記固相媒体は、多数の繊維を含むフィルターを含有している。上記フィルターは、実質的に無秩序な構造を有することが好ましい。また、上記繊維の直径は、１μｍ〜１０μｍの範囲内であることが好ましい。また、上記フィルターは、約０．２μｍ〜約２．７μｍのポアサイズをもつ、１つ以上の穴を有することが好ましい。
ある好適な実施例においては、上記固相媒体は、（ａ）ガラスまたはシリカベースの固相媒体、（ｂ）プラスチックベースの固相媒体、または（ｃ）セルロースベースの固相媒体を含む。
固相媒体は、ガラス、ガラス繊維、ガラスミクロ繊維、シリカ、シリカゲル、酸化シリカ、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、糖質ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidinefluoride）、ウール、または多孔質セラミックの１つから選択されることが好ましい。
ある好適な実施形態において、工程ｄの界面活性剤または洗剤は、陰イオン性の、界面活性剤または洗剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウムを含む。より好ましくは、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の間の濃度のドデシル硫酸ナトリウムを含む。
別の好適な実施形態において、工程ｄの溶液は、さらに、（ｉｉ）弱塩基と、（ｉｉｉ）キレート剤とを含む。
上記に加えて、工程ｄの溶液は、さらに、（ｉｖ）尿酸または尿酸塩を含むことが好ましい。
ある好適な実施形態において、細胞保持物は、核由来の濃縮された物質を含む。
特に好適な実施形態においては、細胞保持物は、無傷なホールセル（intact whole cell）を含んでいる。さらに、工程ｅは、（ｉ）固相媒体によって保持された核から濃縮された物質を放出させるために、上記固相媒体によって保持された無傷なホールセルを破壊する工程と、（ｉｉ）上記核酸を含む細胞溶解物を形成させるために、上記核由来の上記の濃縮された物質を溶解させる工程とを含む。
ある好適な実施形態においては、上記核酸が、実質的に、非イオン的な相互作用、好ましくは、双極分子−双極分子（dipole-dipole）の相互作用、双極分子により誘導される双極分子の相互作用（dipole-induced dipole interaction）、分散力、または水素結合によって、工程ｅの媒体により保持されるにように、上記固相媒体の組成と、大きさとが、選択される。
保持する工程、すなわち工程ｅは、さらに、上記固相媒体を通る核酸の動きを物理的に妨げる工程と定義づけられることが好ましい。
上記固相媒体は、カオトロピック物質（chaotrope）が存在しないときに、上記細胞および核酸を保持できることが好ましい。
工程ｂは、さらに、上記固相媒体内において、上記細胞を濃縮する工程を含むことが好ましい。
ある好適な実施形態においては、溶出する工程、すなわち工程ｈに先立ち、上記核酸を加熱して、６５℃〜１２５℃の高温にすることが好ましく、８０℃〜９５℃の高温にすることがさらに好ましい。
上記細胞は、白血球細胞、上皮細胞、頬細胞（buccal cell）、組織培養細胞、精液、膣細胞、尿路細胞、植物細胞、細菌細胞、および結腸直腸細胞からなる群より選択されることが好ましい。
特に好適な実施形態においては、上記細胞は白血球細胞であり、さらに、上記方法は、上記固相媒体に全血液（whole blood）を供する工程と、全血液中の赤血球細胞を溶解する任意の工程と、不純物を取り除くために、上記固相媒体を洗浄する任意の工程と、上記白血球細胞から細胞溶解物を得る工程とを含む。
より好ましくは、試料は、血液細胞を含み、さらに、工程ｃで保持される細胞の大部分を、白血球細胞が占めるように、上記固相媒体の大きさが、選択される。
好適な実施形態においては、上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことが好ましく、ゲノムＤＮＡを含むことがさらに好ましい。
別の一態様において、本発明は以下の工程を含む核酸を単離および保存する方法を提供する。上記核酸を単離および保存する方法は、
（ａ）固相媒体を用意する工程と、
（ｂ）核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
（ｃ）細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
（ｄ）（ｉ）弱塩基、（ｉｉ）キレート剤、および（ｉｉｉ）陰イオン性の、界面活性剤または洗剤を含む溶液と、上記細胞保持物とを接触させる工程と、
（ｅ）細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、核酸を含む細胞溶解物を形成させる工程と、
（ｆ）核酸を含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
（ｇ）上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を保存する工程と、
（ｈ）上記固相媒体から、上記核酸を溶出する工程とを含む。
さらなる一態様において、本発明は、以下の工程を含むＤＮＡを単離および保存する方法を提供する。上記ＤＮＡを単離および保存する方法は、
（ａ）固相媒体（なお、上記固相媒体は、多数の繊維を含むフィルターを含有し、上記繊維は、（ｉ）ガラスまたはシリカベースの繊維、（ｉｉ）プラスチックベースの繊維、または（ｉｉｉ）ニトロセルロースまたはセルロースベースの繊維を含む）を用意する工程と、
（ｂ）ＤＮＡを含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
（ｃ）細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
（ｄ）上記細胞保持物を、（ｉ）弱塩基と、（ｉｉ）キレート剤と、（ｉｉｉ）陰イオン性の、界面活性剤または洗剤とを含む溶液と接触させる工程と、
（ｅ）細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、ＤＮＡを含む細胞溶解物を形成させる工程と、
（ｆ）ＤＮＡを含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
（ｇ）上記のＤＮＡを保持する乾燥した固相媒体を、５℃〜４０℃の温度で、保存する工程と、
（ｈ）上記固相媒体と共に、上記ＤＮＡを加熱し、６５℃〜１２５℃の高温にする工程と、
（ｉ）上記固相媒体から、上記ＤＮＡを溶出する工程とを含む。
上記保持物は、固相媒体中に包括されている間に溶解されることが好ましい。しかし、本発明にかかる方法は、実質的に保持物の全て、または一部分が、上記固相媒体に包括されてはいないが、上記固相媒体（媒体の表面上を含む）によって保持されている間に、溶解される実施形態をも含むと理解されるものである。
本発明の一態様においては、細胞保持物は、細胞破片のみならず、または、細胞破片の代わりに、無傷なホールセルを含む。上記無傷なホールセルは、上記固相媒体に保持されている間に、都合よく、上記の媒体に洗剤を供することにより、処理されてもよい。なお、細胞膜を破裂させる効果、または「剥がす（peeling away）」効果を有するものであれば、どのような洗剤を用いてもよい。
濃縮された核由来の物質または核酸は、上記の媒体によって保持される。上記洗剤は、デドシル硫酸ナトリウム（特に、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）、ラウリルサルコシン酸ナトリウム（特に、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のＳＬＳ）、または、その他の市販品で入手可能な洗剤、例えば、TWEENTM 20（特に、０．５％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）のTWEEN 20）、ラウリルデドシル硫酸塩（特に、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のＬＤＳ）、もしくはTRITONTMX-100のようなTRITONTM（特に、０．５％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）のTRITON）から選択されることが好ましい。また、上記の物質の代わりに、３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）を用いてもよい。使用される洗剤の量は、細胞膜を溶解するのには十分な分量だが、ＤＮＡを変成させてしまうほどの量ではない。適切な分量は、通常、０．１％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）である。なお、この分量は、０．２％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）であることが好ましく、０．５％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の、ＳＤＳ、TWEEN、またはTRITONであることがさらに好ましい。最も好ましい洗剤は、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳである。
保持物に洗剤を加えることが好ましいが、本発明の方法は、洗剤を添加せずに、その他公知の溶解剤、例えば、エタノールやスクロースなどの低塩非等張液を用いることによって、実施してもよい。しかしながら、保持物が上記固相媒体によって保持されている間に、洗剤を保持物に加えることで、ＤＮＡ産物の質および収量が向上する。
洗剤は、無傷なホールセルを破裂させることに加えて、上記固相媒体に保持されている可能性のある、タンパク質やヘムを洗い落とす機能も有している。
細胞の核の溶解に関して、本発明の一態様においては、低塩で非等張性の緩衝液、例えば、低等張性緩衝液を加えることにより、細胞の核を、溶解、分解、または破裂させて、核酸を含む細胞溶解物を形成させる。なお、上記低塩緩衝液としては、以下のものが好ましい。すなわち、１リットルにつき、純水を５００ｍｌ測定し、１０ｍｌ（９．９−１．１ｍｌ）の１Ｍ Ｔｒｉｓ（Whatman ＷＢ４２０００３）を加え、０．５９６ｇ（０．５９５−０．５９７ｇ）の塩化カリウム（Whatman WB410015）を加え、０．２９ｇ（０．２８−０．３０ｇ）の塩化マグネシウム（Whatman WB410014）を加え、混合して、これら物質を溶解し、１０．０ｍｌのＮＦＢ（ＮＦＢの代わりに、牛胎児血清を用いてもよい）を加え、混合し、０．５ｇ（０．４９−０．５１ｇ）のメタ重亜硫酸ナトリウム（Whatman ＷＢ４１００５５）を加え、混合し、水を１０００ｍｌとなるように加え、よく混合し、クラスＩＩ安全キャビネット内で、０．２μｍフィルターを用いて、溶液を無菌フィルターにかけ、室温で保存した溶液；
ＡＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６−８）；
ＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）；または、
水が好ましい。その他の適切な溶解液には、あらゆる洗剤を含む溶液が含まれる。上記洗剤は、陽イオン性、陰イオン性、または中性であってもよい。また、カオトロピック物質を含む溶液、好ましくはカオトロピック物質を含む緩衝液を用いてもよい。上記溶解液は、濃縮された核由来の物質を溶解または破裂させ、核酸を放出させる。しかしながら、核を溶解させ、核酸を含む溶解物を形成させることは、その他の方法、例えば、加熱することによって達成できることは、当分野に熟達した当業者に理解されているところである。なお、そのような場合は、溶解の後、上記保持物は、フリーの核酸を含有している。
細胞であろうが、核であろうが、その溶解と、溶解の結果生じる不純物の除去とは、連続して行う。例えば、細胞の溶解に続いて、核由来ではない物質、または内容物を除去する。もしくは、核の溶解に続いて、核酸でない物質を除去する。また、連続的に行わない代わりに、上記の溶解と除去との工程を同時に、またはオーバーラップして行ってもよい。
上記溶液の化学組成は、ホールセルの溶解と、放出される核酸のその後の捕捉とを促進するものである。上記溶液は、界面活性剤または洗剤を含んでいることが好ましく、弱塩基、キレート剤、および陰イオン性の、界面活性剤もしくは洗剤を含んでいることがより好ましい。上記化学組成は、さらに、核酸の長期保存を補助する役割も果たす。また、上記溶液の組成は、捕捉された核酸の精製を迅速に行えるように考慮されている。すなわち、上記溶液自身は、溶出する工程で核酸を放出させることを考慮している。その結果、可溶性の核酸分画を得ることができる。以下でより詳細に述べられ、かつ、後述の実施例で例示しているように、本発明の方法は、試料からの全ＤＮＡを溶出することに関して、最も効果的であり、核酸および核酸群を特異的に溶出することが可能である。
フィルター膜を含む実施形態においては、上記溶液は、上記フィルター膜に吸着できる化学成分を含有することが好ましい。上記溶液組成は、好ましくは、米国特許第５７５６１２６号、第５８０７５２７号、および第５４９６５６２号に述べられている通りである。なお、これらの特許文献の内容を、本明細書に織り込んでいる。
ある実施例において、好適な溶液は、タンパク質変性剤とフリーラジカル捕捉剤とを含んでいる。上記の変性剤は、試料中のタンパク質および大部分の病原性の生物を変性させる、界面活性剤である。陰イオン性洗剤は、上記のような変性剤の代表的な例であり、単独で使用されてもよい。また、上記の化学溶液は、弱塩基、キレート剤、および陰イオン性の、界面活性剤または洗剤を含んでいても良い。さらに、上記の米国特許第５８０７５２７号に詳しく述べられているように、随意的に、尿酸または尿酸塩を含んでいてもよい。より好適には、上記弱塩基は、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルメタン）や、フリー塩基もしくは炭酸塩のいずれかのようなものである。また、キレート剤は、ＥＤＴＡであることが好ましい。また、陰イオン性洗剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であることが好ましい。なお、同様の機能を有するその他の溶液を、本発明に用いることもできる。
ある好ましい実施形態においては、本発明のこの態様で用いられる溶液は、以下のものを含んでいる。すなわち、（ｉ）１価の塩基（例えば、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルメタン）や、フリー塩基もしくは炭酸塩のいずれか）、（ｉｉ）キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸））、および（ｉｉｉ）陰イオン洗剤（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））を含む溶液が用いられる。また、随意的に、（ｉｖ）尿酸または尿酸塩を含んでいても良い。
上記溶液のある好ましい実施形態の例としては、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳおよび尿酸を含む、ＦＴＡ（登録商標）溶液（Whatman）が挙げられる。
上記固相媒体上にＤＮＡを短期間保存する場合には重要ではないが、ＤＮＡを固相媒体上に長期間保存する場合、本発明の方法に基づき、尿酸および尿酸塩を使用することが非常に重要であることが見出された。本発明の方法において、尿酸および尿酸塩は、多くの機能を果たす。その中には、フリーラジカル捕捉剤または弱酸としての役割が含まれる。尿酸および尿酸塩は、フリーラジカル捕捉剤として、優先的にフリーラジカルを受容する。フリーラジカルが捕捉されない場合、これらはＤＮＡ中の塩基グアニンを破損する。
上述のように、上記組成は、ｐＨを８．０〜９．５のアルカリ性とし、マトリクス上に配された血液を塩基性の環境にさらすために、塩基、随意的に１価の弱塩基を含んでいてもよい。これは、キレート剤の２価金属結合を適切かつ確実に発生させるためである。また、塩基の存在により、２価金属に依存性でない核酸分解酵素の作用を防ぐことにもなる。上記塩基は、Ｔｒｉｓなどの弱有機塩基であってよい。また、有機塩基の代わりに、炭酸または重炭酸の、ナトリウム塩、リチウム塩、またはカリウム塩などの、アルカリ金属炭酸塩またはアルカリ金属重炭酸塩などの無機塩基が使用されてもよい。
本発明に用いられるキレート剤は、ＥＤＴＡなどの強キレート剤であることが好ましい。なお、現在、種々の強キレート剤を購入することが可能である。キレート剤の機能は、マグネシウムおよびカルシウムのような２価金属イオンと結合すること、また、遷移金属イオン（特に鉄）と結合することである。カルシウムとマグネシウムとは、共に、酵素の補因子として機能し、ＤＮＡ分解を促進することが知られている。容易に酸化および還元される鉄などの金属イオンも、フリーラジカルを生産し、核酸を損傷させる。
本発明のこの態様の上記組成には、上記陰イオン性の、界面活性剤および洗剤は、主要な変性剤として含まれる。上記陰イオン性の洗剤は、単独で用いられてもよく、また、弱塩基、キレート剤、および随意的に尿酸もしくは尿酸塩と組み合わせて用いられてもよい。
タンパク質に結合し、タンパク質を変性させる、いかなる強陰イオン性の洗剤も、適している。また、上述したＳＤＳと同様に、その他の洗剤、例えば、ラウリルサルコシン酸ナトリウムを用いてもよい。また、この陰イオン性の洗剤は、病原体の、外皮タンパク質、内部タンパク質、および、病原体の活動に必要不可欠なその他のあらゆる膜の２次構造を非選択的に破壊するために、ほとんどの病原体を不活性化することができる。しかし、上記陰イオン性の洗剤は、最も抵抗性の強い細菌の胞子や、一部の非常に抵抗性の強い腸内ウイルス粒子を不活性化できないという例外は存在する。これらの例外は、通常の接触により伝播されるような病原体である。また、現時点で、これらの病原体が、血液から危険を与える（血液から進入する）という懸念はない。
上記陰イオン性の洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む群から選択することができる。ＳＤＳは、様々な形態で得られる。例えば、Ｃ１２型やラウリル硫酸塩などである。また、その他の陰イオン性の洗剤を用いることができる。例えば、アルキアリルスルホン酸塩、テトラデシル硫酸ナトリウム長鎖（脂肪性）アルコールスルフェート（sodium tetradecylsulphate long chain (fatty) alcohol sulphates）、２−エチルヘキシル硫酸ナトリウムエチレン列炭化水素スルフェート（sodium 2-ethylhexysulphate olefine sulphates）、スルホコハク酸ナトリウム、またはリン酸エステルを用いることができる。ＳＤＳのような陰イオン性の洗剤は、種々の濃度で、フィルターマトリクスに供することができる。
通常、本発明においては、０．１％〜１０％のＳＤＳが用いられる。例えば、ＳＤＳの濃度を最大１０％（上述の特許文献に記載されているように、ＦＴＡ（登録商標）混合物には、このＳＤＳ濃度を用いることはできないが）にまで増加させると、臨界ミセル濃度がより高くなるために、後述の実施例で示すように、細胞の溶解能がより高くなり、それゆえ、核酸の収量がより増加する。異なるプラスミド集団を、液体培養から直接濃縮および精製するために、ガラスミクロ繊維を用いる場合、たとえば、充填カラム、フィルターカラム、従来公知の多穴プレート（multi-well format）を用いる場合、好適なＳＤＳ濃度は０．５％〜５％の範囲内である。
上記固相媒体として、適した材料には、ガラス繊維もしくはシリカベース、またはシリカ誘導体よりなる固相媒体、並びに、プラスチックベースの固相媒体、例えば、ポリエステルおよびポリプロピレンベースの媒体が含まれる。
ガラスミクロ繊維、ポリエチレン、ポリエステルまたはポリプロピレンを含む特定の材料を用いると、カオトロピック物質が存在しない場合にも、核酸を単離することができる。実質的にカオトロピック物質が存在せずとも、固相媒体が細胞および核酸を保持できるように、固相媒体の組成および大きさが選択されることが好ましい。また、驚くべきことに、発明者らは、ガラスミクロ繊維、ポリエチレン、ポリエステル、またはウールもしくはポリプロピレンを含む、特定の物質を用いることで、カオトロピック物質が存在せずとも核酸を単離できることを見出した。これは、当分野に熟達した、当業者の間で広く知られる知識に反するものである。
本発明の固相媒体は、実質的に損失なく、細胞および核酸を固相媒体内に捕捉するのに十分な厚みをもつことが好ましい。なお、本発明の方法は、スケールの変更が可能であるので、どんな表面積のフィルターでも、また、どんな直径のフィルターでも、用いることができる。
本発明の固相媒体は、上記固相媒体に固定された遺伝物質を、熱による溶出により、解離させることができる。ある好適な実施形態においては、遺伝物質が固定された固相媒体を、核酸分解酵素を含まない、加熱された溶出液または水にさらして、熱による溶出が行われる。また、ある好適な実施形態においては、上記固相媒体は、多孔性であり、核酸が結合するのに十分に広い表面積を備える固相媒体が用いられる。
本発明の固相媒体は、保存期間中のいかなる時点においても、上記固相媒体に固定された核酸を迅速に精製することができるものである。固定された核酸は、本発明の固相媒体より放出される間の簡単な溶出過程の後、可溶性画分の状態で収集される。本発明の固相媒体を用いると、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法、核酸増幅精密測定法（transcription mediated amplification）（ＴＭＡ）、逆転写ＰＣＲ法、ＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリダイゼーション法、塩基配列分析などの、単離した核酸を用いた分析に悪影響を及ぼさないだけ十分な質の核酸を得ることができる。
