JP2010505396A - リボ核酸を抽出するための安定化組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の組成物は、RNAを体液または組織から抽出し、その中に含まれるRNAを長期間、室温で安定に維持するための組成物である。
理論に拘束されたくないが、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼの作用がそれらの複合体構造、特にそれらの触媒部位を破壊するアニオン系界面活性剤により阻害されると考えられる。それ故、アニオン系界面活性剤は本発明の組成物中に含まれうる。適切なアニオン系界面活性剤の非限定的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、サルコシンナトリウム(サルコシル)、ドデシル硫酸リチウム、1−オクタンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明の一実施形態によると、組成物は、アニオン系界面活性剤および5〜8.2の範囲内のpHを維持するための緩衝液を含有する。本発明の別の実施形態によると、組成物は、変性剤および5.1〜7.0の範囲内のpHを維持するための緩衝液を含有する。一例では、組成物のpHは約5.5〜約7.5の範囲内にある。一例では、組成物のpHは約6.5〜約7.0の範囲内にある。一例では、組成物のpHは約6.8である。組成物のpHは、緩衝液を用いて所望のpHに維持されうる。
本発明の別の態様によると、RNAを室温で長期間保存するための方法が提供される。
本発明の組成物および方法は、広範囲の用途での使用に適する。
被験者に対し、最終の食事から30〜60分間あけるよう指示する。可能であれば、被験者に自分の歯を(歯磨き粉を用いずに)磨いてもらう。可能であれば、被験者に自分の歯を水50mlですすいでもらう。そして被験者に5〜10分間待機するよう指示することで、口からの水分の除去が可能になる。唾を吐くことができる被験者においては、特定の採取チューブに唾液の量が1もしくは2mlの水準に達するまで唾液を吐くように指示される。最後の食事から時間をあけて口をすすいでもらうことが望ましいが、必須ではない。唾液の採取には数分かかる場合がある。被験者が十分な量の唾液をだせないばあい、その被験者に数粒のテーブルシュガーを与え、舌の上に乗せるか或いは噛んでもらう。このとき、被験者には、糖の一部がチューブ内に吐き出されてしまうかどうか気にかけないように伝えられる。吐くことができない被験者(例えば、幼児、若年小児、制限/障害を有する者)においては、試料採取のため、糖とともに道具(例えば、綿棒、ブラシ、トランスファーピペット)の使用が可能である。同様に、被験者に液体(例えばうがい薬、水、生理食塩水)を提供して自らの口および喉をうがいするかまたは生理食塩水を提供して自らの鼻腔を洗い出すことが可能である。前記液体を用いて採取した試料であれば、採取チューブ内に送達されることになる。唾液/喀痰/鼻汁が前記液体により実質的に希釈されている状況であれば、その結果より多量の本発明の組成物が提供されることになる。
試料採取
この実施例では、一人の被験者から2種の喀痰/唾液試料(各2ml)を短期間内に得た。第1の試料を採取し、4% SDS、50mM CDTA、pH6.6を含む本発明の組成物2mlを有するバイアルに入れた。その後間もなく、同じ被験者が提供した第2の試料をオラジーン(Oragene)(商標)溶液2mlを有するバイアルに入れた。核酸の精製の3日前、試料を振とうさせ、室温(RT)で放置した。
核酸を、オラジーン(Oragene)(商標)中または本発明の組成物中でこの被験者の唾液から精製した。オラジーン(Oragene)(商標)中の被験者の試料の一部をプロテイナーゼKと混合し50℃で2時間加熱し、次いで90℃で15分のさらなる加熱を行うか(図1および2)または行わなかった(図2)。組成物中の被験者の試料の一部をプロテイナーゼKと混合し、50℃で2時間、次いで90℃で15分間加熱した(図1)。一部の唾液試料に対しては、50℃超の温度での短時間のインキュベーションが、本発明の組成物中での採取された唾液からの無傷の高分子量RNAの抽出の促進に必要であることが見出されたが、オラジーン(Oragene)(商標)中で採取された唾液に対しては全く効果がなかった。
この実施例は、i)唾液のリボ核酸を室温で少なくとも3日間保存する本発明の組成物の能力と、ii)実質的に無傷のリボ核酸を回収するための抽出/精製手順の適合性について示す。この実施例は、RNAの安定性の観点での本発明の組成物のオラジーン(Oragene)(商標)に対する優位性について示す。
方法
純粋RNAを6倍に希釈し、広範囲のpH値(pH3.0、5.0、6.0、7.0、8.2および10.0)にわたる緩衝化溶液を調製した。RNAのリン酸ジエステル骨格での部分加水分解の発生を可能にするため、50℃で16時間のインキュベーション期間後、各pH値に緩衝化されたRNAの一定分量(下記)を0.9%アガロースゲル上での電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した(図3)。
