JPH06315374A - 捕捉法および装置 - Google Patents
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- JPH06315374A JPH06315374A JP5256561A JP25656193A JPH06315374A JP H06315374 A JPH06315374 A JP H06315374A JP 5256561 A JP5256561 A JP 5256561A JP 25656193 A JP25656193 A JP 25656193A JP H06315374 A JPH06315374 A JP H06315374A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】細胞核を細胞から簡単に分離する方法および装
置を提供すること。 【構成】本発明は、細胞核の大部分を無傷で残しなが
ら、核膜の少しの部分と一緒に細胞質膜を選択的に溶解
するように全細胞を含む液体を処理し；処理液を表面に
のせ、それによりその表面に溶解核からのＤＮＡのメッ
シュが形成され無傷の細胞核が捕捉されることから成る
細胞から細胞核を分離する方法を提供する。また、本発
明は上記方法で使用される装置をも提供する。
置を提供すること。 【構成】本発明は、細胞核の大部分を無傷で残しなが
ら、核膜の少しの部分と一緒に細胞質膜を選択的に溶解
するように全細胞を含む液体を処理し；処理液を表面に
のせ、それによりその表面に溶解核からのＤＮＡのメッ
シュが形成され無傷の細胞核が捕捉されることから成る
細胞から細胞核を分離する方法を提供する。また、本発
明は上記方法で使用される装置をも提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞成分の分離法およ
びその分離法に使用する装置に関する。
びその分離法に使用する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの応用ができるため細胞核の調製が
望まれている。これらには細胞における転写の機構に関
する研究が含まれている。核はしばしばインビボ反応で
の転写を可能にするトランス作用因子および必要な酵素
および補助因子を含んでいる。核調製試料からの可溶性
抽出物はトランスおよびシス作用性要素の研究に有用で
あり、またこれらの因子の精製および物理化学的特徴付
けにも有用である。核抽出物使用の最初の報告は１９８
３年に行われており（Ｄｉｇｎａｍ ｅｔａｌ Ｎ．
Ａ．Ｒ．１１：１４７５−１４８９）これらは現在標準
的実施法である。しかしながらこれらの方法では核を調
整するには３ー４時間かかり、密度クッションを用いる
２回の超遠心分離が必要である。透明な無傷の核は溶解
後Ｇフリーカセット（Ｓｗａｄｏｇｏ ａｎｄ Ｒｏｅ
ｄｅｒ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８２ ４３９４−４３９８，
１９８５）、プライマー伸長、ＲＮＡｓｅマッピング、
Ｓ１ヌクレアーゼなどのような実験に使用するため抽出
物とされる。核単離のこれらの伝統的な方法は労力を要
し、時間がかかりおよび一度に取り扱える試料の数制限
されている。
望まれている。これらには細胞における転写の機構に関
する研究が含まれている。核はしばしばインビボ反応で
の転写を可能にするトランス作用因子および必要な酵素
および補助因子を含んでいる。核調製試料からの可溶性
抽出物はトランスおよびシス作用性要素の研究に有用で
あり、またこれらの因子の精製および物理化学的特徴付
けにも有用である。核抽出物使用の最初の報告は１９８
３年に行われており（Ｄｉｇｎａｍ ｅｔａｌ Ｎ．
Ａ．Ｒ．１１：１４７５−１４８９）これらは現在標準
的実施法である。しかしながらこれらの方法では核を調
整するには３ー４時間かかり、密度クッションを用いる
２回の超遠心分離が必要である。透明な無傷の核は溶解
後Ｇフリーカセット（Ｓｗａｄｏｇｏ ａｎｄ Ｒｏｅ
ｄｅｒ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８２ ４３９４−４３９８，
１９８５）、プライマー伸長、ＲＮＡｓｅマッピング、
Ｓ１ヌクレアーゼなどのような実験に使用するため抽出
物とされる。核単離のこれらの伝統的な方法は労力を要
し、時間がかかりおよび一度に取り扱える試料の数制限
されている。
【０００３】一般的に、核のみを沈澱させるため浸透圧
ショック、機械的せん断および分画遠心分離による細胞
の細胞質の選択的溶解により核の調製が実施される。こ
れらの方法は特に複雑な生物試料において実施するには
非常に困難であり、また多数の試料の処理および自動化
ができない。従って精製された核から誘導されたＤＮＡ
の質は他の方法により抽出されたＤＮＡより優れている
と文献は報告しているが核調製は他に方法がないときの
み実施される（ＤＮＡメチル化およびタンパク質／ＤＮ
Ａ相互作用のインビボ研究のための実験室ガイド :Ｂｉ
ｏｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ ３ ｅｄ． Ｈ．Ｐ． Ｓ
ａｌｕｚ， Ｊ．Ｐ． Ｊｏｓｔ １９９０ ，Ｂｉｒ
ｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。
ショック、機械的せん断および分画遠心分離による細胞
の細胞質の選択的溶解により核の調製が実施される。こ
れらの方法は特に複雑な生物試料において実施するには
非常に困難であり、また多数の試料の処理および自動化
ができない。従って精製された核から誘導されたＤＮＡ
の質は他の方法により抽出されたＤＮＡより優れている
と文献は報告しているが核調製は他に方法がないときの
み実施される（ＤＮＡメチル化およびタンパク質／ＤＮ
Ａ相互作用のインビボ研究のための実験室ガイド :Ｂｉ
ｏｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ ３ ｅｄ． Ｈ．Ｐ． Ｓ
ａｌｕｚ， Ｊ．Ｐ． Ｊｏｓｔ １９９０ ，Ｂｉｒ
ｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。
【０００４】分子生物学的研究および診断の両方のほと
んど大多数の方法において最初の工程として抽出された
核酸が必要とされる。例えば、遺伝子病の試験を実施す
るには比較的純粋なゲノムＤＮＡ試料が必要であり、組
換えＤＮＡ技術にはクローン化されるべきＤＮＡは精製
されていなければならない。ウイルスのような感染性病
原生物体の検出において、多くの微生物は隠れて存在し
ているので細胞ＤＮＡへの到達が必要である。
んど大多数の方法において最初の工程として抽出された
核酸が必要とされる。例えば、遺伝子病の試験を実施す
るには比較的純粋なゲノムＤＮＡ試料が必要であり、組
換えＤＮＡ技術にはクローン化されるべきＤＮＡは精製
されていなければならない。ウイルスのような感染性病
原生物体の検出において、多くの微生物は隠れて存在し
ているので細胞ＤＮＡへの到達が必要である。
【０００５】注意力が必要で時間がかかる核調製の過程
を避けるため、ＤＮＡの抽出は普通最初の工程として細
胞室および核の破壊によるＤＮＡの完全な初期放出によ
り実施される。このことは凍結ー融解、超音波、せん
断、酵素、キレート剤または界面活性剤により実施でき
る。ＤＮＡは細胞核中では遊離分子としては観察され
ず、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質との会合複合体と
して存在している。ほとんどのＤＮＡ抽出技術は主なタ
ンパク質およびＲＮＡ除去のために分解酵素を使用し、
残っている夾雑タンパク質および他の巨大分子を除去す
るためにフェノールおよびアルコールによる繰り返しの
溶媒抽出を続いて行う。
を避けるため、ＤＮＡの抽出は普通最初の工程として細
胞室および核の破壊によるＤＮＡの完全な初期放出によ
り実施される。このことは凍結ー融解、超音波、せん
断、酵素、キレート剤または界面活性剤により実施でき
る。ＤＮＡは細胞核中では遊離分子としては観察され
ず、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質との会合複合体と
して存在している。ほとんどのＤＮＡ抽出技術は主なタ
ンパク質およびＲＮＡ除去のために分解酵素を使用し、
残っている夾雑タンパク質および他の巨大分子を除去す
るためにフェノールおよびアルコールによる繰り返しの
溶媒抽出を続いて行う。
【０００６】これらの過程は手間がかかり、危険で揮発
性の溶媒の使用が必要でありおよびたくさんの操作工程
のため比較的壊れ易いゲノムＤＮＡは小さな破片に分解
されているかも知れない。多くの方法は大きな断片を必
要とする（下記参照）。標準核酸抽出法はＳａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌによるモレキュラークローニング、実
験室マニュアル第２版９．１４（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ １９８９）に記載されている。それには細胞の溶
解、酵素消化、繰り返しのフェノール／クロロホルム抽
出および透析が含まれており全工程の実施には多くの時