ある実施形態において、上記固相媒体には、フィルターまたはフィルター膜が含まれる。フィルターが繊維性のものである場合、上述の溶液は、単にフィルターの表面を覆うよりもむしろ、フィルター繊維を覆うことが好ましい。また、その代わりとして、上記溶液は、フィルター繊維に浸透してもよい。
なお、本明細書にて用いられている用語「フィルター」、「フィルター膜」、または「マトリクス」とは、多孔質材料、または全部または一部分が、ガラス、シリカ、シリカゲル、酸化シリカ、または石英から形成されるフィルター媒体を意味する。また、これら物質よりなる繊維、またはこれらの派生物から形成されるフィルター媒体も含まれる。しかし、上記多孔質材料またはフィルターを形成する材料は、上記の物質に限定されるものではない。上記以外にも、上記フィルター膜を構成するその他の材料には、セルロース質の材料（セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロースなど）、合成親水性ポリマーを含む親水性ポリマー（ポリエステル、ポリアミド、糖質ポリマー（carbohydrate polymer）など）、ポリテトラフルオロエチレン、多孔質セラミック、Sephacryl S-500、ウール、および珪藻土（酸化シリカ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、１つ以上のフィルターを押しつぶしたり、破いたり、または均質化したりするなどして、チューブ、カラムまたは多穴プレートに充填して用いてもよい。このような場合、上記フィルターの材料は、例えば緩衝液やその他の溶液中で、半固体状（sludge）または懸濁液を形成させるために用いることができる。
本発明において用いられる固相媒体の好適な例として、GF/L-6TMガラス繊維媒体（Whatman社）、DBS-1000TMガラス繊維媒体（Whatman社）、GenFastカラム（Whatman社）、ＰＶＤＦ媒体（Whatman社）、QiaAmp（登録商標）カラム（Qiagen GmbH）、Wizard（登録商標）カラム（Promega）、Generation（登録商標）カラム（Gentra）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる例として、ニトロセルロース膜（Whatman社; Toronto; Schleicher & Schuell）、セルロースナイトレート膜（Arbor Tech）、アセチルセルロース膜（Tronto）、ナイロン膜（Whatman社; Toronto; Schleicher & Schuell）なども上記例に含まれるが、これらに限定されるものではない。技術的に知られているさらなる例としては、ＷＯ００／２１９７３、米国特許第５２３４８０９号、欧州特許第０３８９０６３号により公開されているものが挙げられる。なお、参考のために、これらの内容を本明細書に織り込んでいる。
さらに、本発明の好適な実施形態には、広範囲の物質を含む、カラム方式またはハイスループットな９６穴方式（吸引または遠心分離）のプラスミド調製キットが含まれるが、本発明はこれに限定されるものではない。市販のハイスループットなプラスミド調整キットの例としては、ＤＮＡ結合マトリクスを含むキット（DNAce 96 Plasmid Kit（Bioline））、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅ−９６ Ｓｐｉｎ（Eppendorf Scientific, Inc））、シリカ膜（Aurum Plasmid 96 kit (Bio-Rad Laboratories)、Nucleospin Multi-96（Clontech Laboratories社）、Perfectprep 96 Vac DB（Eppendorf Scientific社）、Wizard SV 96 Plasmid DNA Purification System（Promega社）、シリカゲル膜（QIAprep 96 Turbo Miniprep kit (Qiagen) ）、シリカマトリクス（96-well prep Express (Qbiogene); RPM Turbo 96 kit (Qbiogene)）、および陰イオン交換膜（QIAwell 96 Ultra Plasmid kit (Qiagen)）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
試料の汚染の危険性を軽減するのに加えて、保存前の核酸の迅速な単離を促進するために、または保存後の核酸の溶出を促進するために、自動プラスミド調製装置を用いてもよい。上記の自動プラスミド調製装置の例としては、AutoGenprep 960（AutoGen社）、PERFECTPrep Process Platform（Brinkmann）、RevPrep（GeneMachines）、Miniprep Workstation（Hudson）、AutoPrep-12（ThermoHybaid）、Mini-Prep 24（MacConnel Research）、RoboPrep 2500/3000/4800（MWG Biotech社）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
同様に、ハイスループットな自動化された単離または溶出技術および装置を、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの単離に用いることができる。
本発明のフィルター膜として用いられる媒体には、上述の溶液を不活性化せず、かつ保存、溶出およびその後に行われる核酸含有物質の分析の妨げとならない、物質を含むことが好ましい。このような媒体には、平らな乾燥マトリクスまたは結合剤と組み合わされたマトリクスが含まれる。結合剤の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）、およびその他の長鎖アルコールが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のフィルター膜は、核酸の固定化を促進するために、多孔性であることが好ましい。ある好ましい実施形態においては、上記フィルターは、多数の繊維を含み、実質的に無秩序な構造を有している。上記繊維の直径は、約１μｍ〜約１０μｍの範囲内であることが好ましい。また、上記繊維マトリクスは、約０．２μｍ〜約２．７μｍのポアサイズをもつ、１つ以上の穴を有することが好ましい。
ある好ましい実施形態においては、イオン性の相互作用が実質的に存在しない状態で、上記フィルターによって核酸が保持されるように、上記フィルターの組成および大きさが選択されることが好ましい。また、上記フィルターを通る核酸の動きを物理的に妨げることにより、核酸がフィルターによって保持されることがより好ましい。
ある好ましい実施形態においては、網状構造のフィルターにより核酸が保持されるように、上記フィルターの組成および大きさが選択されることが好ましい。
「核酸物質」および「核由来の物質」には、核膜、および、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはプラスミドＤＮＡを含む核の内容物が含まれる。「核の核酸でない内容物」には、核膜の構成物、および核酸でない、あらゆるその他のタンパク質または物質が含まれる。
「核酸」には、様々な形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれる。「遺伝物質」には、ＤＮＡの一種で、遺伝情報をコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が含まれる。
核酸は、ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
なお、本発明の方法は、あらゆる核酸に適応可能であるが、上記核酸は、ＤＮＡ、特に、ゲノムＤＮＡを含むことが好ましい。なお、この好ましい方法では、ゲノムＤＮＡが好適な標的化合物であることが示されているが、本発明の方法を、ＲＮＡ含有試料からＲＮＡを単離するために用いることができる。
以下で述べる溶出する工程は別として、溶出する工程ではない工程を行う際の温度は、通常の大気温度、一般的には５℃〜４０℃の範囲内であり、好ましくは、１０℃〜４０℃の範囲内であり、より好ましくは、１５℃〜３０℃の範囲内である。
ある好適な実施形態においては、上記保存工程は、大気温度（室温）・室内湿度で行われる。上記温度は、一般的には５℃〜４０℃の範囲内であり、好ましくは１０℃〜４０℃の範囲内であり、より好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。
上記乾燥した固相媒体を用いた核酸の保存は、数日間、数週間、または数カ月間、維持されてもよい。ある好適な実施形態においては、乾燥した固相媒体を用いて、核酸を少なくとも１週間保存することができる。また、核酸を１カ月間保存することが好ましく、３カ月間保存することがより好ましく、５カ月間保存することがさらに好ましい。
また、ｐＨが５〜１１の範囲内で、好ましくはｐＨが５．８〜１０の範囲内で、核酸を溶出できるように、上記固相媒体の組成および大きさが選択されることが好ましい。より強アリカリの溶媒で、産物である核酸を溶出すると、潜在的に、産物である核酸が分解されるので、上記の範囲内のｐＨで核酸を溶出することは、本発明の方法において、好都合である。したがって、好ましい溶出時のｐＨの１つは、ｐＨ７〜９の範囲内である。
本発明のフィルターから核酸を溶出するのに適したｐＨの溶液であれば、どのようなものを用いてもよい。好適な溶出溶液には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１ｍＭから１Ｍ）、酢酸ナトリウム（１ｍＭから１Ｍ）、１０ｍＭの２−［Ｎ−モルフィリノ］−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）、１０ｍＭの３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）（ｐＨ１０．４）、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８）＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）、ＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（特に、０．５％ＳＤＳ）、TWEENTM 20（特に、１％のTWEENTM 20）、ＬＳＤ（特に、１％のラルリルデドシル硫酸塩（ＬＤＳ））、またはTRITONTM（特に、１％のTRITONTM）、水および１０ｍＭのＴｒｉｓが含まれる。一般的な用途においては、これらの溶液を用いると、ほぼ同量の核酸が得られる。多量の溶出溶液を用いて溶出を行うと、核酸の合計収量はより高くなる。