リボソームRNAの染色二重バンド特性がpH5.0〜8.2処理レーンで保たれていることから示されるように、RNAは中性から弱酸性pHで化学的に安定である。上部バンドの強度低下が下部バンドの強度低下前に予想されることに注意のこと。理論に拘束されたくないが、これは短い方のRNA種(下部バンド)よりも1つのリン酸ジエステル骨格が切断される確率が高い大きい方のリボソームRNA種に起因する可能性が高い。2つのリボソームRNA種に特有のバンドパターンが、より強酸で、各々3.0および10.0の基本的なpH値で完全に消失する。
方法
3人の被験者に、唾液1mLを等量の生理食塩水を含有するチューブ内に吐いてもらった。その直後、唾液試料および生理食塩水を混合し、高速遠心分離を施し、唾液中に含有される細胞をペレット化した。得られた上清、つまり細胞を含有しない唾液画分(CFSF)を希釈し、次いで一定量(1.0μg)の純粋RNAと増加量で混合した。CFSFと混合した純粋RNAを37℃で30分間インキュベートし、次いでアガロースゲル(1.0%)での電気泳動により分析した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、RNAの完全性を画像化した(図4)。
RNAは、細胞を含有しない唾液1μlの画分とともにインキュベートされる場合、速やかに分解される。それ故、強力なリボヌクレアーゼ活性が唾液の細胞外画分中に存在する。
方法
唾液のリボヌクレアーゼが活性を示すpH範囲を決定するため、0.1μL相当のCFSF(被験者2、実施例4)を、pH5.1、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.1および8.6に緩衝化した純粋RNA1μgと混合した。この実施例では、CFSFの不在下での純粋RNA(レーン10)を、この実施例で用いられるRNAの状態すなわち無傷性を例示するために含めた。37℃で30分間のインキュベーション後、試料をアガロースゲル(0.9%)での電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した(図5)。RNA分解の兆候には、1)一方もしくは両方のリボソームRNAサブユニット、ゲルの中央での明確な二重バンドの消失、2)臭化エチジウムで染色された物質の細長いスミア標本の出現、および/または3)ゲル上での臭化エチジウムで染色された物質の対照RNAマーカーよりも加速された移動度が含まれる。
pH>6.5に緩衝化された純粋RNAが、細胞を含有しない唾液0.1μLの添加時に速やかに分解された(レーン6〜9)。pH5.1〜6.5で、純粋RNAが、細胞を含有しない唾液の存在下で無傷のままであった。これらの実験結果は、唾液に対して内因性のリボヌクレアーゼが中性(pH7.0)から弱アルカリ性pHで最適な酵素活性を示すことを示唆している。酸性条件下では有意なリボヌクレアーゼ活性が全く検出されなかった(レーン2〜5)。
方法
5人の対象から採取した唾液から本発明の3つのうちの1つの組成物に抽出したRNAの例を示す(図6)。唾液を採取し、直ちに等量の指示組成物と混合した。組成物は、SDS(下記の表中に示される濃度でのドデシル硫酸ナトリウム)を含有し、50mM CDTA(シクロヘキサンジアミン四酢酸のナトリウム塩)を用いてpH6.2に緩衝化した。唾液の各試料を等量の表示した組成物と混合し、室温で3週間保存した。各試料中に含有されるRNAを調べるため、一定分量50μlを取り出し、90℃で15分間加熱し、次いで5倍希釈した。プロテイナーゼKを一定分量の各希釈物に添加し、次いで50℃で1時間インキュベートし、プロテアーゼによりタンパク質を消化させた。室温に冷却後、KClの2.5M溶液10μlを添加してSDSを沈殿させ、次いで試料を遠心して沈殿SDSを除去した。95%冷却エタノール(2倍量)を透明な上清に添加し、核酸を沈殿させた。−20℃で1時間放置後、沈殿核酸を希釈緩衝液25μl中に溶解した。この溶液10μl(元の唾液約10μlに相当)を0.9%アガロースゲルにアプライし、1時間電気泳動を行った。ゲルを臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した。各試料レーンにおける上部バンドはゲノムDNAである。ゲルの中央の2つのバンドは、唾液中に存在しかつ指示組成物により保存されたリボソームRNAを示す。
これらのデータは、唾液中のRNAが、弱酸性性pH(6.2)に緩衝化された、アニオン系界面活性剤(濃度:8〜16% SDS)を含む組成物と1:1で混合される場合、室温で少なくとも3週間安定であることを示す。これらのデータは、唾液中に存在するRNAの量において被験者間でかなりのばらつきがあることも示す。
この実施例では、組成物は、pH6.2に緩衝化された16% SDS、50mM CDTAを含有した。唾液試料を組成物と1:1で混合し、室温(RT)または37℃のいずかで7日間保存した。試料を37℃でインキュベートすることにより、RTと比べ、唾液のリボヌクレアーゼによるRNAの分解が促進されると予想され、RNAが存在する場合には本発明の組成物中での活性が保持される必要がある。試料を90℃で15分間加熱し、次いで5倍に希釈し、プロテイナーゼKとともに50℃で1時間インキュベートした。SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の95%冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した(図7)。
この実施例は、唾液の試料中のRNAを安定化するための本発明の組成物の有効性を示す。37℃で1週間後、4人の被験者から得た唾液試料は、高分子量RNAが大して分解されないことを示した。
