JP7114676B2 - Ｒｎａウイルスを検出するための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６６，２７
７号及び２０１５年１月１５日に出願された米国仮特許出願６２／１０４，００８号の優
先権並びに利益を主張する。これらの出願のそれぞれの全内容はここで本明細書に参照に
より組み込まれる。
本出願は、２０１４年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６６，２７
７号及び２０１５年１月１５日に出願された米国仮特許出願６２／１０４，００８号の優
先権並びに利益を主張する。これらの出願のそれぞれの全内容はここで本明細書に参照に
より組み込まれる。
エボラウイルスは出血熱を引き起こし、死亡率が感染したヒトの５０％～９０％に達す
る。エボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、４つの種、ザイールＥＢＯＶ、スーダンＥＢＯＶ、
コートジボアールＥＢＯＶ、レストンＥＢＯＶを含む。エボラウイルスによるヒトへの感
染は典型的には、エボラウイルスに感染した動物又は患者の汚染血液、組織、及び／又は
排泄物との接触によって生じる。患者は、典型的にはエボラ感染の４～１０日後に症状を
示す。この長い潜伏期間は、保有者が疾病の任意の兆候を表す前に、ウイルスが新しい地
域へと運ばれる機会を与える。エボラの症状は、発熱、悪寒、吐き気、及び筋肉痛を含む
。そのような症状は、様々な疾病で現れるため、初期ではエボラ感染が誤診され、それに
より疾患の蔓延が助長され得る重大なリスクがある。後期では、エボラ－感染対象は、典
型的には嘔吐、下痢、咳、血管症状、頭痛、錯乱、昏睡、粘膜出血、血性下痢、及び最終
的には多臓器不全を発症して死亡する。エボラ患者の体液は感染性が高く、エボラ患者の
死体も同様である。
る。エボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、４つの種、ザイールＥＢＯＶ、スーダンＥＢＯＶ、
コートジボアールＥＢＯＶ、レストンＥＢＯＶを含む。エボラウイルスによるヒトへの感
染は典型的には、エボラウイルスに感染した動物又は患者の汚染血液、組織、及び／又は
排泄物との接触によって生じる。患者は、典型的にはエボラ感染の４～１０日後に症状を
示す。この長い潜伏期間は、保有者が疾病の任意の兆候を表す前に、ウイルスが新しい地
域へと運ばれる機会を与える。エボラの症状は、発熱、悪寒、吐き気、及び筋肉痛を含む
。そのような症状は、様々な疾病で現れるため、初期ではエボラ感染が誤診され、それに
より疾患の蔓延が助長され得る重大なリスクがある。後期では、エボラ－感染対象は、典
型的には嘔吐、下痢、咳、血管症状、頭痛、錯乱、昏睡、粘膜出血、血性下痢、及び最終
的には多臓器不全を発症して死亡する。エボラ患者の体液は感染性が高く、エボラ患者の
死体も同様である。
西アフリカにおける２０１４年後半のエボラ感染が、１週間当たり１０，０００人に上
ると予想されるように、エボラ感染の公衆衛生上の懸念が高まっている。医療従事者は、
エボラ患者の体液に曝露されるため、感染した患者からエボラがうつるリスクがある。接
触の程度及び頻度が増加すると、感染のリスクが高まる。１９７６年のスーダンエボラ大
流行では、エボラ患者を看護する医療従事者の８１％がウイルスに感染した。医療スタッ
フ及び医療従事者の不必要な感染を避けるために、適切な感染対策を設け、伝染のリスク
を最小限にするようなエボラの早期の検出が重要である。
ると予想されるように、エボラ感染の公衆衛生上の懸念が高まっている。医療従事者は、
エボラ患者の体液に曝露されるため、感染した患者からエボラがうつるリスクがある。接
触の程度及び頻度が増加すると、感染のリスクが高まる。１９７６年のスーダンエボラ大
流行では、エボラ患者を看護する医療従事者の８１％がウイルスに感染した。医療スタッ
フ及び医療従事者の不必要な感染を避けるために、適切な感染対策を設け、伝染のリスク
を最小限にするようなエボラの早期の検出が重要である。
西アフリカでも国際的にもエボラの蔓延を止めるために、感染した対象はすぐに隔離さ
れ、適切な保護具がこれらの対象をケアする医療従事者に使用され得るような迅速な診断
が必須である。高力価の感染性フィロウイルスが、疾病の初期に血液及び組織に存在する
。現在、エボラは、ウイルス単離、リアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む逆転写－ＰＣ
Ｒ（ＲＴ－ＰＣＲ）、抗原捕捉酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫染色による抗原
検出、及び真性ウイルス抗原を使用するＩｇＧ－及びＩｇＭ－ＥＬＩＳＡによって同定さ
れる。残念ながら、これらの試験は、精製及び単離されたＲＮＡにしか実施することがで
きず、エボラが風土病である多くの地域では不足している実験道具及び熟練の技術者の利
用を必要とするため、時間がかかる。
れ、適切な保護具がこれらの対象をケアする医療従事者に使用され得るような迅速な診断
が必須である。高力価の感染性フィロウイルスが、疾病の初期に血液及び組織に存在する
。現在、エボラは、ウイルス単離、リアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む逆転写－ＰＣ
Ｒ（ＲＴ－ＰＣＲ）、抗原捕捉酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫染色による抗原
検出、及び真性ウイルス抗原を使用するＩｇＧ－及びＩｇＭ－ＥＬＩＳＡによって同定さ
れる。残念ながら、これらの試験は、精製及び単離されたＲＮＡにしか実施することがで
きず、エボラが風土病である多くの地域では不足している実験道具及び熟練の技術者の利
用を必要とするため、時間がかかる。
したがって、エボラウイルスに感染した患者を迅速に同定する改善された方法が緊急に
必要である。
必要である。
本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用す
る、エボラ感染を迅速に同定する方法を提供する。
る、エボラ感染を迅速に同定する方法を提供する。
一態様では、本発明は、逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的
ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）を検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標
的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステッ
プ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワー
ド及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ス
テップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション
に特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標
的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポ
リヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法を提供する。
ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）を検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標
的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステッ
プ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワー
ド及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ス
テップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション
に特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標
的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポ
リヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、生体試料中
のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを
生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワー
ド及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ス
テップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション
に特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲ
ＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないこ
とがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、生体試料中
のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを
生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワー
ド及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ス
テップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション
に特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲ
ＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないこ
とがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
関連する態様では、本発明は、試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、生体試料中
のエボラポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成する
ステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワー
ド及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ス
テップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション
に特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するエ
ボラポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中に存在
するエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、生体試料中
のエボラポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成する
ステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワー
ド及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ス
テップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション
に特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するエ
ボラポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中に存在
するエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
上記の態様の様々な実施形態又は本明細書に記述する本発明の任意の他の態様では、エ
ボラポリヌクレオチドは、生体試料を試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができ
る薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ
により得られる。
ボラポリヌクレオチドは、生体試料を試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができ
る薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ
により得られる。
さらに別の態様では、本発明は、試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、試料中に存在するポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤
及びポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステ
ップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、抽出した及
び安定化したエボラＲＮＡをプライマーと接触させ、それによりエボラｃＤＮＡを生成す
るステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄ
ＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触さ
せ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合す
る、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラアンプリコンの存在が試料中の
エボラポリヌクレオチドを検出し、アンプリコンを検出できないことが試料中のエボラポ
リヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
（ａ）生体試料を、試料中に存在するポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤
及びポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステ
ップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、抽出した及
び安定化したエボラＲＮＡをプライマーと接触させ、それによりエボラｃＤＮＡを生成す
るステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄ
ＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触さ
せ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵
素認識配列を持ち、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合す
る、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラアンプリコンの存在が試料中の
エボラポリヌクレオチドを検出し、アンプリコンを検出できないことが試料中のエボラポ
リヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＲＮＡウイルス配列に特異的に結合するプライマー、
ウイルス（例えば、エボラ）アンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転
写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含むＲＮＡウイルスポリヌクレオチ
ド分子を検出するキットを提供する。一実施形態では、プライマーは、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含有し、プローブは、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含有する。
ウイルス（例えば、エボラ）アンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転
写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含むＲＮＡウイルスポリヌクレオチ
ド分子を検出するキットを提供する。一実施形態では、プライマーは、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含有し、プローブは、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含有する。
別の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又
はその逆を有する。一実施形態では、プローブは、
5’-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である。一実施形態では、３’クエンチャーはＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる。
はその逆を有する。一実施形態では、プローブは、
5’-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である。一実施形態では、３’クエンチャーはＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる。
別の態様では、本発明は、
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]；
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、及びエボラポリヌクレオチド分子を
検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含有する、
逆転写酵素ニッキング増幅反応においてエボラポリヌクレオチド分子を増幅するためのキ
ットを提供する。
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]；
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、及びエボラポリヌクレオチド分子を
検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含有する、
逆転写酵素ニッキング増幅反応においてエボラポリヌクレオチド分子を増幅するためのキ
ットを提供する。
一実施形態では、キットは、ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥溶解又
はＲＮＡ安定化試薬を含有しても含有しなくてもよいキャピラリーチューブをさらに含有
する。別の実施形態では、キットは、逆転写酵素及び／又は増幅反応を実施するのに好適
な緩衝液を含有する１つ又は複数の器をさらに含有する。別の実施形態では、キットは、
逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを凍結乾燥形態で含有する器をさ
らに含有する。
はＲＮＡ安定化試薬を含有しても含有しなくてもよいキャピラリーチューブをさらに含有
する。別の実施形態では、キットは、逆転写酵素及び／又は増幅反応を実施するのに好適
な緩衝液を含有する１つ又は複数の器をさらに含有する。別の実施形態では、キットは、
逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを凍結乾燥形態で含有する器をさ
らに含有する。
さらに別の態様では、本発明は、ＲＮＡウイルスを有するヒト又は動物対象を診断する
方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び
抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させる
ステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレ
オチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤ
ＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、そ
れによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマー
は、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持
ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在
が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡ
ウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、を提供する。
方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び
抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させる
ステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレ
オチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤ
ＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、そ
れによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマー
は、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持
ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在
が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡ
ウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、を提供する。
本明細書に記述の任意の態様の様々な実施形態では、アッセイの開始の７分後、１０分
後、及び／又は１５分後に標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能
なシグナルが存在しない。本明細書に記述の任意の態様の他の実施形態では、ステップ（
ａ）で使用したプライマーは、ステップ（ｂ）で使用したプライマーと同じ配列又は異な
る配列を有する。上記の任意の他の実施形態では、ステップ（ａ）～（ｃ）は単一の反応
で実施される。上記の態様のさらに他の実施形態では、逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリ
メラーゼは同じ又は異なる酵素である。さらに他の実施形態では、ステップ（ａ）のｃＤ
ＮＡは第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移さ
れる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は
エボラポリヌクレオチドである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では
、試料は体液（例えば唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液
、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）である。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、体腔は腹膜腔又は囲心腔である
。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、検出の限界は１反応当たり１
０又は２０コピーである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方
法は、約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間実施される。本明細書に記述の任
意の態様のさらに他の実施形態では、ステップａ～ｄは生体試料において実施される。本
明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、エボラ又は他のウイルスＲＮＡは
生体試料（例えば、粗製）から精製も単離もされない。本明細書に記述の任意の態様のさ
らに他の実施形態では、本方法は、ポイントオブケア又は診断において携帯電池式装置で
実施される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、別々の逆転写酵素
プライマーは必要ではないが、フォワード及び／又はリバースプライマーが使用される。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、試料は生体試料又は環境試料で
ある。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、生体試料は、対象、コウ
モリ、ブッシュミート、又は家畜から得られる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他
の実施形態では、生体試料は、頬、鼻、目、直腸、及び膣のいずれか１つ又は複数である
粘膜のスワブ又は皮膚である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、
生体試料は、対象、剖検、又は培養培地から得られる組織試料である。本明細書に記述の
任意の態様のさらに他の実施形態では、剖検はヒト、霊長動物、コウモリ、又は他の哺乳
動物のものである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、環境試料は
、エボラウイルス感染を有する、又は発症する傾向を有する対象の生体液により汚染され
得る材料である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、環境試料は、
ベッド、シートクッション、ラグ、空調フィルター、又は他の材料である。本明細書に記
述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ＧｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｋａＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｃａＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、ＧａｎＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｂｏＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ＤＮＡポリメラーゼＩ、
及び／又はそれらの断片の５’－エキソ－誘導体である。本明細書に記述の任意の態様の
さらに他の実施形態では、ニッキング酵素は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ
、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．Ｂ
ｓｔＳＥＩの１つ又は複数である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態で
は、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、及び／又はそれら
の変異体／誘導体である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、検出
可能なプローブは分子ビーコンを含有する。本明細書に記述の任意の態様の様々な実施形
態では、増幅プライマー（例えば、フォワード及び／又はリバースプライマー）は、３’
末端領域又は認識領域に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチ
ルリボヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、増幅プライマーは、３’末端に、例
えば２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－ヒドロキシル
、２’－アルキル、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチ
ル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－ブリッジ、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’
－ブリッジ、２’－ＬＮＡ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）を含む、１つ又
は複数の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。
後、及び／又は１５分後に標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能
なシグナルが存在しない。本明細書に記述の任意の態様の他の実施形態では、ステップ（
ａ）で使用したプライマーは、ステップ（ｂ）で使用したプライマーと同じ配列又は異な
る配列を有する。上記の任意の他の実施形態では、ステップ（ａ）～（ｃ）は単一の反応
で実施される。上記の態様のさらに他の実施形態では、逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリ
メラーゼは同じ又は異なる酵素である。さらに他の実施形態では、ステップ（ａ）のｃＤ
ＮＡは第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移さ
れる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は
エボラポリヌクレオチドである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では
、試料は体液（例えば唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液
、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）である。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、体腔は腹膜腔又は囲心腔である
。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、検出の限界は１反応当たり１
０又は２０コピーである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方
法は、約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間実施される。本明細書に記述の任
意の態様のさらに他の実施形態では、ステップａ～ｄは生体試料において実施される。本
明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、エボラ又は他のウイルスＲＮＡは
生体試料（例えば、粗製）から精製も単離もされない。本明細書に記述の任意の態様のさ
らに他の実施形態では、本方法は、ポイントオブケア又は診断において携帯電池式装置で
実施される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、別々の逆転写酵素
プライマーは必要ではないが、フォワード及び／又はリバースプライマーが使用される。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、試料は生体試料又は環境試料で
ある。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、生体試料は、対象、コウ
モリ、ブッシュミート、又は家畜から得られる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他
の実施形態では、生体試料は、頬、鼻、目、直腸、及び膣のいずれか１つ又は複数である
粘膜のスワブ又は皮膚である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、
生体試料は、対象、剖検、又は培養培地から得られる組織試料である。本明細書に記述の
任意の態様のさらに他の実施形態では、剖検はヒト、霊長動物、コウモリ、又は他の哺乳
動物のものである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、環境試料は
、エボラウイルス感染を有する、又は発症する傾向を有する対象の生体液により汚染され
得る材料である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、環境試料は、
ベッド、シートクッション、ラグ、空調フィルター、又は他の材料である。本明細書に記
述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ＧｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｋａＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｃａＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、ＧａｎＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｂｏＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ＤＮＡポリメラーゼＩ、
及び／又はそれらの断片の５’－エキソ－誘導体である。本明細書に記述の任意の態様の
さらに他の実施形態では、ニッキング酵素は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ
、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．Ｂ
ｓｔＳＥＩの１つ又は複数である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態で
は、逆転写酵素は、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、及び／又はそれら
の変異体／誘導体である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、検出
可能なプローブは分子ビーコンを含有する。本明細書に記述の任意の態様の様々な実施形
態では、増幅プライマー（例えば、フォワード及び／又はリバースプライマー）は、３’
末端領域又は認識領域に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチ
ルリボヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、増幅プライマーは、３’末端に、例
えば２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－ヒドロキシル
、２’－アルキル、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチ
ル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－ブリッジ、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’
－ブリッジ、２’－ＬＮＡ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）を含む、１つ又
は複数の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、エボラウイルスの検出のため
のフォワード及びリバースプライマーはそれぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含有する。
のフォワード及びリバースプライマーはそれぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含有する。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：gctacA
CGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出される。本明細書に記述の任意の
態様のさらに他の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエン
チャー、又はその逆を有する。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、
プローブは、
5‘-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3”
である。
CGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出される。本明細書に記述の任意の
態様のさらに他の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエン
チャー、又はその逆を有する。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、
プローブは、
5‘-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3”
である。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、３’クエンチャーはＤＡＢｓ
ｙｌによって置き換えられる。
ｙｌによって置き換えられる。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ＨＩＶウイルスの検出のため
のフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含有する。
のフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含有する。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：cgcaag
GGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出される。
GGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出される。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、デングウイルスの検出のため
のフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含有する。
のフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含有する。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：cgcatc
TGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出される。
TGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出される。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルス
の検出のためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含有する。
の検出のためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含有する。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：gccaaG
CTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出される。
CTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出される。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ＢＶＤＶ１ウイルスの検出の
ためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含有する。
ためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含有する。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：cgctac
ATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される。
ATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光
色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャー
を有する。特定の実施形態では、蛍光色素はＣＡＬＲｅｄ６１０ｍｍであり、クエンチャ
ーはＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである。特定の実施形態では、蛍光色素はＦＡＭ又はＦＩ
ＴＣであり、クエンチャーはＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである。
色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャー
を有する。特定の実施形態では、蛍光色素はＣＡＬＲｅｄ６１０ｍｍであり、クエンチャ
ーはＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである。特定の実施形態では、蛍光色素はＦＡＭ又はＦＩ
ＴＣであり、クエンチャーはＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである。
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、エボラウ
イルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス（
例えば、Ｂ型インフルエンザ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ＢＶＤＶ遺伝子
型Ｉ）、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス
、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである。本明細書に記述の任意の態様のさ
らに他の実施形態では、ウイルスを抽出することができる薬剤は、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１
つ又は組合せである。様々な実施形態では、チオシアン酸グアニジン又はウイルスを抽出
することができる他の薬剤は、約０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、７．５、１
０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００ｍＭ又はそれ以上の濃度で使用さ
れる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方法は、医療従事者の
毎日のスクリーニングに使用される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態
では、試料がプールされ、ヒト又は動物集団においてスクリーニングが実施される。
定義
「エボラウイルス（ＥＢＯＶ）」は、エボラウイルスと少なくとも約８５％のアミノ酸
配列同一性を有するフィロウイルス科ウイルスを意味する。エボラウイルスの例としては
、限定はされないが、ヒトで疾患を引き起こすエボラ－ザイールウイルス、エボラ－スー
ダンウイルス、エボラ－コートジボアールウイルス、及びエボラ－ブンディブギョウイル
ス、又は非ヒト霊長動物に影響を及ぼすエボラ－レストンウイルスが挙げられる。
イルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス（
例えば、Ｂ型インフルエンザ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ＢＶＤＶ遺伝子
型Ｉ）、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス
、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである。本明細書に記述の任意の態様のさ
らに他の実施形態では、ウイルスを抽出することができる薬剤は、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１
つ又は組合せである。様々な実施形態では、チオシアン酸グアニジン又はウイルスを抽出
することができる他の薬剤は、約０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、７．５、１
０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００ｍＭ又はそれ以上の濃度で使用さ
れる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方法は、医療従事者の
毎日のスクリーニングに使用される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態
では、試料がプールされ、ヒト又は動物集団においてスクリーニングが実施される。
定義
「エボラウイルス（ＥＢＯＶ）」は、エボラウイルスと少なくとも約８５％のアミノ酸
配列同一性を有するフィロウイルス科ウイルスを意味する。エボラウイルスの例としては
、限定はされないが、ヒトで疾患を引き起こすエボラ－ザイールウイルス、エボラ－スー
ダンウイルス、エボラ－コートジボアールウイルス、及びエボラ－ブンディブギョウイル
ス、又は非ヒト霊長動物に影響を及ぼすエボラ－レストンウイルスが挙げられる。
例示的なエボラザイールゲノムの配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＫＣ２４２８００．１で提
供され、以下に再現される。
供され、以下に再現される。
本発明は、この配列と少なくとも約８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は
１００％の同一性を有するポリヌクレオチドをさらに提供する。他のエボラザイールゲノ
ムは当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢａｉｚｅ
ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４；３７１：１４１８～２５に記載さ
れる。
１００％の同一性を有するポリヌクレオチドをさらに提供する。他のエボラザイールゲノ
ムは当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢａｉｚｅ
ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４；３７１：１４１８～２５に記載さ
れる。
「リボヌクレアーゼＰ ＲＮＡ成分Ｈ１（ＲＰＰＨ１）」は、ｔＲＮＡ前駆体分子を切
断し、それらのｔＲＮＡ配列の成熟５’プライム末端を形成するＲＮａｓｅＰリボ核タン
パク質のＲＮＡ成分、エンドヌクレアーゼを意味する。例示的な核酸配列は、ＮＣＢＩ受
託番号ＮＲ＿００２３１２で提供される。
断し、それらのｔＲＮＡ配列の成熟５’プライム末端を形成するＲＮａｓｅＰリボ核タン
パク質のＲＮＡ成分、エンドヌクレアーゼを意味する。例示的な核酸配列は、ＮＣＢＩ受
託番号ＮＲ＿００２３１２で提供される。
「アンプリコン」は、目的のポリヌクレオチドの増幅の間に生成されるポリヌクレオチ
ドを意味する。一例では、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応の間に生成される。
ドを意味する。一例では、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応の間に生成される。
「増幅率モディファイヤー」は、ポリメラーゼの伸長率に影響を及ぼすことができる薬
剤を意味する。
剤を意味する。
「塩基置換」は、相補的なヌクレオチド鎖間のハイブリダイゼーションの重大な破壊を
引き起こさないヌクレオ塩基ポリマーの置換を意味する。
引き起こさないヌクレオ塩基ポリマーの置換を意味する。
本開示では、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（contain
ing）」及び「有する（having）」等は、米国特許法のそれらに帰する意味を有すること
ができ、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味することができ；「か
ら本質的になる（consisting essentially of）」又は「本質的になる（consists essent
ially）」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、用語はオープンエンド型であり、列
挙したよりも多くの存在により、列挙したその基本的な又は新規の特徴が変更されない限
り、列挙したよりも多くの存在を可能にするが、先行技術の実施形態を除外する。
ing）」及び「有する（having）」等は、米国特許法のそれらに帰する意味を有すること
ができ、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味することができ；「か
ら本質的になる（consisting essentially of）」又は「本質的になる（consists essent
ially）」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、用語はオープンエンド型であり、列
挙したよりも多くの存在により、列挙したその基本的な又は新規の特徴が変更されない限
り、列挙したよりも多くの存在を可能にするが、先行技術の実施形態を除外する。
「相補的」又は「相補性」は、伝統的なワトソン・クリック型又はフーグスティーン型
塩基対のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができる
核酸を意味する。相補的な塩基対はＧ－Ｃ及びＡ－Ｔ塩基対だけでなく、イノシンなどユ
ニバーサル塩基を含む塩基対も含む。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（
例えば、ワトソン・クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の連続した
残基のパーセンテージを示す（例えば、第一のオリゴヌクレオチドにおいて合計１０ヌク
レオチドのうち５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドが１０ヌクレオチドを有する
第二の核酸配列と塩基対を形成すると、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％、及び１００％相補的であること表す）。少なくとも特定のパーセンテージのパーセン
ト相補性を決定するため、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック型塩
基対）を形成することができる核酸分子の連続する残基のパーセンテージを算出し、四捨
五入した（例えば、２３ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対を形成する第一の
オリゴヌクレオチドの全部で２３ヌクレオチドのうち、１２、１３、１４、１５、１６、
又は１７ヌクレオチドは、それぞれ５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、及び７４
％を表し、それぞれ少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、及び７０％の
相補性を有する）。本明細書で使用する場合、「実質的に相補的」は、生物学的条件下で
ハイブリダイズすることができるような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、
６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％もの相補性を有する。さらに、
それらのヌクレオチド配列を調べることにより、２本の鎖が生物学的条件下でハイブリダ
イズすることができるか調べる技術は当技術分野で周知である。
塩基対のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができる
核酸を意味する。相補的な塩基対はＧ－Ｃ及びＡ－Ｔ塩基対だけでなく、イノシンなどユ
ニバーサル塩基を含む塩基対も含む。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（
例えば、ワトソン・クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の連続した
残基のパーセンテージを示す（例えば、第一のオリゴヌクレオチドにおいて合計１０ヌク
レオチドのうち５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドが１０ヌクレオチドを有する
第二の核酸配列と塩基対を形成すると、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％、及び１００％相補的であること表す）。少なくとも特定のパーセンテージのパーセン
ト相補性を決定するため、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック型塩
基対）を形成することができる核酸分子の連続する残基のパーセンテージを算出し、四捨
五入した（例えば、２３ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対を形成する第一の
オリゴヌクレオチドの全部で２３ヌクレオチドのうち、１２、１３、１４、１５、１６、
又は１７ヌクレオチドは、それぞれ５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、及び７４
％を表し、それぞれ少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、及び７０％の
相補性を有する）。本明細書で使用する場合、「実質的に相補的」は、生物学的条件下で
ハイブリダイズすることができるような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、
６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％もの相補性を有する。さらに、
それらのヌクレオチド配列を調べることにより、２本の鎖が生物学的条件下でハイブリダ
イズすることができるか調べる技術は当技術分野で周知である。
本明細書で使用する場合、「二重鎖」は、２つの一本鎖核酸の相互作用によって形成さ
れる二重らせん構造を指す。二重鎖は、典型的には、互いに逆平行の２つの一本鎖核酸の
間で塩基の対の水素結合、すなわち「塩基対形成」によって形成される。二重鎖の塩基対
形成は、通常ワトソン・クリック型塩基対形成によって起こり、例えばグアニン（Ｇ）は
ＤＮＡ及びＲＮＡでシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＤＮＡでチミン
（Ｔ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＲＮＡでウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する
。塩基対を形成することができる条件は、生理学的及び生物学的に適当な条件を含む（例
えば、細胞内ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナ
トリウムイオン）。さらに、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間の相互作用をスタッキン
グすることにより安定化される。本明細書で使用されるように、二重鎖は、塩基対形成に
より又はスタッキング相互作用により確立又は維持することができる。二重鎖は、実質的
に相補的又は完全に相補的であり得る２つの相補的核酸鎖によって形成される。いくつか
の塩基に渡って塩基対を形成する一本鎖核酸は「ハイブリダイズ」と呼ぶ。
れる二重らせん構造を指す。二重鎖は、典型的には、互いに逆平行の２つの一本鎖核酸の
間で塩基の対の水素結合、すなわち「塩基対形成」によって形成される。二重鎖の塩基対
形成は、通常ワトソン・クリック型塩基対形成によって起こり、例えばグアニン（Ｇ）は
ＤＮＡ及びＲＮＡでシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＤＮＡでチミン
（Ｔ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＲＮＡでウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する
。塩基対を形成することができる条件は、生理学的及び生物学的に適当な条件を含む（例
えば、細胞内ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナ
トリウムイオン）。さらに、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間の相互作用をスタッキン
グすることにより安定化される。本明細書で使用されるように、二重鎖は、塩基対形成に
より又はスタッキング相互作用により確立又は維持することができる。二重鎖は、実質的
に相補的又は完全に相補的であり得る２つの相補的核酸鎖によって形成される。いくつか
の塩基に渡って塩基対を形成する一本鎖核酸は「ハイブリダイズ」と呼ぶ。
「検出する」は、検出される分析物の存在、不在、又は量を同定することを指す。一実
施形態では、分析物はエボラポリヌクレオチド又は他のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド
である。
施形態では、分析物はエボラポリヌクレオチド又は他のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド
である。
「検出可能な部分」は、目的の分子に結合した場合、分光学的、光化学的、生化学的、
免疫化学的又は化学的手段によってその分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば
、有用な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、
電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるように）、ビオチン、ジ
ゴキシゲニン、又はハプテンを含む。
免疫化学的又は化学的手段によってその分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば
、有用な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、
電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるように）、ビオチン、ジ
ゴキシゲニン、又はハプテンを含む。
「断片」は、核酸分子の部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照の核酸分子又
はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、
７０％、８０％、又は９０％を含有する。断片は、５、１０、１５、２０、３０、４０、
５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチドを含有し得る。一実施形態では
、断片は、エボラポリヌクレオチド又は他のＲＮＡウイルスポリヌクレオチドの少なくと
も約５０、７５、８０、８５、８９、９０、又は１００ヌクレオチドを含む。
はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、
７０％、８０％、又は９０％を含有する。断片は、５、１０、１５、２０、３０、４０、
５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチドを含有し得る。一実施形態では
、断片は、エボラポリヌクレオチド又は他のＲＮＡウイルスポリヌクレオチドの少なくと
も約５０、７５、８０、８５、８９、９０、又は１００ヌクレオチドを含む。
「自由エネルギー（ΔＧ）」は、式：ΔＧ＝ΔＨ－ＴΔＳによって記載される一定温度
及び圧力で系とその環境の間の正味のエネルギー交換を意味する。自由エネルギーは、熱
力学的に安定な（すなわち、低いΔＧを有する構造は、高いΔＧを有するものよりも安定
である）ネガティブΔＧ（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌｅで表される）を有する構造の形成
により、構造がどの程度熱力学的に安定かを表す。一定の圧力及び温度で系が平衡に達す
る場合、熱力学ポテンシャルは最小限である。
及び圧力で系とその環境の間の正味のエネルギー交換を意味する。自由エネルギーは、熱
力学的に安定な（すなわち、低いΔＧを有する構造は、高いΔＧを有するものよりも安定
である）ネガティブΔＧ（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌｅで表される）を有する構造の形成
により、構造がどの程度熱力学的に安定かを表す。一定の圧力及び温度で系が平衡に達す
る場合、熱力学ポテンシャルは最小限である。
「ハイブリダイズ」は、ストリンジェンシーの様々な条件下で相補的なポリヌクレオチ
ド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、又はその部分間の二本鎖分子を形成するこ
とを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。ハイブリダイゼーションは
水素結合によって生じ、相補的なヌクレオ塩基間のワトソン・クリック型、フーグスティ
ーン型、又は逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニン及びチミンは
、水素結合の形成によって対をなす相補的なヌクレオ塩基である。
ド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、又はその部分間の二本鎖分子を形成するこ
とを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。ハイブリダイゼーションは
水素結合によって生じ、相補的なヌクレオ塩基間のワトソン・クリック型、フーグスティ
ーン型、又は逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニン及びチミンは
、水素結合の形成によって対をなす相補的なヌクレオ塩基である。
「単離したポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物体の天然のゲノム
において、遺伝子に隣接する遺伝子がない核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を意味する。
したがって、用語は、例えば、ベクター；自律複製プラスミド又はウイルス；又は原核生
物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる又は他の配列に非依存的な別々の分子
（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノ
ム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。さらに、用語は、ＤＮＡ
分子並びにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換
えＤＮＡから転写されるＲＮＡ分子を含む。
において、遺伝子に隣接する遺伝子がない核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を意味する。
したがって、用語は、例えば、ベクター；自律複製プラスミド又はウイルス；又は原核生
物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる又は他の配列に非依存的な別々の分子
（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノ
ム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。さらに、用語は、ＤＮＡ
分子並びにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換
えＤＮＡから転写されるＲＮＡ分子を含む。
用語「単離した」、「精製した」、又は「生物学的に純粋な」は、材料が、その天然の
状態で見出されるような通常それに付随する成分を様々な程度で含まないことを指す。「
単離する」は、供給源又は周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高
い分離の程度を示す。「精製した」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純
物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさない、又は他の有害な結果を引き
起こさないように、他の材料をそれほど含まない。すなわち、本発明の核酸又はペプチド
は、組換えＤＮＡ技術によって製造される場合は細胞物質、ウイルス性物質、若しくは培
養培地、又は化学的に合成される場合は化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含ま
なければ、精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。
用語「精製した」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルでほぼ１つのバンドを生じるこ
とを意味することができる。例えばリン酸化又はグリコシル化などの修飾にさらされるタ
ンパク質については、様々な修飾が様々な単離したタンパク質を生じ、それらのタンパク
質は別々に精製することができる。
状態で見出されるような通常それに付随する成分を様々な程度で含まないことを指す。「
単離する」は、供給源又は周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高
い分離の程度を示す。「精製した」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純
物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさない、又は他の有害な結果を引き
起こさないように、他の材料をそれほど含まない。すなわち、本発明の核酸又はペプチド
は、組換えＤＮＡ技術によって製造される場合は細胞物質、ウイルス性物質、若しくは培
養培地、又は化学的に合成される場合は化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含ま
なければ、精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。
用語「精製した」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルでほぼ１つのバンドを生じるこ
とを意味することができる。例えばリン酸化又はグリコシル化などの修飾にさらされるタ
ンパク質については、様々な修飾が様々な単離したタンパク質を生じ、それらのタンパク
質は別々に精製することができる。
「融解温度（Ｔｍ）」は、分子集団の５０％がある状態であり、その集団の５０％が別
の状態である平衡な系の温度を意味する。本発明の核酸に関して、Ｔｍは集団の５０％が
一本鎖であり、５０％が二本鎖（例えば、分子内又は分子間）である温度である。
の状態である平衡な系の温度を意味する。本発明の核酸に関して、Ｔｍは集団の５０％が
一本鎖であり、５０％が二本鎖（例えば、分子内又は分子間）である温度である。
「反応のモニタリング」は、反応の進行を検出することを意味する。一実施形態では、
反応の進行のモニタリングは、ポリメラーゼ伸長の検出及び／又は増幅反応の完了の検出
を含む。
反応の進行のモニタリングは、ポリメラーゼ伸長の検出及び／又は増幅反応の完了の検出
を含む。
本明細書で使用する場合、「薬剤を得る」のように「得る」は、薬剤の合成、購入、又
はその他の獲得を含む。
はその他の獲得を含む。
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオ
チド、又は修飾ヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖形態のそのポリマーを指す。この用
語は、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は連結を含有し、合成、天然
、及び非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の形で
代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、２’修
飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｆヌクレオチド）
が挙げられる。
チド、又は修飾ヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖形態のそのポリマーを指す。この用
語は、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は連結を含有し、合成、天然
、及び非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の形で
代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、２’修
飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｆヌクレオチド）
が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペ
ントース環、又はリン酸基に対して１つ又は複数の修飾を有するヌクレオチドを指す。例
えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン
酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リ
ン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン
一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除く。修飾は、メチル基転移酵素などヌ
クレオチドを修飾する酵素による修飾によって生じる天然のものを含む。修飾ヌクレオチ
ドはまた、合成又は非天然のヌクレオチドも含む。ヌクレオチドの合成又は非天然の修飾
は、２’修飾、例えば２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２
’－ヒドロキシル（ＲＮＡ）、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－
オキソエチル］、４’チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－ブリッジ、４’－（ＣＨ２）２－
Ｏ－２’－ブリッジ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）を有するもの又は塩基
類似体を含むものを含む。
ントース環、又はリン酸基に対して１つ又は複数の修飾を有するヌクレオチドを指す。例
えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン
酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リ
ン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン
一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除く。修飾は、メチル基転移酵素などヌ
クレオチドを修飾する酵素による修飾によって生じる天然のものを含む。修飾ヌクレオチ
ドはまた、合成又は非天然のヌクレオチドも含む。ヌクレオチドの合成又は非天然の修飾
は、２’修飾、例えば２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２
’－ヒドロキシル（ＲＮＡ）、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－
オキソエチル］、４’チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－ブリッジ、４’－（ＣＨ２）２－
Ｏ－２’－ブリッジ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）を有するもの又は塩基
類似体を含むものを含む。
「ヌクレオチド付加物」は、標準的なヌクレオチド塩基に共有結合によって結合される
又はそうでなければ固定される部分を意味する。
又はそうでなければ固定される部分を意味する。
「ニッキング剤」は、二本鎖核酸分子の特定の構造を認識してそれに結合し、その認識
される特定の構造に結合すると一本鎖上の隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結
合を切断し、それにより、ニック部位に先行する末端ヌクレオチドに遊離３’－ヒドロキ
シル基を作ることができる化学実体を意味する。好ましい実施形態では、３’末端はエキ
ソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによって伸長することができる。例示的なニッキング剤
は、ニッキング酵素、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、及び遷移金属キレート剤を含む。
される特定の構造に結合すると一本鎖上の隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結
合を切断し、それにより、ニック部位に先行する末端ヌクレオチドに遊離３’－ヒドロキ
シル基を作ることができる化学実体を意味する。好ましい実施形態では、３’末端はエキ
ソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによって伸長することができる。例示的なニッキング剤
は、ニッキング酵素、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、及び遷移金属キレート剤を含む。
「パリンドローム」は、１つの鎖で５’から３’、又は相補鎖で５’から３’へと読ん
だ場合、互いに同一又は実質的に同一である核酸配列を意味する。完全なパリンドローム
は、１つのサブ配列が５’から３’方向へ読まれる場合、それが３’から５’方向へと読
まれる他のサブ配列と同一であるような２つの隣接するサブ配列を有する配列を指す。
だ場合、互いに同一又は実質的に同一である核酸配列を意味する。完全なパリンドローム
は、１つのサブ配列が５’から３’方向へ読まれる場合、それが３’から５’方向へと読
まれる他のサブ配列と同一であるような２つの隣接するサブ配列を有する配列を指す。
「ポリメラーゼ休止分子」は、ポリヌクレオチド鋳型上のポリメラーゼの進行を防ぐ又
は著しく減少するポリヌクレオチド鋳型／プライマーと関連する部分を意味する。好まし
くは、その部分はポリヌクレオチドに組み込まれる。好ましい一実施形態では、その部分
はポリメラーゼの鋳型上の進行を防ぐ。
は著しく減少するポリヌクレオチド鋳型／プライマーと関連する部分を意味する。好まし
くは、その部分はポリヌクレオチドに組み込まれる。好ましい一実施形態では、その部分
はポリメラーゼの鋳型上の進行を防ぐ。
「ポリメラーゼ伸長」は、鋳型ポリヌクレオチド上のポリメラーゼの結合パートナーと
次に来るモノマーをマッチさせるポリメラーゼの前方向の進行を意味する。
次に来るモノマーをマッチさせるポリメラーゼの前方向の進行を意味する。
本明細書で使用する場合、「プライマーダイマー」は、２つのモノマーオリゴヌクレオ
チドプライマーのダイマーを意味する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーでは、モ
ノマープライマーの５’テール領域がダイマー化する。
チドプライマーのダイマーを意味する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーでは、モ
ノマープライマーの５’テール領域がダイマー化する。
「半定量的」は、内部標準に基づく相対量の見積もりを提供することを意味する。
「特異的産物」は、プライマーオリゴヌクレオチドが相補的な標的配列にハイブリダイ
ズした後、標的配列がポリメラーゼを介して伸長することによって生じるポリヌクレオチ
ド産物を意味する。
ズした後、標的配列がポリメラーゼを介して伸長することによって生じるポリヌクレオチ
ド産物を意味する。
「実質的に等温条件」は、単一の温度であるか、又は大きく変わらない温度の狭い範囲
内にあることを意味する。一実施形態では、反応は、約１～５℃のみ変わる（例えば、１
、２、３、４、又は５℃変わる）温度で実施される実質的に等温条件下で実施される。別
の実施形態では、反応は、利用する機器の操作パラメーター内の単一温度で実施される。
内にあることを意味する。一実施形態では、反応は、約１～５℃のみ変わる（例えば、１
、２、３、４、又は５℃変わる）温度で実施される実質的に等温条件下で実施される。別
の実施形態では、反応は、利用する機器の操作パラメーター内の単一温度で実施される。
「量閾値方法」は、比較標準を量で超えるかまたは超えないかに基づく量の見積もりを
提供することを意味する。
提供することを意味する。
「参照」は、標準又は対照条件を意味する。当業者には明らかなように、適切な参照は
要素の効果を決定するために要素が変更される。
要素の効果を決定するために要素が変更される。
「逆転写酵素」は、デオキシリボヌクレオチド並びに限定はされないが、緩衝液（ｐＨ
７．０～９．０）、ナトリウム及び／又はカリウムイオン、並びにマグネシウムイオンを
含む許容的な反応媒体の存在下で、プライマーが作用した（primed）一本鎖ＲＮＡ鋳型鎖
を相補的なＤＮＡ鎖へと複製する酵素を意味する。当業者には明らかなように、許容的な
反応媒体の濃度及びｐＨ範囲は、特定の逆転写酵素に関して変わり得る。当業者に周知の
好適な「逆転写酵素」の例は、限定はされないが、ＭｍＬＶ逆転写酵素及びその市販の誘
導体「ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）、「ＭａｘｉＳｃｒｉｐｔ」（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＲＳＶ逆転写酵素及びそ