核酸の溶出、言い換えれば、上記固相媒体からの核酸の放出は、いくつかの様式の影響を受ける。溶出前に核酸を放出させるためのインキュベーション（incubation）工程中に、上記システムにエネルギーを加えることで、溶出の効率を向上させることができる。上記エネルギーは、物理的エネルギー（攪拌など）または熱エネルギーの形であってよい。上記システムに加えるエネルギーを増やすことにより、インキュベーション時間または放出時間を短くすることができる。
上記固相媒体から、核酸を室温で溶出できるが、溶出前に核酸を放出させるためのインキュベーション工程中に、上記システムにエネルギーを加えることで、溶出の効率を向上させることができる。なお、上記エネルギーは熱エネルギーの形であってよい。溶出に先立ち、核酸が上記固相媒体に保持されている間に、所定の時間、核酸を加熱し、高温とすることによって、熱エネルギーをシステムに加えることが好ましい。しかし、核酸を損傷する程の温度および時間であってはならない。核酸を加熱して、４０℃〜１２５℃の高温にすることが好ましく、８０℃〜９５℃の高温にすることがさらに好ましい。最も好ましくは、上記核酸を加熱して、約９０℃の温度で約１０分間加熱することが好都合である。
上記の昇温させる工程の代わりに、事前に加熱して温度が上昇している緩衝液を用いてもよい。また、昇温させる工程を行い、さらに、加熱した緩衝液を用いることがより好ましい。ある好適な実施形態においては、上述の溶出する工程は以下のようにして行われる。
（ａ）溶出緩衝液を加熱して、４０℃〜１２５℃の高温とし、
（ｂ）上記固相媒体へと上記溶出緩衝液を加え、
（ｃ）上記固相媒体と上記溶出緩衝液とを加熱して、４０℃〜１２５℃の高温とし、
（ｄ）核酸を溶出し、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の作業を、少なくとも１回は繰り返す。
なお、上記の工程において、８０℃〜９５℃の範囲内の高温とすることがより好ましい。また、核酸を加熱し、温度を約９０℃に上昇させ、１０分間加熱することがさらに好ましい。
本発明のシステムからは、主に１本鎖の物質が得られると思われる。しかし、得られる２本鎖ＤＮＡの割合は実験条件に依存しており、実験条件によりこの割合を調節することができる。
時間および温度のパラメーターを使って、インキュベーションを制御すると、この割合を調節することができる。溶出温度を低くし、溶出時間を長くすると、得られる２本鎖ＤＮＡの割合が増加する。また、溶出温度を高くし、溶出時間を短くしても、得られる２本鎖ＤＮＡの割合が増加する。
核酸がフィルターに保持されている間に、核酸を一度加熱して、温度を上昇させると、溶出する工程中に温度を高いままに保つ必要はない。溶出自体は、いかなる温度で行われてもよい。作業を簡便にするためにも、核酸がフィルターに保持されている間に、高温で核酸を加熱する場合には、溶出は、それよりも低い温度で行うことが好ましい。これは、加熱を止めると、時間と共に核酸の温度が低下し、さらに、室温に保たれた溶出緩衝液をフィルターに供することによっても、核酸の温度が低下するからである。
本発明の方法は、実質的に、カオトロピック物質が存在しない状況下において行われることが好ましい。
多くの場合、固相媒体を含むカラムに血液試料が供される。ある好適な実施形態においては、赤血球細胞溶解液を用いて、血液試料は処理される。本発明の方法に用いられる、典型的な赤血球細胞溶解液には、表１に示されるものが含まれる。好適な溶解液は、０．８３％（ｗ／ｖ）の塩化アンモニウム、０．１６％（ｗ／ｖ）の炭酸アンモニウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡである。赤血球細胞がフィルターを通過するときに、必ずしも無傷な赤血球細胞を溶解する必要があるわけではない。しかし、赤血球細胞溶解液を用いることで、より質の高い最終産物を得ることができる。
遊離したＤＮＡの分析に適した試薬には、ＰＣＲ法、ＤＮＡのプロセシング、ＤＮＡの消化もしくはサブクローニングまたはその一部、ＤＮＡの塩基配列分析、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、サザンブロッティング、並びに、その他の、溶出の後に行われるＤＮＡ分析の範疇に属する方法に適した、いかなる試薬も含めることができる。上記の試薬には、プローブ、プライマー、制限酵素、緩衝液、タンパク質、指示薬、および、その他のＤＮＡ分析に有効なあらゆる試薬が含まれるが、それらに限定されるものではない。
遊離したＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の分析に適した試薬には、逆転写、プロセッシング、ノーザンブロッティング、および、その他の溶出後に行われるＲＮＡ分析の範疇に属するあらゆる方法に適した、あらゆる試薬も含めることができる。上記の試薬には、プローブ、プライマー、制限酵素、緩衝液、タンパク質、指示薬、および、その他のＲＮＡ分析に有効なあらゆる試薬が含まれるが、それらに限定されるものではない。
本発明の方法は、核酸産物の収量および純度を実質的に改善することが分かった。さらに、本発明の方法は、迅速かつ簡便で、費用効果に優れており、かつ、手作業の部分が少なく、技量に依存せず、有害な化学物質を用いない核酸の精製方法を提供する。本発明の一実施形態に従って生じさせられる核酸は、後の様々な処理に用いることが可能である。また、随意的に、適切なあらゆる洗浄溶液を用いて、フィルターに保持された核酸を洗浄してもよい。なお、上記のフィルターに保持された核酸は、そのｐＨが５．８〜１０の範囲内にある緩衝液で洗浄されることが好ましく、ｐＨ７〜８の範囲内にある緩衝液で洗浄されることがより好ましい。特に、水、またはＴＥ−１（１００μＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８））のような低塩緩衝液により洗浄されることが好ましい。上記の洗浄工程は、溶出前、または溶出と同時に行われてもよい。上記の洗浄は、核酸産物の収量および純度を高める。また、上記洗浄工程は、後の処理において、問題となる可能性のある、細胞の物質および溶解液のあらゆる残留物を除去する。
適切な洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ、７０％エタノール、ＳＴＥＴ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５％ Triton X-100）、ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、および０．３Ｍ クエン酸ナトリウムを含み、ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整）、ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、および０．０２Ｍ ＥＤＴＡを含み、ｐＨを７．４に調整）、ＦＴＡTM精製試薬、およびこれらに類似したものからなる群より選択することができる。特に、水、またはＴＥ−１（１００μＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０））のような低塩緩衝液を用いて、洗浄することが好ましい。
実施例の項で述べられる様々な緩衝液を用いるような洗浄する工程は、細胞を溶解した前、またはその後に行われるが、それに限定されるものではない。洗浄する工程が細胞を溶解した後に行われるとき、上記固相媒体は、その後、核酸を物理的に、その内部に捕捉する。さらに、洗浄する工程は、保存の後、溶出の直前に、行ってもよい。
ある好適な実施形態においては、本発明の方法は、細胞破片を含む細片などの不純物を除去するために、細胞を溶解する工程の前に、洗浄する工程を含む。別のある好適な実施形態においては、本発明の方法は、同じように汚染物質を除去するために、細胞を溶解する工程の後で、固相膜を乾燥させる工程の前に、洗浄する工程を含む。さらに別の好適な実施形態においては、本発明の方法は、保存する工程の後で、溶出する工程の前に、洗浄する工程を含む。
上記核酸の由来（source）は、ホールセルを含む生物学的試料である。上記ホールセルの例としては、血液、細菌培養物、細菌集落（コロニー）、組織培養細胞、唾液、尿、飲料水、血漿、糞便試料、精液、膣試料、痰、植物細胞の試料が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これら試料は、技術的に知られている種々の方法により採取し、固相媒体に移して、上記固相媒体に供することができる。なお、上記固相媒体は、布、シート材、ボールまたはその他類似物などの、試料採取装置（sampling device）の形態であってもよい。また、上記試料は、その由来から直接、得てもよい。言い換えれば、上記固相媒体は、強打、または別の方法で、由来から細胞試料を得ることができる装置の形態であってもよい。なお、試料の由来は、液体試料を含む試料管、口や耳またはヒトまたは動物のその他の部分などの器官、犯罪現場の血液試料やそれに類似するものなどの試料プール、全血液または白血球が減少した血液（leukocyte-reduced blood）、または科学、法医学、またはその他の分野において知られている種々の細胞由来である。上記の試料を供する工程は、上記固相媒体にホールセルを供することによって達成される。核酸は、真核生物または原核生物由来であり、プラスミドＤＮＡをも含む。
概して、本発明の方法は、あらゆるホールセルの懸濁液に対して、好都合に用いることができる。本発明の方法に特に適した細胞には、細菌細胞、酵母細胞、並びに、哺乳動物およびその他動物の細胞、例えば、白血球細胞、上皮細胞、頬細胞（buccal cell）、組織培養細胞、精液、膣細胞、尿路細胞、結腸直腸細胞が含まれる。ＤＮＡは、綿棒で採った標本、塩水およびスクロース含嗽水、並びに軟膜の試料から、うまく得られる。
なお、細胞に白血球細胞が含まれる場合、本発明の方法は、さらに、全血液（whole blood）を固相媒体上に供する工程と、全血液に含まれる赤血球細胞を溶解する任意の工程と、不純物を除去するために、上記固相媒体を洗浄する任意の工程と、上記血液細胞から細胞溶解物を得る工程とを含むことが好ましい。全血液は、採取したばかりのものでも、凍結されたものであってもよい。Ｎａ／ＥＤＴＡ、Ｋ／ＤＥＴＡを含む血液、およびクエン酸エステル化された血液の全てにおいて、同様の収量が得られる。１００μｌの全血液試料から、約２〜５μｇの収量で核酸が得られる。また、５００μｌの試料からは約１５〜４０μｇの収量で核酸が得られる。さらに、１０ｍｌの試料からは、約２００〜４００μｇの収量で核酸が得られる。