この実施例では、クエン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液(pKa6.4、50mM)を先の組成物中のpHの緩衝化に用いたCDTAと交換した。他の実施例などでは、唾液を2人の被験者から採取し、組成物(pH6.6に緩衝化された4% SDS、50mMクエン酸)と1:1で混合した。次いで、試料を室温で3週間保存した。唾液/組成物混合物中に存在するRNAを抽出するため、試料をプロテイナーゼKとともに50℃で1時間インキュベートし、90℃で15分間加熱し、SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の冷却エタノールで上清から沈殿させた。抽出された物質がRNAであることを確認するため、沈殿核酸の一部を膵リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)で処理した。次いで、RNアーゼでの処理抽出物および未処理抽出物をアガロースゲル電気泳動により分離し、上記のように臭化エチジウムで染色した(図8)。レーン5および9における速やかに移動するRNアーゼ耐性材料の一部がDNAである可能性が高く、90℃での加熱期間により変性され、部分的に分解されていることに注意のこと。
この実施例は、組成物のpHの緩衝化にクエン酸とCDTAとの交換が適することを示す。
この実施例では、サルコシル(N−ラウロイルサルコシンナトリウム塩またはラウロイルサルコシンナトリウム)をSDSと置換した。唾液を3人の被験者から採取し、i)pH6.6に緩衝化された4%サルコシル、50mM CDTAと、ii)pH6.6に緩衝化された8%サルコシル、50mM CDTAの2つの組成物と1:1で混合した。次いで、試料を室温で3週間保存した。唾液/組成物混合物中に存在するRNAを抽出するため、試料の一部をプロテイナーゼKとともに50℃で1時間インキュベートし、90℃で15分間加熱し、塩化カリウムで処理し、遠心分離した。上清中に残存する核酸を2倍量の冷却エタノールで沈殿させた。抽出された材料がRNAであったことを確認するため、沈殿核酸の一部を膵リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)で処理した。次いで、RNアーゼでの処理抽出物および未処理抽出物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した(図9)。
この実験は、サルコシルという別の強力なアニオン系界面活性剤が本発明の組成物中でSDSと交換可能であることを示す。実施例6および9は、アニオン系界面活性剤が適切な緩衝剤とともに唾液中のRNAを有効に安定化することを示す。
この実施例では、組成物は、pH6.6で緩衝化された4% SDS、50mM CDTAを含有した。1人の被験者から得た唾液試料を組成物と1:1で混合し、室温で6日間インキュベートした。唾液/組成物混合物中に存在するRNAを抽出するため、まず試料をプロテイナーゼKとともに50℃で1時間インキュベートし、タンパク質を消化した。一定分量を採取し、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃もしくは90℃で15分間加熱した。SDSを塩化カリウムで加熱された一定分量から沈殿し、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した(図10)。
この実施例では、50℃超と最大で約90℃の温度での15分間の加熱により、この唾液/組成物試料から抽出された高分子量RNAの収量が50℃のみの場合と比べて改善された。これらの結果は、抽出されたRNAの、最大90℃の温度で15分間の加熱ステップによる分解が有意でないことも示す。
この実施例では、組成物は、pH6.6で緩衝化された4% SDS、50mM CDTAを含有した。2人の被験者から得た唾液試料を組成物と1:1で混合し、室温で4日間インキュベートした。唾液/組成物混合物中に存在するRNAを抽出するため、まず試料をプロテイナーゼKとともに50℃で1時間インキュベートし、タンパク質を消化した。一定分量を採取し、90℃で0、5、15、30もしくは60分間加熱し、次いで水で4倍に希釈し、室温でさらに18時間インキュベートした。試料を希釈し、SDSの濃度を通常であればRNアーゼ活性を許容することになるレベルまで低下させることにより、加熱ステップの効率の試験が可能になった。SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した(図11;被験者1、左パネル;被験者2、右パネル)。
この実施例では、90℃での5〜15分の加熱により、2人の被験者の試料から抽出された無傷RNAの収量が未加熱試料の場合に対して改善された。RNAの分解が90℃で30および60分間加熱された試料中で観察された。
この実施例では、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を用い、本発明の組成物中での採取された6人の被験者の唾液から回収されたRNA中でのヒト特異的なメッセンジャーRNAの検出が可能であることが示される。