間を要する。有機溶媒の使用を避ける改良抽出法の開発
に関して多くの研究がなされてきた。塩化ナトリウム、
過塩素酸ナトリウム、塩化リチウムのようなカオトロー
プ剤の使用が挙げられる［Ｇｒｉｍｂｅｒｇ Ｊ． ｅ
ｔ ａｌ Ｎ．Ａ．Ｒ． １７，８３９０ （１９８
９），Ｂｕｔｔｏｎｅ Ｇ．Ｊ． ａｎｄ Ｄａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ Ｇ．Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３
１， １６４−１６５ （１９８９）， Ｊｏｈｎｓ，
Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｐａｕｌｕｓ−Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．
Ｅ． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０， ２７６
−２７８ （１９８９）， ＭｉｌｌｅｒＳ．Ａ．
Ｎ．Ａ．Ｒ． １６， １２１５ （１９８８）］。
性の溶媒の使用が必要でありおよびたくさんの操作工程
のため比較的壊れ易いゲノムＤＮＡは小さな破片に分解
されているかも知れない。多くの方法は大きな断片を必
要とする（下記参照）。標準核酸抽出法はＳａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌによるモレキュラークローニング、実
験室マニュアル第２版９．１４（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ １９８９）に記載されている。それには細胞の溶
解、酵素消化、繰り返しのフェノール／クロロホルム抽
出および透析が含まれており全工程の実施には多くの時
間を要する。有機溶媒の使用を避ける改良抽出法の開発
に関して多くの研究がなされてきた。塩化ナトリウム、
過塩素酸ナトリウム、塩化リチウムのようなカオトロー
プ剤の使用が挙げられる［Ｇｒｉｍｂｅｒｇ Ｊ． ｅ
ｔ ａｌ Ｎ．Ａ．Ｒ． １７，８３９０ （１９８
９），Ｂｕｔｔｏｎｅ Ｇ．Ｊ． ａｎｄ Ｄａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ Ｇ．Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３
１， １６４−１６５ （１９８９）， Ｊｏｈｎｓ，
Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｐａｕｌｕｓ−Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．
Ｅ． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０， ２７６
−２７８ （１９８９）， ＭｉｌｌｅｒＳ．Ａ．
Ｎ．Ａ．Ｒ． １６， １２１５ （１９８８）］。
【０００７】欧州特許出願第１４５３５６号および欧州
特許出願第２４０１９１号および欧州特許出願第２４５
９４５号は全てにアルコール抽出を含んでいる抽出法に
付いて記載している。血液試料からのＤＮＡ抽出は大過
剰の赤血球および血清タンパク質からの白血球分離の余
分の工程が普通必要とされるので特に困難である。これ
は遠心分離によるバフィーコート分画の単離または細胞
溶解後の核のペレット化により行われる［Ｇｒｉｍｂｅ
ｒｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ Ｎ．Ａ．Ｒ． １７， ８３
９０ （１９８９）］。
特許出願第２４０１９１号および欧州特許出願第２４５
９４５号は全てにアルコール抽出を含んでいる抽出法に
付いて記載している。血液試料からのＤＮＡ抽出は大過
剰の赤血球および血清タンパク質からの白血球分離の余
分の工程が普通必要とされるので特に困難である。これ
は遠心分離によるバフィーコート分画の単離または細胞
溶解後の核のペレット化により行われる［Ｇｒｉｍｂｅ
ｒｇ Ｊ． ｅｔ ａｌ Ｎ．Ａ．Ｒ． １７， ８３
９０ （１９８９）］。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ポリメラーゼ連鎖反応
および他の増幅法を用いる核酸の増幅および検出のため
の最近の進歩においては異なった仕様の精製または抽出
ＤＮＡを必要とする。米国特許第４、６８３、１９５号
および米国特許第４、６８３、２０２号は種々の生物試
料中に観察される核酸のポリメラーゼを用いた増幅およ
び検出法について記載している。増幅のためのＤＮＡは
他の応用のようには完全な精製を必要としないがヘモグ
ロビンの有効な除去のような他の重要な必要条件が血液
ＤＮＡ試料には存在する。血液中のこのおよび他の阻害
物質はポリメラーゼ酵素の阻害を避けるために除去され
ねばならない。
および他の増幅法を用いる核酸の増幅および検出のため
の最近の進歩においては異なった仕様の精製または抽出
ＤＮＡを必要とする。米国特許第４、６８３、１９５号
および米国特許第４、６８３、２０２号は種々の生物試
料中に観察される核酸のポリメラーゼを用いた増幅およ
び検出法について記載している。増幅のためのＤＮＡは
他の応用のようには完全な精製を必要としないがヘモグ
ロビンの有効な除去のような他の重要な必要条件が血液
ＤＮＡ試料には存在する。血液中のこのおよび他の阻害
物質はポリメラーゼ酵素の阻害を避けるために除去され
ねばならない。
【０００９】この事は定量的増幅の実施においては特に
重要であり反応の効率の変化は間違った結果を与えるで
あろう。実際そのような有害物が存在するため、血液成
分の阻害を受けにくい酵素の発見に多くの努力がなされ
た。更にＤＮＡ抽出においてごく普通の試薬であるフェ
ノールのような変性剤は全ての型の酵素反応に対し非常
に阻害的である。
重要であり反応の効率の変化は間違った結果を与えるで
あろう。実際そのような有害物が存在するため、血液成
分の阻害を受けにくい酵素の発見に多くの努力がなされ
た。更にＤＮＡ抽出においてごく普通の試薬であるフェ
ノールのような変性剤は全ての型の酵素反応に対し非常
に阻害的である。
【００１０】これらのことを考えにいれて核酸精製の間
にフェノール抽出を避けた方法が考案された。例えばＫ
ｏｇａｎ ｅｔ ａｌ Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅ
ｄ．，３１７ １６ ９８５−９９０（１９８７）煮沸
により全血から遠心分離的に前もって分離された細胞か
らのＤＮＡ抽出を記載している。欧州特許第２３７３６
２号およびサイキら（Ｓａｉｋｉ）のＮａｔｕｒｅ，３
２４，１６３−１６６（１９８６）と類似の方法も記載
されている。これらの方法は未だ速度律速工程である遠
心分離による全血の前処理を含んでおり、また増幅反応
に非常に阻害的となり得るヘモグロビンのような血液中
に観察される因子を完全に除去する方法を提供していな
い。
にフェノール抽出を避けた方法が考案された。例えばＫ
ｏｇａｎ ｅｔ ａｌ Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅ
ｄ．，３１７ １６ ９８５−９９０（１９８７）煮沸
により全血から遠心分離的に前もって分離された細胞か
らのＤＮＡ抽出を記載している。欧州特許第２３７３６
２号およびサイキら（Ｓａｉｋｉ）のＮａｔｕｒｅ，３
２４，１６３−１６６（１９８６）と類似の方法も記載
されている。これらの方法は未だ速度律速工程である遠
心分離による全血の前処理を含んでおり、また増幅反応
に非常に阻害的となり得るヘモグロビンのような血液中
に観察される因子を完全に除去する方法を提供していな
い。
【００１１】またそれはかなり迅速で簡便であるように
思われるがそれらは試料が比較的大量にあるような状況
でのみ有用である。欧州特許第３９３７４４号は白血球
遠心分離を必要とし、煮沸工程の間にポリサッカライド
を添加するこの方法の別法について記載している。
思われるがそれらは試料が比較的大量にあるような状況
でのみ有用である。欧州特許第３９３７４４号は白血球
遠心分離を必要とし、煮沸工程の間にポリサッカライド
を添加するこの方法の別法について記載している。
【００１２】さらにより速い方法は血液を濾紙上にスポ
ットし放置して乾燥させる。これらは病院で長い間”ガ
スリー”スポットとして用いられてきたものであり、フ
ェニルケトン尿症、甲状腺機能不全およびガラクトース
血症のような障害のための生後一か月以内の幼児のスク
リーニングを本来は目的としているものである。メタノ
ール中への抽出によるガスリースポットからのＤＮＡ抽
出および続いての酵素およびフェノール／クロロホルム
処理およびスポットを切り出しメタノールで固定した
後、膜上でＰＣＲによる直接的増幅が報告されている
［ＭｃＣａｂｅ，Ｅ．Ｒ．Ｂ． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １（２） ９９
−１０６ （１９９１）］。この報告はまた抽出物の質
を保ったまま非実験室的採集ができるＤＮＡ抽出に対す
る必要性を非常に詳しく説明している。
ットし放置して乾燥させる。これらは病院で長い間”ガ
スリー”スポットとして用いられてきたものであり、フ
ェニルケトン尿症、甲状腺機能不全およびガラクトース