本発明は、遺伝学の様々な分野において、その有用性を見出すことができる。例えば、本発明は、遺伝物質を、迅速に精製するために、様々な市販の固相媒体、例えば、カラム、チューブ、または多穴プレートに入った固相媒体を用いて、固相媒体に結合した核酸を溶出する可能性（capability）を提供するものである。
Figure 2006501850
〔実施例〕
本来の、および改変された、Whatman Genomic DNA Purification System GenFastを用いて、ヒトの全血液試料（４００〜１０００μｌ）の処理を行った。有核細胞捕捉および赤血球溶解工程（Nucleated Cell Capture and Red Cell Lysis Step）の後、それぞれのカラムに、２５〜５０μｌのＦＴＡ（登録商標）溶液（Whatman）を供した。その後、カラムを、乾燥、保存、およびその後のＤＮＡ抽出のために、室温で放置した。
上記の保存されたＤＮＡの回収には、以下に示すGenFastのプロトコールを用いた。
〔実施例１〜４の研究デザイン〕
・異なるタイプのLeukoreduction（ＬＲ）ガラス繊維媒体が充填された、自家製カラムに、０．５〜１ｍｌの採取したばかりの、または凍結されたヒトの全血液を供した。
・赤血球細胞溶解液GenFast溶液１（Whatman社）を用いて、Ｈｂ、および、その他の不要な血液成分を洗い流した（GenFast溶液１＝１５５．２ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭの炭酸アンモニウム、０．１０ｍＭのＥＤＴＡ）。
・白血球細胞が捕捉されている上記媒体に、２５〜５０μｌの容量のＦＴＡ（登録商標）溶液（Whatman社）を供した（ＦＴＡ（登録商標）溶液＝１６０ｍＭのＴｒｉｓ、７．８ｍＭのＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．６７２％（ｗ／ｖ）の尿酸）。なお、他の手順が示されている場合はこの限りではない。
・室温または３７℃でカラムを乾燥させた。
・カラムを周囲条件（室温・室内湿度）で１日間、５日間、２０日間、または３．５カ月間保存した。
・保存中の異なる時点において、GenFast化合物（GenFast溶液２、３、４（Whatman社））を用いて、固相媒体からＤＮＡを単離した（溶液２＝０．５％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム；溶液３＝８．０（±０．１）ｍＭの塩化カリウム、３．０（±０．１）ｍＭの塩化マグネシウム、１０（±０．１）ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８）、１％（ｗ／ｖ）のＦＣＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸ナトリウム；溶液４＝１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）。
・ＵＶ／ｖｉｓ分光分析、PicoGreen蛍光色素、およびアガロースゲル電気泳動法を用いて、得られたＤＮＡの質および量を評価した。
以下の実施例は、室温で３．５カ月間、試料を保存した後、抽出されたＤＮＡは最大約７５％の２本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡを、期待されるＤＮＡ収量の最大７８％（５００μｌの血液から８〜１２μｇのＤＮＡ）の収率で抽出することができることを示す。また、上記保存過程におけるＤＮＡの安定性は、試料を１日間（図１Ａ）、５日間（図１Ｂ）、２０日間（図２）、および３．５カ月間（図３）保存した後の、アガロースゲル電気泳動の写真を表す図に示されている。
〔実施例１および２〕
自家製カラム内のガラス繊維GF/L-6ＴＭ媒体に、凍結された血液（＃１）０．５ｍｌの試料を供した。保存期間は、１日間および５日間とした。その結果を、表２、並びに図１Ａおよび図１Ｂに示す。
Figure 2006501850
図１Ａおよび図１Ｂは、室温で、GF/L-6ＴＭ媒体上に、１日間（Ｉ）（図１Ａ）、および、５日間（ＩＩ）（図１Ｂ）保存された後の血液試料から抽出されたＤＮＡの質を、０．７８％アガロースゲル電気泳動により調べた結果を示している（Ｍ＝分子量スタンダード）。
〔実施例３〕
自家製カラム内のガラス繊維DBS-1000TM媒体に、採取されたばかりの血液（＃２）０．５ｍｌの試料を供した。保存期間は、２０日間とした。その結果を、表３および図２に示す。
Figure 2006501850
図２は、室温で、DBS-1000TM媒体上に、２０日間保存した後の血液試料から抽出されたＤＮＡの質を、０．７８％アガロースゲル電気泳動により調べた結果を示している（Ｍ＝分子量スタンダード）。
〔実施例４〕
自家製カラム内のガラス繊維DBS-1000TM媒体に、採取したばかりの血液１．０ｍｌの（＃３）試料を供した。保存期間は、３．５カ月間とした。その結果を表４および図３に示す。
Figure 2006501850
図３は、室温で、DBS-1000TM媒体上に、３．５ヶ月間保存した後の血液試料から抽出されたＤＮＡの質を、０．７８％アガロースゲル電気泳動により調べた結果を示している（Ｍ＝分子量スタンダード）。
本発明の実施例に基づく、これらの結果は固相ベースに精製する技術の後に、室温で核酸を保存する本発明の実施形態の使用を実証するものである。このように、本発明によれば、固相ベースの核酸精製技術を使って、核酸を好都合に保存、輸送、および／または、単離することができる。
〔実施例５：異なるタイプのガラス繊維媒体が充填された１ｍｌカラムを用いて、血液由来のＤＮＡを保存および単離するためのＦＴＡ（登録商標）化合物〕
（研究デザイン）
・２つの異なるタイプのＬＲガラス繊維媒体、GF/L-6ＴＭおよびＤＢＳＴＭ（Whatman社）がそれぞれ充填された１ｍｌカラムに、１ｍｌの血液を供した。
・洗浄溶液を用いて、Ｈｂ、および、その他の不要な血液成分を洗い流した。
・カラムの一方のグループに、ＦＴＡ（登録商標）溶液を供し（以下、GF/L-6−ＦＴＡ（登録商標）またはＤＢＳ−ＦＴＡ（登録商標）とも記する）、カラムの他方のグループにはＦＴＡ（登録商標）を加えなかった（以下、GF/L-6ＴＭ−コントロール、ＤＢＳＴＭ−コントロールとも記する）。
・周囲条件（室温・室内湿度）で、カラムを１カ月間保存した。
・GenFastの標準プロトコールを用いて、上記媒体からＤＮＡを単離した。
・ＵＶ／ｖｉｓ分光分析、PicoGreen蛍光色素（表５および６）、およびアガロースゲル電気泳動法（図４）を用いて、ＤＮＡの質および量を評価した。
（結果）
図４は、室温で、GF/L-6ＴＭ媒体およびＤＢＳＴＭ媒体上に、１カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、０．７８％アガロースゲル電気泳動法により調べ、コントロール（図中、GLF6-コントロール、およびDBS-コントロール）とＦＴＡ（登録商標）処理したもの（図中、GLF6-FTA、およびDBS-FTA）とで比較したものである。（Ｍ＝分子量スタンダード）。
図４、並びに表５および表６は、ＦＴＡ（登録商標）処理した媒体から単離されたＤＮＡの質および量がすばらしいことを実証している。すなわち、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値が、１．８であり、ＤＮＡの約８０％が、２本鎖型であった。コントロール、すなわち、ＦＴＡ（登録商標）処理していない媒体から単離されたＤＮＡは、顕著に品質が悪かった。すなわち、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の値が、１．５〜１．２であり、２本鎖型の割合は、２０％以下であった。また、コントロールのカラムから単離されたＤＮＡの量は、ＦＴＡ（登録商標）処理されたカラムから単離されたＤＮＡの量の３〜４分の１であった。
Figure 2006501850
Figure 2006501850
〔実施例６：室温で、３．５カ月間保存した後、ガラス繊維カラムシステムから抽出されたＤＮＡ試料の質〕
（研究デザイン）
・１−ｍｌのＬＲガラス繊維GF/L-6ＴＭスピンカラムのフィルター媒体に、１ｍｌの凍結された全血液を供した。
・洗浄溶液（GenFast溶液１）を用いて、Ｈｂ、および、その他の不要な血液成分を１回洗浄した。
・上記の試験カラム内の細胞を捕捉した媒体に、ＦＴＡ（登録商標）溶液を供し、一方、コントロール群には、ＦＴＡ（登録商標）溶液を供さなかった。
・カラムを乾燥させ、周囲条件（室温、室内湿度）で、３．５カ月間保存した。
・GenFastの標準プロトコール（Whatman社）を用いて、上述の通り、上記媒体からＤＮＡを単離した。
・アガロースゲル電気泳動法（図５）およびPicoGreen蛍光色素を用いて、単離されたＤＮＡの質および量を評価した。
（結果）
図５は、室温で、GF/L-6ＴＭ媒体上に、１カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、０．８％アガロースゲル電気泳動法により調べ、コントロール（下段、コントロールカラム）とＦＴＡ（登録商標）処理したもの（上段、ＦＴＡ処理カラム）とで比較したものである。（Ｍ＝分子量スタンダード）。
その結果、ＦＴＡ（登録商標）処理された媒体から単離されたＤＮＡの質（図５）および量は、すばらしく、約８０％が２本鎖の状態で（PicoGreen蛍光色素）、収量は、カラムあたり平均１１μｇであった。また、コントロール、すなわちＦＴＡ（登録商標）処理されていない媒体から単離されたＤＮＡでは、その品質が大きく低下している徴候が見られた。
〔実施例７：室温で、５カ月間保存された後のガラス繊維カラムシステムから抽出されたＤＮＡ試料の質〕
（研究デザイン）
・ガラス繊維GF/L-6ＴＭ媒体を有する、１−ｍｌ GenFastのようなスピンカラムのフィルター媒体上に、１ｍｌの凍結された全血液を供し、減圧濾過により負荷した。
・洗浄溶液（GenFast溶液１）を用いて、Ｈｂ、および、その他の不要な血液成分を１回洗浄した。
・上記試験カラム内の上記捕捉された細胞を有する媒体に、尿酸を含まないＦＴＡ（登録商標）様溶液（Whatman社）を供した。なお、２つの試料には、２％ＳＤＳを含むＦＴＡ（登録商標）様溶液を供し、別の２つの試料には、４％ＳＤＳを含むＦＴＡ（登録商標）様溶液を供した。一方、コントロール群には、ＦＴＡ（登録商標）様溶液（Whatman社）を供さなかった。
・カラムを乾燥させて、周囲条件（室温、室内湿度）で５カ月間保存した。
・GenFastの標準プロトコール（Whatman社）を用いて、上記媒体よりＤＮＡを単離した。
・アガロースゲル電気泳動法（図６）およびPicoGreen蛍光色素を用いて、単離されたＤＮＡの質および量を評価した。