6人の被験者から得た唾液試料を組成物(4% SDS、50mM CDTA、pH6.6で緩衝化)と1:1で混合し、室温で10〜16日間保存した。室温での保存後、各唾液/組成物混合物の一部をプロテイナーゼKとともに50℃で1時間、次いで90℃で15分間加熱した。SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の95%冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した(図12)。
この実施例は、唾液中のヒトメッセンジャーRNAが本発明の組成物により安定化され、かつ抽出物がRT−PCR分析に適することを示す。
この実施例では、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を用い、本発明の組成物中で採取された唾液から回収された全RNA中でのウイルスRNAの検出が可能であることが示される。
被験者1由来の2つの唾液(1mL)試料に、pH6.6に緩衝化された4% SDS、50mM CDTAとの1:1の混合の前に、4.25×109pfu(プラーク形成単位)の水疱性口内炎ウイルス(VSV)を添加し、室温で5分間インキュベートした。各唾液/組成物試料からの一定分量0.5mLを取り出し、プロテイナーゼKとともに50℃で1時間、次いで90℃で15分間加熱した。SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の95%冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿物を適切な緩衝液(0.1M NaClを含有するCBS100μl)中に再溶解させ、次いで核酸を、冷却エタノール200μlを添加し−20℃で40分間インキュベートすることにより再沈殿させた。沈殿核酸を水50μl中にリボヌクレアーゼ阻害剤を用いて再溶解した。上記の核酸の精製の前に、被験者1由来の1つの試料を室温で4週間保存した。被験者2由来の唾液試料2mLを本発明の組成物と1:1で混合し、次いで5.0×107pfuのVSVと混合した。室温で18時間のインキュベーション後、RNAを80℃で40分間インキュベートすることにより一定分量0.5mLから抽出し、その後の精製におけるステップは上記の通りであった。
この実施例は、唾液中のウイルスRNAが本発明の組成物により安定化され、かつ抽出材料がRT−PCR分析に適することを示す。
この実施例では、組成物は、pH6.8に調整された4% SDS、50mM LiCDTA、250mM LiClを含有した。10人の被験者由来の唾液試料(2mL)を採取し、組成物と1:1で混合した。採取の直後、試料を激しく振とうし、一定分量100μLを取り出した。各一定分量を室温(RT)、4℃および−20℃で保存した。RT、4℃、および−20℃での1週間および8週間の保存後、試料を分析した。唾液/組成物混合物からRNAを抽出するため、一定分量を、プロテイナーゼKの存在下、50℃で1時間、次いで90℃で15分間加熱した。SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の95%冷却エタノールで上清から沈殿させた。各沈殿核酸試料の一部をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色し、透光下で撮影した(図14Aおよび14B)。
これらの例は、唾液の試料中のRNAを室温で長期間安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。8週間後、10人の被験者由来の唾液試料は、(図14Aおよび14Bに示されるように)高分子量RNAが大して分解されず、(表VIに示されるように)ヒト18SリボソームRNAにおけるCt値の変化が有意でないことが示された。
この実施例では、RT−PCRを用い、本発明の組成物中で幼児および若年小児11名の唾液から回収されたRNA中でのヒト特異的なメッセンジャーRNAの検出が可能であることが示される。唾液試料の採取は、前記被験者が唾液1〜2mLを採取デバイスに直接送達できなかったことから、フォームチップ綿棒(foam−tipped swab)(1被験者当たり綿棒5本)を用いて容易にした。少量の糖を用い、若年小児からの唾液の分泌が刺激された。試料採取の直後、ハサミを用いて各綿棒のフォームチップを切断し、pH6.8に調整された4% SDS、50mM LiCDTA、250mM LiClを含む本発明の組成物(2mL)を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温(RT)で保存した。試料を、RTで最大で1週間保存後、プロテイナーゼKの存在下、50℃で1時間加熱した。唾液/組成物をフォームチップから以下の低速遠心分離により回収した。チップを、15mLのコニカルチューブ内部に配置した5mLのプラスチック注射器のバレルに移し、それに対して低速遠心分離を行った。回収された液体を採取デバイス内に残存する試料とともにプールした。唾液試料からRNAを抽出するため、一定分量を90℃で15分間加熱し、SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の95%冷却エタノールで上清から沈殿させた。
これらの例は、幼児および若年小児、すなわち採取デバイスに直接唾を吐けない個体から非侵襲的に採取した唾液の試料中のRNAを安定化するための本発明の組成物の有効性を示す。RT−PCR分析に適する大量のヒトRNAが前記「唾を吐かない者(non−spitters)」の唾液から回収されうる。