の市販の誘導体「ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）、ＡＭＶ逆転写酵素及びその
市販の誘導体「Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
７．０～９．０）、ナトリウム及び／又はカリウムイオン、並びにマグネシウムイオンを
含む許容的な反応媒体の存在下で、プライマーが作用した（primed）一本鎖ＲＮＡ鋳型鎖
を相補的なＤＮＡ鎖へと複製する酵素を意味する。当業者には明らかなように、許容的な
反応媒体の濃度及びｐＨ範囲は、特定の逆転写酵素に関して変わり得る。当業者に周知の
好適な「逆転写酵素」の例は、限定はされないが、ＭｍＬＶ逆転写酵素及びその市販の誘
導体「ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）、「ＭａｘｉＳｃｒｉｐｔ」（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＲＳＶ逆転写酵素及びそ
の市販の誘導体「ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）、ＡＭＶ逆転写酵素及びその
市販の誘導体「Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
「対象」は、限定はされないが、ヒト又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコなどの
非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。
非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。
「標的核酸分子」は、分析されるポリヌクレオチドを意味する。そのようなポリヌクレ
オチドは、標的配列のセンス又はアンチセンス鎖であり得る。用語「標的核酸分子」は、
元々の標的配列のアンプリコンも指す。
オチドは、標的配列のセンス又はアンチセンス鎖であり得る。用語「標的核酸分子」は、
元々の標的配列のアンプリコンも指す。
本明細書に提供される範囲は、範囲内の全ての値の簡略表記法であると理解される。例
えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、
４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群の
任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。
えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、
４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群の
任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。
具体的に述べない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、用語
「又は」は、包括的であると理解される。具体的に述べない限り又は文脈から明らかでな
い限り、本明細書で使用する場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「
その（ｔｈｅ）」は、単数又は複数であると理解される。
「又は」は、包括的であると理解される。具体的に述べない限り又は文脈から明らかでな
い限り、本明細書で使用する場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「
その（ｔｈｅ）」は、単数又は複数であると理解される。
具体的に述べない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、用語
「約」は、当技術分野の一般公差の範囲内、例えば平均の２標準偏差内であると理解され
る。約は、述べた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％
、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解され得る。文脈か
ら明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語約によって修飾される。
「約」は、当技術分野の一般公差の範囲内、例えば平均の２標準偏差内であると理解され
る。約は、述べた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％
、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解され得る。文脈か
ら明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語約によって修飾される。
本明細書の変数の任意の定義における化学基の列挙の記載は、その変数が任意の単一の
基又は列挙した基の組合せである定義を含む。本明細書の変数の実施形態又は態様の記載
は、実施形態が任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態との組合せ又はそれらの一
部であることを含む。
基又は列挙した基の組合せである定義を含む。本明細書の変数の実施形態又は態様の記載
は、実施形態が任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態との組合せ又はそれらの一
部であることを含む。
本明細書で提供される任意の組成物又は方法は、本明細書で提供される１つ又は複数の
任意の他の組成物及び方法と組み合わせることができる。
任意の他の組成物及び方法と組み合わせることができる。
本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用す
る、ＲＮＡウイルス感染（例えば、エボラウイルス）を迅速に同定する方法を提供する。
る、ＲＮＡウイルス感染（例えば、エボラウイルス）を迅速に同定する方法を提供する。
エボラは、診断及び区別が臨床的に難しい。エボラが疑われる症例では、迅速及び確か
な検査診断が必要である。本発明は、そのようなアッセイを提供する。本発明は、エボラ
ウイルスポリヌクレオチドのワンステップ又はツーステップリアルタイム逆転写－等温増
幅アッセイで、エボラウイルスのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）が検出できる発見
に少なくとも部分的に基づく。
エボラウイルス
エボラウイルスは、ネガティブセンスＲＮＡゲノムを有する糸状ウイルスである。ウイ
ルス粒子は、ウイルスエンベロープ、マトリックス、及びヌクレオキャプシド成分を含有
し、およそ直径８０ｎｍ及び長さ８００～１０００ｎｍの、円柱状／管状である。エボラ
は、バイオセイフティーレベル４に分類される。エボラウイルス出血熱の潜伏期間は、通
常５～１８日であるが、罹患したウイルス株及び感染した個体の状態によって２～２１日
に延長する場合がある。エボラウイルスは、素早く作用する。エボラの初期症状は、マラ
リア、インフルエンザ、又は様々な細菌感染の症状に似ている。したがって、エボラが診
断される前に数日又は数週間経過する場合がある。続発症状は、下痢、赤目、吐血、鼻、
口、又は直腸からの出血、及び脳での出血さえも含む。ウイルスが感染した個体の約５０
～９０％が全身性多臓器不全及び死へと進行する。
患者の診断及びモニタリング
生体試料におけるエボラウイルスポリヌクレオチドを検出するステップ及びこの検出を
エボラ感染の存在と関連付けるステップにより、エボラを有する又は有さない患者の状態
を診断することができる。一実施形態では、エボラウイルスを有する患者の疾患状態は、
患者の生体試料においてエボラウイルスを検出する本発明の方法及び組成物を使用して検
出することができる。例示的な生体試料は、体液（例えば、唾液、汗、涙、体腔に蓄積し
た液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母
乳、血液、血清、及び血漿）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原性細胞など細胞が成
長する液体）又は例えば対象の生体液に汚染されている可能性がある材料から得られる環
境試料を含む。
な検査診断が必要である。本発明は、そのようなアッセイを提供する。本発明は、エボラ
ウイルスポリヌクレオチドのワンステップ又はツーステップリアルタイム逆転写－等温増
幅アッセイで、エボラウイルスのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）が検出できる発見
に少なくとも部分的に基づく。
エボラウイルス
エボラウイルスは、ネガティブセンスＲＮＡゲノムを有する糸状ウイルスである。ウイ
ルス粒子は、ウイルスエンベロープ、マトリックス、及びヌクレオキャプシド成分を含有
し、およそ直径８０ｎｍ及び長さ８００～１０００ｎｍの、円柱状／管状である。エボラ
は、バイオセイフティーレベル４に分類される。エボラウイルス出血熱の潜伏期間は、通
常５～１８日であるが、罹患したウイルス株及び感染した個体の状態によって２～２１日
に延長する場合がある。エボラウイルスは、素早く作用する。エボラの初期症状は、マラ
リア、インフルエンザ、又は様々な細菌感染の症状に似ている。したがって、エボラが診
断される前に数日又は数週間経過する場合がある。続発症状は、下痢、赤目、吐血、鼻、
口、又は直腸からの出血、及び脳での出血さえも含む。ウイルスが感染した個体の約５０
～９０％が全身性多臓器不全及び死へと進行する。
患者の診断及びモニタリング
生体試料におけるエボラウイルスポリヌクレオチドを検出するステップ及びこの検出を
エボラ感染の存在と関連付けるステップにより、エボラを有する又は有さない患者の状態
を診断することができる。一実施形態では、エボラウイルスを有する患者の疾患状態は、
患者の生体試料においてエボラウイルスを検出する本発明の方法及び組成物を使用して検
出することができる。例示的な生体試料は、体液（例えば、唾液、汗、涙、体腔に蓄積し
た液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母
乳、血液、血清、及び血漿）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原性細胞など細胞が成
長する液体）又は例えば対象の生体液に汚染されている可能性がある材料から得られる環
境試料を含む。
一実施形態では、本発明は、逆転写酵素及びニッキング増幅反応において標的ポリヌク
レオチドを増幅する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、標的ＲＮＡ
分子（例えば、エボラウイルスゲノム）を逆転写酵素（ＲＴ）プライマーと接触させ、そ
れによりｃＤＮＡを生成するステップ；及び
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、そ
れによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマー
は、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持
ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；
を含む、方法を提供する。
レオチドを増幅する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、標的ＲＮＡ
分子（例えば、エボラウイルスゲノム）を逆転写酵素（ＲＴ）プライマーと接触させ、そ
れによりｃＤＮＡを生成するステップ；及び
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ
、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、そ
れによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマー
は、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持
ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；
を含む、方法を提供する。
特定の一実施形態では、本発明は、生体試料中のエボラウイルスを検出する方法であっ
て、
（ａ）試料を、試料中に存在するエボラＲＮＡを抽出することができる薬剤（例えば、Ｓ
ＤＳ、ラウリル硫酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン）及びエ
ボラＲＮＡを分解に対して安定化することができる薬剤（例えば、ＳＤＳ、ＲＮＡａｓｅ
阻害剤、ＲＮＡｓｅに対する抗体、競合ＲＮＡｓｅ阻害剤、又はインサイチュでＲＮＡを
可逆的に化学的修飾することができる薬剤（例えば、無水酢酸））と接触させるステップ
；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、エボラＲＮ
ＡをＲＴプライマーと接触させ、それによりエボラＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成するス
テップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄ
ＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触さ
せ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配
列を持ち、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステ
ップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラウイルスアンプリコンの存在が
試料中のエボラウイルス感染を検出し、アンプリコンを検出できないことがエボラウイル
ス感染の非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
て、
（ａ）試料を、試料中に存在するエボラＲＮＡを抽出することができる薬剤（例えば、Ｓ
ＤＳ、ラウリル硫酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン）及びエ
ボラＲＮＡを分解に対して安定化することができる薬剤（例えば、ＳＤＳ、ＲＮＡａｓｅ
阻害剤、ＲＮＡｓｅに対する抗体、競合ＲＮＡｓｅ阻害剤、又はインサイチュでＲＮＡを
可逆的に化学的修飾することができる薬剤（例えば、無水酢酸））と接触させるステップ
；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、エボラＲＮ
ＡをＲＴプライマーと接触させ、それによりエボラＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成するス
テップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄ
ＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触さ
せ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプラ
イマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配
列を持ち、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステ
ップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラウイルスアンプリコンの存在が
試料中のエボラウイルス感染を検出し、アンプリコンを検出できないことがエボラウイル
ス感染の非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
一実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法は、５、７、１０、１５、２０、２５
又は３０分間以内に結果を提供する。有利には、本発明の方法は、粗生体試料（例えば、
唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、
痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）から抽出されたが、精製も単離
もされていないＲＮＡに適用できる。試験は現地（例えば、病院、診療所、医師のオフィ
ス、外来治療施設、自宅、コミュニティーセンター、空港、船（例えば、クルーズ船、又
はヒト若しくは動物を輸送するために使用される他の船）、電車若しくは駅、又は国へ入
る地点（例えば、入国））で実施されるためである。有利には、一実施形態では、試験は
携帯電池式装置（例えば、増幅器）で実施される。
又は３０分間以内に結果を提供する。有利には、本発明の方法は、粗生体試料（例えば、
唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、
痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）から抽出されたが、精製も単離
もされていないＲＮＡに適用できる。試験は現地（例えば、病院、診療所、医師のオフィ
ス、外来治療施設、自宅、コミュニティーセンター、空港、船（例えば、クルーズ船、又
はヒト若しくは動物を輸送するために使用される他の船）、電車若しくは駅、又は国へ入
る地点（例えば、入国））で実施されるためである。有利には、一実施形態では、試験は
携帯電池式装置（例えば、増幅器）で実施される。
一実施形態では、カオトロピック塩（例えば、ＧＩＴＣ、ＧＨＣＬ）又は界面活性剤（
例えば、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ及びトリトン）を使用して、ＲＮＡは生体試料から抽出され
る。所望であれば、ＲＮＡｓｅ阻害剤が、抽出ステップの前、間、又は後に添加される。
例えば、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ及びトリトン）を使用して、ＲＮＡは生体試料から抽出され
る。所望であれば、ＲＮＡｓｅ阻害剤が、抽出ステップの前、間、又は後に添加される。
別の実施形態では、逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは全く同一のものである
。
。
別の実施形態では、別のプライマーは必要ではなく、ＲＴプライマーはフォワード及び
／又はリバースプライマーと同じである。
／又はリバースプライマーと同じである。
別の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ検出のためのＤｕａｌ ＦＲＥＴ分子ビーコン
（例えば、Ｓａｎｔａｇｅｌｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２
（６）：ｅ５７によって記載されるように）、ｄＮＴＰからのピロリン酸の濁度放出、及
びマグネシウム又はカルシウムによる沈殿を使用する、ＥＢＯＶ又は他のウイルスアンプ
リコンの検出を提供する。
（例えば、Ｓａｎｔａｇｅｌｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２
（６）：ｅ５７によって記載されるように）、ｄＮＴＰからのピロリン酸の濁度放出、及
びマグネシウム又はカルシウムによる沈殿を使用する、ＥＢＯＶ又は他のウイルスアンプ
リコンの検出を提供する。
別の実施形態では、本発明は、エボラウイルスアンプリコンが対の結合パートナー（例
えば、ビオチン及びストレプトアビジン）の１つのメンバーを含む横流れ型装置を使用し
、横流れ型装置が対の他のメンバーを含み、アンプリコンの検出の手段（例えば、比色分
析）を提供する、エボラウイルスアンプリコンの検出を提供する。
えば、ビオチン及びストレプトアビジン）の１つのメンバーを含む横流れ型装置を使用し
、横流れ型装置が対の他のメンバーを含み、アンプリコンの検出の手段（例えば、比色分
析）を提供する、エボラウイルスアンプリコンの検出を提供する。
本発明の方法において使用する逆転写酵素は、限定はされないが、モロニー（Maloney
）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）及び野生型ＭＭＬＶ－ＲＴに対し
て変異を含むその誘導体又は変異体；トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ ＲＴ）及びそれ
に対して熱安定性を付与する変異を含むその誘導体又は変異体、ラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）ＲＴ（例えば、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、Ｑｉａｇｅｎ）及びその誘導体又は変異体
、並びにパイロ逆転写酵素（例えば、ＰｙｒｏＳｃｒｉｐｔ、Ｌｕｃｉｇｅｎ）及びその
誘導体又は変異体、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９４
，５３９号に記載のＲＴ、又は市販のＲＴ ＰＣＲ及びトランスクリプトーム解析（例え
ば、Ｌｕｃｉｇｅｎ）用のハイフィデリティ熱安定性逆転写酵素を含む。
）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）及び野生型ＭＭＬＶ－ＲＴに対し
て変異を含むその誘導体又は変異体；トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ ＲＴ）及びそれ
に対して熱安定性を付与する変異を含むその誘導体又は変異体、ラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）ＲＴ（例えば、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、Ｑｉａｇｅｎ）及びその誘導体又は変異体
、並びにパイロ逆転写酵素（例えば、ＰｙｒｏＳｃｒｉｐｔ、Ｌｕｃｉｇｅｎ）及びその
誘導体又は変異体、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９４
，５３９号に記載のＲＴ、又は市販のＲＴ ＰＣＲ及びトランスクリプトーム解析（例え
ば、Ｌｕｃｉｇｅｎ）用のハイフィデリティ熱安定性逆転写酵素を含む。
一実施形態では、５６℃でプライマー及びＲＮＡ又はアンプリコンは安定な複合体を形
成する。一実施形態では、プライマー配列の５０％より多くが標的核酸分子と相補的でな
ければならない。一実施形態では、ＲＴプライマーは長さが約１８塩基である。一実施形
態では、逆転写酵素（ＲＴ）プライマーは、ランダムプライマー（例えば、各配列位置に
おいて、４つの塩基のいずれか１つが可能であり、これらのプライマーのいずれかが標的
とハイブリダイズする）である。一実施形態では、ＲＴプライマーは、ヘキサマー、ヘプ
タマー、オクタマー、又はノナマーである。
成する。一実施形態では、プライマー配列の５０％より多くが標的核酸分子と相補的でな
ければならない。一実施形態では、ＲＴプライマーは長さが約１８塩基である。一実施形
態では、逆転写酵素（ＲＴ）プライマーは、ランダムプライマー（例えば、各配列位置に
おいて、４つの塩基のいずれか１つが可能であり、これらのプライマーのいずれかが標的
とハイブリダイズする）である。一実施形態では、ＲＴプライマーは、ヘキサマー、ヘプ
タマー、オクタマー、又はノナマーである。
一実施形態では、ＲＴは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stea
rothermophilus）由来、ＭＭＬＶ ＲＴ（すなわち、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ／Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈ、Ｍａｘｉｍａ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）及び／又はその変異体／誘導体
、ＡＭＶ ＲＴ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ／ＬｉｆｅＴｅｃｈ）及び／又は
その変異体／誘導体、ＲＳＶ ＲＴ（すなわち、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ／Ｑｉａｇｅｎ）
及び／又はその変異体／誘導体である。
rothermophilus）由来、ＭＭＬＶ ＲＴ（すなわち、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ／Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈ、Ｍａｘｉｍａ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）及び／又はその変異体／誘導体
、ＡＭＶ ＲＴ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ／ＬｉｆｅＴｅｃｈ）及び／又は
その変異体／誘導体、ＲＳＶ ＲＴ（すなわち、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ／Ｑｉａｇｅｎ）
及び／又はその変異体／誘導体である。
本発明の方法は、高度な感受性を提供する。一実施形態では、ＥＢＯＶは、血液中１ｍ
ｌ当たり１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は１×１０
９コピーのＥＢＯＶ ＲＮＡが検出される。別の実施形態では、本発明は、１反応当たり
約１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）コピーの間のＲＮＡ
の検出を提供する。
ｌ当たり１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は１×１０
９コピーのＥＢＯＶ ＲＮＡが検出される。別の実施形態では、本発明は、１反応当たり
約１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）コピーの間のＲＮＡ
の検出を提供する。
ＥＢＯＶ（又は他のウイルス）は、ＥＢＯＶ感染を有する又は有する疑いのある対象か
ら試料（例えば生体試料）を得ることによって、又はエボラウイルス又はＥＢＯＶ含有生
体液に汚染されている又は汚染されている疑いのある家、病室、輸送手段からの環境試料
を得ることによって検出される。一実施形態では、生体試料は、血液試料、粘液試料、排
泄物を得ることによって、又は患部組織を拭き取ることによって得られる。スワブは鼻、
喉、目、又は他の粘膜から採取することができる。剖検では、試料は死者の血液又は組織
から集めることができる。
ら試料（例えば生体試料）を得ることによって、又はエボラウイルス又はＥＢＯＶ含有生
体液に汚染されている又は汚染されている疑いのある家、病室、輸送手段からの環境試料
を得ることによって検出される。一実施形態では、生体試料は、血液試料、粘液試料、排
泄物を得ることによって、又は患部組織を拭き取ることによって得られる。スワブは鼻、
喉、目、又は他の粘膜から採取することができる。剖検では、試料は死者の血液又は組織
から集めることができる。
有利には、本発明の診断方法は、事実上いずれの設定での使用にも好適である。ＥＢＯ
Ｖは、リベリア、ナイジェリア、ギニア、及びシエラレオネを含む西アフリカのほとんど
で風土病である。西アフリカの多くの地域で、基礎医学設備及び診断施設が利用できない
。本発明は、電気が利用できない地域での生体試料の試験によく適している電池式ハンド
ヘルド装置で使用することができる。さらに、本方法は、十分に簡単であり、診断技術の
使用の訓練が制限される医療従事者によって容易に実施することができる。
Ｖは、リベリア、ナイジェリア、ギニア、及びシエラレオネを含む西アフリカのほとんど
で風土病である。西アフリカの多くの地域で、基礎医学設備及び診断施設が利用できない
。本発明は、電気が利用できない地域での生体試料の試験によく適している電池式ハンド
ヘルド装置で使用することができる。さらに、本方法は、十分に簡単であり、診断技術の
使用の訓練が制限される医療従事者によって容易に実施することができる。
本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用す
る、ＥＢＯＶ又は他のウイルス感染を迅速に同定する方法を提供する。
る、ＥＢＯＶ又は他のウイルス感染を迅速に同定する方法を提供する。
疾患過程の初期には、対象の生体試料、例えば血液試料には低レベルのウイルスのみが
存在する。所望であれば、例えば、ＰＥＧ及びＮａＣｌの添加により試料からウイルス粒
子を沈殿し、次いでナノポアフィルターを使用して試料からウイルス粒子を濾過し、それ
によりウイルスポリヌクレオチドの早期の検出を提供することによって、試料中に存在す
るウイルス粒子は当技術分野で公知の方法を使用して増やされる。
存在する。所望であれば、例えば、ＰＥＧ及びＮａＣｌの添加により試料からウイルス粒
子を沈殿し、次いでナノポアフィルターを使用して試料からウイルス粒子を濾過し、それ
によりウイルスポリヌクレオチドの早期の検出を提供することによって、試料中に存在す
るウイルス粒子は当技術分野で公知の方法を使用して増やされる。
エボラウイルス（又は他のウイルス）に曝露された可能性のある対象の疾患状態又は治
療は、本発明の方法及び組成物を使用してモニターすることができる。一実施形態では、
体液、例えば唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ
液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿に存在するエボラウ
イルスポリヌクレオチド（又は他のウイルスのポリヌクレオチド）の検出をモニターする
。そのようなモニタリングは、例えば、対象がエボラ（又は他のウイルス）を有すると診
断する、又は対象における特定の薬物の効果を決定する、又は疾患の進行を評価するのに
有用であり得る。
核酸増幅方法
核酸増幅技術は、ＥＢＯＶ又は他のＲＮＡウイルスなどの病原菌の複雑な生物学的工程
を理解し、それを検出、同定、及び定量する手段を提供する。本発明は、逆転写酵素を使
用してＲＮＡゲノムからＥＢＯＶ ＤＮＡ分子を合成し、次いで等温ニッキング増幅反応
においてＤＮＡを増幅することにより生体試料のＥＢＯＶネガティブセンスＲＮＡゲノム
の検出を提供する。
療は、本発明の方法及び組成物を使用してモニターすることができる。一実施形態では、
体液、例えば唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ
液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿に存在するエボラウ
イルスポリヌクレオチド（又は他のウイルスのポリヌクレオチド）の検出をモニターする
。そのようなモニタリングは、例えば、対象がエボラ（又は他のウイルス）を有すると診
断する、又は対象における特定の薬物の効果を決定する、又は疾患の進行を評価するのに
有用であり得る。
核酸増幅方法
核酸増幅技術は、ＥＢＯＶ又は他のＲＮＡウイルスなどの病原菌の複雑な生物学的工程
を理解し、それを検出、同定、及び定量する手段を提供する。本発明は、逆転写酵素を使
用してＲＮＡゲノムからＥＢＯＶ ＤＮＡ分子を合成し、次いで等温ニッキング増幅反応
においてＤＮＡを増幅することにより生体試料のＥＢＯＶネガティブセンスＲＮＡゲノム
の検出を提供する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ融解及びＤＮＡポリメラーゼを使用するＤ
ＮＡの酵素的な複製反応の加熱及び冷却の繰り返しのサイクルからなるＤＮＡを増幅する
ために使用する、一般的な熱サイクル依存性核酸増幅技術である。リアルタイム定量的Ｐ
ＣＲ（ｑＰＣＲ）は、生体試料の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用する技
術である。現在、ｑＰＣＲはリアルタイムの反応全体の反応産物の検出を利用し、増幅プ
ロファイルを各反応の開始時に公知の量の核酸を含有する対照の増幅と比較する（又は未
知の試験した核酸に対する公知の核酸の相対比）。対照の結果を使用して標準曲線を構築
し、典型的には標準的な反応増幅曲線の対数部分に基づく。標準的な対照の量と比較した
それらの増幅曲線に基づいて、これらの値を使用して未知の量を補間する。
ＮＡの酵素的な複製反応の加熱及び冷却の繰り返しのサイクルからなるＤＮＡを増幅する
ために使用する、一般的な熱サイクル依存性核酸増幅技術である。リアルタイム定量的Ｐ
ＣＲ（ｑＰＣＲ）は、生体試料の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用する技
術である。現在、ｑＰＣＲはリアルタイムの反応全体の反応産物の検出を利用し、増幅プ
ロファイルを各反応の開始時に公知の量の核酸を含有する対照の増幅と比較する（又は未
知の試験した核酸に対する公知の核酸の相対比）。対照の結果を使用して標準曲線を構築
し、典型的には標準的な反応増幅曲線の対数部分に基づく。標準的な対照の量と比較した
それらの増幅曲線に基づいて、これらの値を使用して未知の量を補間する。
ＰＣＲに加えて、限定されないが、ニッキング増幅反応、ローリングサークル増幅（Ｒ
ＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（
ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増
幅（ＮＡＳＢＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、Ｑ－βレプリカーゼシステム
、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む熱サイクル非依存性増幅システ
ム又は等温核酸増幅技術が存在する。
ＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（
ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増
幅（ＮＡＳＢＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、Ｑ－βレプリカーゼシステム
、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む熱サイクル非依存性増幅システ
ム又は等温核酸増幅技術が存在する。
等温ニッキング増幅反応はＰＣＲ熱サイクルと類似点を有する。ＰＣＲのように、ニッ
キング増幅反応は、プライマーと呼ばれる標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を
用いる。さらに、標的配列のニッキング増幅反応は、標準のＰＣＲでもそうであるように
標的配列の対数増加をもたらす。標準のＰＣＲとは違い、ニッキング増幅反応は等温で進
行する。標準のＰＣＲでは、温度を上げてＤＮＡの２つの鎖を分離する。ニッキング増幅
反応では、標的核酸配列は試験試料に存在する特異的なニッキング部位にニックを入れる
。ポリメラーゼはニック部位に浸潤し、既存の相補的なＤＮＡ鎖の置換とともにニックを
入れた標的ヌクレオチド配列（添加した外来性ＤＮＡ）の相補的な鎖の合成を開始する。
鎖置換複製工程は、温度上昇を必要としない。この時点で、プライマー分子は、添加した
外来性ＤＮＡから置換した相補的な配列とアニールする。ここで、ポリメラーゼは鋳型の
３’末端から伸長し、事前に置換した鎖と相補的な鎖を作る。第二のオリゴヌクレオチド
プライマーは、次いで、新しく合成された相補的な鎖とアニールし、伸長してニッキング
酵素認識配列を含むＤＮＡの二重鎖を作製する。この鎖は、次いで、ポリメラーゼによる
続く鎖置換伸長によりニックを入れやすく、本来の標的ＤＮＡのいずれかの部位にニック
部位を有するＤＮＡの二重鎖の産生をもたらす。これが合成されると、分子は、新しい鋳
型分子で置換された鎖の複製により指数関数的に増幅され続ける。さらに、増幅はまた、
ニック部位を導入した鋳型でのニック翻訳合成の繰り返し作用により、各生成物分子から
直線的に進行する。結果は、標的シグナル増幅の非常に速い増加であり、ＰＣＲ熱サイク
ルよりもずっと早く、増幅は１０分未満で生じる。
ニッキング増幅アッセイ
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイで増幅したＥＢＯＶ標的核酸分子の検出を提供
する。
キング増幅反応は、プライマーと呼ばれる標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を
用いる。さらに、標的配列のニッキング増幅反応は、標準のＰＣＲでもそうであるように
標的配列の対数増加をもたらす。標準のＰＣＲとは違い、ニッキング増幅反応は等温で進
行する。標準のＰＣＲでは、温度を上げてＤＮＡの２つの鎖を分離する。ニッキング増幅
反応では、標的核酸配列は試験試料に存在する特異的なニッキング部位にニックを入れる
。ポリメラーゼはニック部位に浸潤し、既存の相補的なＤＮＡ鎖の置換とともにニックを
入れた標的ヌクレオチド配列（添加した外来性ＤＮＡ）の相補的な鎖の合成を開始する。
鎖置換複製工程は、温度上昇を必要としない。この時点で、プライマー分子は、添加した
外来性ＤＮＡから置換した相補的な配列とアニールする。ここで、ポリメラーゼは鋳型の
３’末端から伸長し、事前に置換した鎖と相補的な鎖を作る。第二のオリゴヌクレオチド
プライマーは、次いで、新しく合成された相補的な鎖とアニールし、伸長してニッキング
酵素認識配列を含むＤＮＡの二重鎖を作製する。この鎖は、次いで、ポリメラーゼによる
続く鎖置換伸長によりニックを入れやすく、本来の標的ＤＮＡのいずれかの部位にニック
部位を有するＤＮＡの二重鎖の産生をもたらす。これが合成されると、分子は、新しい鋳
型分子で置換された鎖の複製により指数関数的に増幅され続ける。さらに、増幅はまた、
ニック部位を導入した鋳型でのニック翻訳合成の繰り返し作用により、各生成物分子から
直線的に進行する。結果は、標的シグナル増幅の非常に速い増加であり、ＰＣＲ熱サイク
ルよりもずっと早く、増幅は１０分未満で生じる。
ニッキング増幅アッセイ
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイで増幅したＥＢＯＶ標的核酸分子の検出を提供
する。
本明細書に記載の方法に有用なポリメラーゼは、ヌクレオチドの取り込みを触媒し、鎖
置換活性を伴い、標的核酸分子に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の
３’ヒドロキシル末端及び／又は二本鎖ＤＮＡ分子のニック部位の３’ヒドロキシル末端
を伸長することができる。そのようなポリメラーゼはまた、５’－３’エキソヌクレアー
ゼ活性を欠損又は実質的に減少し、好熱性のものを含み得る。６つの３’－末端ヌクレオ
チドを含むプライマー領域の２’－修飾ヌクレオチドを有するプライマーを含む方法に有
用なＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスとしても分類される
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）から、並びに５’
－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損又は実質的に減少し、鎖置換活性を有するゲオバチ
ルス属を含む密接に関連した細菌株、単離体、及び種から単離されたＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの誘導体及び変異体を含む。例示的なポリメラーゼは、限定はされないが、Ｂｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＧｋａ ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大きな断片を含む。
置換活性を伴い、標的核酸分子に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の
３’ヒドロキシル末端及び／又は二本鎖ＤＮＡ分子のニック部位の３’ヒドロキシル末端
を伸長することができる。そのようなポリメラーゼはまた、５’－３’エキソヌクレアー