（結果）
図６は、室温で、ガラス繊維GF/L-6ＴＭをもつGenFast様スピンカラム上に、５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、０．７８％アガロースゲル電気泳動により調べ、コントロール（図中、コントロール）とＦＴＡ（登録商標）様溶液で処理したもの（図中、ＦＴＡ処理）とで比較したものである（Ｍ＝分子量スタンダード）。
４つのＦＴＡ（登録商標）処理レーンのうち、左側の２レーン（コントロールの隣）は、４％ＳＤＳを含むＦＴＡ（登録商標）様溶液で処理されたものである。一方、右側の２レーンは、２％のＳＤＳを含むＦＴＡ（登録商標）様溶液で処理されたものである。ＦＴＡ（登録商標）様溶液で処理されたレーンにおけるＤＮＡ量は、１バンドあたり約１００ｎｇである。
この結果は、ＦＴＡ（登録商標）処理された媒体から単離されたＤＮＡの質（図６）、および量は、すばらしいことを実証するものである。具体的には、全ＤＮＡの収量は、１カラムあたり平均で１６μｇであった。コントロール、すなわち、ＦＴＡ（登録商標）処理されていない媒体から単離されたＤＮＡは、その品質が大きく低下している徴候を示した（図６）。
〔実施例８：室温で、３．５カ月間保存した後のシリカゲルカラムシステムから抽出されたＤＮＡ試料の質〕
（研究デザイン）
・０．２−ｍｌのシリカゲルＱｉａＡｍｐ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）スピンカラムのフィルター媒体上に、０．２ｍｌの凍結された全血液を供した。
・洗浄溶液（GenFast溶液１）を用いて、Ｈｂ、および、その他の不要な血液成分を洗い流した。
・実験カラム内の捕捉された細胞を有する媒体に、ＦＴＡ（登録商標）溶液を供し、一方、コントロール群には、ＦＴＡ（登録商標）溶液を供さなかった。
・カラムを乾燥させ、周囲条件（室温、室内湿度）で３．５カ月間保存した。
・GenFastの標準プロトコール（Whatman社）を用いて、上述のように、上記媒体からＤＮＡを単離した。
・アガロースゲル電気泳動法（図７）およびPicoGreen蛍光色素を用いて、単離されたＤＮＡの質および量を評価した。
（結果）
図７は、室温で、ＦＴＡ（登録商標）処理されたＱｉａＡｍｐ媒体上に、３．５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、０．８％アガロースゲル電気泳動により調べた結果を示している（Ｍ＝分子量スタンダード）。
この結果は、ＦＴＡ（登録商標）処理された媒体から単離されたＤＮＡの質（図７）、および量は、すばらしいことを実証するものである。具体的には、２本鎖ＤＮＡが約７０％を占めるＤＮＡを（PicoGreen蛍光色素）、１カラムあたり平均で約３．４μｇ得ることができた。
〔実施例９：室温で３．５カ月間保存した後のＰＶＤＦカラムシステムから抽出されたＤＮＡ試料の質〕
（研究デザイン）
・GenFastカラムベースデザイン（Whatman社）の、１．２μｍＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）親水性膜（Whatman）のフィルター媒体に、０．４ｍｌの白血球細胞の懸濁液（ＷＢＣ；１μｌあたりの細胞数＝１００００）減圧濾過により供した。
・洗浄溶液（GenFast溶液１）を用いて、カラムを１回洗浄した。
・試験カラム内の上記捕捉した細胞を有する媒体に、尿酸を含むＦＴＡ（登録商標）溶液、または、改変した尿酸を含まないＦＴＡ（登録商標）溶液を供した。一方、コントロール群には、ＦＴＡ（登録商標）溶液を供さなかった。
・カラムを乾燥させ、周囲条件（室温、室内湿度）で３．５カ月間保存した。
・GenFastの標準プロトコール（Whatman社）を用いて、上述のように、上記媒体からＤＮＡを単離した。
・ＤＮＡ試料を１０倍に希釈し、アガロースゲル電気泳動法（図８）およびPicoGreen蛍光色素を用いて、単離されたＤＮＡの質および量を評価した。
（結果）
図８は、室温で、上記ＰＶＤＦ媒体上に、３カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、０．７８％アガロースゲル電気泳動により、調べたものである結果を示している（Ｍ＝分子量スタンダード、レーン１〜２＝コントロール、レーン３＝空きレーン（ブランク）、レーン４〜５＝ＦＴＡ（登録商標）処理試料、レーン６〜９＝改変したＦＴＡ（登録商標）処理試料）。この結果は、ＦＴＡ（登録商標）処理、および、改変したＦＴＡ（登録商標）処理された媒体から単離したＤＮＡの質（図８）、および量は、すばらしいことを実証するものである。具体的には、２本鎖ＤＮＡが約７５％を占めるＤＮＡ（PicoGreen蛍光色素）を、１カラムあたり平均で１５μｇ（期待される収量の約６０％）得ることができた。コントロール、すなわち、ＦＴＡ（登録商標）処理されていない媒体から単離されたＤＮＡでは、その質が大きく低下している徴候を見られた（図８）。
本明細書を通して、著者、出願年、および特許番号を用いて、米国特許を含む様々なの刊行物を引用している。本発明が属する技術の現状をより完全に述べるために、これらの刊行物および特許の完全な内容を、参考として本明細書に織り込んでいる。
本発明は、実例例を通じて述べられている。また、用いられている専門用語は、限定することを目的するものというよりはむしろ、伝達手段としての言葉または説明を目的とするものであると理解されるべきものである。
上述の説明の観点から、本発明に多くの修正や変更を加えることが可能である。したがって、特に記載がない限りは、上記のような修正や変更が加えられたものは、本発明の範囲内にふくまれるものであると理解すべきものである。
〔参考文献〕
１．米国特許第５４９６５６２号（Burgoyne, Solid medium and method for DNA storage, 1996）
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３．米国特許第５８０７５２７号（Burgoyne, Solid medium and method for DNA storage, 1998）
４．国際特許ＷＯ００／２１９７３（２０００）(Mitchell et al., Isolation Methods and Apparatus (PCT/GB99/0337(1999)))
５．米国特許第５６５８５４８号(Padhey et al., Nucleic Acid Purification on silica gel and glass mixtures, 1997)
図１Ａは、凍結されたヒトの全血液より抽出され、室温・室内湿度で１日間保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図１Ｂは、凍結されたヒトの全血液より抽出され、室温・室内湿度で５日間保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図２は、凍結されたヒトの全血液より抽出され、室温・室内湿度で２０日間保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図３は、凍結されたヒトの血液より抽出され、室温・室内湿度で３．５カ月保存した後、ガラス繊維媒体から回収されたＤＮＡの質をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図４は、室温・室内湿度で、ガラス繊維GF/L-6TMおよびＤＢＳTM媒体（Whatman）上に、１カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡと、ＦＴＡ処理されたＤＮＡとで比較した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図５は、室温・室内湿度で、ガラス繊維ＧＦ／ＬTM GenFastカラム媒体（Whatman）上に、３．５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡ（下側）と、ＦＴＡ（登録商標）処理されたＤＮＡ（上側）とで比較した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図６は、室温・室内湿度で、ガラス繊維GF/L-6TM媒体（Whatman）上に、５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡと、ＦＴＡ（登録商標）様溶液（FTA（登録商標）-treated）処理されたＤＮＡとで比較した結果を示す（Ｍ＝分子量スタンダード）。 図７は、室温・室内湿度で、シリカゲルQiaAmp Mini Kitカラム（Qiagen）上に、３．５カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質のアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す。 図８は、室温・室内湿度で、カラムベースに設計された親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に、３カ月間保存した後、単離されたＤＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動により解析し、コントロールＤＮＡと、ＦＴＡ（登録商標）処理されたＤＮＡと、改変したＦＴＡ（登録商標）処理されたＤＮＡとで比較した結果を示す（ＭＷ＝分子量スタンダード、レーン１〜２：コントロール、レーン３：試料無し（ブランク）、レーン４〜５：ＦＴＡ（登録商標）処理された試料、レーン４〜６：改変したＦＴＡ（登録商標）処理された試料）。

Claims (76)

  1. 核酸を単離および保存する方法であって、
    ａ．固相媒体を用意する工程と、
    ｂ．核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
    ｃ．細胞保持物（cell retentate）として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
    ｄ．界面活性剤、または洗剤を含む溶液と、上記細胞保持物とを接触させる工程と、
    ｅ．細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、核酸を含む細胞溶解物を形成させる工程と、
    ｆ．核酸を含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
    ｇ．上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を保存する工程と、を含む核酸を単離および保存する方法。