被験者から鼻前部または鼻咽頭試料を採取するため、種々の道具の使用が可能である。粘膜細胞を硬いもしくは軟らかいブラシ、綿棒、またはプラスチック/木製のスクレーパを用いてこすり、液体(例えば生理食塩水)を導入して液体を回収することにより細胞を鼻腔から流し出すことが可能である。例えば、硬い綿棒/ブラシを鼻の前部に、かつ軟らかい綿棒/ブラシを後部鼻咽頭腔に置き、それを用いて粘膜分泌物を採取し、細胞を粘膜から優しくこすり落としてもよい。前記液体および/または道具を用いて採取した試料を、本発明の組成物を有する採取デバイスに送達してもよい。組成物の容量より多い容量の前記液体を導入することが望ましい状況であれば、それに対応するより多量の本発明の組成物が提供されることになる。切断デバイス(例えばハサミ)を用いて綿棒/アプリケータの取っ手の長さを短くすることで、採取デバイスの閉鎖が可能になる。あるいは、加圧下で折れる取っ手を有する綿棒またはブラシ、ならびに取っ手/シャフト内に成形された切断点を有する綿棒またはブラシを用い、試料採取が容易になりうる。「完全長」の取っ手により試料の採取が容易になり、かつ改変された切断点での綿棒/ブラシの短縮により採取デバイスへのよりよい適合が可能になる。鼻腔から採取した組織試料からRNAを回収することも可能である。それに続くRNA単離においては、鼻形成術または内視鏡的洞手術を受ける患者から得られた新しい組織標本/生検(例えば正常な鼻粘膜または鼻ポリープ組織)の採取が本発明の組成物中で可能である。
この実施例では、組成物は、pH6.8に調整された4% SDS、50mM LiCDTA、250mM LiClを含有した。鼻前部試料を1被験者当たりフォームチップ綿棒2本で採取した。試料採取の直後、ハサミを用いて各綿棒のフォームチップを切断して、本発明の組成物(2mL)を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温(RT)で保存した。室温での1日および4週間の保存後、各試料由来の一定分量を分析した。鼻試料からRNAを抽出するため、一定分量をプロテイナーゼKの存在下、50℃で1時間、次いで90℃で15分間加熱した。SDSを塩化カリウムで沈殿させ、沈殿物の遠心分離による除去後、核酸を2倍量の95%冷却エタノールで上清から沈殿させた。
この実施例は、鼻腔から採取した試料中のRNAを室温で長期間安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。4週間後、(表VIIIに示されるように)7人の被験者由来の鼻前部試料が示すヒト18SリボソームRNAにおけるCt値の変化は全く有意でなかった。重要なことに、この実施例は、鼻腔がヒトRNAの新規供給源であることを示す。
この実施例は、図15に示されるように、被験者から唾液を採取するために行われうるステップの一例を提供する。
この実施例は、本発明の組成物を用いて保存された試料からのRNAの単離のために行われうるステップの一例を提供する。この実施例では、本発明の組成物を試料(唾液など)と混合し、室温で保存する。次いで、以下のステップを用い、試料/組成物混合物を処理し、RNAが試料から精製されうる。
1.中和剤溶液。
2.エタノール溶液:70%および80%(室温)、95%(−20℃)。
3.キアゲン(Qiagen)アールエヌイージー・マイクロキット(RNeasy Micro Kit)(カタログ番号74004)および使用説明書。アールエヌイージー(RNeasy)キットの成分:RLT緩衝液、ミンエルート(MinElute)スピンカラム、採取チューブ、RW1緩衝液、ディーエヌアーゼI(DNase I)ストック溶液、RDD緩衝液、RPE緩衝液およびRNアーゼを含有しない水。あるいは、キアゲン(Qiagen)アールエヌイージー・ミニキット(RNeasy Mini Kit)(カタログ番号74104)は、キアゲン(Qiagen)アールエヌアーゼ−フリー・ディーエヌアーゼ・セット(RNase−Free DNase Set)(カタログ番号79254)と併用されうる。
1.本発明の組成物と組み合わせた試料を受け取る場合(例えば研究室内で)、8秒以上の間、非常に激しく振とうさせる。
2.試料は、室温で最大で8週間保存されうる。または−20℃で永続的に凍結保存されうる。
3.精製の前に、全試料を、50℃で、水槽内で1時間またはエアインキュベーター内で2時間、元のバイアル内でインキュベートする。
1.一定分量250〜500μLを1.5mLのマイクロ遠心チューブに移す(2つのチューブ内で一定分量1000μLが処理される必要がある)。
2.一定分量を90℃で15分間インキュベートし、次いで室温まで冷却する。
3.1/25倍量の中和剤溶液(例えば試料250μLに対して中和剤10μL)を添加する。氷上で10分間インキュベートする。
4.最大速度(>13,000×g)で3分間遠心分離する。
5.ペレットを破壊しないように注意し、上清を新しいチューブに慎重に移し、ペレットを捨てる。
6.2倍量の95%冷却EtOH(エタノール)を添加する。転倒攪拌、ボルテックスまたは振とうにより徹底的に混合する。
7.−20℃で30分間インキュベートする。
8.沈殿物を最大速度(>13,000×g)で3分間の遠心分離により回収する。
9.ペレットを破壊しないように注意し、上清を慎重に移して捨てる。
10.ペレットを緩衝液RLT(アールエヌイージー(RNeasy))350μL中に激しいボルテックスにより溶解させる。このとき、ペレットが完全に溶解されるように注意する。
11.1倍量(350μL)の70%エタノールを添加する。ボルテックスにより十分に混合する。