ゼ活性を欠損又は実質的に減少し、好熱性のものを含み得る。６つの３’－末端ヌクレオ
チドを含むプライマー領域の２’－修飾ヌクレオチドを有するプライマーを含む方法に有
用なＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスとしても分類される
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）から、並びに５’
－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損又は実質的に減少し、鎖置換活性を有するゲオバチ
ルス属を含む密接に関連した細菌株、単離体、及び種から単離されたＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの誘導体及び変異体を含む。例示的なポリメラーゼは、限定はされないが、Ｂｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＧｋａ ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大きな断片を含む。
本明細書に記載の方法に有用なニッキング剤は、二本鎖核酸分子の特定の構造を認識及
び結合し、その認識した特定の構造への結合時にボトム鎖上に隣接するヌクレオチド間の
リン酸ジエステル結合の切断よりも実質的に高い率で、トップ鎖上に隣接するヌクレオチ
ド間のリン酸ジエステル結合を切断し、それにより５’－３’－エキソヌクレアーゼ欠損
鎖置換ポリメラーゼによって伸長することができるニック部位に先行する末端ヌクレオチ
ド上に遊離の３’－ヒドロキシル基を作ることができる化学実体である。本明細書に開示
の方法の好ましい実施形態では、「ニッキング剤」のトップ鎖のリン酸ジエステル結合切
断率は１００％に達し、ボトム鎖のリン酸ジエステル結合切断率は０％である。本明細書
に記載の方法に有用なニッキング剤は、等モル比様式で、酵素、すなわち複数の基質分子
を代謝回転する自己再生触媒、又は単一の基質分子だけを代謝回転する非再生触媒のいず
れかであり得る。
び結合し、その認識した特定の構造への結合時にボトム鎖上に隣接するヌクレオチド間の
リン酸ジエステル結合の切断よりも実質的に高い率で、トップ鎖上に隣接するヌクレオチ
ド間のリン酸ジエステル結合を切断し、それにより５’－３’－エキソヌクレアーゼ欠損
鎖置換ポリメラーゼによって伸長することができるニック部位に先行する末端ヌクレオチ
ド上に遊離の３’－ヒドロキシル基を作ることができる化学実体である。本明細書に開示
の方法の好ましい実施形態では、「ニッキング剤」のトップ鎖のリン酸ジエステル結合切
断率は１００％に達し、ボトム鎖のリン酸ジエステル結合切断率は０％である。本明細書
に記載の方法に有用なニッキング剤は、等モル比様式で、酵素、すなわち複数の基質分子
を代謝回転する自己再生触媒、又は単一の基質分子だけを代謝回転する非再生触媒のいず
れかであり得る。
ニッキング酵素は二本鎖ＤＮＡに結合し、二本鎖の１つの鎖を切断する。本発明の方法
では、ニッキング酵素はトップ鎖（ニッキング剤認識部位の５’－３’配列を含む鎖）を
切断する。本明細書に開示の本発明の特定の実施形態では、ニッキング酵素はトップ鎖の
み及び認識部位の３’下流を切断する。例示的な実施形態では、反応は、生成物の配列が
ニッキング部位を含有しないように結合部位の下流を切断又はニックを入れるニッキング
酵素の使用を含む。結合部位の下流を切断する酵素の使用によりニッキング酵素を置換す
ることなくポリメラーゼがより容易に伸長する。理想的には、ニッキング酵素は、ポリメ
ラーゼと同じ反応条件下で機能的である。例示的なニッキング酵素は、限定はされないが
、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、Ｎ．ＢｓｔＳＥＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０
Ｉ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（ＮＥＢ）、
Ｎｂ．ＢｔｓＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、
Ｎｔ．Ｂｐｕ１０Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、
Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）、及びＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ
（ＮＥＢ）を含む。ニッキング酵素認識部位の配列は表１に提供する。
では、ニッキング酵素はトップ鎖（ニッキング剤認識部位の５’－３’配列を含む鎖）を
切断する。本明細書に開示の本発明の特定の実施形態では、ニッキング酵素はトップ鎖の
み及び認識部位の３’下流を切断する。例示的な実施形態では、反応は、生成物の配列が
ニッキング部位を含有しないように結合部位の下流を切断又はニックを入れるニッキング
酵素の使用を含む。結合部位の下流を切断する酵素の使用によりニッキング酵素を置換す
ることなくポリメラーゼがより容易に伸長する。理想的には、ニッキング酵素は、ポリメ
ラーゼと同じ反応条件下で機能的である。例示的なニッキング酵素は、限定はされないが
、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、Ｎ．ＢｓｔＳＥＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０
Ｉ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（ＮＥＢ）、
Ｎｂ．ＢｔｓＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、
Ｎｔ．Ｂｐｕ１０Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、
Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）、及びＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ
（ＮＥＢ）を含む。ニッキング酵素認識部位の配列は表１に提供する。
ニッキング酵素は、制限エンドヌクレアーゼの切断活性を改変して作られた、操作した
ニッキング酵素も含む（ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ Ｊｕｌｙ ２００６、ｖｏｌ
１．２）。制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡのそれらの認識配列と結合する場合、各鎖
を加水分解する各酵素内の２つの触媒部位が並行して進行する２つの非依存的な加水分解
反応を誘導する。変更した制限酵素は操作することができ、二重鎖の１つの鎖のみを加水
分解し、切断ではなく、「ニックを入れた」（３’－ヒドロキシル、５’－リン酸）ＤＮ
Ａ分子を産生する。ニッキング酵素は、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写活性
化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びニッカーゼ活性を有するＺｎフ
ィンガーヌクレアーゼも含み得る。
ニッキング酵素も含む（ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ Ｊｕｌｙ ２００６、ｖｏｌ
１．２）。制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡのそれらの認識配列と結合する場合、各鎖
を加水分解する各酵素内の２つの触媒部位が並行して進行する２つの非依存的な加水分解
反応を誘導する。変更した制限酵素は操作することができ、二重鎖の１つの鎖のみを加水
分解し、切断ではなく、「ニックを入れた」（３’－ヒドロキシル、５’－リン酸）ＤＮ
Ａ分子を産生する。ニッキング酵素は、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写活性
化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びニッカーゼ活性を有するＺｎフ
ィンガーヌクレアーゼも含み得る。
ニッキング増幅反応は、典型的には、例えばジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄ
ＮＴＰ）などのヌクレオチドを含む。反応は、限定はされないが、放射線標識（例えば、
３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ）酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）、蛍光
標識（例えば、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジオキシ
ゲニン、抗原、ハプテン、又は蛍光色素を含む検出可能な部分を含むｄＮＴＰの存在下で
も実施され得る。反応は、ニッキング酵素及びポリメラーゼの活性を提供する特定の塩及
び緩衝液をさらに含む。
ＮＴＰ）などのヌクレオチドを含む。反応は、限定はされないが、放射線標識（例えば、
３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ）酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）、蛍光
標識（例えば、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジオキシ
ゲニン、抗原、ハプテン、又は蛍光色素を含む検出可能な部分を含むｄＮＴＰの存在下で
も実施され得る。反応は、ニッキング酵素及びポリメラーゼの活性を提供する特定の塩及
び緩衝液をさらに含む。
有利には、ニッキング増幅反応は、増幅反応の経過の間、反応の温度が大体一定である
実質的に等温条件下で実施される。温度は、高温と低温の間でサイクルされる必要がない
ため、ニッキング増幅反応は、従来のＰＣＲを実施するのが難しい条件下で実施すること
ができる。典型的には、反応は約３５℃と９０℃の間（例えば、約３５、３７、４２、５
５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５℃）で実施される。有利には、温度をより
精密に維持することは必須ではない。温度のある程度の変動は許容される。
実質的に等温条件下で実施される。温度は、高温と低温の間でサイクルされる必要がない
ため、ニッキング増幅反応は、従来のＰＣＲを実施するのが難しい条件下で実施すること
ができる。典型的には、反応は約３５℃と９０℃の間（例えば、約３５、３７、４２、５
５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５℃）で実施される。有利には、温度をより
精密に維持することは必須ではない。温度のある程度の変動は許容される。
増幅反応のプライマーセットは、ΔΔＧ’ｓ≦－１５、－１６、－１７、－１８、－１
９、－２０、－２５、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ又はそれ以上を有するものが選択される
。増幅反応の性能特性は、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド（例えば、１つ又は複数の
プライマー及び／若しくはプローブ）の濃度並びに／又はそれらの比を増加させることに
よって変更することができる。高濃度のプライマーもプライマーダイマー形成を好む。様
々な実施形態では、プライマーの濃度は１００、２００、３００、４００、５００、６０
０、７００、８００、９００、１０００ｎＭ又はそれ以上である。融解温度（Ｔｍ）及び
反応率モディファイヤーは、（限定はされないが）エチレングリコール及びグリセロール
など、オリゴヌクレオチドの融解温度を下げるためにも使用され得る。さらに、ＤＮＡポ
リメラーゼ反応率モディファイヤー（ｄＮＴＰ及びマグネシウム濃度など）は、反応率を
変更し、より定量精度を上げるために使用され得る。特定の実施形態では、フォワード及
びリバースプライマーの５’テール配列は同じ核酸配列を有する。
９、－２０、－２５、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ又はそれ以上を有するものが選択される
。増幅反応の性能特性は、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド（例えば、１つ又は複数の
プライマー及び／若しくはプローブ）の濃度並びに／又はそれらの比を増加させることに
よって変更することができる。高濃度のプライマーもプライマーダイマー形成を好む。様
々な実施形態では、プライマーの濃度は１００、２００、３００、４００、５００、６０
０、７００、８００、９００、１０００ｎＭ又はそれ以上である。融解温度（Ｔｍ）及び
反応率モディファイヤーは、（限定はされないが）エチレングリコール及びグリセロール
など、オリゴヌクレオチドの融解温度を下げるためにも使用され得る。さらに、ＤＮＡポ
リメラーゼ反応率モディファイヤー（ｄＮＴＰ及びマグネシウム濃度など）は、反応率を
変更し、より定量精度を上げるために使用され得る。特定の実施形態では、フォワード及
びリバースプライマーの５’テール配列は同じ核酸配列を有する。
本発明は、例えば本明細書に記載の増幅戦略の利用を含む、リアルタイムでのニッキン
グ増幅反応をモニタリングする方法を提供する。一実施形態では、定量的核酸増幅は、公
知の量の対照の増幅とともに標的核酸増幅を利用する。標的核酸の量は、対照（外因性又
は内因性対照）の供給源に基づいて絶対定量又は相対定量（半定量的）として算出するこ
とができる。
グ増幅反応をモニタリングする方法を提供する。一実施形態では、定量的核酸増幅は、公
知の量の対照の増幅とともに標的核酸増幅を利用する。標的核酸の量は、対照（外因性又
は内因性対照）の供給源に基づいて絶対定量又は相対定量（半定量的）として算出するこ
とができる。
未知のヌクレオチド配列の定量は、反応の別々のセット若しくは同じ反応のいずれかに
おいて未知の対数閾値増幅と一連の公知の標的配列の比較によって、又は閾値を産み出し
、陽性結果（未知が閾値を超える場合）又は陰性結果（未知が閾値を超えない場合）のい
ずれかを示す、体内の内在性又は外在性の同時増幅産物として達成することができる。
おいて未知の対数閾値増幅と一連の公知の標的配列の比較によって、又は閾値を産み出し
、陽性結果（未知が閾値を超える場合）又は陰性結果（未知が閾値を超えない場合）のい
ずれかを示す、体内の内在性又は外在性の同時増幅産物として達成することができる。
本発明は、候補フォワードプライマー及び／又は候補リバースプライマーの多くの組合
せを実験的にスクリーニングすることなく、ニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイ
を設計する方法も提供する。標的配列内の３５～７０ｂｐの長い領域は、Ｔｍ≧アッセイ
温度（例えば、～５５℃）での中心部分に１２～２０ｂｐ配列を有することが同定される
。上記の基準に従って、中心領域の１５～２０ｂｐ長のすぐ下流及び上流の隣接する配列
１２～２０ｂｐ長が同定される。選択した二本鎖の隣接する配列の下流及び上流のＴｍは
、互いに±３℃未満外れる。フォワード及びリバースプライマーの標的特異的対は、安定
なダイマー形成プライマーの５’テール領域を、隣接する配列の１２～２０塩基上流の５
’末端、及び隣接する配列の１２～２０塩基下流の相補的な鎖の５’末端に結合すること
により作られる。フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを組み合わ
せる場合、プローブに相補的な鎖の合成を誘導するプライマーは、モル比約１．１：１～
１０：１で他のプライマーを超過する。アッセイにおいてプライマーの合わせた濃度は、
１０００ｎＭ以下である。アッセイ設計方法は、≦７０ｂｐのアンプリコンの事前に検証
されたＰＣＲアッセイをニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイに変えるために使用
することもできる。
プライマー設計
プライマー設計の従来の方法は、プライマー融解温度、プライマーアニーリング温度、
ＧＣ（グアニン及びシトシン）含量、プライマー長、及びプライマーの標的核酸以外全て
との相互作用を最小限にすることに注目されてきた（例えば、www.premierbiosoft.com/t
ech_notes/PCR_Primer_Design.htmlを参照）。これらの方法に反して、安定なプライマー
／ダイマーを形成し、形成の自由エネルギー（ΔＧ）で表されるプライマーは、核酸増幅
反応において予想通りに機能することが見出されてきた。自由エネルギー（ΔＧ）及び融
解温度（Ｔｍ）は、主成分のエンタルピー（ΔＨ）及びエントロピー（ΔＳ）を共有する
が、ΔＧ及びＴｍ値は別々に由来し、相関する関係がなく、所与のΔＧと所与のＴｍ値を
関係させる唯一の方法は、それらが由来するΔＨ及びΔＳの値をはっきりと知ることであ
る（Ｍａｎｔｈｅｙ、「ｍＦｏｌｄ，Ｄｅｌｔａ Ｇ，ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍ
ｐｅｒａｔｕｒｅ」（著作権）２００５及び２０１１ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。図１～１１は、最適なプライマーの設計に関する。
せを実験的にスクリーニングすることなく、ニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイ
を設計する方法も提供する。標的配列内の３５～７０ｂｐの長い領域は、Ｔｍ≧アッセイ
温度（例えば、～５５℃）での中心部分に１２～２０ｂｐ配列を有することが同定される
。上記の基準に従って、中心領域の１５～２０ｂｐ長のすぐ下流及び上流の隣接する配列
１２～２０ｂｐ長が同定される。選択した二本鎖の隣接する配列の下流及び上流のＴｍは
、互いに±３℃未満外れる。フォワード及びリバースプライマーの標的特異的対は、安定
なダイマー形成プライマーの５’テール領域を、隣接する配列の１２～２０塩基上流の５
’末端、及び隣接する配列の１２～２０塩基下流の相補的な鎖の５’末端に結合すること
により作られる。フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを組み合わ
せる場合、プローブに相補的な鎖の合成を誘導するプライマーは、モル比約１．１：１～
１０：１で他のプライマーを超過する。アッセイにおいてプライマーの合わせた濃度は、
１０００ｎＭ以下である。アッセイ設計方法は、≦７０ｂｐのアンプリコンの事前に検証
されたＰＣＲアッセイをニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイに変えるために使用
することもできる。
プライマー設計
プライマー設計の従来の方法は、プライマー融解温度、プライマーアニーリング温度、
ＧＣ（グアニン及びシトシン）含量、プライマー長、及びプライマーの標的核酸以外全て
との相互作用を最小限にすることに注目されてきた（例えば、www.premierbiosoft.com/t
ech_notes/PCR_Primer_Design.htmlを参照）。これらの方法に反して、安定なプライマー
／ダイマーを形成し、形成の自由エネルギー（ΔＧ）で表されるプライマーは、核酸増幅
反応において予想通りに機能することが見出されてきた。自由エネルギー（ΔＧ）及び融
解温度（Ｔｍ）は、主成分のエンタルピー（ΔＨ）及びエントロピー（ΔＳ）を共有する
が、ΔＧ及びＴｍ値は別々に由来し、相関する関係がなく、所与のΔＧと所与のＴｍ値を
関係させる唯一の方法は、それらが由来するΔＨ及びΔＳの値をはっきりと知ることであ
る（Ｍａｎｔｈｅｙ、「ｍＦｏｌｄ，Ｄｅｌｔａ Ｇ，ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍ
ｐｅｒａｔｕｒｅ」（著作権）２００５及び２０１１ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。図１～１１は、最適なプライマーの設計に関する。
分子間のプライマー構造の形成の自由エネルギー（ΔＧ）は、当技術分野で公知の式を
使用して算出され得る。様々な分子内及び分子間プライマー構造の形成の決定、及びそれ
らのΔＧの算出にいくつかのプログラムが利用可能であり、例えば、ｍ倍及びＵＮＡ倍の
予測アルゴリズムを含む（例えば、Ｍａｒｋｈａｍ及びＺｕｋｅｒ．ＵＮＡＦｏｌｄ：Ｓ
ｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｃｈａｐｔ
ｅｒ１、ｐｐ３～３１、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、２００８；Ｚｕｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ
ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｉｎ ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１～４３，ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｋｌｕｗｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９；Ｍ． Ｚｕｋｅｒ．Ｐｒｅｄｉｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ Ｅｎｅｒｇ
ｙ Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、２６７～２９４、１９９４；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎ
ｇ Ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｄ Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｆｏｒ ＲＮＡ．Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３、２８
１～３０６、１９９０；Ｚｕｋｅｒ．Ｏｎ Ｆｉｎｄｉｎｇ Ａｌｌ Ｓｕｂｏｐｔｉｍ
ａｌ Ｆｏｌｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４、４８～５２、１９８９を参照）。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１は、ｍ倍の
プライマー設計を実施するものである（www.idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoA
nalyzer/）。例えば、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１を参照すると、ΔＧの算出は
以下のパラメーター：標的型：ＤＮＡ；オリゴ濃度０．２５μＭ；Ｎａ＋濃度：６０ｍＭ
；Ｍｇ＋＋濃度：１５ｍＭ；及びｄＮＴＰ濃度；０．３ｍＭを使用して実施され得る。
３’認識領域
本発明は、プライマー－標的形成が安定であり（ΔＧ≦約－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又は
それ以上）、核酸増幅反応の実施を増強する能力を有する、３’認識配列を有するプライ
マーを提供する。３’認識領域は核酸分子、例えば核酸分子の相補的な配列に特異的に結
合する。特定の実施形態では、３’認識領域は、核酸配列の１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、又は２０塩基又はそれ以上に相補的な配列を有する。特定の実施
形態では、３’認識領域は、１つ又は複数のイノシン塩基を含む。特定の実施形態では、
３’認識領域は２／１２以下のイノシンを含む。様々な実施形態では、プライマー－標的
融解温度は、アッセイの反応又は伸長温度より８℃又は６℃低い温度以上である（Ｔｍ≧
アッセイ温度－８℃）。特定の実施形態では、３’認識配列は１２～２０、１２～１７、
又は１２～１４塩基含む。特定の実施形態では、プライマー－標的形成は、自己ダイマー
形成よりもより安定である（例えば、ΔΔＧ≦約－１５、－１６、－１７、－１８、－１
９、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ以上）。好ましくは、３’認識配列は、プライマー
－標的アニーリングに干渉する能力を有する、自己相補的な配列、短い逆方向反復（例え
ば、＞４塩基／反復）、又はそうでなければ分子内相互作用を促進する配列を含有しない
。
使用して算出され得る。様々な分子内及び分子間プライマー構造の形成の決定、及びそれ
らのΔＧの算出にいくつかのプログラムが利用可能であり、例えば、ｍ倍及びＵＮＡ倍の
予測アルゴリズムを含む（例えば、Ｍａｒｋｈａｍ及びＺｕｋｅｒ．ＵＮＡＦｏｌｄ：Ｓ
ｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｃｈａｐｔ
ｅｒ１、ｐｐ３～３１、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、２００８；Ｚｕｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ
ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｉｎ ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１～４３，ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｋｌｕｗｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９；Ｍ． Ｚｕｋｅｒ．Ｐｒｅｄｉｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ Ｅｎｅｒｇ
ｙ Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、２６７～２９４、１９９４；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎ
ｇ Ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｄ Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｆｏｒ ＲＮＡ．Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３、２８
１～３０６、１９９０；Ｚｕｋｅｒ．Ｏｎ Ｆｉｎｄｉｎｇ Ａｌｌ Ｓｕｂｏｐｔｉｍ
ａｌ Ｆｏｌｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４、４８～５２、１９８９を参照）。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１は、ｍ倍の
プライマー設計を実施するものである（www.idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoA
nalyzer/）。例えば、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１を参照すると、ΔＧの算出は
以下のパラメーター：標的型：ＤＮＡ；オリゴ濃度０．２５μＭ；Ｎａ＋濃度：６０ｍＭ
；Ｍｇ＋＋濃度：１５ｍＭ；及びｄＮＴＰ濃度；０．３ｍＭを使用して実施され得る。
３’認識領域
本発明は、プライマー－標的形成が安定であり（ΔＧ≦約－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又は
それ以上）、核酸増幅反応の実施を増強する能力を有する、３’認識配列を有するプライ
マーを提供する。３’認識領域は核酸分子、例えば核酸分子の相補的な配列に特異的に結
合する。特定の実施形態では、３’認識領域は、核酸配列の１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、又は２０塩基又はそれ以上に相補的な配列を有する。特定の実施
形態では、３’認識領域は、１つ又は複数のイノシン塩基を含む。特定の実施形態では、
３’認識領域は２／１２以下のイノシンを含む。様々な実施形態では、プライマー－標的
融解温度は、アッセイの反応又は伸長温度より８℃又は６℃低い温度以上である（Ｔｍ≧
アッセイ温度－８℃）。特定の実施形態では、３’認識配列は１２～２０、１２～１７、
又は１２～１４塩基含む。特定の実施形態では、プライマー－標的形成は、自己ダイマー
形成よりもより安定である（例えば、ΔΔＧ≦約－１５、－１６、－１７、－１８、－１
９、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ以上）。好ましくは、３’認識配列は、プライマー
－標的アニーリングに干渉する能力を有する、自己相補的な配列、短い逆方向反復（例え
ば、＞４塩基／反復）、又はそうでなければ分子内相互作用を促進する配列を含有しない
。
一実施形態では、プライマーは、アニーリングに寄与しないプライマーの端に４つの配
列特異的な塩基を有し、Ｔｍが５６℃になるように設計する。一実施形態では、プライマ
ーは１６、１７、１８、１９、２０、又は２１塩基長である。
列特異的な塩基を有し、Ｔｍが５６℃になるように設計する。一実施形態では、プライマ
ーは１６、１７、１８、１９、２０、又は２１塩基長である。
特に、３’認識配列を有する本発明のプライマーは、ニッキング増幅アッセイに有用で
ある。さらに、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的３’認識領域は１つ又は複数の２’
修飾ヌクレオチドを含む（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－
フルオロ、２’－アルキル、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オ
キソエチル］、２’－ヒドロキシル（ＲＮＡ）、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－
ブリッジ、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－ブリッジ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカル
バメート））。理論に縛られることなく、１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドの認識領
域への組込みは、プライマー／鋳型の分子間及び／若しくは分子内相互作用を減少させる
又は除き（例えば、プライマー－ダイマー形成）、それにより等温増幅の背景シグナルを
減少させる又は除くと仮定される。２’修飾ヌクレオチドは、好ましくは標的配列と塩基
対を形成する塩基を有する。特定の実施形態では、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的
認識領域の２つ又はそれ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ
又はそれ以上の２’修飾ヌクレオチド）は近接している（例えば、修飾ヌクレオチドのブ
ロック）。いくつかの実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは標的特異的認識
領域の３’末端に位置する。他の実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、Ｅ
ＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的認識領域の５’末端に位置する。２’修飾ヌクレオチ
ドのブロックが標的特異的認識領域の５’末端に位置する場合、２’修飾ヌクレオチドは
、１つ又は複数の非修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の
２’非修飾ヌクレオチド）によるニック部位から分けられ得る。出願人らは、１つ又は複
数の２’修飾ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレオチドのブロックの位置により増幅の速度
論が変更することを見出した。１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレ
オチドのブロックが、認識領域の５’末端若しくはその近く、又はニック部位の近位に位
置する場合、リアルタイム増幅反応は検出時間の減少を示した。さらに、シグナル曲線は
縮小され、曲線の傾斜が変わる。
ある。さらに、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的３’認識領域は１つ又は複数の２’
修飾ヌクレオチドを含む（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－
フルオロ、２’－アルキル、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オ
キソエチル］、２’－ヒドロキシル（ＲＮＡ）、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－
ブリッジ、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－ブリッジ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカル
バメート））。理論に縛られることなく、１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドの認識領
域への組込みは、プライマー／鋳型の分子間及び／若しくは分子内相互作用を減少させる
又は除き（例えば、プライマー－ダイマー形成）、それにより等温増幅の背景シグナルを
減少させる又は除くと仮定される。２’修飾ヌクレオチドは、好ましくは標的配列と塩基
対を形成する塩基を有する。特定の実施形態では、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的
認識領域の２つ又はそれ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ
又はそれ以上の２’修飾ヌクレオチド）は近接している（例えば、修飾ヌクレオチドのブ
ロック）。いくつかの実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは標的特異的認識
領域の３’末端に位置する。他の実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、Ｅ
ＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的認識領域の５’末端に位置する。２’修飾ヌクレオチ
ドのブロックが標的特異的認識領域の５’末端に位置する場合、２’修飾ヌクレオチドは
、１つ又は複数の非修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の
２’非修飾ヌクレオチド）によるニック部位から分けられ得る。出願人らは、１つ又は複
数の２’修飾ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレオチドのブロックの位置により増幅の速度
論が変更することを見出した。１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレ
オチドのブロックが、認識領域の５’末端若しくはその近く、又はニック部位の近位に位
置する場合、リアルタイム増幅反応は検出時間の減少を示した。さらに、シグナル曲線は
縮小され、曲線の傾斜が変わる。
関連する実施形態では、１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーの比
を使用し、検出時間及び／又は反応の「調整」のための反応の効率を変更し、反応速度論
の予測可能な調節をもたらすことができる。認識配列の３’末端に１つ又は複数の２’修
飾ヌクレオチドを有するプライマーと認識配列の５’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌク
レオチドを有するプライマーの比が増加すると、シグナル曲線を縮小し、曲線の傾斜が変
わる。検出時間並びに反応の効率の両方を操作する手段を提供する反応を「調整」できる
ことは有利である。内部対照を使用する相対定量は、２つの重要な条件が合うことが必要
である。まず、非競合反応条件を作り出す反応の検出時間を改変できることは有利である
。したがって、後半の時点で検出可能な対照の反応に影響を及ぼすことにより（目的の標
的に対して）、目的の標的が少ない初期存在量である場合でさえ、対照の反応は目的の特
異的標的を打ち負かさない。第二に、真の相対存在量の算出を確実にするため、対照及び
特異的標的反応は効率が釣り合う必要がある。「調整」条件を使用して各反応の効率を調
節することによって、反応を釣り合わせることができ、十分な相対定量算出を可能にする
。反応の調整は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において、標的核酸増幅と参照核酸増幅（例
えば、内部標準）の効率を釣り合わせるために使用できる。さらに、標的核酸及び内部標
準の増幅曲線は変更することができ、それらの増幅産物の検出時間が分けられ、一方標的
核酸増幅及び内部標準増幅に同じ効率を提供する。反応におけるオリゴヌクレオチド構造
の特定の組合せ及び比の使用によって、調整した反応の実施を可能にする条件を作り出す
ことが可能である。
５’テールダイマー化領域
本発明は、ＥＢＯＶ又は他のウイルス核酸増幅反応性能を増強する自己ダイマー化可能
な５’テール領域を有するプライマーを提供する。理論に縛られることなく、核酸増幅反
応において、プライマーはプライマー－ダイマーとして標的核酸にアニールする。例えば
、ニッキング増幅プライマーは、標的認識配列へのプライマーの結合特異性と関連しない
５’末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的なプライマー相互作用によ
る非特異的なバックグラウンド産物は、そうでなければ特異的な産物の増幅に利用される
隔絶反応成分の可能性がある。様々な実施形態では、ホモダイマー形成は安定である（例
えば、ΔＧ≦約－３０、－３５、－４０、－４５、－５０、－５５、－６０ｋｃａｌ／ｍ
ｏｌ又はそれ以上）。様々な実施形態では、ホモダイマーは伸長反応温度よりも高い融解
温度を有する。特定の実施形態では、５’テール領域はパリンドロームである配列を有す
る。さらなる実施形態では、５’テール領域は少なくとも長さが１２塩基（例えば、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４塩基）で
ある。さらなる実施形態では、５’テール領域は８０～９０％のＧＣ含量を有する。特定
の実施形態では、ホモダイマー形成は、他のより不安定なプライマーダイマー形態形成の
形成よりも安定である（例えば、ΔΔＧ≦約－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、
－１７、－１８、－１９、－２０、－２５、－３０、－３５、－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又
はそれ以上）。
を使用し、検出時間及び／又は反応の「調整」のための反応の効率を変更し、反応速度論
の予測可能な調節をもたらすことができる。認識配列の３’末端に１つ又は複数の２’修
飾ヌクレオチドを有するプライマーと認識配列の５’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌク
レオチドを有するプライマーの比が増加すると、シグナル曲線を縮小し、曲線の傾斜が変
わる。検出時間並びに反応の効率の両方を操作する手段を提供する反応を「調整」できる
ことは有利である。内部対照を使用する相対定量は、２つの重要な条件が合うことが必要
である。まず、非競合反応条件を作り出す反応の検出時間を改変できることは有利である