  2. 乾燥させる工程、すなわち工程ｆに先立ち、上記核酸が、上記固相媒体に保持されている間に、核酸を保持する上記固相媒体を、不純物を除去するために、洗浄する、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  3. 工程ｇにおける、上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を、実質的に５℃〜４０℃の温度で維持する、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  4. ｈ．上記固相媒体から、上記核酸を溶出する工程をさらに含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  5. 溶出する工程、すなわち、工程ｈに先立ち、上記核酸が、上記固相媒体に保持されている間に、不純物を除去するために、上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を、洗浄する、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  6. 上記工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも１週間である、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  7. 上記工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも１ヶ月間である、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  8. 上記工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも３ヶ月間である、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  9. 上記工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも５ヶ月間である、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  10. 上記固相媒体が、多数の繊維を含むフィルターを含有する、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  11. 上記フィルターが、実質的に無秩序な構造を有する、請求項１０に記載の核酸を単離および保存する方法。
  12. 上記繊維の直径が、１μｍ〜１０μｍの範囲内である、請求項１０に記載の核酸を単離および保存する方法。
  13. 上記フィルターが、約０．２μｍ〜約２．７μｍのポアサイズをもつ１つ以上の穴を有する、請求項１０に記載の核酸を単離および保存する方法。
  14. 上記固相媒体が、
    ａ．ガラス、またはシリカベースの固相媒体、
    ｂ．プラスチックベースの固相媒体、または
    ｃ．セルロースベースの固相媒体
    を含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  15. 上記固相媒体が、ガラス、ガラス繊維、ガラスミクロ繊維、シリカ、シリカゲル、酸化シリカ、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、糖質ポリマー（carbohydrate polymer）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidinefluoride）、ウール、または多孔質セラミックから選択される１つである、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  16. 上記工程ｄの界面活性剤または洗剤が、陰イオン性の、界面活性剤または洗剤を含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  17. 上記陰イオン性の、界面活性剤または洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項１６に記載の核酸を単離および保存する方法。
  18. 上記ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の間である、請求項１７に記載の核酸を単離および保存する方法。
  19. 上記工程ｄの溶液が、さらに、
    ｉｉ．弱塩基と、
    ｉｉｉ．キレート剤と
    を含む、請求項１６に記載の核酸を単離および保存する方法。
  20. 上記工程ｄの溶液が、さらに、
    ｉｖ．尿酸または尿酸塩
    を含む、請求項１９に記載の核酸を単離および保存する方法。
  21. 上記細胞保持物が、核由来の濃縮された物質を含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  22. 上記細胞保持物が、無傷なホールセル（intact whole cell）を含み、かつ、
    工程ｅが、
    ｉ．固相媒体によって保持された核から濃縮された物質を放出させるために、上記固相媒体によって保持された無傷なホールセルを破壊する工程と、
    ｉｉ．上記核酸を含む細胞溶解物を形成させるために、上記核由来の上記の濃縮された物質を溶解させる工程と、
    を含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  23. 上記核酸が、実質的に、非イオン的な相互作用によって、工程ｅの媒体により保持されるように、上記固相媒体の組成と、大きさとが、選択される、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  24. 上記非イオン性の相互作用が、双極分子−双極分子の相互作用（dipole-dipole interaction）、双極分子により誘導される双極分子の相互作用（dipole-induced dipole interaction）、分散力、または水素結合を含む、請求項２３に記載の核酸を単離および保存する方法。
  25. 保持する工程、すなわち工程ｅが、さらに、上記固相媒体を通る核酸の動きを物理的に妨げる工程と定義づけられる、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  26. 上記固相媒体が、カオトロピック物質（chaotrope）が存在しないときに、上記細胞と、上記核酸とを保持できる、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  27. 工程ｂが、さらに、上記固相媒体内において、上記細胞を濃縮する工程を含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  28. 溶出する工程、すなわち工程ｈに先立ち、上記核酸を加熱して、６５℃〜１２５℃の高温にする、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  29. 溶出する工程、すなわち工程ｈに先立ち、上記核酸を加熱して、８０℃〜９５℃の高温にする、請求項４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  30. 上記細胞が、白血球細胞、上皮細胞、頬細胞（buccal cell）、組織培養細胞、精液、膣細胞、尿路細胞、植物細胞、微生物細胞、および結腸直腸細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  31. 上記細胞が、白血球細胞であって、さらに、
    全血液を上記固相媒体に供する工程と、
    全血液中の赤血球細胞を溶解する任意の工程と、
    不純物を取り除くために、上記固相媒体を洗浄する任意の工程と、
    上記白血球細胞から細胞溶解物を得る工程と、
    を含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  32. 上記試料が、血液細胞を含み、
    工程ｃで保持される細胞の大部分を、白血球細胞が占めるように、上記固相媒体の大きさが、選択される、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  33. 上記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  34. 上記核酸が、ゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  35. 核酸を単離および保存する方法であって、
    ａ．固相媒体を用意する工程と、
    ｂ．核酸を含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
    ｃ．細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
    ｄ．上記細胞保持物を
    ｉ．弱塩基と、
    ｉｉ．キレート剤と、
    ｉｉｉ．陰イオン性の、界面活性剤または洗剤と、
    を含む溶液と接触させる工程と、
    ｅ．細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、核酸を含む細胞溶解物を形成させる工程と、
    ｆ．核酸を含む上記細胞溶解物を保持する上記固相媒体を乾燥させる工程と、
    ｇ．上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を保存する工程と、
    ｈ．上記固相媒体から、上記核酸を溶出する工程と、
    を含む、核酸を単離および保存する方法。
  36. 乾燥させる工程、すなわち工程ｆに先立ち、上記核酸が上記固相媒体に保持されている間に、不純物を除去するために、上記核酸を保持する固相媒体を洗浄する、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  37. 溶出する工程、すなわち、工程ｈに先立ち、上記核酸が、上記固相媒体に保持されている間に、不純物を除去するために、上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体を、洗浄する、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  38. 工程ｇにおける、上記の核酸を保持する乾燥した固相媒体が、実質的に５℃〜４０℃の温度で維持される、請求項１に記載の核酸を単離および保存する方法。