12.直ぐにキアゲン(Qiagen)アールエヌイージー・サンプル・ピューリフィケーション(RNeasy Sample Purification)の使用説明書の手順に進む。
キアゲン(Qiagen)アールエヌイージー・マイクロキット(RNeasy Micro Kit)による「動物細胞からの全RNA単離」プロトコルのステップ#5(注:溶出ステップ#13にやや改良を加えたもの)から開始。
5.2mLの採取チューブ内のアールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラム上に試料を移す。蓋を閉じ、>8000×gで15秒間遠心分離する。濾過物を捨てる。ステップ6で回収チューブを再使用する。
6.350μLの緩衝液RW1をアールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラムに添加する。蓋を閉じ、>8000×gで15秒間遠心分離する。濾過物を捨てる。ステップ8で回収チューブを再使用する。
7.10μLのディーエヌアーゼI(DNase I)ストック溶液を70μLの緩衝液RDDに添加する。チューブを静かに反転させて混合する。
8.ディーエヌアーゼI(DNase I)インキュベーション混合物(80μL)をアールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラム膜上に直接添加し、ベンチトップ上で15分間インキュベートする。
9.350μLの緩衝液RW1をアールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラムに添加する。蓋を閉じ、>8000×gで15秒間遠心分離する。濾過物および回収チューブを捨てる。
10.アールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラムを新しい2mLの回収チューブ内に設置する。500μLの緩衝液RPEをスピンカラムに添加する。蓋を閉じ、>8000×gで15秒間遠心分離する。濾過物を捨てる。ステップ11で回収チューブを再使用する。
11.80%エタノール500μLをアールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラムに添加する。蓋を閉じ、>8000×gで2分間遠心分離する。濾過物および回収チューブを捨てる。
12.アールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラムを新しい2mLの回収チューブ内に設置する。スピンカラムの蓋を開き、全速で5分間遠心分離する。濾過物および回収チューブを捨てる。
13.アールエヌイージー・ミンエルート(RNeasy MinElute)スピンカラムを新しい1.5mLの回収チューブ内に設置する。RNアーゼを含有しない水25μLをスピンカラム膜の中央に直接添加する。室温で5分間インキュベートする。蓋を閉じ、全速で1分間遠心分離し、RNAを溶出する。
この実施例では、RT−PCRを用い、本発明の組成物中で若年小児6名の鼻腔前部から回収されたRNA中のヒト特異的なメッセンジャーRNAを検出した。試料を、フォームチップ綿棒2本(1鼻孔につき綿棒1本)を用いて採取した。具体的には、成人がフォームチップを小児の鼻腔前部/下部に挿入し、フォームチップで綿棒を円運動させることにより粘膜を採取した。第2の鼻孔においては新しい綿棒で手順を繰り返した。試料採取の直後、ハサミを用い、各綿棒のフォームチップを切断し、pH6.8に緩衝化された4% SDS、50mM LiCDTA、250mM LiClからなる本発明の組成物(2mL)を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温(RT)で保存した。
この実施例は、小児由来の鼻前部試料中のRNAを抽出しかつ安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。RT−PCR分析に適する大量のヒトRNAは、侵襲性が最小限のこの採取方法および安定化組成物により小児から回収されうる。
鼻腔および口腔試料を、肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリおよびウマなどの家畜から採取してもよい。非限定的な具体例としては、鼻腔または口腔試料は、乳牛(ボビダエ・ボス・タウルス(Bovidae Bos taurus))から、ウシが搾乳室内の支柱の所に立っている間かまたは檻につながれている間、容易に採取可能である。動物の年齢、サイズ、および/または力により、鼻試料の採取における動物の頭部の制止/固定または口腔試料の採取における動物の口を開けるのに調教師の支援が必要とされる場合もあればそうでない場合もある。種々の道具を用い、家畜からの鼻腔および口腔試料の採取が可能である。例えば、上記の実施例16における道具と同じかまたは類似の道具の使用が可能である。道具が挿入されることになる空洞の寸法を考慮し、道具を適切にサイジングする必要がある。この方法を用いると獣医の支援が必要でない場合があることは明白であろう。