血症のような障害のための生後一か月以内の幼児のスク
リーニングを本来は目的としているものである。メタノ
ール中への抽出によるガスリースポットからのＤＮＡ抽
出および続いての酵素およびフェノール／クロロホルム
処理およびスポットを切り出しメタノールで固定した
後、膜上でＰＣＲによる直接的増幅が報告されている
［ＭｃＣａｂｅ，Ｅ．Ｒ．Ｂ． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １（２） ９９
−１０６ （１９９１）］。この報告はまた抽出物の質
を保ったまま非実験室的採集ができるＤＮＡ抽出に対す
る必要性を非常に詳しく説明している。
【００１３】この事は世界中の先進国および開発途上国
の両方において、生後一か月以内の幼児のスクリーニン
グプログラム、法定試料、伝染性疾患状態および農業的
適用に関係している
の両方において、生後一か月以内の幼児のスクリーニン
グプログラム、法定試料、伝染性疾患状態および農業的
適用に関係している
【００１４】商業的に可能である診断試験のためには経
済的にも効率がよくなければならない。各々の段階は単
純でなければならず、使用法が容易で、特に血液、血液
産物および組織中の隠れた感染性作因により起こり得る
実験室感染に関して安全でなければならない。使い捨て
が困難であり高くつくので血液または他の体液で汚染さ
れた廃棄物の量は最小に保たなければならない。早めの
臨床決定を可能にする迅速な処理に対する要望もある。
済的にも効率がよくなければならない。各々の段階は単
純でなければならず、使用法が容易で、特に血液、血液
産物および組織中の隠れた感染性作因により起こり得る
実験室感染に関して安全でなければならない。使い捨て
が困難であり高くつくので血液または他の体液で汚染さ
れた廃棄物の量は最小に保たなければならない。早めの
臨床決定を可能にする迅速な処理に対する要望もある。
【００１５】多くの臨床試料においては、患者が死にか
けている状態であるが、または胎児、羊水穿刺、脳脊髄
液その他のような試料起源の為、試料の量は非常に制限
されている。また免疫抑制患者のように、ＤＮＡを含ん
でいる細胞が低濃度であるような、または母親の血流中
の胎児細胞のように細胞が非常にまれな集団であるよう
な多くの例がある。ウイルスＤＮＡがのっている量は非
常に少ないが（例えば１００万細胞中１）正しい診断の
ためにはこの感染細胞を見つけることが非常に重要であ
るＨＩＶのようなウイルス感染もこの例である。
けている状態であるが、または胎児、羊水穿刺、脳脊髄
液その他のような試料起源の為、試料の量は非常に制限
されている。また免疫抑制患者のように、ＤＮＡを含ん
でいる細胞が低濃度であるような、または母親の血流中
の胎児細胞のように細胞が非常にまれな集団であるよう
な多くの例がある。ウイルスＤＮＡがのっている量は非
常に少ないが（例えば１００万細胞中１）正しい診断の
ためにはこの感染細胞を見つけることが非常に重要であ
るＨＩＶのようなウイルス感染もこの例である。
【００１６】ＤＮＡが比較的大きな片で残っているよう
な生きた細胞の場合にはべつのＤＮＡ抽出法が用いられ
る。合成染色体研究の為の最も大きな必要条件では数千
のメガ塩基長のものが必要とされている。別のクローニ
ング系は５０ｋｂから５００ｋｂの大きさを必要として
おり、多くの場合、３０００メガ塩基の全ゲノムをカバ
ーするクローンの総数を減らすためより大きなものがよ
り良好である。細胞内のＤＮＡを完全に伸ばすと２０メ
ートル以上に達するので、核内の保護位置から放出され
た場合、ピペッテング、遠心分離または他の操作の間に
非常傷つけられ易くなり破損される。寒天ブロックまた
はシート内に細胞懸濁液を封じ込め、次に界面活性剤な
どの分散によりブロック内で細胞の細胞質および核を溶
解させる方法が開発された。酵素反応のような他の処理
もブロック内での分散により起きており、そのためＤＮ
Ａへのストレスは最小に保たれている。ＤＮＡにストレ
スを与える操作無しに電気泳動が実施できる。この方法
でメガ塩基の大きさのＤＮＡが産生でき、必要とされる
大きさがもし小さいならば、続けて制限酵素で切断す
る。ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．８６，９９９１ー９９９５、１９８９。
な生きた細胞の場合にはべつのＤＮＡ抽出法が用いられ
る。合成染色体研究の為の最も大きな必要条件では数千
のメガ塩基長のものが必要とされている。別のクローニ
ング系は５０ｋｂから５００ｋｂの大きさを必要として
おり、多くの場合、３０００メガ塩基の全ゲノムをカバ
ーするクローンの総数を減らすためより大きなものがよ
り良好である。細胞内のＤＮＡを完全に伸ばすと２０メ
ートル以上に達するので、核内の保護位置から放出され
た場合、ピペッテング、遠心分離または他の操作の間に
非常傷つけられ易くなり破損される。寒天ブロックまた
はシート内に細胞懸濁液を封じ込め、次に界面活性剤な
どの分散によりブロック内で細胞の細胞質および核を溶
解させる方法が開発された。酵素反応のような他の処理
もブロック内での分散により起きており、そのためＤＮ
Ａへのストレスは最小に保たれている。ＤＮＡにストレ
スを与える操作無しに電気泳動が実施できる。この方法
でメガ塩基の大きさのＤＮＡが産生でき、必要とされる
大きさがもし小さいならば、続けて制限酵素で切断す
る。ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．８６，９９９１ー９９９５、１９８９。
【００１７】酵母人工染色体のように非常に精巧な大き
な構築物に対しては取扱中の破損を防ぐことが決定的に
重要である。これはＤＮＡをアガロース ブロック内へ
埋め込み、全ての時間それを保持させることにより実施
される。これらのアガロースの詰め物はアガロースゲル
上に置くことができ、非常に大きなＤＮＡ試料のための
通常の電気泳動が実施される。［Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｒ．
ｅｔ ａｌ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８７ ８２４２−８２４
６，（１９９０）］
な構築物に対しては取扱中の破損を防ぐことが決定的に
重要である。これはＤＮＡをアガロース ブロック内へ
埋め込み、全ての時間それを保持させることにより実施
される。これらのアガロースの詰め物はアガロースゲル
上に置くことができ、非常に大きなＤＮＡ試料のための
通常の電気泳動が実施される。［Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｒ．
ｅｔ ａｌ Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８７ ８２４２−８２４
６，（１９９０）］
【００１８】核単離は色々な他の分子生物学技術のため
に通常実施される。それはｍＲＮＡ精製のための主たる
汚染源を除去する為に用いられる。ＤＮＡ除去の伝統的
方法の改良法にはＤＮＡｓｅ処理（それは次に除去され
ねばならない）またはグアニジウム塩が細胞破壊するた
めに含まれ、続いてＤＮＡが物理的にせん断される［分
子生物学における最新のプロトコール，Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８８）ｐｐ４．１．２−４．１．
６，Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ］
に通常実施される。それはｍＲＮＡ精製のための主たる
汚染源を除去する為に用いられる。ＤＮＡ除去の伝統的
方法の改良法にはＤＮＡｓｅ処理（それは次に除去され
ねばならない）またはグアニジウム塩が細胞破壊するた
めに含まれ、続いてＤＮＡが物理的にせん断される［分
子生物学における最新のプロトコール，Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８８）ｐｐ４．１．２−４．１．
６，Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ］
【００１９】核の他の用途には、ＤＮＡ結合タンパク質
研究，その場でのハイブリダイゼーション，転写研究，
核ケージ研究などがある。
研究，その場でのハイブリダイゼーション，転写研究，
核ケージ研究などがある。
【００２０】高分子量ＤＮＡを得る試みが報告されてい
る。全細胞が膜上のその場所で溶解されることを方法は
示唆しており、前もって単離された核もまた使用できた
と述べているが、これらの核がいかにして調製されたか
については何も語っておらず、この事についての研究も
報告されていない。［Ｌｅａｄｏｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄＣ
ｅｒｕｔｔｉ， Ｐ．Ａ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１２０ ２８２−２８８（１９８２）］ この報告は
ポリカーボネートフィルター上で細胞が溶解、消化およ
び洗浄され、夾雑物質の洗い出しが可能な方法について
記載している。
る。全細胞が膜上のその場所で溶解されることを方法は
示唆しており、前もって単離された核もまた使用できた
と述べているが、これらの核がいかにして調製されたか