。したがって、後半の時点で検出可能な対照の反応に影響を及ぼすことにより（目的の標
的に対して）、目的の標的が少ない初期存在量である場合でさえ、対照の反応は目的の特
異的標的を打ち負かさない。第二に、真の相対存在量の算出を確実にするため、対照及び
特異的標的反応は効率が釣り合う必要がある。「調整」条件を使用して各反応の効率を調
節することによって、反応を釣り合わせることができ、十分な相対定量算出を可能にする
。反応の調整は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において、標的核酸増幅と参照核酸増幅（例
えば、内部標準）の効率を釣り合わせるために使用できる。さらに、標的核酸及び内部標
準の増幅曲線は変更することができ、それらの増幅産物の検出時間が分けられ、一方標的
核酸増幅及び内部標準増幅に同じ効率を提供する。反応におけるオリゴヌクレオチド構造
の特定の組合せ及び比の使用によって、調整した反応の実施を可能にする条件を作り出す
ことが可能である。
５’テールダイマー化領域
本発明は、ＥＢＯＶ又は他のウイルス核酸増幅反応性能を増強する自己ダイマー化可能
な５’テール領域を有するプライマーを提供する。理論に縛られることなく、核酸増幅反
応において、プライマーはプライマー－ダイマーとして標的核酸にアニールする。例えば
、ニッキング増幅プライマーは、標的認識配列へのプライマーの結合特異性と関連しない
５’末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的なプライマー相互作用によ
る非特異的なバックグラウンド産物は、そうでなければ特異的な産物の増幅に利用される
隔絶反応成分の可能性がある。様々な実施形態では、ホモダイマー形成は安定である（例
えば、ΔＧ≦約－３０、－３５、－４０、－４５、－５０、－５５、－６０ｋｃａｌ／ｍ
ｏｌ又はそれ以上）。様々な実施形態では、ホモダイマーは伸長反応温度よりも高い融解
温度を有する。特定の実施形態では、５’テール領域はパリンドロームである配列を有す
る。さらなる実施形態では、５’テール領域は少なくとも長さが１２塩基（例えば、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４塩基）で
ある。さらなる実施形態では、５’テール領域は８０～９０％のＧＣ含量を有する。特定
の実施形態では、ホモダイマー形成は、他のより不安定なプライマーダイマー形態形成の
形成よりも安定である（例えば、ΔΔＧ≦約－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、
－１７、－１８、－１９、－２０、－２５、－３０、－３５、－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又
はそれ以上）。
特に、５’テール配列を有する本発明のプライマーは、ニッキング増幅反応に有用であ
る。ニッキング増幅反応に使用するため、１つ又は複数のニッキング剤認識部位及び５’
テール領域を含む５’テール領域は、対称的に反転した配列を有する。特定の実施形態で
は、５’テール領域は偶数個のヌクレオチドを含有する（例えば、２２、２４ヌクレオチ
ド）。ニック部位は５’テール領域の３’末端のヌクレオチドと３’認識領域の５’末端
のヌクレオチドの間に位置するように設計される。理論に縛られることなく、ニッキング
酵素は３’認識領域が一本鎖である場合、ニック部位で切断しない。しかし、３’認識領
域が二本鎖である場合、ニック部位での切断が起こる（例えば、核酸増幅反応の経過の間
に二本鎖標的核酸分子へとプライマーが組み込まれる場合）。
る。ニッキング増幅反応に使用するため、１つ又は複数のニッキング剤認識部位及び５’
テール領域を含む５’テール領域は、対称的に反転した配列を有する。特定の実施形態で
は、５’テール領域は偶数個のヌクレオチドを含有する（例えば、２２、２４ヌクレオチ
ド）。ニック部位は５’テール領域の３’末端のヌクレオチドと３’認識領域の５’末端
のヌクレオチドの間に位置するように設計される。理論に縛られることなく、ニッキング
酵素は３’認識領域が一本鎖である場合、ニック部位で切断しない。しかし、３’認識領
域が二本鎖である場合、ニック部位での切断が起こる（例えば、核酸増幅反応の経過の間
に二本鎖標的核酸分子へとプライマーが組み込まれる場合）。
様々な実施形態では、５’テール配列は、ニッキング酵素認識配列に動作可能に連結し
たパリンドローム配列（又は、自己相補的な配列）に動作可能に連結した、５’から３’
への反転したニッキング酵素認識配列を含む。特定の実施形態では、スペーサー領域は偶
数個のヌクレオチドである（例えば、２、４、６個など）。２、４、及び６個のヌクレオ
チドスペーサーを有するＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素認識配列（５’－GAGTC－３
’）に基づく例示的な５’テールは、以下の式：
たパリンドローム配列（又は、自己相補的な配列）に動作可能に連結した、５’から３’
への反転したニッキング酵素認識配列を含む。特定の実施形態では、スペーサー領域は偶
数個のヌクレオチドである（例えば、２、４、６個など）。２、４、及び６個のヌクレオ
チドスペーサーを有するＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素認識配列（５’－GAGTC－３
’）に基づく例示的な５’テールは、以下の式：
（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシ
ン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）ヌクレオ塩基を有する）であり、Ｎ１はＮ１’と相補的で
あり、Ｎ２はＮ２’と相補的であり、Ｎ３はＮ３’と相補的であるなど）による核酸配列
を含む。
ン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）ヌクレオ塩基を有する）であり、Ｎ１はＮ１’と相補的で
あり、Ｎ２はＮ２’と相補的であり、Ｎ３はＮ３’と相補的であるなど）による核酸配列
を含む。
例示的な５’テール領域は、以下の鋳型５’－NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN－３’に基づ
いて生成することができるＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する長さ２４ヌクレオチドを
配列する。この鋳型に基づいて、以下の特性：ΔＧ＝－４８Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ～－６２
ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；ΔΔＧ＜－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；及びＧＣ含量６８％～８４％
を有する５３７,８２４個の５’テール配列がある。これらのうち、１０５０個の選択さ
れた配列が提供され、全体の配列空間（２４８，８３２）の０．２％を表す。例示的な５
’テール領域は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する長さ２２ヌクレオチドを配列し、
以下の鋳型５’－NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN－３’に基づく。この鋳型に基づいて、以下の
特性：ΔＧ＝－４７Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ～－５５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；ΔΔＧ＜－４０ｋ
ｃａｌ／ｍｏｌｅ；及びＧＣ含量７２％～８２％を有する２４８，８３２個の５’テール
配列がある。これらのうち、２００個の選択された配列が提供され、全体の配列空間（２
４８，８３２）の０．０８％を表す。
標的核酸分子
本発明の方法及び組成物は、試験試料中のＥＢＯＶ又は他のウイルス核酸分子の増幅及
び／又は同定に有用である。標的配列は、ＥＢＯＶ核酸分子を含むウイルス核酸分子を含
む事実上任意の試料から増幅される。特に、本発明の方法及び組成物は、ＲＮＡウイルス
の増幅及び／又は同定に有用である。ＥＢＯＶに加えて、本発明の方法及び組成物を使用
して検出できる例示的なＲＮＡウイルスは、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｂ型インフルエンザ）、
ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ＢＶＤＶ遺伝子型Ｉ）、黄熱ウイルス、西ナイル
ウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、及び一本鎖Ｒ
ＮＡウイルスを含む。
いて生成することができるＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する長さ２４ヌクレオチドを
配列する。この鋳型に基づいて、以下の特性：ΔＧ＝－４８Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ～－６２
ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；ΔΔＧ＜－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；及びＧＣ含量６８％～８４％
を有する５３７,８２４個の５’テール配列がある。これらのうち、１０５０個の選択さ
れた配列が提供され、全体の配列空間（２４８，８３２）の０．２％を表す。例示的な５
’テール領域は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する長さ２２ヌクレオチドを配列し、
以下の鋳型５’－NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN－３’に基づく。この鋳型に基づいて、以下の
特性：ΔＧ＝－４７Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ～－５５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；ΔΔＧ＜－４０ｋ
ｃａｌ／ｍｏｌｅ；及びＧＣ含量７２％～８２％を有する２４８，８３２個の５’テール
配列がある。これらのうち、２００個の選択された配列が提供され、全体の配列空間（２
４８，８３２）の０．０８％を表す。
標的核酸分子
本発明の方法及び組成物は、試験試料中のＥＢＯＶ又は他のウイルス核酸分子の増幅及
び／又は同定に有用である。標的配列は、ＥＢＯＶ核酸分子を含むウイルス核酸分子を含
む事実上任意の試料から増幅される。特に、本発明の方法及び組成物は、ＲＮＡウイルス
の増幅及び／又は同定に有用である。ＥＢＯＶに加えて、本発明の方法及び組成物を使用
して検出できる例示的なＲＮＡウイルスは、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｂ型インフルエンザ）、
ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ＢＶＤＶ遺伝子型Ｉ）、黄熱ウイルス、西ナイル
ウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、及び一本鎖Ｒ
ＮＡウイルスを含む。
例示的な試験試料は、体液（例えば、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣
分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及
び血漿）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原性細胞など細胞が成長する液体）、環境
試料、農産物、又は他の食料品、及びそれらの抽出物、並びにＤＮＡ同定タグを含む。所
望であれば、試料は、生体試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される任意の
標準の方法を使用するニッキング増幅反応に包含される前に精製される。
分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及
び血漿）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原性細胞など細胞が成長する液体）、環境
試料、農産物、又は他の食料品、及びそれらの抽出物、並びにＤＮＡ同定タグを含む。所
望であれば、試料は、生体試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される任意の
標準の方法を使用するニッキング増幅反応に包含される前に精製される。
一実施形態では、プライマーは病原体の標的核酸を増幅し、試料中のＥＢＯＶ又は他の
ウイルスの存在を検出する。環境への適用のため、試験試料は、ＥＢＯＶに感染した対象
、環境スワブ、又は任意の他の試料に曝露されてきた水、建築材料（例えば、乾式壁、天
井タイル、壁材、織物、壁紙、及び床材）の液体抽出物を含み得る。
ウイルスの存在を検出する。環境への適用のため、試験試料は、ＥＢＯＶに感染した対象
、環境スワブ、又は任意の他の試料に曝露されてきた水、建築材料（例えば、乾式壁、天
井タイル、壁材、織物、壁紙、及び床材）の液体抽出物を含み得る。
本発明の方法は、血液中１ｍｌ当たり１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０
６、１×１０７、又は１×１０９コピーのＥＢＯＶ ＲＮＡの検出を提供する。
適用
本発明のプライマーを使用する標的核酸増幅は、ウイルス（例えば、ＥＢＯＶ）核酸分
子の迅速な検出に有用な特徴を有する。本発明の組成物及び方法はヒトの診断に有用であ
り、迅速な診断回答が望まれる（例えば、２０、１５、１０、９、８、７、６、５分又は
それ以下で検出可能な増幅）。特定の実施形態では、本発明は、臨床背景若しくは野外で
のヒト又は獣医診断におけるＥＢＯＶニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。他
の実施形態では、本発明は、熱サイクル装置が入手できない又は極めて高価な野外作業で
の診断における、ニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。さらに他の実施形態で
は、本発明は、迅速な定量的回答が望まれる臨床背景でのニッキング増幅反応アッセイの
使用を提供する。
検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ休止分子を含む増幅できない検出可能なポリ
ヌクレオチドプローブを使用するニッキング増幅反応における、標的核酸分子又はそれら
のアンプリコンの検出を提供する（例えば、オリゴヌクレオチドを標的核酸分子に結合で
きるようにするが、標的として検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを利用するポリメ
ラーゼ伸長を支持することができないようにするヌクレオチド修飾又は他の部分）。理論
に縛られることを望まないが、ポリメラーゼを進行させない１つ又は複数の部分の存在は
、オリゴヌクレオチドに加えて又は複製ポリメラーゼの失速によって、非核酸主鎖におけ
るポリメラーゼの休止を引き起こす（すなわち、Ｃ３－スペーサー、損傷したＤＮＡ塩基
、他のスペーサー部分、Ｏ－２－Ｍｅ塩基）。したがって、これらの構築物は、ニッキン
グ増幅反応の経過の間にプローブの異常な増幅を防ぐ又は減少する。これは、それらを従
来の検出プローブから区別し、ニッキング増幅反応の最後に添加し、それらの増幅を防ぐ
。
６、１×１０７、又は１×１０９コピーのＥＢＯＶ ＲＮＡの検出を提供する。
適用
本発明のプライマーを使用する標的核酸増幅は、ウイルス（例えば、ＥＢＯＶ）核酸分
子の迅速な検出に有用な特徴を有する。本発明の組成物及び方法はヒトの診断に有用であ
り、迅速な診断回答が望まれる（例えば、２０、１５、１０、９、８、７、６、５分又は
それ以下で検出可能な増幅）。特定の実施形態では、本発明は、臨床背景若しくは野外で
のヒト又は獣医診断におけるＥＢＯＶニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。他
の実施形態では、本発明は、熱サイクル装置が入手できない又は極めて高価な野外作業で
の診断における、ニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。さらに他の実施形態で
は、本発明は、迅速な定量的回答が望まれる臨床背景でのニッキング増幅反応アッセイの
使用を提供する。
検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ休止分子を含む増幅できない検出可能なポリ
ヌクレオチドプローブを使用するニッキング増幅反応における、標的核酸分子又はそれら
のアンプリコンの検出を提供する（例えば、オリゴヌクレオチドを標的核酸分子に結合で
きるようにするが、標的として検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを利用するポリメ
ラーゼ伸長を支持することができないようにするヌクレオチド修飾又は他の部分）。理論
に縛られることを望まないが、ポリメラーゼを進行させない１つ又は複数の部分の存在は
、オリゴヌクレオチドに加えて又は複製ポリメラーゼの失速によって、非核酸主鎖におけ
るポリメラーゼの休止を引き起こす（すなわち、Ｃ３－スペーサー、損傷したＤＮＡ塩基
、他のスペーサー部分、Ｏ－２－Ｍｅ塩基）。したがって、これらの構築物は、ニッキン
グ増幅反応の経過の間にプローブの異常な増幅を防ぐ又は減少する。これは、それらを従
来の検出プローブから区別し、ニッキング増幅反応の最後に添加し、それらの増幅を防ぐ
。
従来の検出プローブは、リアルタイムでのニッキング増幅反応を検出するためには非実
用的であることが分かっている。従来の検出プローブがニッキング増幅反応に組み込まれ
る場合、これらの従来の検出プローブは標的と同時に増幅される。これらの検出分子の増
幅は、反応の開始時の検出プローブの開始分子の数により正当な標的アンプリコンの検出
をマスクする。
用的であることが分かっている。従来の検出プローブがニッキング増幅反応に組み込まれ
る場合、これらの従来の検出プローブは標的と同時に増幅される。これらの検出分子の増
幅は、反応の開始時の検出プローブの開始分子の数により正当な標的アンプリコンの検出
をマスクする。
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ休止分子を含む増幅できない検出可能なポリ
ヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリメラーゼ休止分子は、限定はされないが
、複製のＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断し、それにより検出分子の増幅を防ぐが、
標的分子若しくは増幅した標的分子のコピーへの正確なハイブリダイゼーション又はヌク
レオチドスペーシングを可能にするヌクレオチド修飾又は他の部分を含む。一実施形態で
は、本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、検出分子の異常な増幅を防ぐ又
は減少する３個の炭素スペーサー（３Ｃ－スペーサー）を含む。
ヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリメラーゼ休止分子は、限定はされないが
、複製のＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断し、それにより検出分子の増幅を防ぐが、
標的分子若しくは増幅した標的分子のコピーへの正確なハイブリダイゼーション又はヌク
レオチドスペーシングを可能にするヌクレオチド修飾又は他の部分を含む。一実施形態で
は、本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、検出分子の異常な増幅を防ぐ又
は減少する３個の炭素スペーサー（３Ｃ－スペーサー）を含む。
一実施形態では、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、相補的なヌクレオチドへ
の増強した結合親和性を有する１つ又は複数の修飾ヌクレオチド塩基を含む。修飾塩基の
例は、限定はされないが、２’フルオロアミダイト、及び２’ＯＭｅ ＲＮＡアミダイト
（ポリメラーゼ休止分子としても機能する）を含む。本発明の検出可能なオリゴヌクレオ
チドプローブは、異なる蛍光色素で合成することができ、事実上任意の標的配列とハイブ
リダイズするように設計され得る。それらの顕著な特異性のため、本発明の増幅できない
検出可能なポリヌクレオチドプローブは試料中の単一の標的核酸分子を検出するために使
用され、又はそれぞれが異なる標的核酸分子に結合する検出可能なオリゴヌクレオチドプ
ローブと組み合わせて使用される。したがって、本発明の増幅できない検出可能なポリヌ
クレオチドプローブは、同じ反応で１つ又は複数の標的核酸分子を検出するために使用し
、これらの標的を同時に検出するようにし得る。本発明は、本明細書に記載の検出可能な
オリゴヌクレオチドプローブと併せてそのような蛍光の使用を包含する。
ハードウェア及び／又はソフトウェアの実行
本明細書に記載の方法は、多目的の又は特別にプログラムしたハードウェア若しくはソ
フトウェアで実行することができる。例えば、本方法は、コンピューター可読媒体によっ
て実行することができる。したがって、本発明は、本発明の任意の実施形態によるアルゴ
リズム及び／又は方法を実施するように構成されたソフトウェア及び／又はコンピュータ
ープログラム製品も提供する。本発明において提供するアルゴリズム及び／又は方法を実
施できるソフトウェアを構成する方法は、当業者に周知である。コンピューター可読媒体
は、非一時的及び／又は有形であり得る。例えば、コンピューター可読媒体は揮発性メモ
リー（例えば、ランダムアクセスメモリなど）又は非揮発性メモリー（例えば、読み出し
専用メモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、光ディスク、紙テー
プ（paper table）、パンチカードなど）であり得る。コンピューター実行可能な命令は
、好適なコンピューター言語又はいくつかの言語の組合せで記述され得る。基本的な計算
生物学の方法は、例えば、Ｓｅｔｕｂａｌ及びＭｅｉｄａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７）；Ｓ
ａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ、（Ｅｄ．）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８）；Ｒａｓｈｉｄｉ及びＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、
２０００）並びにＯｕｅｌｅｔｔｅ及びＢｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ
ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、２ｎｄ ｅｄ．、２０
０１）に記載されている。
の増強した結合親和性を有する１つ又は複数の修飾ヌクレオチド塩基を含む。修飾塩基の
例は、限定はされないが、２’フルオロアミダイト、及び２’ＯＭｅ ＲＮＡアミダイト
（ポリメラーゼ休止分子としても機能する）を含む。本発明の検出可能なオリゴヌクレオ
チドプローブは、異なる蛍光色素で合成することができ、事実上任意の標的配列とハイブ
リダイズするように設計され得る。それらの顕著な特異性のため、本発明の増幅できない
検出可能なポリヌクレオチドプローブは試料中の単一の標的核酸分子を検出するために使
用され、又はそれぞれが異なる標的核酸分子に結合する検出可能なオリゴヌクレオチドプ
ローブと組み合わせて使用される。したがって、本発明の増幅できない検出可能なポリヌ
クレオチドプローブは、同じ反応で１つ又は複数の標的核酸分子を検出するために使用し
、これらの標的を同時に検出するようにし得る。本発明は、本明細書に記載の検出可能な
オリゴヌクレオチドプローブと併せてそのような蛍光の使用を包含する。
ハードウェア及び／又はソフトウェアの実行
本明細書に記載の方法は、多目的の又は特別にプログラムしたハードウェア若しくはソ
フトウェアで実行することができる。例えば、本方法は、コンピューター可読媒体によっ
て実行することができる。したがって、本発明は、本発明の任意の実施形態によるアルゴ
リズム及び／又は方法を実施するように構成されたソフトウェア及び／又はコンピュータ
ープログラム製品も提供する。本発明において提供するアルゴリズム及び／又は方法を実
施できるソフトウェアを構成する方法は、当業者に周知である。コンピューター可読媒体
は、非一時的及び／又は有形であり得る。例えば、コンピューター可読媒体は揮発性メモ
リー（例えば、ランダムアクセスメモリなど）又は非揮発性メモリー（例えば、読み出し
専用メモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、光ディスク、紙テー
プ（paper table）、パンチカードなど）であり得る。コンピューター実行可能な命令は
、好適なコンピューター言語又はいくつかの言語の組合せで記述され得る。基本的な計算
生物学の方法は、例えば、Ｓｅｔｕｂａｌ及びＭｅｉｄａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７）；Ｓ
ａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ、（Ｅｄ．）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８）；Ｒａｓｈｉｄｉ及びＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、
２０００）並びにＯｕｅｌｅｔｔｅ及びＢｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ
ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、２ｎｄ ｅｄ．、２０
０１）に記載されている。
本発明は、プローブ設計、データの管理、分析、及び機器操作など、様々な目的のため
に様々なコンピュータープログラム製品及びソフトウェアも使用する。（米国特許第５，
５９３，８３９号、５，７９５，７１６号、５，７３３，７２９号、５，９７４，１６４
号、６，０６６，４５４号、６，０９０，５５５号、６，１８５，５６１号、６，１８８
，７８３号、６，２２３，１２７号、６，２２９，９１１号及び６，３０８，１７０号を
参照）さらに、本発明は、ＵＳ Ｓｅｒ Ｎｏｓ １０／１９７，６２１、１０／０６３
，５５９（ＵＳ Ｐｕｂ Ｎｏ ２００２０１８３９３６）、１０／０６５，８５６、１
０／０６５，８６８、１０／３２８，８１８、１０／３２８，８７２、１０／４２３，４
０３、及び６０／４８２，３８９に示すように、インターネットなどネットワーク上で遺
伝情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有し得る。
キット
本発明はＥＢＯＶ又は他のＲＮＡウイルス核酸分子の増幅のためのキットも提供する。
そのようなキットは、対象から得た生体試料のＥＢＯＶ又は他のＲＮＡ核酸の検出又は定
量に有用である。本発明のキットは、本明細書に記載のように、例えば、１つ又は複数の
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワード及びリバースプライマー、及び１つ又は複
数のニッキング酵素、並びに検出可能なプローブを含み得る。ＥＢＯＶ又は他のＲＮＡが
増幅される場合、１つ又は２つのニッキング酵素がキットに含まれ得る。複数の病原体配
列が増幅される場合、それらの標的配列のために設計された鋳型が同じニッキング酵素の
ためのニッキング酵素部位を含み、次いで１つ又は２つのニッキング酵素が含まれ得る。
鋳型が異なるニッキング酵素によって認識される場合、例えば３つ又はそれ以上など、よ
り多くのニッキング酵素がキットに含まれ得る。
に様々なコンピュータープログラム製品及びソフトウェアも使用する。（米国特許第５，
５９３，８３９号、５，７９５，７１６号、５，７３３，７２９号、５，９７４，１６４
号、６，０６６，４５４号、６，０９０，５５５号、６，１８５，５６１号、６，１８８
，７８３号、６，２２３，１２７号、６，２２９，９１１号及び６，３０８，１７０号を
参照）さらに、本発明は、ＵＳ Ｓｅｒ Ｎｏｓ １０／１９７，６２１、１０／０６３
，５５９（ＵＳ Ｐｕｂ Ｎｏ ２００２０１８３９３６）、１０／０６５，８５６、１
０／０６５，８６８、１０／３２８，８１８、１０／３２８，８７２、１０／４２３，４
０３、及び６０／４８２，３８９に示すように、インターネットなどネットワーク上で遺
伝情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有し得る。
キット
本発明はＥＢＯＶ又は他のＲＮＡウイルス核酸分子の増幅のためのキットも提供する。
そのようなキットは、対象から得た生体試料のＥＢＯＶ又は他のＲＮＡ核酸の検出又は定
量に有用である。本発明のキットは、本明細書に記載のように、例えば、１つ又は複数の
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワード及びリバースプライマー、及び１つ又は複
数のニッキング酵素、並びに検出可能なプローブを含み得る。ＥＢＯＶ又は他のＲＮＡが
増幅される場合、１つ又は２つのニッキング酵素がキットに含まれ得る。複数の病原体配
列が増幅される場合、それらの標的配列のために設計された鋳型が同じニッキング酵素の
ためのニッキング酵素部位を含み、次いで１つ又は２つのニッキング酵素が含まれ得る。
鋳型が異なるニッキング酵素によって認識される場合、例えば３つ又はそれ以上など、よ
り多くのニッキング酵素がキットに含まれ得る。
一態様では、本発明は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、一次プライマー、二次プラ
イマー、プライマー内のニッキング酵素結合部位に特異性を有するニッキング酵素、及び
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む核酸増幅のためのキットを提供する（
例えば、増幅に十分な成分を含有する緩衝溶液中）。様々な実施形態では、一次プライマ
ー及び二次プライマーは、それぞれ、標的配列に相補的又は実質的に相補的な３’末端特
異的認識領域配列を有し、末端特異的認識領域は１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド；
それ自身でダイマー化できる（例えば、自己相補的）３’末端特異的認識領域配列の上流
のニッキング酵素結合部位を含有する５’末端テール領域を含む。特定の実施形態では、
１つ又は複数のプライマーは、プライマー－ダイマー形状である（例えば、約Ｔｍに加熱
し、ゆっくりと冷却することにより産生される）。
イマー、プライマー内のニッキング酵素結合部位に特異性を有するニッキング酵素、及び
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む核酸増幅のためのキットを提供する（
例えば、増幅に十分な成分を含有する緩衝溶液中）。様々な実施形態では、一次プライマ
ー及び二次プライマーは、それぞれ、標的配列に相補的又は実質的に相補的な３’末端特
異的認識領域配列を有し、末端特異的認識領域は１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド；
それ自身でダイマー化できる（例えば、自己相補的）３’末端特異的認識領域配列の上流
のニッキング酵素結合部位を含有する５’末端テール領域を含む。特定の実施形態では、
１つ又は複数のプライマーは、プライマー－ダイマー形状である（例えば、約Ｔｍに加熱
し、ゆっくりと冷却することにより産生される）。
本発明のキットは、任意の数の別々の容器、パケット、チューブ（例えば、＜０．２ｍ
ｌ、０．２ｍｌ、０．６ｍｌ、１．５ｍｌ、５．０ｍｌ、＞５．０ｍｌ）、バイアル、マ
イクロタイタープレート（例えば、＜９６ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６
ウェル、＞１５３６ウェル）、ＡｒｒａｙＴａｐｅなど１つ又は複数の成分、又はそのよ
うな容器内で様々な組合せで合わせることができる成分も含み得る。様々な実施形態では
、キットは、参照配列を結合及び増幅することができるプライマー対をさらに含む。特定
の実施形態では、キットは、プライマーダイマー形状中に１つ又は複数のプライマーを含
む（例えば、約Ｔｍに加熱し、ゆっくりと冷却することにより産生される）。さらに他の
実施形態では、キットはプライマーを含有する無菌容器を含み；そのような容器は箱、ア
ンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、プラスチックの包み、又は当技術
分野で公知の他の好適な容器形態を含み得る。そのような容器はプラスチック、ガラス、
ラミネート紙、金属箔、又は核酸の保持に好適な他の材料から作製され得る。
ｌ、０．２ｍｌ、０．６ｍｌ、１．５ｍｌ、５．０ｍｌ、＞５．０ｍｌ）、バイアル、マ
イクロタイタープレート（例えば、＜９６ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６
ウェル、＞１５３６ウェル）、ＡｒｒａｙＴａｐｅなど１つ又は複数の成分、又はそのよ
うな容器内で様々な組合せで合わせることができる成分も含み得る。様々な実施形態では
、キットは、参照配列を結合及び増幅することができるプライマー対をさらに含む。特定
の実施形態では、キットは、プライマーダイマー形状中に１つ又は複数のプライマーを含
む（例えば、約Ｔｍに加熱し、ゆっくりと冷却することにより産生される）。さらに他の
実施形態では、キットはプライマーを含有する無菌容器を含み；そのような容器は箱、ア
ンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、プラスチックの包み、又は当技術
分野で公知の他の好適な容器形態を含み得る。そのような容器はプラスチック、ガラス、
ラミネート紙、金属箔、又は核酸の保持に好適な他の材料から作製され得る。
キットの成分は、例えば、１つ又は複数の容器に存在してもよく、例えば成分の全てが
１つの容器内にあってもよく、例えば酵素がプライマーとは別々の容器にあってもよい。
成分は、例えば乾燥（例えば、粉末）又は安定な緩衝液中（例えば。化学的に安定、熱安
定）であってもよい。乾燥成分は、例えば、凍結乾燥、真空及び遠心分離による乾燥、及
び／又は周囲環境下での乾燥によって調製され得る。様々な実施形態では、ポリメラーゼ
及びニッキング酵素は単一の容器内で凍結乾燥形態であり、プライマーは異なる容器内で
、凍結乾燥、フリーズドライ、又は緩衝液中のいずれかである。いくつかの実施形態では
、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、及びプライマーは単一の容器内で凍結乾燥形態である
。他の実施形態では、ポリメラーゼ及びニッキング酵素は異なる容器に分けられてもよい
。
１つの容器内にあってもよく、例えば酵素がプライマーとは別々の容器にあってもよい。
成分は、例えば乾燥（例えば、粉末）又は安定な緩衝液中（例えば。化学的に安定、熱安
定）であってもよい。乾燥成分は、例えば、凍結乾燥、真空及び遠心分離による乾燥、及
び／又は周囲環境下での乾燥によって調製され得る。様々な実施形態では、ポリメラーゼ
及びニッキング酵素は単一の容器内で凍結乾燥形態であり、プライマーは異なる容器内で
、凍結乾燥、フリーズドライ、又は緩衝液中のいずれかである。いくつかの実施形態では
、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、及びプライマーは単一の容器内で凍結乾燥形態である
。他の実施形態では、ポリメラーゼ及びニッキング酵素は異なる容器に分けられてもよい
。
キットは、例えば、反応に使用されるｄＮＴＰ、又は修飾ヌクレオチド、反応に使用さ
れるキュベット若しくは他の容器、又は再水和する凍結乾燥成分のための水若しくは緩衝
液のバイアルをさらに含み得る。使用する緩衝液は、例えば、ポリメラーゼとニッキング
酵素活性の両方に適切であり得る。
れるキュベット若しくは他の容器、又は再水和する凍結乾燥成分のための水若しくは緩衝
液のバイアルをさらに含み得る。使用する緩衝液は、例えば、ポリメラーゼとニッキング
酵素活性の両方に適切であり得る。
本発明のキットは、本明細書に記載の１つ又は複数の方法を実施するための使用説明書
及び／又は本明細書に記載の１つ若しくは複数の組成物又は試薬の指示書も含み得る。使
用説明書及び／又は指示書は印刷形態であってもよく、キットの中に含まれてもよい。キ
ットは、そのような使用説明書又は指示書を提供するインターネットに記載された指示書
も含み得る。
及び／又は本明細書に記載の１つ若しくは複数の組成物又は試薬の指示書も含み得る。使
用説明書及び／又は指示書は印刷形態であってもよく、キットの中に含まれてもよい。キ
ットは、そのような使用説明書又は指示書を提供するインターネットに記載された指示書
も含み得る。
本発明の実践は、特に指示しない限り、当業者の範囲内で周知の分子生物学（組換え技
術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いる。そのよ
うな技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ”、ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；“Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ、１９８４）；“Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ、１９９６）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏ
ｓ、１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、（Ｍｕｌｌｉｓ、１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ、１９９１）
など、文献で完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポ
リペプチドの産生に適用可能であり、そのように、本発明の作製及び実践において考えら
れ得る。特定の実施形態に特に有用な技術は、以下の節で記載する。
術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いる。そのよ
うな技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ”、ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；“Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ、１９８４）；“Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ、１９９６）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏ
ｓ、１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、（Ｍｕｌｌｉｓ、１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ、１９９１）
など、文献で完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポ
リペプチドの産生に適用可能であり、そのように、本発明の作製及び実践において考えら
れ得る。特定の実施形態に特に有用な技術は、以下の節で記載する。
以下の例は、当業者にアッセイ、スクリーニング、及び本発明の治療方法の作製及び使
用方法の完全な開示及び記載を提供するように記載され、本発明者らが彼らの発明と認識
する範囲を制限することを意図しない。
用方法の完全な開示及び記載を提供するように記載され、本発明者らが彼らの発明と認識