この実施例では、組成物は、pH6.8に緩衝化された4% SDS、50mM LiCDTA、250mM LiClを含有した。鼻前部試料を、ウシ1頭につき大きいフォームチップ綿棒(頭長2.6cm、頭幅1.2cm、綿棒長15.1cm)1本を用いて採取した。各々の場合、ウシの頭部を「調教師」により固定する間、「コレクター(collector)」により綿棒のフォームチップをウシの鼻孔、具体的には鼻前部に速やかに挿入した。フォームチップを鼻前部/鼻孔の粘膜に対して速やかにこすり、次いで回収した。通常、「調教師」は子牛からの鼻試料の採取にとって必要ではない。採取直後、ハサミを用い、綿棒のフォームチップを切断し、本発明の組成物(2mL)を有する採取デバイスに入れた。試料を激しく振とうし、室温(RT)で保存した。
この実施例は、(表Xに示されるように)乳牛の鼻腔前部から採取した試料中のRNAを抽出しかつ安定化させるための本発明の組成物の有効性を示す。重要なことには、この実施例は、鼻腔がウシにおけるメッセンジャーRNAの新規の豊富な供給源であることを示す。
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Claims (30)
- 試料由来のリボ核酸を、前記試料中の前記リボ核酸が室温で安定に維持されるように抽出しかつ保存するための組成物であって、
a.アニオン系界面活性剤、および
b.pH約5〜約8.2の緩衝剤
を含有し、前記リボ核酸を室温で安定化する、組成物。 - 前記アニオン系界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム(サルコシル)、ドデシル硫酸リチウムまたは1−オクタンスルホン酸ナトリウムである、請求項1に記載の組成物。
- 前記アニオン系界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはラウロイルサルコシン酸ナトリウムである、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記ドデシル硫酸ナトリウムまたはサルコシルが、前記試料と混合されたとき、約0.5%〜約8%の濃度である、請求項3に記載の組成物。
- 前記緩衝剤のpHが、約5.1〜約7、約5.5〜約7.5、約6.5〜約7.0または約6.8である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝剤が、シクロヘキサンジアミンテトラアセテート(CDTA)ナトリウム、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(ヘペス)、酢酸または酢酸塩(例えば酢酸ナトリウム)、クエン酸またはクエン酸塩、リンゴ酸、フタル酸、コハク酸、ヒスチジン、ピロリン酸、マレイン酸、カコジル酸、ββ’−ジメチルグルタル酸、炭酸または炭酸塩、5(4)−ヒドロキシメチルイミダゾール、グリセロール2−リン酸、エチレンジアミン、イミダゾール、ヒ酸、リン酸またはリン酸塩、酢酸ナトリウム、2:4:6−コリジン、5(4)−メチルイミダゾール、N−エチルモリホリン、トリエタノールアミン、ジエチルバルビツール酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、4−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸(EPPS)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、それらの類似体、あるいはこれらの組み合わせである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝液が、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、エチレンジアミン緩衝液またはイミダゾール緩衝液である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記緩衝剤がCDTAまたはクエン酸である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記試料が哺乳動物由来の体液または体組織である、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物がヒトまたはウシである、請求項9に記載の組成物。
- 前記試料が、ヒト;非ヒト霊長動物;ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒルもしくはガチョウを含む家禽を含む家畜;シカ、ヘラジカ、ムース、魚、鳥またはクマを含む狩猟動物または野生動物;非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミもしくはハムスターを含む齧歯類を含む実験動物またはペット;イヌ;ネコ;魚;ヘビ;トカゲ;カメ;ウマ;植物;植物の一部;細胞系;土壌微生物;汚水微生物;またはウイルス、細菌もしくは寄生虫を含む病原微生物に由来する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、室温で少なくとも約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間または8週間、約1日間〜約8週間、または約8週間超にわたり前記リボ核酸を安定化する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、室温で約1日間〜約8週間にわたり前記リボ核酸を安定化する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 生物学的試料由来のリボ核酸を保存するための方法であって、