  39. 工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも１週間である、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  40. 工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも１ヶ月間である、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  41. 工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも３ヶ月間である、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  42. 工程ｇにおける核酸の保存期間が、少なくとも５ヶ月間である、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  43. 工程ｄの溶液が、さらに、
    ｄ．尿酸または尿酸塩
    を含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  44. 上記固相媒体が、多数の繊維を含むフィルターを含有する、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  45. 上記フィルターが、実質的に無秩序な構造を有する、請求項４４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  46. 上記繊維の直径が、１μｍ〜１０μｍの範囲内である、請求項４４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  47. 上記フィルターが、約０．２μｍ〜約２．７μｍのポアサイズをもつ１つ以上の穴を有する、請求項４４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  48. 上記固相媒体が、
    ａ．ガラス、またはシリカベースの固相媒体、
    ｂ．プラスチックベースの固相媒体、または
    ｃ．セルロースベースの固相媒体
    を含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  49. 上記固相媒体が、ガラス、ガラス繊維、ガラスミクロ繊維、シリカ、シリカゲル、酸化シリカ、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、糖質ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidinefluoride）、ウール、または多孔質セラミックから選択される１つである、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  50. 上記陰イオン性の、界面活性剤または洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  51. 上記ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の間である、請求項５０に記載の核酸を単離および保存する方法。
  52. 上記細胞保持物が、核由来の濃縮された物質を含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  53. 上記細胞保持物が、無傷なホールセル（intact whole cell）を含み、かつ、
    工程ｅが、
    ｉ．固相媒体によって保持された核から濃縮された物質を放出させるために、上記固相媒体によって保持された無傷なホールセルを破壊する工程と、
    ｉｉ．上記核酸を含む細胞溶解物を形成させるために、上記核由来の上記の濃縮された物質を溶解させる工程と、
    を含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  54. 上記核酸が、実質的に、非イオン的な相互作用によって、工程ｅの媒体により保持されるにように、上記固相媒体の組成と、大きさとが、選択される、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  55. 上記非イオン性の相互作用が、双極分子−双極分子の相互作用（dipole-dipole interaction）、双極分子により誘導される双極分子の相互作用、分散力、または水素結合を含む、請求項５４に記載の核酸を単離および保存する方法。
  56. 保持する工程、すなわち工程ｅが、さらに、上記固相媒体を通る拡散の動きを物理的に妨げる工程と定義づけられる、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  57. 工程ｂが、さらに、上記固相媒体上で、上記細胞を濃縮する工程を含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  58. 上記固相媒体が、カオトロピック物質（chaotrope）が存在しないときに、上記細胞と、上記核酸とを保持できる、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  59. 溶出する工程、すなわち工程ｈに先立ち、上記核酸を加熱して、６５℃〜１２５℃の高温にする、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  60. 溶出する工程、すなわち工程ｈに先立ち、上記核酸を加熱して、８０℃〜９５℃の高温にする、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  61. 上記細胞が、白血球細胞、上皮細胞、頬細胞（buccal cell）、組織培養細胞、精液、膣細胞、尿路細胞、植物細胞、微生物細胞、および結腸直腸細胞からなる群より選択される、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  62. 上記細胞が、白血球細胞であって、さらに、
    全血液を上記固相媒体に供する工程と、
    赤血球細胞を溶解する任意の工程と、
    不純物を取り除くために、上記固相媒体を洗浄する任意の工程と、
    上記白血球細胞から細胞溶解物を得る工程と、
    を含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  63. 上記試料が、血液細胞を含み、
    工程ｂで保持される細胞の大部分を、白血球細胞が占めるように、上記固相媒体の大きさが、選択される、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  64. 上記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  65. 上記核酸が、ゲノムＤＮＡを含む、請求項３５に記載の核酸を単離および保存する方法。
  66. ＤＮＡを単離および保存する方法であって、
    ａ．固相媒体を用意する工程を含み、
    上記固相媒体が多数の繊維を含むフィルターを含有し、
    上記繊維が、
    ｉ．ガラスまたはシリカベースの繊維、
    ｉｉ．プラスチックベースの繊維、または
    ｉｉｉ．ニトロセルロースまたはセルロースベースの繊維
    を含み、かつ、
    ｂ．ＤＮＡを含む細胞を含有する試料を、上記固相媒体に供する工程と、
    ｃ．細胞保持物として、上記細胞を上記固相媒体で保持し、不純物を除去する工程と、
    ｄ．上記細胞保持物を
    ｉ．弱塩基と、
    ｉｉ．キレート剤と、
    ｉｉｉ．陰イオン性の、界面活性剤または洗剤と、
    を含む溶液と接触させる工程と、
    ｅ．細胞溶解物が上記媒体上に保持されている間に、上記細胞保持物を溶解し、ＤＮＡを含む細胞溶解物を形成させる工程と、
    ｆ．ＤＮＡを含む上記細胞溶解物を保持する固相媒体を乾燥させる工程と、
    ｇ．上記のＤＮＡを保持する乾燥した固相媒体を、５℃〜４０℃の温度で、保存する工程と、
    ｈ．上記固相媒体と共に、上記ＤＮＡを加熱し、６５℃〜１２５℃の高温にする工程と、
    ｉ．上記固相媒体から、上記ＤＮＡを溶出する工程と、
    を含む、ＤＮＡを単離および保存する方法。
  67. 工程ｇにおけるＤＮＡの保存期間が、少なくとも１週間である、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  68. 工程ｇにおけるＤＮＡの保存期間が、少なくとも１ヶ月間である、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  69. 工程ｇにおけるＤＮＡの保存期間が、少なくとも３ヶ月間である、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  70. 工程ｇにおけるＤＮＡの保存期間が、少なくとも５ヶ月間である、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  71. 上記繊維の直径が、１μｍ〜１０μｍの範囲内である、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  72. 上記フィルターが、約０．２μｍ〜約２．７μｍのポアサイズをもつ１つ以上の穴を有する、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  73. 工程ｄの溶液が、さらに、
    ｉｖ．尿酸または尿酸塩
    を含む、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  74. 上記細胞保持物が、無傷なホールセル（intact whole cell）を含み、かつ、
    工程ｅが、
    ｉ．固相媒体によって保持された核から濃縮された物質を放出させるために、上記固相媒体によって保持された無傷なホールセルを破壊する工程と、
    ｉｉ．上記ＤＮＡを含む細胞溶解物を形成させるために、上記核由来の濃縮された物質を溶解させる工程と、
    を含む、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  75. 上記ＤＮＡが、実質的に、非イオン的な相互作用によって、工程ｅの媒体により保持されるにように、上記固相媒体の組成と、大きさとが、選択される、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
  76. 上記陰イオン性の、界面活性剤または洗剤が、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の間の濃度のドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項６６に記載のＤＮＡを単離および保存する方法。
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