については何も語っておらず、この事についての研究も
報告されていない。［Ｌｅａｄｏｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄＣ
ｅｒｕｔｔｉ， Ｐ．Ａ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１２０ ２８２−２８８（１９８２）］ この報告は
ポリカーボネートフィルター上で細胞が溶解、消化およ
び洗浄され、夾雑物質の洗い出しが可能な方法について
記載している。
【００２１】示唆された方法はより小さな大きさの孔を
通しての核または細胞の濾過または濾紙上への核の乾燥
の簡素化からなっている。第一の場合、捕捉できる核の
量は孔が急速に埋められるので非常に制限される。ま
た、捕捉の性質のため夾雑物を完全に洗い流すことは不
可能である。特に負荷がほとんどの孔を埋めるほど多け
れば、激しい洗浄では核が除去されるであろう。同じ原
理に基づいた他の方法は小さな細胞夾雑物を選択的に除
去するための続いての透析段階を持っている。［Ｄｅ
Ｋｌｏｗｅｔ，Ｄ，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２，１８９−１９６（１９８
４）］
通しての核または細胞の濾過または濾紙上への核の乾燥
の簡素化からなっている。第一の場合、捕捉できる核の
量は孔が急速に埋められるので非常に制限される。ま
た、捕捉の性質のため夾雑物を完全に洗い流すことは不
可能である。特に負荷がほとんどの孔を埋めるほど多け
れば、激しい洗浄では核が除去されるであろう。同じ原
理に基づいた他の方法は小さな細胞夾雑物を選択的に除
去するための続いての透析段階を持っている。［Ｄｅ
Ｋｌｏｗｅｔ，Ｄ，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２，１８９−１９６（１９８
４）］
【００２２】これらは特異的捕捉機構を含んでおらず、
非特異的濾過および捕捉に頼っている。これらの方法の
目的はＤＮＡを無傷の形で保存するためであり、そのた
め調製間の切断は計画的であり非特異的破壊によるもの
ではない。同様に日本特許第２２９５４８５号は１０ミ
クロンより小さな孔径を持つメッシュを通した濾過によ
る全血液細胞捕捉を記載している。彼らはメッシュの孔
内への吸着がヘモグロビンの効果的な洗い出しを可能に
することを請求している。
非特異的濾過および捕捉に頼っている。これらの方法の
目的はＤＮＡを無傷の形で保存するためであり、そのた
め調製間の切断は計画的であり非特異的破壊によるもの
ではない。同様に日本特許第２２９５４８５号は１０ミ
クロンより小さな孔径を持つメッシュを通した濾過によ
る全血液細胞捕捉を記載している。彼らはメッシュの孔
内への吸着がヘモグロビンの効果的な洗い出しを可能に
することを請求している。
【００２３】最近の数年の間に、特に抗体精製のための
濾過膜に基づいたアフィニティークロマトグラフィーの
為のいくつかの新しい型式が現れた。最も普通には、こ
れらには生物学分野で働いている者にはなじみの深い濾
過カートリッジ型式を使用している。これは使い捨てま
たは再使用可能なカセットから成り、その中に濾過膜の
ディスクが装着されている。
濾過膜に基づいたアフィニティークロマトグラフィーの
為のいくつかの新しい型式が現れた。最も普通には、こ
れらには生物学分野で働いている者にはなじみの深い濾
過カートリッジ型式を使用している。これは使い捨てま
たは再使用可能なカセットから成り、その中に濾過膜の
ディスクが装着されている。
【００２４】膜はカセット中プラスチックメッシュによ
り両側が支持されており上側から導かれ、カセットの下
方表面はシリンジに結合されるように設計されたノズル
および集収容器内へ導くように設計された出口である。
これらのカセットはしばしば設計において、膜を越える
液体との相互作用を最大にするための液体の流れの水路
を含んでいる（米国特許第４，６９０，７５７号）。
り両側が支持されており上側から導かれ、カセットの下
方表面はシリンジに結合されるように設計されたノズル
および集収容器内へ導くように設計された出口である。
これらのカセットはしばしば設計において、膜を越える
液体との相互作用を最大にするための液体の流れの水路
を含んでいる（米国特許第４，６９０，７５７号）。
【００２５】最近の進歩により、すでに永久的に結合さ
れた、または使用者による誘導化のために化学的に活性
化された形の捕捉部分を持つ新しい型式が導かれた。デ
ィスクは通常約５ｃｍの直径であり、カラムとして高い
結合能力を持つと特許請求されている。これは一度に１
および５０ｍｌの間の溶液の大きな試料を応用するため
のシリンジの使用と両立する。
れた、または使用者による誘導化のために化学的に活性
化された形の捕捉部分を持つ新しい型式が導かれた。デ
ィスクは通常約５ｃｍの直径であり、カラムとして高い
結合能力を持つと特許請求されている。これは一度に１
および５０ｍｌの間の溶液の大きな試料を応用するため
のシリンジの使用と両立する。
【００２６】これらのカートリッジは内蔵されているの
で液体で満たされたかどうかを見るのが容易ではなく、
このため最小容量に減少させる試みにおいて空気が引き
込まれ膜が部分的に乾燥される。また膜が内蔵され支持
されているため、工学または電子顕微鏡使用による可視
化の為に膜を除去するのは容易ではい。カートリッジの
いくつかは分解でき、従って膜が除かれる。この本当の
目的はカートリッジの再使用であるが、通常膜にいくら
かの損傷を生じる。
で液体で満たされたかどうかを見るのが容易ではなく、
このため最小容量に減少させる試みにおいて空気が引き
込まれ膜が部分的に乾燥される。また膜が内蔵され支持
されているため、工学または電子顕微鏡使用による可視
化の為に膜を除去するのは容易ではい。カートリッジの
いくつかは分解でき、従って膜が除かれる。この本当の
目的はカートリッジの再使用であるが、通常膜にいくら
かの損傷を生じる。
【００２７】ＷＯ８８０９２０１号の前にチップの先端
上での分離をもたらす概念は利用されている。しかしな
がらこの場合、チップは二つのフリットの間にカラム材
料を含んでおり、従ってそれは小型カラムである。
上での分離をもたらす概念は利用されている。しかしな
がらこの場合、チップは二つのフリットの間にカラム材
料を含んでおり、従ってそれは小型カラムである。
【００２８】
【課題を解決するための手段】本発明は細胞の成分を分
離する方法を提供し、その方法は ａ）細胞核の大部分を無傷で残しながら、核膜の一部と
一緒に細胞質膜を選択的に溶解するように全細胞を含む
液体を処理し、 ｂ）処理液を表面にのせ、それによりその表面に溶解核
からのＤＮＡのメッシュが形成され無傷の細胞核が捕捉
される、 ｃ）細胞の他の成分から捕捉された細胞核を分離するた
めに表面上のＤＮＡメッシュを洗浄することからなる。
離する方法を提供し、その方法は ａ）細胞核の大部分を無傷で残しながら、核膜の一部と
一緒に細胞質膜を選択的に溶解するように全細胞を含む
液体を処理し、 ｂ）処理液を表面にのせ、それによりその表面に溶解核
からのＤＮＡのメッシュが形成され無傷の細胞核が捕捉
される、 ｃ）細胞の他の成分から捕捉された細胞核を分離するた
めに表面上のＤＮＡメッシュを洗浄することからなる。
【００２９】本発明はまたその後方端が開口され、その
先方端に渡ってひろがるフィルター要素を持っている管
から成る前記の方法で使用するための装置も提供し、こ
の管はその末端の間に弱体化の為の円周上に拡がる周囲
の線を持つとともに、砕け易いプラスチック材料からで
きており、そのため管を前記の弱体化線に沿って破壊で
き、前記フィルター要素はＤＮＡのメッシュが形成され
る表面を提供している。
先方端に渡ってひろがるフィルター要素を持っている管
から成る前記の方法で使用するための装置も提供し、こ
の管はその末端の間に弱体化の為の円周上に拡がる周囲
の線を持つとともに、砕け易いプラスチック材料からで
きており、そのため管を前記の弱体化線に沿って破壊で
き、前記フィルター要素はＤＮＡのメッシュが形成され
る表面を提供している。
【００３０】本方法の第一段階は全細胞の選択的溶解で
ある。典型的にはこの事は緩和な界面活性剤および（緩
衝液）塩濃度を用いて実施され浸透圧ショックを生み出
す。現れた核膜のクションとなるように蔗糖のような追
加の試薬を加えてもまたは加えなくてもよい。文献には
全ての型の細胞および組織のための方法が豊富であり、
熟練した読者は適した方法の選択に何の困難も感じない
であろう。本方法の概念は非常に少量の核しか破裂させ
ずに、そのＤＮＡを放出させるとそれが粗いマットを形
成し、それが非溶解核を捕捉し保持する。
ある。典型的にはこの事は緩和な界面活性剤および（緩
衝液）塩濃度を用いて実施され浸透圧ショックを生み出
す。現れた核膜のクションとなるように蔗糖のような追
加の試薬を加えてもまたは加えなくてもよい。文献には
全ての型の細胞および組織のための方法が豊富であり、
熟練した読者は適した方法の選択に何の困難も感じない
であろう。本方法の概念は非常に少量の核しか破裂させ
ずに、そのＤＮＡを放出させるとそれが粗いマットを形
成し、それが非溶解核を捕捉し保持する。
【００３１】非常に緩和な条件下でさえも数分後に単離
核のゆっくりした溶解が始まり、数時間つずくことが示
されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｎ． 博士論文，グルココ
ルチコイド レセプターの細胞内局在および機能、１９
８２）。
核のゆっくりした溶解が始まり、数時間つずくことが示
されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｎ． 博士論文，グルココ
ルチコイド レセプターの細胞内局在および機能、１９
８２）。
【００３２】細胞の性質は本発明には決定的ではない。
植物細胞および動物細胞を含む任意の細胞源からの核を
持つ細胞が使用できるが本発明は全動物血および組織か
らのゲノムＤＮＡの回収に特に価値があるようである。
昆虫、酵母、無脊椎動物、チキン赤血球、植物細胞など
を含む任意の細胞源の為の選択的溶解法は既知である。
植物細胞および動物細胞を含む任意の細胞源からの核を
持つ細胞が使用できるが本発明は全動物血および組織か
らのゲノムＤＮＡの回収に特に価値があるようである。
昆虫、酵母、無脊椎動物、チキン赤血球、植物細胞など
を含む任意の細胞源の為の選択的溶解法は既知である。
【００３３】ａ）核を損傷させることなく細胞質膜の選
択的溶解および、ｂ）捕捉織布を形成するための十分な
核の溶解を可能にするために選択された緩衝液は適切な
ものでなくてはならない。問題とする核の型に依存して
異なった緩衝液が必要とされる。これはある種の核は他
に比べて溶解に対してより耐性である為である。さら
に、溶解の程度により捕捉効率の変化があるであろう。
例えば、培養細胞株は溶解に対して非常に抵抗性の核を
持っている。最適化のためにもかなりの範囲がある。も
し核を良好な状態に保存するのが最も重要であるなら
ば、最大の捕捉を犠牲にして最小の溶解が選択されるで
あろう。もし可能な限り多くの核ＤＮＡの捕捉が重要で
あるならば、増加した細胞核の溶解は妥協されるであろ
う。
択的溶解および、ｂ）捕捉織布を形成するための十分な
核の溶解を可能にするために選択された緩衝液は適切な
ものでなくてはならない。問題とする核の型に依存して
異なった緩衝液が必要とされる。これはある種の核は他
に比べて溶解に対してより耐性である為である。さら
に、溶解の程度により捕捉効率の変化があるであろう。
例えば、培養細胞株は溶解に対して非常に抵抗性の核を
持っている。最適化のためにもかなりの範囲がある。も
し核を良好な状態に保存するのが最も重要であるなら
ば、最大の捕捉を犠牲にして最小の溶解が選択されるで
あろう。もし可能な限り多くの核ＤＮＡの捕捉が重要で
あるならば、増加した細胞核の溶解は妥協されるであろ
う。
【００３４】溶解の程度に寄与できる他の因子はより勢
いよくまたはより弱く膜を通過する液体、および細胞が
溶解溶液に暴露されている時間の長さなどのような機械
的作用である。これら全ての因子は、使用される各々の
新しい細胞型に対し最良の結果を与えるように最適化さ
れる必要がある。
いよくまたはより弱く膜を通過する液体、および細胞が
溶解溶液に暴露されている時間の長さなどのような機械
的作用である。これら全ての因子は、使用される各々の
新しい細胞型に対し最良の結果を与えるように最適化さ
れる必要がある。
【００３５】処理液は次に表面にのせられる。全て、ま
たはより普通には一部、の溶解核からのＤＮＡがメッシ
ュを形成し、それは表面と接触して残り無傷の細胞核を
捕捉する。表面は好適には透過性膜の形であり、即ち、
その膜を通して処理液が通過させられる。織または不織
繊維または単繊維の膜が好適である。しかしながら、フ
ィルター製造のトラックエッチ法または他の方法もまた
適している。もしくは、固形シートも使用できる。この
選択は特定の適用例に依存している。種々の孔径の膜も
また適している、より大きな孔径はＤＮＡメッシュの付
着のための位置が少ないので、夾雑物の除去はより容易
になるが核の保持は悪くなる。
たはより普通には一部、の溶解核からのＤＮＡがメッシ
ュを形成し、それは表面と接触して残り無傷の細胞核を
捕捉する。表面は好適には透過性膜の形であり、即ち、
その膜を通して処理液が通過させられる。織または不織
繊維または単繊維の膜が好適である。しかしながら、フ
ィルター製造のトラックエッチ法または他の方法もまた
適している。もしくは、固形シートも使用できる。この
選択は特定の適用例に依存している。種々の孔径の膜も
また適している、より大きな孔径はＤＮＡメッシュの付
着のための位置が少ないので、夾雑物の除去はより容易
になるが核の保持は悪くなる。
【００３６】ＤＮＡのメッシュが表面と接触して残って
いることを確かめるために種々の手段が利用できる。好
適には表面はＤＮＡと結合できる（例えば化学的相互作
用により）材料からできている。プラスチック材料への
ＤＮＡの結合は複雑であり、これらの現象の種々の組み
合わせを含んでいる。例えば高度に荷電されたポリマー
表面は荷電相互作用を好むであろうし、一方荷電されて
いないポリマー表面は疎水的結合を好むであろう。表面
が透過性膜である場合、ＤＮＡメッシュは膜の上、また
は、孔中または孔の開き口に物理的に捕捉される。もし
くは、好ましくはないが、核捕捉性を持たない表面の使
用も可能である、例えばＤＮＡメッシュを二つの透過性
膜間にサンドイッチにすることができる。
いることを確かめるために種々の手段が利用できる。好
適には表面はＤＮＡと結合できる（例えば化学的相互作
用により）材料からできている。プラスチック材料への
ＤＮＡの結合は複雑であり、これらの現象の種々の組み
合わせを含んでいる。例えば高度に荷電されたポリマー
表面は荷電相互作用を好むであろうし、一方荷電されて
いないポリマー表面は疎水的結合を好むであろう。表面
が透過性膜である場合、ＤＮＡメッシュは膜の上、また
は、孔中または孔の開き口に物理的に捕捉される。もし
くは、好ましくはないが、核捕捉性を持たない表面の使
用も可能である、例えばＤＮＡメッシュを二つの透過性
膜間にサンドイッチにすることができる。
【００３７】ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネ
ート、セルロース、ニトロセルロース、ポニビニリデ
ン、ジフルオライド、およびガラスを含む核捕捉能力を
持つ材料が知られている。織または不織布繊維または単
繊維の多孔性膜の形で好適に使用され、そのようなもの
は市販品として入手可能である。または、表面はＤＮＡ
と結合するように化合物または物理的に活性化できる材
料から作ることができる、例えば結合された陽性荷電を
持たせることによりまたは陰性荷電を隠すことによりま
たは疎水的結合部分を付加させることにより。
ート、セルロース、ニトロセルロース、ポニビニリデ
ン、ジフルオライド、およびガラスを含む核捕捉能力を
持つ材料が知られている。織または不織布繊維または単
繊維の多孔性膜の形で好適に使用され、そのようなもの
は市販品として入手可能である。または、表面はＤＮＡ
と結合するように化合物または物理的に活性化できる材
料から作ることができる、例えば結合された陽性荷電を
持たせることによりまたは陰性荷電を隠すことによりま
たは疎水的結合部分を付加させることにより。
【００３８】透過性膜または他の表面を支持するための
器具の構造は本発明には決定的ではない。これは濾過ユ
ニットの一部でもよいし”計量器”の形で坦体に結合で
きる。また、処理液を透過性膜または他の表面にのせる
方法は本発明には決定的ではない。ポンプ系を使用する
ことも可能であり（陽性または陰性の気圧を用いて）ま
たは、単純にインキュベーションの間表面上へのＤＮＡ
メッシュへ供給を可能にするものでよい。
器具の構造は本発明には決定的ではない。これは濾過ユ
ニットの一部でもよいし”計量器”の形で坦体に結合で
きる。また、処理液を透過性膜または他の表面にのせる
方法は本発明には決定的ではない。ポンプ系を使用する
ことも可能であり（陽性または陰性の気圧を用いて）ま
たは、単純にインキュベーションの間表面上へのＤＮＡ
メッシュへ供給を可能にするものでよい。
【００３９】無傷の細胞核が核捕捉表面の形というより
もＤＮＡのメッシュに捕捉されるということが本発明の
特徴的な様相である。それは一般的には表面に吸着また
は結合されているＤＮＡメッシュである。一般的にはメ
ッシュのためのＤＮＡは透過性膜または他の表面に液体
がのせられると同時に存在または形成され、それより後
ではない。しかしながら、このような状況においては本
発明の方法の工程ａ）およびｂ）は同時に実施できる。
もＤＮＡのメッシュに捕捉されるということが本発明の
特徴的な様相である。それは一般的には表面に吸着また
は結合されているＤＮＡメッシュである。一般的にはメ
ッシュのためのＤＮＡは透過性膜または他の表面に液体
がのせられると同時に存在または形成され、それより後
ではない。しかしながら、このような状況においては本
発明の方法の工程ａ）およびｂ）は同時に実施できる。
【００４０】核の捕捉が有効になったら溶解剤は通常の
洗浄技術を用いて除去できる。従って、透過性膜または
他の表面（ＤＮＡメッシュおよび核が結合されている）
を洗浄溶液に浸漬するかまたは、洗浄溶液を透過性膜に
通すことができる。洗浄溶液および技術は本発明では決
定的要素ではない。
洗浄技術を用いて除去できる。従って、透過性膜または
他の表面（ＤＮＡメッシュおよび核が結合されている）
を洗浄溶液に浸漬するかまたは、洗浄溶液を透過性膜に
通すことができる。洗浄溶液および技術は本発明では決
定的要素ではない。