する範囲を制限することを意図しない。
実施例１．ＥＢＯＶのワンステップ及びツーステップリアルタイム逆転写－等温増幅アッ
セイ
ワンステップ反応は、単一の反応プロトコールで逆転写と増幅が起こる逆転写（ＲＴ）
反応を指す。ツーステップ反応は、第一に逆転写が起こり、続いて第二の増幅反応に移る
逆転写反応を指す。
セイ
ワンステップ反応は、単一の反応プロトコールで逆転写と増幅が起こる逆転写（ＲＴ）
反応を指す。ツーステップ反応は、第一に逆転写が起こり、続いて第二の増幅反応に移る
逆転写反応を指す。
アッセイ１及びアッセイ２は、ＥＢＯＶポリヌクレオチドを検出するそれらの能力を試
験した（図１）。これらのアッセイのためのプライマーは図２に示す。
験した（図１）。これらのアッセイのためのプライマーは図２に示す。
図３Ａ～３Ｘは、アッセイ１及びアッセイ２で得られた増幅結果を示す。アッセイは、
ヒトｃＤＮＡのバックグラウンドにおけるＥＢＯＶ ｇＢｌｏｃｋのコピーを検出するた
めに使用した。反応条件を特定した。
ヒトｃＤＮＡのバックグラウンドにおけるＥＢＯＶ ｇＢｌｏｃｋのコピーを検出するた
めに使用した。反応条件を特定した。
図４は、ワンステップアッセイでの全ヒトＲＮＡのバックグラウンドでのＥＢＯＶの検
出を示す。
出を示す。
図５は、ワンステップアッセイでの全ヒトＲＮＡのバックグラウンドでの合成ＥＢＯＶ
ＲＮＡの検出を示す。
ＲＮＡの検出を示す。
図６Ａ～６Ｃは、増幅及び検出機器に使用するための試料の処理を例示するフローチャ
ートを提供する。
ートを提供する。
図７Ａ及び７Ｂは、それぞれスワブ及び血液から試料を調製する方法を示す。
一実施例では、エボラウイルスは以下のプライマー及びプローブ配列：
を使用して検出した。
上記の配列では、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。ピリミジンは、ザイールを
含むエボラ株の縮重検出を提供する。
合成ＤＮＡ標的：
含むエボラ株の縮重検出を提供する。
合成ＤＮＡ標的：
合成ＲＮＡ標的：
１ステップ及び２ステップ反応の両方とも、最終濃度１６６．７ｎＭのフォワードプラ
イマー及び最終濃度８３３．３ｎＭのリバースプライマーと、２００ｎＭの濃度のプロー
ブ及び０．１×ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（最終濃度）を含有した。１及び２ステップ反応両方
に加えて、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４
Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵
素を含む、最終濃度１×抽出緩衝液２を含有した。これらの成分に加えて；１ステップ反
応は１０Ｕ／ｕｌのＭａｘｉｍａ逆転写酵素；１．０Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（ｌｉ
ｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＵＢＥＲａｓｅ ＩＮ）を含有した。合成ＲＮＡは
分解を防ぐために１．０Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤も同様に加えた。使用した全ての水
は購入した核酸フリーのものであった。
イマー及び最終濃度８３３．３ｎＭのリバースプライマーと、２００ｎＭの濃度のプロー
ブ及び０．１×ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（最終濃度）を含有した。１及び２ステップ反応両方
に加えて、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、ＮＨ４ ＋、Ｎａ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４
Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵
素を含む、最終濃度１×抽出緩衝液２を含有した。これらの成分に加えて；１ステップ反
応は１０Ｕ／ｕｌのＭａｘｉｍａ逆転写酵素；１．０Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（ｌｉ
ｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＵＢＥＲａｓｅ ＩＮ）を含有した。合成ＲＮＡは
分解を防ぐために１．０Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤も同様に加えた。使用した全ての水
は購入した核酸フリーのものであった。
反応物は氷上で混合し、Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０を実行するまで冷たく維持した。Ｒｏ
ｃｈｅ ＬＣ４８０は、ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９
０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）及びＳＹＢＲｇｒｅｅｎシグナル（Ａｂｓ４９５ｎｍ／Ｅｍ５
２０ｎｍ）を検出する２色検出下で実行した。１ステップ反応は５６℃で２０分間実施し
た。結果は図８に示す。
ｃｈｅ ＬＣ４８０は、ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９
０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）及びＳＹＢＲｇｒｅｅｎシグナル（Ａｂｓ４９５ｎｍ／Ｅｍ５
２０ｎｍ）を検出する２色検出下で実行した。１ステップ反応は５６℃で２０分間実施し
た。結果は図８に示す。
２ステップ反応は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（https://www.neb.com/
protocols/2012/10/03/first-strand-cdna-synthesis-kit-using-protoscript-ii-revers
e-transcriptase-m0368）に概説されている設定条件に従って、５６℃で５分間（ヒート
ブロック中）又は室温で５分間の逆転写酵素ステップで実施した（図９）。これらのＲＴ
温度は両方、１反応当たり１×１０５コピーの標的のシグナルを産生した。逆転写酵素ス
テップは、ＬＣ４８０上５６℃で１５分間の増幅ステップへと続いた。このアッセイの結
果は図１０に示す。１反応当たり示したコピー数は、製造業者の算出を使用して決定した
。
実施例２．複合のＲＮＡ混合物における標的ＲＮＡの検出
１ステップ及び２ステップ反応が、ＲＮＡ分子の複合混合物において標的ＲＮＡを検出
できるかどうか決定するため、アッセイは、全ヒトＲＮＡのＲＰＰＨ１（ＲＮａｓｅＰ
ＲＮＡ成分）の検出のために設計した。一実施例では、ＲＰＰＨ１は、以下のプライマー
及びプローブ配列：
protocols/2012/10/03/first-strand-cdna-synthesis-kit-using-protoscript-ii-revers
e-transcriptase-m0368）に概説されている設定条件に従って、５６℃で５分間（ヒート
ブロック中）又は室温で５分間の逆転写酵素ステップで実施した（図９）。これらのＲＴ
温度は両方、１反応当たり１×１０５コピーの標的のシグナルを産生した。逆転写酵素ス
テップは、ＬＣ４８０上５６℃で１５分間の増幅ステップへと続いた。このアッセイの結
果は図１０に示す。１反応当たり示したコピー数は、製造業者の算出を使用して決定した
。
実施例２．複合のＲＮＡ混合物における標的ＲＮＡの検出
１ステップ及び２ステップ反応が、ＲＮＡ分子の複合混合物において標的ＲＮＡを検出
できるかどうか決定するため、アッセイは、全ヒトＲＮＡのＲＰＰＨ１（ＲＮａｓｅＰ
ＲＮＡ成分）の検出のために設計した。一実施例では、ＲＰＰＨ１は、以下のプライマー
及びプローブ配列：
を使用して検出した。
２ステップ反応では、ヒトＲＮＡ（１０ｎｇ）は、ランダムヘキサマープライマーによ
ってｃＤＮＡに変換し、ＲＰＰＨ１は、標的特異的配列の増幅によって検出した（図１１
Ａ）。１ステップ反応では、特異的な逆転写プライマーを使用する標的特異的配列の増幅
によってヒトＲＮＡ（２０ｎｇ）を検出した（図１１Ｂ）。
実施例３．生体試料におけるエボラウイルスの検出。
ってｃＤＮＡに変換し、ＲＰＰＨ１は、標的特異的配列の増幅によって検出した（図１１
Ａ）。１ステップ反応では、特異的な逆転写プライマーを使用する標的特異的配列の増幅
によってヒトＲＮＡ（２０ｎｇ）を検出した（図１１Ｂ）。
実施例３．生体試料におけるエボラウイルスの検出。
別の実施例では、合成エボラウイルスＲＮＡ標的は、１ステップアッセイを使用する粗
血液調製物と混合した場合に検出された。粗血液調製物は、全血液（２０μｌ）と硫酸ド
デシルナトリウム（０．５％ ＳＤＳ；２０μｌ）を混合し、室温で混合物をインキュベ
ートする（３分間）ことによって調製した。インキュベーション後、ウシ血清アルブミン
（２％ ＢＳＡ；２０μｌ）を添加し、得られた混合物を室温でインキュベートした（１
分間）。粗血液調製物（１μｌ）は、合成エボラウイルスＲＮＡ標的（１０００コピー）
をスパイクした。反応は、ＲｏｃｈｅＬＣ４８０で５６℃で３回実行した。結果は図１２
に示す。
血液調製物と混合した場合に検出された。粗血液調製物は、全血液（２０μｌ）と硫酸ド
デシルナトリウム（０．５％ ＳＤＳ；２０μｌ）を混合し、室温で混合物をインキュベ
ートする（３分間）ことによって調製した。インキュベーション後、ウシ血清アルブミン
（２％ ＢＳＡ；２０μｌ）を添加し、得られた混合物を室温でインキュベートした（１
分間）。粗血液調製物（１μｌ）は、合成エボラウイルスＲＮＡ標的（１０００コピー）
をスパイクした。反応は、ＲｏｃｈｅＬＣ４８０で５６℃で３回実行した。結果は図１２
に示す。
さらなる実験では、１ステップアッセイは、ザイールエボラウイルスラメインガ株とス
ーダンエボラボニファス株ＲＮＡ分子を区別できた。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に、ザイールエ
ボラウイルスラメインガ株又はスーダンエボラボニファス株ウイルスを感染させ、ウイル
スＲＮＡを精製した。反応のセットは、精製ＲＮＡザイールエボラウイルスメインガ株（
６８３コピー）又はスーダンエボラウイルスボニファス株ウイルス（６５０コピー）を使
用して実行した。各セットに関して、４回の反応（１０μｌ）をＲｏｃｈｅＬＣ４８０で
実行した。アッセイによりザイールエボラウルメインガ株ＲＮＡを検出したが（図１３；
Ａで表す曲線のセット）、スーダンエボラウイルスボニファス株ＲＮＡは検出しなかった
（図１３；Ｂで表す曲線のセット）。したがって、ザイールエボラアッセイは、ザイール
エボラウイルスメインガ株の検出に特異的であった。
ーダンエボラボニファス株ＲＮＡ分子を区別できた。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に、ザイールエ
ボラウイルスラメインガ株又はスーダンエボラボニファス株ウイルスを感染させ、ウイル
スＲＮＡを精製した。反応のセットは、精製ＲＮＡザイールエボラウイルスメインガ株（
６８３コピー）又はスーダンエボラウイルスボニファス株ウイルス（６５０コピー）を使
用して実行した。各セットに関して、４回の反応（１０μｌ）をＲｏｃｈｅＬＣ４８０で
実行した。アッセイによりザイールエボラウルメインガ株ＲＮＡを検出したが（図１３；
Ａで表す曲線のセット）、スーダンエボラウイルスボニファス株ＲＮＡは検出しなかった
（図１３；Ｂで表す曲線のセット）。したがって、ザイールエボラアッセイは、ザイール
エボラウイルスメインガ株の検出に特異的であった。
機器の比較は、非標的対照（ＮＴＣ）試料を含む、約１０１～１０７コピーの標的ＲＮ
Ａからザイールエボラウイルスメインガ株ＲＮＡの様々な希釈を使用して実行した。試験
した機器は、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ、Ａｘｘｉｎ Ｄｅｔ
ｅｃｔｏｒ、及びＤｏｕｇｌａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｒｅ ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを含む。い
くつかの機器では変動が観察されたが、全ての機器が広範に渡ってＥＢＯＶ ＲＮＡのコ
ピーを検出できた（図１４）。
Ａからザイールエボラウイルスメインガ株ＲＮＡの様々な希釈を使用して実行した。試験
した機器は、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ、Ａｘｘｉｎ Ｄｅｔ
ｅｃｔｏｒ、及びＤｏｕｇｌａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｒｅ ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを含む。い
くつかの機器では変動が観察されたが、全ての機器が広範に渡ってＥＢＯＶ ＲＮＡのコ
ピーを検出できた（図１４）。
１ステップＥＢＯＶアッセイの検出の下限を決定するため、１００、５０、２５、及び
１２コピーのザイールエボラウイルスメインガ株ＲＮＡを含有する段階希釈した試料を試
験した。１ステップ反応（１０μｌ）は、各希釈に関して少なくとも１０個の技術的複製
物を使用して、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０で実行した。２０個（２０
）の技術的複製物を、１００及び５０コピーの反応に実行した。４０個（４０）の技術的
複製物を、２５コピーの反応に実行した。１反応当たり、１００及び５０コピーの検出に
関して、１００％（２０／２０）の検出率が観察された（図１５Ａ及び１５Ｂ）。１反応
当たり２５コピーの検出に関して、９５％（３８／４０）の検出率が観察された（図１５
Ｃ）。したがって、これらの結果は、１ステップアッセイとして実施した場合でさえも、
ＥＢＯＶアッセイの感受性及び特異性を示す。
実施例４：生体試料におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出。
１２コピーのザイールエボラウイルスメインガ株ＲＮＡを含有する段階希釈した試料を試
験した。１ステップ反応（１０μｌ）は、各希釈に関して少なくとも１０個の技術的複製
物を使用して、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０で実行した。２０個（２０
）の技術的複製物を、１００及び５０コピーの反応に実行した。４０個（４０）の技術的
複製物を、２５コピーの反応に実行した。１反応当たり、１００及び５０コピーの検出に
関して、１００％（２０／２０）の検出率が観察された（図１５Ａ及び１５Ｂ）。１反応
当たり２５コピーの検出に関して、９５％（３８／４０）の検出率が観察された（図１５
Ｃ）。したがって、これらの結果は、１ステップアッセイとして実施した場合でさえも、
ＥＢＯＶアッセイの感受性及び特異性を示す。
実施例４：生体試料におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出。
一実施例では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ギャップタンパク質配列を標的と
する１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。精製ＨＩＶ ＲＮＡ（
サブタイプＣ）が得られ（ＳｅｒａＣａｒｅ）、ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶ－１
ｖ２．０試験によって定量したように、ＨＩＶ ＲＮＡの公知の量を、１ステップＨＩ
Ｖ ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで試験した。以下のプライマー及びプローブ配列
：
する１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。精製ＨＩＶ ＲＮＡ（
サブタイプＣ）が得られ（ＳｅｒａＣａｒｅ）、ＣＯＢＡＳ ＴａｑＭａｎ ＨＩＶ－１
ｖ２．０試験によって定量したように、ＨＩＶ ＲＮＡの公知の量を、１ステップＨＩ
Ｖ ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで試験した。以下のプライマー及びプローブ配列
：
を使用した。
図１６Ａは使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。外側プライマーの
配列はＨＩＶサブタイプＣに特異的であった（使用した精製ＲＮＡ試料に関して）。１ス
テップＨＩＶＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワード及びリバースプライマー
の２つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニ
ッキング酵素認識部位である。
配列はＨＩＶサブタイプＣに特異的であった（使用した精製ＲＮＡ試料に関して）。１ス
テップＨＩＶＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワード及びリバースプライマー
の２つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニ
ッキング酵素認識部位である。
１ステップ反応は、約１：１０のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、
最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（Ｈｇａｇ．Ｆ２ａ＋Ｈｇａｇ．Ｆ２ｂの１：１
混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマー（Ｈｇａｇ．Ｒ１ａ＋Ｈｇａｇ．Ｒ１
ｂの１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プラ
イマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；グアニ
ジニウムチオシアネート（ＧＩＴＣ）；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ
；及び０．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩
衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈ
ｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（Ｈｇａｇ．Ｆ２ａ＋Ｈｇａｇ．Ｆ２ｂの１：１
混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマー（Ｈｇａｇ．Ｒ１ａ＋Ｈｇａｇ．Ｒ１
ｂの１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プラ
イマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；グアニ
ジニウムチオシアネート（ＧＩＴＣ）；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ
；及び０．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩
衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈ
ｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅ
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、ＨＩＶ Ｒ
ＮＡの１２５、２５０、５００、及び１０００コピーを使用して５６℃で２０分間実施し
た。全てのコピー数でのＨＩＶ ＲＮＡの特異的な検出は、１ステップＨＩＶ ＲＮＡｂ
ｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１６Ｂ）。
実施例５：生体試料におけるデングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）の検出
一実施例では、デングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）は、３’ＵＴＲ配列を標的とする
１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡ
の両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＤＥＮＶ－４ ＲＮＡｂｌｅ
（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以下のプラ
イマー及びプローブ配列：
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、ＨＩＶ Ｒ
ＮＡの１２５、２５０、５００、及び１０００コピーを使用して５６℃で２０分間実施し
た。全てのコピー数でのＨＩＶ ＲＮＡの特異的な検出は、１ステップＨＩＶ ＲＮＡｂ
ｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１６Ｂ）。
実施例５：生体試料におけるデングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）の検出
一実施例では、デングウイルス４型（ＤＥＮＶ－４）は、３’ＵＴＲ配列を標的とする
１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡ
の両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＤＥＮＶ－４ ＲＮＡｂｌｅ
（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以下のプラ
イマー及びプローブ配列：
を使用した。
図１７Ａは、使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。１ステップＤＥ
ＮＶ－４ ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、リバースプライマーの２つのセットで
設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識
部位である。
ＮＶ－４ ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、リバースプライマーの２つのセットで
設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識
部位である。
１ステップ反応は、約５：１のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、最
終濃度８３ｎＭのフォワードプライマー及び最終濃度１７ｎＭのリバースプライマー（Ｄ
ｅｎ４．Ｒ１ａ＋Ｄｅｎ４．Ｒ１ｂの１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプ
ローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉ
ｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３
Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含有し
た。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓ
ｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＸＬ（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５Ｕ
／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含有
した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
終濃度８３ｎＭのフォワードプライマー及び最終濃度１７ｎＭのリバースプライマー（Ｄ
ｅｎ４．Ｒ１ａ＋Ｄｅｎ４．Ｒ１ｂの１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプ
ローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉ
ｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３
Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含有し
た。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓ
ｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＸＬ（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５Ｕ
／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含有
した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅ
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、２０ｐｇの
全ＲＮＡを使用して５６℃で２０分間実施した。デング４ＲＮＡの特異的な検出は、１ス
テップＤＥＮＶ－４ ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１７Ｂ）。
実施例６：生体試料におけるＢ型インフルエンザの検出
一実施例において、Ｂ型インフルエンザは、インフルエンザセグメント７配列を標的と
する１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞Ｒ
ＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＢ型インフルエンザＲＮ
Ａｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以
下のプライマー及びプローブ配列：
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、２０ｐｇの
全ＲＮＡを使用して５６℃で２０分間実施した。デング４ＲＮＡの特異的な検出は、１ス
テップＤＥＮＶ－４ ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１７Ｂ）。
実施例６：生体試料におけるＢ型インフルエンザの検出
一実施例において、Ｂ型インフルエンザは、インフルエンザセグメント７配列を標的と
する１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞Ｒ
ＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＢ型インフルエンザＲＮ
Ａｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以
下のプライマー及びプローブ配列：
を使用した。
図１８Ａは使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。１ステップＢ型イ
ンフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワード及びリバースプライマー
並びに２つの外側プライマーの３つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記
の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。
ンフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワード及びリバースプライマー
並びに２つの外側プライマーの３つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記
の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。
１ステップ反応は、約１：１０のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、
最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（ＦｌｕＢ．Ｆ２ａ＋ＦｌｕＢ．Ｆ２ｂ＋Ｆｌｕ
Ｂ．Ｆ２ｃの１：１：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマー（ＦｌｕＢ．
Ｒ３ａ＋ＦｌｕＢ．Ｒ３ｂ＋ＦｌｕＢ．Ｒ３ｃの１：１：１混合）を含有した。最終濃度
２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ
反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラー
ゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン
緩衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（ＦｌｕＢ．Ｆ２ａ＋ＦｌｕＢ．Ｆ２ｂ＋Ｆｌｕ
Ｂ．Ｆ２ｃの１：１：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマー（ＦｌｕＢ．
Ｒ３ａ＋ＦｌｕＢ．Ｒ３ｂ＋ＦｌｕＢ．Ｒ３ｃの１：１：１混合）を含有した。最終濃度
２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ
反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラー
ゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン
緩衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ ＸＬ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅ
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、異なる単離
体からの全ＲＮＡを使用して５６℃で２０分間実施した。全ての単離体におけるＢ型イン
フルエンザの特異的な検出は、１ステップＢ型インフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）
アッセイで実証した（図１８Ｂ）。
実施例７：生体試料におけるウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）の検
出。
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、異なる単離
体からの全ＲＮＡを使用して５６℃で２０分間実施した。全ての単離体におけるＢ型イン
フルエンザの特異的な検出は、１ステップＢ型インフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）
アッセイで実証した（図１８Ｂ）。
実施例７：生体試料におけるウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）の検
出。
一実施例において、ウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）は、インフ
ルエンザセグメント７配列を標的とする１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで
検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、
１ステップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コ
ピー数は未知であった。以下のプライマー及びプローブ配列：
ルエンザセグメント７配列を標的とする１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで
検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、
１ステップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コ
ピー数は未知であった。以下のプライマー及びプローブ配列：
を使用した。
図１９Ａは使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。１ステップＢＶＤ
Ｖ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワードプライマーの２つのセットで設計
し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位
である。
Ｖ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワードプライマーの２つのセットで設計
し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位
である。
１ステップ反応は、約１：１０のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、
最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（ＢＶＤＶ１．Ｆ１ａ＋ＢＶＤＶ１．Ｆ１ｂの１
：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマーを含有した。最終濃度２００ｎＭ
のプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔ
ｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ；及び０
．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含
有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ Ｒｅｖｅ
ｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＸＬ（
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．
５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を
含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（ＢＶＤＶ１．Ｆ１ａ＋ＢＶＤＶ１．Ｆ１ｂの１
：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマーを含有した。最終濃度２００ｎＭ
のプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔ
ｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ ＢＳＴポリメラーゼ；及び０
．３Ｕ／ｕｌ Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含
有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ Ｒｅｖｅ
ｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＸＬ（
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．
５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を
含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅ
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、ＢＶＤＶ１
ウイルス培養物（混合したウシ宿主細胞ＲＮＡ及びウイルス）及び細胞培養粗溶解物（未
希釈及び１：１００希釈）からの精製ＲＮＡ（２０ｐｇ／技術的複製物）を使用して５６
℃で２０分間実施した。全ての試料におけるＢＶＤＶ１ウイルスの特異的な検出は、１ス
テップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１９Ｂ）。
実施例８：エボラ株の分子ビーコン認識
例示的なビーコンＢＬＡＳＴアライメント出力及び株リスト
ｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、ＢＶＤＶ１
ウイルス培養物（混合したウシ宿主細胞ＲＮＡ及びウイルス）及び細胞培養粗溶解物（未
希釈及び１：１００希釈）からの精製ＲＮＡ（２０ｐｇ／技術的複製物）を使用して５６
℃で２０分間実施した。全ての試料におけるＢＶＤＶ１ウイルスの特異的な検出は、１ス
テップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１９Ｂ）。
実施例８：エボラ株の分子ビーコン認識
例示的なビーコンＢＬＡＳＴアライメント出力及び株リスト
ビーコン単独株リスト：
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍ
ｂｕｋｕ－Ｅｃｒａｎ、全ゲノム
２９．４ ８９．２ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ６５５２４６．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０５、全ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＪ６６０３４８．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０７、全ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＪ６６０３４７．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｋｉｓ
ｓｉｄｏｕｇｏｕ－Ｃ１５、全ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＪ６６０３４６．２
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５７、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５０、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４８、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４６、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４０、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３８、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３４、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２９、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２７、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１０１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２６、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１００．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２５.２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２５．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１９、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１８、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１７、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１６、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０９０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１４、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０８９．１