a.前記試料を対象から得るステップと、
b.前記試料を、アニオン系界面活性剤とpH約5〜約8.2の緩衝剤とを含有する組成物と接触させ、混合物を形成するステップと、
c.前記混合物を室温で保存するステップと、
d.以降の処理の前に、前記混合物を約50℃以上で加熱するステップと、
を含み、前記組成物が前記リボ核酸を室温で安定化する、方法。 - ステップdが、前記混合物をプロテアーゼと接触させるステップをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがプロテイナーゼKである、請求項15に記載の方法。
- (e)以降の処理の前に、前記混合物を約90℃以上で加熱するステップをさらに含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン系界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウムまたは1−オクタンスルホン酸ナトリウムである、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン系界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはサルコシンナトリウムである、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドデシル硫酸ナトリウムまたはサルコシルが、約0.5%〜約8%の濃度である、請求項14〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝剤のpHが、約5.1〜約7、約5.5〜約7.5、約6.5〜約7.0または約6.8である、請求項14〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝剤が、シクロヘキサンジアミンテトラアセテート(CDTA)ナトリウム、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(ヘペス)、酢酸または酢酸塩(例えば酢酸ナトリウム)、クエン酸またはクエン酸塩、リンゴ酸、フタル酸、コハク酸、ヒスチジン、ピロリン酸、マレイン酸、カコジル酸、ββ’−ジメチルグルタル酸、炭酸または炭酸塩、5(4)−ヒドロキシメチルイミダゾール、グリセロール2−リン酸、エチレンジアミン、イミダゾール、ヒ酸、リン酸またはリン酸塩、酢酸ナトリウム、2:4:6−コリジン、5(4)−メチルイミダゾール、N−エチルモリホリン、トリエタノールアミン、ジエチルバルビツール酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、4−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸(EPPS)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、またはこれらの組み合わせである、請求項14〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝剤が、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、エチレンジアミン緩衝液またはイミダゾール緩衝液である、請求項14〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝剤がCDTAまたはクエン酸である、請求項14〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が哺乳動物由来の体液または体組織である、請求項14〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトまたはウシである、請求項25に記載の方法。
- 前記試料が、ヒト;非ヒト霊長動物;ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒルもしくはガチョウを含む家禽を含む家畜;シカ、ヘラジカ、ムース、魚、鳥またはクマを含む狩猟動物または野生動物;非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミもしくはハムスターを含む齧歯類を含む実験動物またはペット;イヌ;ネコ;魚;ヘビ;トカゲ;カメ;ウマ;植物;植物の一部;細胞系;土壌微生物;汚水微生物;またはウイルス、細菌もしくは寄生虫を含む病原微生物に由来する、請求項14に記載の方法。
- 前記組成物が、室温で少なくとも約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間または8週間、約1日間〜約8週間、または約8週間超にわたり前記リボ核酸を安定化する、請求項14〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、室温で約1日間〜約8週間にわたり前記リボ核酸を安定化する、請求項14〜27のいずれか一項に記載の方法。
- a.請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物、および
b.その使用についての使用説明書
を含むRNA保存キット。
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