【００４１】本発明の方法は好適には細胞核のおよび他
の細胞夾雑物からの会合ＤＮＡの分離および回収に使用
される。しかしながら、本方法はまた、核成分の除去に
も有用であり細胞質分画の回収が可能である。このこと
はＤＮＡに対するものと同じ利点を持ち全工程が迅速で
あり潜在的に不安定な細胞質成分を良好な条件下で得る
ことができる。
の細胞夾雑物からの会合ＤＮＡの分離および回収に使用
される。しかしながら、本方法はまた、核成分の除去に
も有用であり細胞質分画の回収が可能である。このこと
はＤＮＡに対するものと同じ利点を持ち全工程が迅速で
あり潜在的に不安定な細胞質成分を良好な条件下で得る
ことができる。
【００４２】これらの応用例において、ある種の界面活
性剤／緩衝液は問題とする成分を損傷するかも知れず界
面活性剤／緩衝液溶液は最適である必要がある。ｐＨ／
イオン強度／イオン型／界面活性剤型／界面活性剤濃度
および溶解の時間を変化させることにより、この方法を
すべての応用例に適合させることができる。
性剤／緩衝液は問題とする成分を損傷するかも知れず界
面活性剤／緩衝液溶液は最適である必要がある。ｐＨ／
イオン強度／イオン型／界面活性剤型／界面活性剤濃度
および溶解の時間を変化させることにより、この方法を
すべての応用例に適合させることができる。
【００４３】透過性膜または他の表面から核を除くには
いくつかの方法が適用可能である。
いくつかの方法が適用可能である。
【００４４】もし大きな無傷のＤＮＡが必要とされる場
合、ビーズのような固相の上に固定化された非配列特異
的ＤＮＡｓｅまたは配列特異的制限酵素を使用すること
により核の除去がなされる。なぜなら、核膜は非常に透
過しやすいのでこれらの酵素は侵入でき内部ＤＮＡを分
解させる。また、細胞内へのより多くの侵入が起こる前
に暴露ＤＮＡを切断するために洗浄することにより短時
間でＤＮＡｓｅを除くことにより同じ効果を得ることが
可能である。
合、ビーズのような固相の上に固定化された非配列特異
的ＤＮＡｓｅまたは配列特異的制限酵素を使用すること
により核の除去がなされる。なぜなら、核膜は非常に透
過しやすいのでこれらの酵素は侵入でき内部ＤＮＡを分
解させる。また、細胞内へのより多くの侵入が起こる前
に暴露ＤＮＡを切断するために洗浄することにより短時
間でＤＮＡｓｅを除くことにより同じ効果を得ることが
可能である。
【００４５】両方の場合において、核は膜から洗浄また
は遠心分離で除くことができる。
は遠心分離で除くことができる。
【００４６】もし、制限分解されたＤＮＡが必要なら、
メッシュ上で制限分解が実施できる。捕捉ＤＮＡは核内
ＤＮＡと同様に切断できるであろう。核／切断ＤＮＡは
洗浄または遠心分離により溶出できる。
メッシュ上で制限分解が実施できる。捕捉ＤＮＡは核内
ＤＮＡと同様に切断できるであろう。核／切断ＤＮＡは
洗浄または遠心分離により溶出できる。
【００４７】もし、無傷の核が必要とされるなら、転写
因子のような内部成分の損失を防ぐため、界面活性剤を
含まずグリセロールまたはショ糖を含む支持培地へ捕捉
後迅速に返さなければならない。
因子のような内部成分の損失を防ぐため、界面活性剤を
含まずグリセロールまたはショ糖を含む支持培地へ捕捉
後迅速に返さなければならない。
【００４８】核は続いて更成る処理のため上記の方法の
いずれかにより除去できる。
いずれかにより除去できる。
【００４９】ＤＮＡおよび／または核はまた乾燥、凍結
乾燥またはー２０またはそれ以下で凍結することにより
膜上で長期間貯蔵できる。短期間の貯蔵のためには、そ
れらは４℃に維持される。
乾燥またはー２０またはそれ以下で凍結することにより
膜上で長期間貯蔵できる。短期間の貯蔵のためには、そ
れらは４℃に維持される。
【００５０】超巨大ＤＮＡの最大の保存の為には、核は
膜上に残すことができ、低融解アガロースブロック中に
その場所での溶解のために置かれるかまたは、電気的溶
出されるべき電気泳動ゲルに直接加えられる；このこと
はパルスフィールド電気泳動または大きなＤＮＡ断片を
分離するため全てがパルス化、変形されおよび逆転され
ている電場を持つＣＨＥＦなどのような変形法に関連し
て特に重要である。
膜上に残すことができ、低融解アガロースブロック中に
その場所での溶解のために置かれるかまたは、電気的溶
出されるべき電気泳動ゲルに直接加えられる；このこと
はパルスフィールド電気泳動または大きなＤＮＡ断片を
分離するため全てがパルス化、変形されおよび逆転され
ている電場を持つＣＨＥＦなどのような変形法に関連し
て特に重要である。
【００５１】ＰＣＲのような反応は反応を阻害されるこ
となく膜上で実施できる。メッシュの粗さは成分の自由
な相互作用を可能にしている。しかしながら、ある種の
プラスチックの阻害効果を避けるため材料は選択されな
ければならない。
となく膜上で実施できる。メッシュの粗さは成分の自由
な相互作用を可能にしている。しかしながら、ある種の
プラスチックの阻害効果を避けるため材料は選択されな
ければならない。
【００５２】図１は固形表面上のＤＮＡのメッシュ中に
捕捉されたヤギ血液核を示している電子顕微鏡写真であ
る。簡単に説明すると、ショ糖／トリトン（核を発生）
により溶解された血液はポリエステル膜を通して吸引さ
れ、続いて洗浄されリン酸緩衝化塩溶液中で貯蔵され
た。濃度を増したエタノールへの連続的な暴露により膜
を脱水し、グルタルアルデヒドで固定し、凍結乾燥し、
装着し、金でぶつぶつに被覆された。これは標準的Ｅ．
Ｍ．調製技術である。顕微鏡像は示されたように倍率で
のスキャニングＥ．Ｍ．により作製された。細胞核は明
瞭に直径数ｍｍのディスクとして観察できる。核が捕捉
されるＤＮＡメッシュはある程度一緒にもつれた青白い
線として明瞭に観察される。灰色のバックグラウンドは
ＤＮＡのメッシュが結合される表面である。
捕捉されたヤギ血液核を示している電子顕微鏡写真であ
る。簡単に説明すると、ショ糖／トリトン（核を発生）
により溶解された血液はポリエステル膜を通して吸引さ
れ、続いて洗浄されリン酸緩衝化塩溶液中で貯蔵され
た。濃度を増したエタノールへの連続的な暴露により膜
を脱水し、グルタルアルデヒドで固定し、凍結乾燥し、
装着し、金でぶつぶつに被覆された。これは標準的Ｅ．
Ｍ．調製技術である。顕微鏡像は示されたように倍率で
のスキャニングＥ．Ｍ．により作製された。細胞核は明
瞭に直径数ｍｍのディスクとして観察できる。核が捕捉
されるＤＮＡメッシュはある程度一緒にもつれた青白い
線として明瞭に観察される。灰色のバックグラウンドは
ＤＮＡのメッシュが結合される表面である。
【００５３】図２および３は、各々細胞核捕捉の手段と
して本方法で使用された装置の好適な形の断面および正
面図である。
して本方法で使用された装置の好適な形の断面および正
面図である。
【００５４】装置はその先端１２に向かってその長さと
ともに直径が減少している管１０および孔１１から成っ
ている。管の先端面は孔全体に拡がりおよび捕捉される
べき核の性質に従って選択された透過性膜または他のフ
ィルター要素の装着のための環状の仕切１３を持ってい
る。この構成物中の仕切は三角の断面を持っている。周
囲の溝の形をとる弱体化のための線１４は先端から定め
られた距離で管の壁に形成されている。その後方端部分
１５においては管の外部表面は円筒状でありマイクロピ
ペットの末端上へ管の末端が摩擦により適合するのを安
全にする一連の軸に沿った堅くする肋骨状物１６を持っ
ている。管は透明なおよび砕け易い熱可塑性プラスチッ
ク材料から作られている。ポリカーボネートはこの目的
に特に適している。
ともに直径が減少している管１０および孔１１から成っ
ている。管の先端面は孔全体に拡がりおよび捕捉される
べき核の性質に従って選択された透過性膜または他のフ
ィルター要素の装着のための環状の仕切１３を持ってい
る。この構成物中の仕切は三角の断面を持っている。周
囲の溝の形をとる弱体化のための線１４は先端から定め
られた距離で管の壁に形成されている。その後方端部分
１５においては管の外部表面は円筒状でありマイクロピ
ペットの末端上へ管の末端が摩擦により適合するのを安
全にする一連の軸に沿った堅くする肋骨状物１６を持っ
ている。管は透明なおよび砕け易い熱可塑性プラスチッ
ク材料から作られている。ポリカーボネートはこの目的
に特に適している。
【００５５】装置の使用に当たっては、実施例に記載し
たような混合物が、捕捉されるべき核の性質に従って選
択された膜を通してマイクロピペットにより吸引され
る。捕捉されたＤＮＡメッシュは次に膜を通して洗浄液
が吸引され、続いて管は膜を含む管の全先端の部分の弱
体化の線で破壊され、捕捉されたＤＮＡはＰＣＲ増幅の
ための標準反応混合物を含む標準エッペンドルフチュー
ブ内に置かれた。エッペンドルフチューブの蓋が閉まる
のを可能にするためには、溝１４が管の先端から１８ｍ
ｍの距離に形成されるのが都合が良い。
たような混合物が、捕捉されるべき核の性質に従って選
択された膜を通してマイクロピペットにより吸引され
る。捕捉されたＤＮＡメッシュは次に膜を通して洗浄液
が吸引され、続いて管は膜を含む管の全先端の部分の弱
体化の線で破壊され、捕捉されたＤＮＡはＰＣＲ増幅の
ための標準反応混合物を含む標準エッペンドルフチュー
ブ内に置かれた。エッペンドルフチューブの蓋が閉まる
のを可能にするためには、溝１４が管の先端から１８ｍ
ｍの距離に形成されるのが都合が良い。