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０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１０．２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０６６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３５．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３４．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７２９、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．４、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２０、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１９、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１５、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０４０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０３９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０３８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１０、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０３７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１０６、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０３６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１０４、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３０３５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８７．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８６．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３１５６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８３．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８２．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８０．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７９．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７０．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９８、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９６、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５０．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／Ｍａｎ
ｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５Ｂ、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５４９．１
変異ザイールエボラウイルス、全ゲノム
２９．４ ８９．２ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＦ８２７４２７．１。
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍ
ｂｕｋｕ－Ｅｃｒａｎ、全ゲノム
２９．４ ８９．２ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ６５５２４６．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０５、全ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＪ６６０３４８．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０７、全ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＪ６６０３４７．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｋｉｓ
ｓｉｄｏｕｇｏｕ－Ｃ１５、全ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＪ６６０３４６．２
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．３、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５７、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ２３３１１５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．３、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３１５６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８３．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８０．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．２、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７０．１、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９８、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９６、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５５０．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／Ｍａｎ
ｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５Ｂ、部分ゲノム
２９．４ １０４ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＭ０３４５４９．１
変異ザイールエボラウイルス、全ゲノム
２９．４ ８９．２ １００％ ０．０１７ ９４％ ＫＦ８２７４２７．１。
エボラ株間のアンプリコン類似性分析
例示的なＢＬＡＳＴアライメント出力及び株リスト
例示的なＢＬＡＳＴアライメント出力及び株リスト
株リスト：
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍ
ｂｕｋｕ－Ｅｃｒａｎ、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ６５５２４６．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０５、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＪ６６０３４８．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０７、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＪ６６０３４７．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｋｉｓ
ｓｉｄｏｕｇｏｕ－Ｃ１５、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＪ６６０３４６．２
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１００．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２５．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１０．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０５．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８００、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７９９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７９８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７９５、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８９．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７７１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７７０．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７７０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６９．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６９．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６９．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３５．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３４．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７２９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７２４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７０７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１５、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１０６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１０４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８７．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８６．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８３．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８２．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７９．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５０．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／Ｍａｎ
ｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５Ｂ、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５４９．１
変異体ザイールエボラウイルス、全配列
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％。
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍ
ｂｕｋｕ－Ｅｃｒａｎ、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ６５５２４６．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０５、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＪ６６０３４８．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅ
ｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０７、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＪ６６０３４７．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｋｉｓ
ｓｉｄｏｕｇｏｕ－Ｃ１５、全ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＪ６６０３４６．２
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＮＭ０４２．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５６．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８５０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１１０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８４０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８３１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１０１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３１００．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２５．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８２１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０９０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１０．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８１０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８０５．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３８００、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７９９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０８０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７９８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７９５、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８９．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７８２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７７１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７７０．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０７０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７７０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６９．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６９．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６９．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７６４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７５０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３５．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３５．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７３４．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７２９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７２４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７１３．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０５０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３７０７、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２４．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１２０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１９、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１５、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１３、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０４０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１１０、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１０６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ１０４、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ２３３０３５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８７．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８６．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８３．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８２．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６８０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７９．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７７．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．２、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７６．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－Ｇ３６７０．１、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９８、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９６、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２
０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５５０．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／Ｍａｎ
ｏＲｉｖｅｒ－ＥＭ０９５Ｂ、部分ゲノム
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％ ＫＭ０３４５４９．１
変異体ザイールエボラウイルス、全配列
１０２ １０２ １００％ １ｅ－２３ １００％。
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法。
［２］
試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないことがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
［３］
ポリヌクレオチド分子が、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、又はアレナウイルスのポリヌクレオチドである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のエボラポリヌクレオチドをプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
［５］
試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、試料中に存在するポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤及びポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、抽出した及び安定化したエボラＲＮＡをプライマーと接触させ、それによりエボラｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラアンプリコンの存在が試料中のエボラポリヌクレオチド分子を検出し、アンプリコンを検出できないことが試料中のエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
［６］
ポリヌクレオチド分子が、試料を、試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができる薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤の１つ又は複数と接触させるステップによって得られる、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
アッセイの開始の７分後、１０分後、及び／又は１５分後に標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能なシグナルが存在しない、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
ステップ（ａ）で使用したプライマーが、ステップ（ｂ）で使用したプライマーと同じ配列又は異なる配列を有する、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
ステップ（ａ）～（ｃ）が単一の反応で実施される、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが同じ又は異なる酵素である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
ステップ（ａ）のｃＤＮＡが第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移される、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
試料が体液である、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
体液が、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］
体腔が腹膜腔又は囲心腔である、［１３］に記載の方法。
［１５］
検出の限界が１反応当たり１０又は２０コピーである、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間で実施される、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
ステップ（ａ）～（ｄ）が生体試料において実施される、［１］～［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
エボラＲＮＡが生体試料から精製も単離もされていない、［３］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
ポイントオブケア又は診断において携帯電池式装置で実施される、［１］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
別々の逆転写酵素プライマーは必要ではないが、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーが使用される、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
試料が生体試料又は環境試料である、［１］～［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
生体試料が、対象、コウモリ、ブッシュミート、又は家畜から得られる、［２１］に記載の方法。
［２３］
生体試料が、頬、鼻、目、直腸、及び膣からなる群から選択される粘膜のスワブ、又は皮膚である、［２１］に記載の方法。
［２４］
生体試料が、対象、剖検、又は培養培地から得られる組織試料である、［２１］に記載の方法。
［２５］
剖検が、ヒト、霊長動物、コウモリ、又は他の哺乳動物のものである、［２４］に記載の方法。
［２６］
環境試料が、エボラウイルス感染を有するか、又は発症する傾向を有する、対象の生体液により汚染され得る材料である、［２１］に記載の方法。
［２７］
環境試料が、ベッド、シートクッション、ラグ、空調フィルター、又は他の材料である、［２６］に記載の方法。
［２８］
ポリメラーゼが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｃａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇａｎ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｂｏ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び／又はそれらの断片の５’－エキソ － 誘導体である、［１］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
ニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．ＢｓｔＳＥＩの１つ又は複数である、［１］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、及び／又はそれらの変異体／誘導体である、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
検出可能なプローブが分子ビーコンを含む、［１］～［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］
ＥＢＯＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］
ＥＢＯＶの増幅が、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３２］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［３３］に記載の方法。
［３５］
プローブが、
5‘-CALRed 610nm - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である、［３４］に記載の方法。
［３６］
３’クエンチャーがＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる、［３５］に記載の方法。
［３７］
ＨＩＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３８］
ＨＩＶの増幅が、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］
デングウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］
デングウイルスの増幅が、以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［３９］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］
Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［４２］
Ｂ型インフルエンザウイルスの増幅が、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［４１］のいずれか一項に記載の方法。
［４３］
ＢＶＤＶ１の検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［４４］
ＢＶＤＶ１の増幅が、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［４３］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［１］～［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ ６１０ｍｍ であり、クエンチャーがＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである、［４５］に記載の方法。
［４７］
蛍光色素がＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーがＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである、［４５］に記載の方法。
［４８］
フォワードプライマー又はリバースプライマーが、３’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを含む、［１］～［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［４９］
１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－ヒドロキシル、２’－アルキル、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ ２ －Ｏ－２’－ブリッジ、４’－（ＣＨ ２ ） ２ －Ｏ－２’－ブリッジ、２’－ＬＮＡ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）の１つ又は複数である、［４８］に記載の方法。
［５０］
ＲＮＡウイルス配列に特異的に結合するプライマー、ＲＮＡウイルスアンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含む、ＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を検出するためのキット。
［５１］
プライマーが、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含む、ＥＢＯＶの検出のための、［５０］に記載のキット。
［５２］
プローブが、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含む、［５０］に記載のキット。
［５３］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［５２］に記載のキット。
［５４］
プローブが、
5’-CALRed 610nm - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である、［５３］に記載のキット。
［５５］
３’クエンチャーがＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる、［５４］に記載のキット。
［５６］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含む、ＨＩＶの検出のための、［５０］に記載のキット。
［５７］
プローブが、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを含む、［５０］に記載のキット。
［５８］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含む、デングウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［５９］
プローブが以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを含む、デングウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［６０］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［６１］
プローブが、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［６２］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含む、ＢＶＤＶ１の検出のための、［５０］に記載のキット。
［６３］
プローブが、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを含む、ＢＶＤＶ１の検出のための、［５０］に記載のキット。
［６４］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［５０］、［５７］、［５９］、［６１］、及び［６３］のいずれか一項に記載のキット。
［６５］
蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ ６１０ｍｍ であり、クエンチャーがＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである、［６４］に記載のキット。
［６６］
蛍光色素がＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーがＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである、［６５］に記載のキット。
［６７］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU];
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにエボラポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてエボラポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［６８］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＨＩＶポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＨＩＶポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［６９］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにデングウイルスポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてデングウイルスポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［７０］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT;
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＢ型インフルエンザウイルスポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＢ型インフルエンザウイルスポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［７１］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＢＶＤＶ１ポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＢＶＤＶ１ポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［７２］
ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥溶解試薬又はＲＮＡ安定化試薬を含み得るか又は含み得ないキャピラリーチューブをさらに含む、［５０］～［７１］のいずれか一項に記載のキット。
［７３］
逆転写酵素及び／又は増幅反応を実施するのに好適な緩衝液を含む１つ又は複数の器をさらに含む、［５０］～［７２］のいずれか一項に記載のキット。
［７４］
逆転写酵素、ニッキング酵素、及び凍結乾燥形態の鎖置換ポリメラーゼを含む器をさらに含む、［５０］～［７３］のいずれか一項に記載のキット。
［７５］
ＲＮＡウイルスを有するヒト又は動物の対象を診断する方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、方法。
［７６］
ＲＮＡウイルスが、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである、［７５］に記載の方法。
［７７］
ウイルスを抽出することができる薬剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１つ又は組合せである、［７５］又は［７６］に記載の方法。
［７８］
医療従事者の毎日のスクリーニングに使用される、［７５］～［７７］のいずれか一項に記載の方法。
［７９］
試料がプールされ、ヒト又は動物の集団においてスクリーニングが実施される、［７７］～［７８］のいずれか一項に記載の方法。
他の実施形態
先の記述により、変異及び修飾が本明細書に記載の本発明になされ、様々な利用及び条件に採用し得ることが明らかである。そのような実施形態は以下の特許請求の範囲内でもある。
［１］
逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法。
［２］
試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないことがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
［３］
ポリヌクレオチド分子が、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、又はアレナウイルスのポリヌクレオチドである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のエボラポリヌクレオチドをプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
［５］
試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、試料中に存在するポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤及びポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、抽出した及び安定化したエボラＲＮＡをプライマーと接触させ、それによりエボラｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラアンプリコンの存在が試料中のエボラポリヌクレオチド分子を検出し、アンプリコンを検出できないことが試料中のエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
［６］
ポリヌクレオチド分子が、試料を、試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができる薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤の１つ又は複数と接触させるステップによって得られる、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
アッセイの開始の７分後、１０分後、及び／又は１５分後に標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能なシグナルが存在しない、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
ステップ（ａ）で使用したプライマーが、ステップ（ｂ）で使用したプライマーと同じ配列又は異なる配列を有する、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
ステップ（ａ）～（ｃ）が単一の反応で実施される、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが同じ又は異なる酵素である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
ステップ（ａ）のｃＤＮＡが第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移される、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
試料が体液である、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
体液が、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］
体腔が腹膜腔又は囲心腔である、［１３］に記載の方法。
［１５］
検出の限界が１反応当たり１０又は２０コピーである、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間で実施される、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
ステップ（ａ）～（ｄ）が生体試料において実施される、［１］～［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
エボラＲＮＡが生体試料から精製も単離もされていない、［３］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
ポイントオブケア又は診断において携帯電池式装置で実施される、［１］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
別々の逆転写酵素プライマーは必要ではないが、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーが使用される、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
試料が生体試料又は環境試料である、［１］～［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
生体試料が、対象、コウモリ、ブッシュミート、又は家畜から得られる、［２１］に記載の方法。
［２３］
生体試料が、頬、鼻、目、直腸、及び膣からなる群から選択される粘膜のスワブ、又は皮膚である、［２１］に記載の方法。
［２４］
生体試料が、対象、剖検、又は培養培地から得られる組織試料である、［２１］に記載の方法。
［２５］
剖検が、ヒト、霊長動物、コウモリ、又は他の哺乳動物のものである、［２４］に記載の方法。
［２６］
環境試料が、エボラウイルス感染を有するか、又は発症する傾向を有する、対象の生体液により汚染され得る材料である、［２１］に記載の方法。
［２７］
環境試料が、ベッド、シートクッション、ラグ、空調フィルター、又は他の材料である、［２６］に記載の方法。
［２８］
ポリメラーゼが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｃａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇａｎ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｂｏ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び／又はそれらの断片の５’－エキソ － 誘導体である、［１］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
ニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．ＢｓｔＳＥＩの１つ又は複数である、［１］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、ＲＳＶ ＲＴ、及び／又はそれらの変異体／誘導体である、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
検出可能なプローブが分子ビーコンを含む、［１］～［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］
ＥＢＯＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］
ＥＢＯＶの増幅が、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３２］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［３３］に記載の方法。
［３５］
プローブが、
5‘-CALRed 610nm - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である、［３４］に記載の方法。
［３６］
３’クエンチャーがＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる、［３５］に記載の方法。
［３７］
ＨＩＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３８］
ＨＩＶの増幅が、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］
デングウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］
デングウイルスの増幅が、以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［３９］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］
Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［４２］
Ｂ型インフルエンザウイルスの増幅が、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［４１］のいずれか一項に記載の方法。
［４３］
ＢＶＤＶ１の検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含む、［３］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［４４］
ＢＶＤＶ１の増幅が、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される、［３］～［３１］、及び［４３］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［１］～［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ ６１０ｍｍ であり、クエンチャーがＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである、［４５］に記載の方法。
［４７］
蛍光色素がＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーがＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである、［４５］に記載の方法。
［４８］
フォワードプライマー又はリバースプライマーが、３’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを含む、［１］～［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［４９］
１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－ヒドロキシル、２’－アルキル、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ ２ －Ｏ－２’－ブリッジ、４’－（ＣＨ ２ ） ２ －Ｏ－２’－ブリッジ、２’－ＬＮＡ、及び２’－Ｏ－（Ｎ－メチルカルバメート）の１つ又は複数である、［４８］に記載の方法。
［５０］
ＲＮＡウイルス配列に特異的に結合するプライマー、ＲＮＡウイルスアンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含む、ＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を検出するためのキット。
［５１］
プライマーが、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含む、ＥＢＯＶの検出のための、［５０］に記載のキット。
［５２］
プローブが、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含む、［５０］に記載のキット。
［５３］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［５２］に記載のキット。
［５４］
プローブが、
5’-CALRed 610nm - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である、［５３］に記載のキット。
［５５］
３’クエンチャーがＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる、［５４］に記載のキット。
［５６］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含む、ＨＩＶの検出のための、［５０］に記載のキット。
［５７］
プローブが、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを含む、［５０］に記載のキット。
［５８］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含む、デングウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［５９］
プローブが以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを含む、デングウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［６０］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［６１］
プローブが、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のための、［５０］に記載のキット。
［６２］
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含む、ＢＶＤＶ１の検出のための、［５０］に記載のキット。
［６３］
プローブが、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを含む、ＢＶＤＶ１の検出のための、［５０］に記載のキット。
［６４］
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、［５０］、［５７］、［５９］、［６１］、及び［６３］のいずれか一項に記載のキット。
［６５］
蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ ６１０ｍｍ であり、クエンチャーがＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである、［６４］に記載のキット。
［６６］
蛍光色素がＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーがＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである、［６５］に記載のキット。
［６７］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU];
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにエボラポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてエボラポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［６８］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＨＩＶポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＨＩＶポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［６９］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにデングウイルスポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてデングウイルスポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［７０］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT;
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＢ型インフルエンザウイルスポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＢ型インフルエンザウイルスポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［７１］
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＢＶＤＶ１ポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＢＶＤＶ１ポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
［７２］
ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥溶解試薬又はＲＮＡ安定化試薬を含み得るか又は含み得ないキャピラリーチューブをさらに含む、［５０］～［７１］のいずれか一項に記載のキット。
［７３］
逆転写酵素及び／又は増幅反応を実施するのに好適な緩衝液を含む１つ又は複数の器をさらに含む、［５０］～［７２］のいずれか一項に記載のキット。
［７４］
逆転写酵素、ニッキング酵素、及び凍結乾燥形態の鎖置換ポリメラーゼを含む器をさらに含む、［５０］～［７３］のいずれか一項に記載のキット。
［７５］
ＲＮＡウイルスを有するヒト又は動物の対象を診断する方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、方法。
［７６］
ＲＮＡウイルスが、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである、［７５］に記載の方法。
［７７］
ウイルスを抽出することができる薬剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１つ又は組合せである、［７５］又は［７６］に記載の方法。
［７８］
医療従事者の毎日のスクリーニングに使用される、［７５］～［７７］のいずれか一項に記載の方法。
［７９］
試料がプールされ、ヒト又は動物の集団においてスクリーニングが実施される、［７７］～［７８］のいずれか一項に記載の方法。
他の実施形態
先の記述により、変異及び修飾が本明細書に記載の本発明になされ、様々な利用及び条件に採用し得ることが明らかである。そのような実施形態は以下の特許請求の範囲内でもある。
本明細書の変数の任意の定義における要素の列挙の引用は、その変数が任意の単一の要
素又は列挙した要素の組合せ（又は部分的組合せ）である定義を含む。本明細書の実施形
態の引用は、実施形態が任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態若しくはその部分
との組合せであることを含む。
素又は列挙した要素の組合せ（又は部分的組合せ）である定義を含む。本明細書の実施形
態の引用は、実施形態が任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態若しくはその部分
との組合せであることを含む。
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年４月９日に出願
した米国仮特許出願第６１／６２１，９７５号の利益を主張する、２０１３年４月９日に
出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３５７５０号に関し得る。
した米国仮特許出願第６１／６２１，９７５号の利益を主張する、２０１３年４月９日に
出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３５７５０号に関し得る。
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年８月１３日に出
願した米国仮特許出願第６１／３７３，６９５号の利益を主張する、２０１１年８月９日
に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４７０４９に関し得る。
願した米国仮特許出願第６１／３７３，６９５号の利益を主張する、２０１１年８月９日
に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４７０４９に関し得る。
本明細書に述べた全ての特許及び刊行物は、それぞれの特許及び刊行物が特異的に及び
個々に参照に組み込まれると示されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれ
る。
個々に参照に組み込まれると示されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれ
る。
Claims (18)
- 逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標的ポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、
（ｉ）フォワードプライマー及びリバースプライマー；
（ｉｉ）ｄＮＴＰ；
（ｉｉｉ）検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ；及び
（ｉｖ）鎖置換ポリメラーゼ
と接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を含み、ニッキング酵素の存在下で前記ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合し、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーが、３’末端領域の末端に１つ又は複数の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、前記逆転写酵素プライマーは前記フォワードプライマー又はリバースプライマーと同じプライマーである、ステップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含み、
前記逆転写酵素は前記鎖置換ポリメラーゼではない、方法。 - 試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、
（ｉ）フォワードプライマー及びリバースプライマー；
（ｉｉ）ｄＮＴＰ；
（ｉｉｉ）検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ；及び
（ｉｖ）鎖置換ポリメラーゼ
と接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内の少なくとも１つのニッキング酵素認識配列と、ニッキング酵素の存在下で前記ｃＤＮＡに特異的に結合する３’末端領域とを含み、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーが、３’末端領域に１つ又は複数の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、前記逆転写酵素プライマーは前記フォワードプライマー又はリバースプライマーと同じプライマーである、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないことがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含み、
前記逆転写酵素は前記鎖置換ポリメラーゼではない、方法。 - ポリヌクレオチド分子が、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、フラビウイルス、又はアレナウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
- ポリヌクレオチド分子が、試料を、試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができる薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤の１つ又は複数と接触させるステップによって得られ、及び／又は
アッセイの開始の７分後、１０分後、及び／又は１５分後に、標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能なシグナルが存在せず、及び／又は
ステップ（ａ）～（ｃ）が単一の反応で実施され、及び／又は
ステップ（ａ）のｃＤＮＡが第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移され、及び／又は
試料が体液、生体試料、又は環境試料である、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記シグナルの検出限界下限が１反応当たり１０又は２０コピーの標的ポリヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ（ａ）～（ｃ）は、約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間以内で実施される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｃａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇａｎ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｂｏ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び／又はＧｓｐ５２ ＤＮＡポリメラーゼＩの５’－エキソ－誘導体であり、及び／又は
前記ニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．ＢｓｔＳＥＩの１つ又は複数である、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記検出可能なプローブが分子ビーコンを含み、及び／又は
前記検出可能なプローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを含む、
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 - 前記クエンチャーがＢＨＱ１、ＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌであり、及び／又は前記蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ６１０ｍｍ、ＦＡＭ又はＦＩＴＣである、請求項８に記載の方法。
- （１）ポリヌクレオチド分子がＥＢＯＶであって、
（１－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCAmCAGTTATCmUmAmCmCmG（配列番号１）であり
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCGAAATGCmAACGAmCmAmCmCmU（配列番号２）であり、
及び／又は
（１－２）前記プローブが以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc（配列番号３）を含むか、又は
（２）ポリヌクレオチド分子がＨＩＶであって、
（２－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG（配列番号６）及び
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG（配列番号７）からなる群から選択され、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC（配列番号８）及び
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC（配列番号９）からなる群から選択され、及び／又は
（２－２）前記プローブが以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg（配列番号１０）を含むか、又は
（３）ポリヌクレオチド分子がデングウイルスであって、
（３－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC（配列番号１１）であり
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG（配列番号１２）及び
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG（配列番号１３）からなる群から選択され、
及び／又は
（３－２）前記プローブが以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg（配列番号１４）を含むか、又は
（４）ポリヌクレオチド分子がＢ型インフルエンザウイルスであって、
（４－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA（配列番号１５）、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA（配列番号１６）、及び
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA（配列番号１７）からなる群から選択され、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT（配列番号１８）、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT（配列番号１９）、及び
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT（配列番号２０）からなる群から選択され、
及び／又は
（４－２）前記プローブが以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc（配列番号２１）を含むか、又は
（５）ポリヌクレオチド分子がウシウイルス性下痢ウイルスであって、
（５－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA（配列番号２２）及び
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA（配列番号２３）からなる群から選択され、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC（配列番号２４）
であり、及び／又は
（５－２）前記プローブが以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcg（配列番号２５）を含む、
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。 - ポリヌクレオチド分子がＥＢＯＶであって、前記プローブが以下の群から選択される配列をふくむ：
5’-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ2- 3’及び
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記逆転写酵素が、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴ、及び／又はＲＳＶ ＲＴの野生型又は逆転写酵素活性を保持するその変異体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、前記検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、前記逆転写酵素、前記逆転写酵素プライマー、前記ニッキング酵素、及び前記鎖置換ポリメラーゼを含む、請求項２に記載の方法によってＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を検出するためのキット。
- （１）ＲＮＡウイルスポリヌクレオチドがＥＢＯＶであって、
（１－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCAmCAGTTATCmUmAmCmCmG（配列番号１）であり
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCGAAATGCmAACGAmCmAmCmCmU （配列番号２）であり、
及び／又は
（１－２）前記プローブが、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc（配列番号３）を含むか、又は
（２）ＲＮＡウイルスポリヌクレオチドがＨＩＶであって、
（２－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG（配列番号６）及び
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG（配列番号７）からなる群から選択され、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC（配列番号８）及び
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC（配列番号９）からなる群から選択され、
及び／又は
（２－２）前記プローブが、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg（配列番号１０）を含むか、又は
（３）ＲＮＡウイルスポリヌクレオチドがデングウイルスであって、
（３－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC（配列番号１１）であり、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG（配列番号１２）及び
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG（配列番号１３）からなる群から選択され、
及び／又は
（３－２）前記プローブが以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg（配列番号１４）を含むか、又は
（４）ＲＮＡウイルスポリヌクレオチドがＢ型インフルエンザウイルスであって、
（４－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA（配列番号１５）、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA（配列番号１６）、及び
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA（配列番号１７）からなる群から選択され、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT（配列番号１８）、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT（配列番号１９）、及び
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT（配列番号２０）からなる群から選択され、
及び／又は
（４－２）前記プローブが、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc（配列番号２１）を含むか、又は
（５）ＲＮＡウイルスポリヌクレオチドがウシウイルス性下痢ウイルスであって、
（５－１）フォワードプライマーが
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA（配列番号２２）及び
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA（配列番号２３）からなる群から選択され、
リバースプライマーが
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC（配列番号２４）であり、
及び／又は
（５－２）前記プローブが、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcg（配列番号２５）を含む、
請求項１３に記載のキット。 - （ａ）ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥溶解試薬又はＲＮＡ安定化試薬を含む又は含まないキャピラリーチューブ；
（ｂ）逆転写酵素反応及び／又は増幅反応を実施するのに好適な緩衝液を含む１つ又は複数の器；及び／又は
（ｃ）逆転写酵素、ニッキング酵素、及び凍結乾燥形態の鎖置換ポリメラーゼを含む器
のうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１３又は１４に記載のキット。 - ＲＮＡウイルス感染について試験する方法であって、
（ａ）ヒトまたは動物の対象に由来する試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤及び抽出したＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子のｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、
（ｉ）フォワードプライマー及びリバースプライマー；
（ｉｉ）ｄＮＴＰ；
（ｉｉｉ）検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ；及び
（ｉｖ）鎖置換ポリメラーゼと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内の少なくとも１つのニッキング酵素認識配列と、ニッキング酵素の存在下でｃＤＮＡに特異的に結合する３’末端領域とを含み、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーが、３’末端領域に１つ又は複数の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、前記逆転写酵素プライマーは前記フォワードプライマー又はリバースプライマーと同じプライマーである、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在が対象のＲＮＡウイルス感染を示し、前記アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡウイルス感染の非存在を示す、ステップ
を含み、
前記逆転写酵素は前記鎖置換ポリメラーゼではない、方法。 - ＲＮＡウイルスが、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１６に記載の方法。
- 前記ＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１つ又は組合せである、請求項１６又は１７に記載の方法。
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