【００５６】マイクロピペットの汚染を防ぐため管１０
およびマイクロピペットの間にエアロゾールフィルター
が好適には提供される。
およびマイクロピペットの間にエアロゾールフィルター
が好適には提供される。
【００５７】管が作製されるポリカーボネート材料はあ
る種の厳密な要求に従っていなければならない。１２０
℃で２０分間のオートクレーブおよび９５℃および室温
のあいだの繰り返しの加熱および冷却に耐えなければな
らない。材料はその表面の化学性質または付加された構
成物による吸着または化学的阻害によりＰＣＲのような
酵素反応を阻害してはならない。材料は好適には凍結ー
融解で割れてはならない。
る種の厳密な要求に従っていなければならない。１２０
℃で２０分間のオートクレーブおよび９５℃および室温
のあいだの繰り返しの加熱および冷却に耐えなければな
らない。材料はその表面の化学性質または付加された構
成物による吸着または化学的阻害によりＰＣＲのような
酵素反応を阻害してはならない。材料は好適には凍結ー
融解で割れてはならない。
【００５８】管の製造に於いては、可塑剤または型放出
を使用してはならない。
を使用してはならない。
【００５９】本出願人により本出願と同日付で出願され
た特許出願には、管からの液体の引き出しのためのポン
プに合うように適合した後方端および、その前方端また
はそれに隣接した所に管全体に渡って拡がった少なくと
も一つの膜を持つ前方端を持つ管からなる、体液中に存
在する成分を捕捉するための装置を開示している。その
装置はこの発明の方法においての使用にも好適である。
た特許出願には、管からの液体の引き出しのためのポン
プに合うように適合した後方端および、その前方端また
はそれに隣接した所に管全体に渡って拡がった少なくと
も一つの膜を持つ前方端を持つ管からなる、体液中に存
在する成分を捕捉するための装置を開示している。その
装置はこの発明の方法においての使用にも好適である。
【００６０】
【実施例１】 ”サザンブロット”のための核の調製 等容量の下記の緩衝液をクエン酸被覆チューブ（抗凝血
物質）に採った新鮮な全ヒト血液に加える： １０ｍＭ トリス ｐＨ ８．０ ３２０ｍＭ スクロース ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １％（ｖ／ｖ） トリトンＸ−１００
物質）に採った新鮮な全ヒト血液に加える： １０ｍＭ トリス ｐＨ ８．０ ３２０ｍＭ スクロース ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １％（ｖ／ｖ） トリトンＸ−１００
【００６１】緩衝液は室温で５分間インキュベートし赤
血球および白血球細胞膜および少量の核膜を溶解する。
血球および白血球細胞膜および少量の核膜を溶解する。
【００６２】混合物はＤＮＡメッシュを捕捉し結合する
１ミクロンの孔径のポリエステルの５ｍｍのデイスクを
通して引き込んで集める。これはシリンジを用いて実施
される。
１ミクロンの孔径のポリエステルの５ｍｍのデイスクを
通して引き込んで集める。これはシリンジを用いて実施
される。
【００６３】メッシュは洗浄溶液を引き込むことにより
洗浄される：２ｘ１ｍｌリン酸緩衝化塩溶液、続いて蒸
留水で一度洗浄。
洗浄される：２ｘ１ｍｌリン酸緩衝化塩溶液、続いて蒸
留水で一度洗浄。
【００６４】メッシュがまだ保持されている膜は次に核
を破壊する下記の溶液の表面に接触させる：最小量の溶
液が必要とされる： ２０ｍＭ トリス ｐＨ ８．０ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０ ０．５％ （ｗ／ｖ）ＳＤＳ １ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼ Ｋ ０．４ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａ ０．４Ｕ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ｔ１
を破壊する下記の溶液の表面に接触させる：最小量の溶
液が必要とされる： ２０ｍＭ トリス ｐＨ ８．０ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０ ０．５％ （ｗ／ｖ）ＳＤＳ １ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼ Ｋ ０．４ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａ ０．４Ｕ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ｔ１
【００６５】膜は続いてエッペンドルフチューブ内にい
れ５５℃で３０分続いて８０℃で１０分間インキュベー
トする。
れ５５℃で３０分続いて８０℃で１０分間インキュベー
トする。
【００６６】３０秒遠心分離して膜から精製ＤＮＡを除
く。
く。
【００６７】この時点で夾雑タンパク質および次の制限
酵素反応を阻害するであろう界面活性剤を除くためフェ
ノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱の標準
法を続けて行う。
酵素反応を阻害するであろう界面活性剤を除くためフェ
ノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱の標準
法を続けて行う。
【００６８】この方法で作製されたＤＮＡは１０の異な
った酵素で消化され、伝統的は方法で作製されたＤＮＡ
およびメッシュ捕捉ＤＮＡ間で同じ切断が行われている
ことを示した。
った酵素で消化され、伝統的は方法で作製されたＤＮＡ
およびメッシュ捕捉ＤＮＡ間で同じ切断が行われている
ことを示した。
【００６９】これらの消化物は”デフェンシン”プロー
ブで探査され、メッシュＤＮＡならびに標準ＤＮＡでサ
ザンブロットの質は同じであった。ＤＮＡ”フィンガー
プリント”帯のパターンは対照およびメッシュ捕捉核か
ら誘導されたＤＮＡ間で同一であった。
ブで探査され、メッシュＤＮＡならびに標準ＤＮＡでサ
ザンブロットの質は同じであった。ＤＮＡ”フィンガー
プリント”帯のパターンは対照およびメッシュ捕捉核か
ら誘導されたＤＮＡ間で同一であった。
【００７０】
【実施例２】等容量の下記の緩衝液をクエン酸被覆チュ
ーブ（抗凝血物質）に採った新鮮な全ヒト血液に加え
る： １０ｍＭ トリス ｐＨ ８．０ ３２０ｍＭ スクロース ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １％（ｖ／ｖ） トリトンＸ−１００
ーブ（抗凝血物質）に採った新鮮な全ヒト血液に加え
る： １０ｍＭ トリス ｐＨ ８．０ ３２０ｍＭ スクロース ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １％（ｖ／ｖ） トリトンＸ−１００
【００７１】緩衝液は室温で５分間インキュベートし赤
血球および白血球細胞膜および少量の核膜を溶解する。
血球および白血球細胞膜および少量の核膜を溶解する。
【００７２】混合物はＤＮＡメッシュを捕捉し結合する
１ミクロンの孔径のポリエステルの５ｍｍのデイスクを
通して引き込んで集める。これはシリンジを用いて実施
される。
１ミクロンの孔径のポリエステルの５ｍｍのデイスクを
通して引き込んで集める。これはシリンジを用いて実施
される。
【００７３】メッシュは洗浄溶液を引き込むことにより
洗浄される：２ｘ１ｍｌリン酸緩衝化塩溶液、続いて蒸
留水で一度洗浄。
洗浄される：２ｘ１ｍｌリン酸緩衝化塩溶液、続いて蒸
留水で一度洗浄。
【００７４】メッシュがまだ保持されている膜は次にＰ
ＣＲ増幅のための標準反応混合物を含むエッペンドルフ
チューブに加える。本実施例においてそれは下記の液で
ある： ５μｌ １０ｘＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス，１５
ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０） ５μｌ ３Ｈ ｄＮＴＰ 混合物（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
２００μＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ＋
１μＣｉ ３Ｈ−ＴＴＰ ０．１μｌ プライマー１（５０μＭ） ０．１μｌ プライマー２（５９μＭ） ０．４μｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（５０μｌ） ０．５μｌ ゼラチン（１０ｍｇ／ｍｌ） ３３．９μｌ 無菌水 全量 ４５μｌ
ＣＲ増幅のための標準反応混合物を含むエッペンドルフ
チューブに加える。本実施例においてそれは下記の液で
ある： ５μｌ １０ｘＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス，１５
ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ９．０） ５μｌ ３Ｈ ｄＮＴＰ 混合物（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
２００μＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ＋
１μＣｉ ３Ｈ−ＴＴＰ ０．１μｌ プライマー１（５０μＭ） ０．１μｌ プライマー２（５９μＭ） ０．４μｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（５０μｌ） ０．５μｌ ゼラチン（１０ｍｇ／ｍｌ） ３３．９μｌ 無菌水 全量 ４５μｌ
【００７５】膜は液体の表面下を保つように加えられ、
２滴の鉱油を加える。
２滴の鉱油を加える。
【００７６】下記のサイクルプログラムが使用された： ９５℃ ー ３０秒 ５５℃ ー １２０秒 ７２℃ ー １８０秒 ４０ サイクル ９５℃ ー ３０秒 ５５℃ ー １２０秒 ７２℃ ー ６００秒 ４０℃ ー 不定 反応終了後、試料はアガロースゲルにのせられた。
【００７７】プライマーセット間のＤＮＡの増幅は膜捕
捉核で有効であることが示され、再懸濁および遠心分離
により塩溶液で数回洗浄された核と比較された。１ミク
ロンのポリエステル膜を通して吸引された血液の１００
倍希釈溶液（塩溶液で）の１００マイクロリットルがＰ
ＣＲへ添加され、遠心分離により同じ希釈容量で得られ
た核ペレットと等しい増幅度を与えた。定量はエチジウ
ム ブロミド染色ゲルの光学密度計測スキャンにより実
施された。
捉核で有効であることが示され、再懸濁および遠心分離
により塩溶液で数回洗浄された核と比較された。１ミク
ロンのポリエステル膜を通して吸引された血液の１００
倍希釈溶液（塩溶液で）の１００マイクロリットルがＰ
ＣＲへ添加され、遠心分離により同じ希釈容量で得られ
た核ペレットと等しい増幅度を与えた。定量はエチジウ
ム ブロミド染色ゲルの光学密度計測スキャンにより実
施された。
【００７８】
【実施例３】ヒーラ細胞を何回も凍結ー融解させ、下記
の核発生緩衝液に曝した： １０ｍＭ トリス ｐＨ ７．５ １０ｍＭ ＫＣｌ ３ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．１％ トリトンＸ−１００
の核発生緩衝液に曝した： １０ｍＭ トリス ｐＨ ７．５ １０ｍＭ ＫＣｌ ３ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．１％ トリトンＸ−１００
【００７９】核は実施例１および２に記載したごとくＤ
ＮＡメッシュ／膜機構により捕捉された。捕捉膜は溶解
溶液に室温で１ー５分浸された。捕捉核は血液から誘導
された核と同じ方法で処理された。ＤＮＡメッシュ上で
の無傷の核の捕捉が成功したことが示され、写真に撮ら
れた。消化物は実施例１に記載したごとく調製されサザ
ンブロットの発生に使用された。
ＮＡメッシュ／膜機構により捕捉された。捕捉膜は溶解
溶液に室温で１ー５分浸された。捕捉核は血液から誘導
された核と同じ方法で処理された。ＤＮＡメッシュ上で
の無傷の核の捕捉が成功したことが示され、写真に撮ら
れた。消化物は実施例１に記載したごとく調製されサザ
ンブロットの発生に使用された。
【００８０】これらの実施例で記載された技術はヒト、
ヤギ、ニワトリ、ウマ、ウサギ、マウス、およびラット
の血液に対しても成功理に応用された。全ての血液由来
試料は実施例１のごとくスクロースートリトン溶解溶液
で処理された。細胞株および組織由来試料は実施例３の
ごとく糖を含まない溶解溶液で処理された。各々の場合
において、無傷の核の捕捉が示された。
ヤギ、ニワトリ、ウマ、ウサギ、マウス、およびラット
の血液に対しても成功理に応用された。全ての血液由来
試料は実施例１のごとくスクロースートリトン溶解溶液
で処理された。細胞株および組織由来試料は実施例３の
ごとく糖を含まない溶解溶液で処理された。各々の場合
において、無傷の核の捕捉が示された。
【００８１】成功理に使用された捕捉膜は１，５，６お
よび１１μのポリエステル織り膜および１μのナイロン
織り膜である。両方とも１μの膜が好適であった。好適
さが落ち、より低い程度で有効であったのは５０，１０
０μランダムメッシュポリカーボネート膜および５，１
０μトラックーエッチ化ポリエステル膜である。また、
０．４５μニトロセルロースも成功理に使用できたが
（０．４５μナイロンも）、流速、それ故洗浄効率が減
少した。
よび１１μのポリエステル織り膜および１μのナイロン
織り膜である。両方とも１μの膜が好適であった。好適
さが落ち、より低い程度で有効であったのは５０，１０
０μランダムメッシュポリカーボネート膜および５，１
０μトラックーエッチ化ポリエステル膜である。また、
０．４５μニトロセルロースも成功理に使用できたが
（０．４５μナイロンも）、流速、それ故洗浄効率が減
少した。
【図１】図１は、固形表面上のＤＮＡのメッシュ中に捕
捉されたヤギ血液核を示している電子顕微鏡写真であ
る。
捉されたヤギ血液核を示している電子顕微鏡写真であ
る。
【図２】図２は、細胞核捕捉の手段として本方法で使用
された装置の好適な形の断面図である。
された装置の好適な形の断面図である。
【図３】図３は、細胞核捕捉の手段として本方法で使用
された装置の好適な形の正面図である。
された装置の好適な形の正面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーガレット・パトリシア・レイバック イギリス国ウェールズ シーエフ７・９ジ ェイティー，ミッド・グラモーガン，ポン ティクラン，タリガーン，フェアビュー・ ハウス（番地なし) (72)発明者 マイケル・ケネス・ケンリック イギリス国ウェールズ シーエフ４・３ピ ーキュー，カーディフ，ヒース，アレンズ バンク・ロード 119 (72)発明者 デーヴィッド・アラン・パリー イギリス国ロンドン ダブリュー５，アー リング，ノースフィールズ・アベニュー 304 (72)発明者 アンドリュー・ルイギ・バーテラ イギリス国ウェールズ エヌピー９・５エ ヌアール，グウェント，ニューポート, ザ・ターンスタイルズ 23 (72)発明者 ジョン・ジョージ・アンソン イギリス国シーエフ４・０イーディー，カ ーディフ，ホワイトチャーチ，アルフレー ダ・ロード 12 (72)発明者 ニコラ・メアリー・ウィリアムソン イギリス国ウェルズ シーエフ４・７エイ チエス，カーディフ，ホワイトチャーチ, メリングリフィスズ・ドライブ 14
Claims (15)
- 【請求項１】 ａ）細胞核の大部分を無傷で残しなが
ら、核膜の一部と一緒に細胞質膜を選択的に溶解するよ
うに全細胞を含む液体を処理し、 ｂ）処理液を表面にのせ、それによりその表面に溶解核
からのＤＮＡのメッシュが形成され無傷の細胞核が捕捉
される、 ｃ）細胞の他の成分から捕捉された細胞核を分離するた
めに表面上のＤＮＡメッシュを洗浄することからなる細
胞の成分の分離法。 - 【請求項２】 工程ａ）で処理される液体が哺乳類血液
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 表面がＤＮＡを結合できる物質からなる
請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 表面がポリエステル、ポリアミド、ポリ
カーボネート、またはセルロースである請求項１から３
のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項５】 表面が透過性膜の形である請求項１から
４のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項６】 工程ｂ）が処理液を透過性膜を通過させ
ることにより実施され、それによりその上にＤＮＡのメ
ッシュが形成され、そこで無傷の細胞核を捕捉する請求
項５に記載の方法。 - 【請求項７】 工程ｃ）が洗浄液を透過性膜を通過させ
ることにより実施される請求項５または６に記載の方
法。 - 【請求項８】 ＤＮＡメッシュにより捕捉された細胞核
が溶解され、それにより暴露された核酸がその場所で処
理または反応される請求項１から７のいずれかの項に記
載の方法。 - 【請求項９】 表面上のＤＮＡメッシュからの核酸の放
出にＤＮアーゼ酵素（ＤＮＡｓｅ）が使用される請求項
１から７のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項１０】 後方端が開放されており、その先端ま
たは先端に隣接した所に管全体に渡って拡がっている膜
（前記膜はその上にＤＮＡのメッシュが形成される表面
を提供する）を持つ管からなる請求項１から７のいずれ
かの項に記載の方法に使用する装置。 - 【請求項１１】 管が透明である請求項１０に記載の装
置。 - 【請求項１２】 管がポリカーボネート材から作製され
ている請求項１０または１１に記載の装置。 - 【請求項１３】 管が円錐形であり、前記先端に向かっ
て直径が減少している請求項１０から１２のいずれかの
項に記載の装置。 - 【請求項１４】 管の後方端部分の外部に軸に沿って堅
い肋骨状物が形成されている請求項１０から１３のいず
れかの項に記載の装置。 - 【請求項１５】 管がその末端の間に円周状に拡がる弱
体化のための周辺線を持ち、前記弱体化のための線に沿
って破壊できるような壊れ易いプラスチック材料から管
が作製されている請求項１０から１４のいずれかの項に
記載の装置。
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