CN106660043B - 用于细胞核制备的装置及方法 - Google Patents

用于细胞核制备的装置及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106660043B
CN106660043B CN201580035640.9A CN201580035640A CN106660043B CN 106660043 B CN106660043 B CN 106660043B CN 201580035640 A CN201580035640 A CN 201580035640A CN 106660043 B CN106660043 B CN 106660043B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solid support
plunger
cell sample
nuclei
container
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580035640.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106660043A (zh
Inventor
M.K.肯尼克
G.塞莫尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Original Assignee
Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd filed Critical Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Publication of CN106660043A publication Critical patent/CN106660043A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106660043B publication Critical patent/CN106660043B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/041—Connecting closures to device or container
    • B01L2300/044—Connecting closures to device or container pierceable, e.g. films, membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及核酸收集和储存的领域，并且具体涉及核的收集和长期储存。本发明提供了一种装置和方法，其可用于在周围温度下捕获和储存核，允许通过以清洗缓冲液的被动清洗来随后隔离核酸。本发明还提供了一种套件，其包括适合于执行本发明的方法的本发明的装置。

Description

用于细胞核制备的装置及方法
技术领域
本发明涉及核酸收集和储存的领域，并且具体涉及核的收集和长期储存。本发明提供了一种装置和方法，其可用于在周围温度下捕获和储存核，允许通过以清洗缓冲液的被动清洗来随后隔离核酸。本发明在核酸的长期储存和容易处理中得到应用，并且在基因分型、诊断和取证中为特别有用的。
背景技术
将血液从资源有限的区域运输的挑战是公知的，并且促进允许血样的干燥和邮寄的纸基介质的开发。这被广泛采用，包括世界卫生组织，提供了HIV和其它人类病原体和甚至感染鸟类、动物和植物的那些的流行病调查。核酸在滤纸或化学改性的基质上的长期储存、运输和归档是用于在以在基因分析如聚合酶链反应中使用的形式抽取和隔离DNA或RNA之前保存基因材料的公知技术。
EP1563091(Smith等人，Whatman)涉及用于储存来自样本如细胞或细胞溶解产物的核酸的方法。核酸在延长的时间段内，在室温和室内湿度下隔离和储存在多种过滤器和其它类型的固体支承物或固相介质上。此外，该文献描述了用于将含核酸的样本储存在管、柱或多孔板中的宽范围的固体支承基质上的方法。
WO9003959(Burgoyne)描述了用于储存DNA，包括血液DNA的基于纤维素的固体支承物，其包括具有防止并入到基质中或吸收在基质上的DNA的退化的化合物或成分的固体基质。该文献还公开了用于使用固体介质储存DNA以及DNA的回收或原地使用的方法。
US5705345(Lundin等人)描述了核酸制备的方法，由此包含细胞的样本溶解来释放核酸，并且样本以环糊精处理来中和提取物。该方法的优点在于，其消除了除去溶解试剂所需的分离步骤的需要。
GB2346370(Cambridge Molecular Technologies有限公司)公开了方法，其涉及将包含核酸的细胞样本施加于过滤器、溶解细胞，接着将核酸固持在过滤器上同时除去污染物。
WO9618731(Deggerdal)描述了隔离核酸的方法，由此样本粘合于固体支承物，并且样本与清洁剂接触，并且执行后续步骤来隔离核酸。
WO0053807(Smith)公开了用于可洗脱和分析的包含基因材料的样本的储存和溶解的介质。介质涂覆有溶解试剂，并且可选具有弱碱、螯合剂、表面活性剂或尿酸。
Nuclitip™(GE Healthcare；US5447864中所述，Kenrick等人)是一定数量的已知核捕获装置中的一种，并且由处理达到10ml的新鲜血液的移液管的末梢的微丝织物构成。血液经历受控的溶解；细胞膜溶解，使大部分核膜完好。平面的处理的膜位于Nuclitip移液管末梢的外部上，完全覆盖末梢的孔口，使得样本在进入到末梢中之前过滤，并且存在于样本中的任何DNA和核粘合于过滤器。移液管末梢接着以磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗来除去任何污染物。US5447864描述了使用nuclitip方法分离细胞的细胞组分的方法，以及在-20℃或更低下在膜上储存核达较长时段并且如果在4℃下保持，则储存达短时段的可能性。该文献并未公开或提出细胞核在周围温度下的长期储存。此外，该文献提出了包括使用清洁剂来溶解核膜的标准核酸提取技术的使用。
生物样本的常温储存看作是低温下储存的更好的备选方案。然而，常温储存并未广泛替代目前生物样本库中如此典型的冷链运输和冷冻器储存的使用。GE Healthcare的FTA™和903™纸介质的应用限于几十或几百微升的血液的储存，其典型地仅提供分布在纤维素的大区之上的达到1μg的DNA。
一定数量的国际前瞻性研究招募了几千参与者以图调查出生活环境、生活方式和遗传学与疾病的发作之间的关联。例如，欧洲癌症与营养前瞻性调查和加拿大伙伴明日计划。研究依靠在开始对参与者的深入分析，以及未来的某时诊断出显著威胁生命的疾病之后的随后的DNA分析。在进行大型群体研究时，需要4ml或更多的适度血量，以允许使用当代和进化的技术的样本的基因分析。理想的样本应当包含将允许其它重要分子的附加调查的材料，例如，长链非编码RNA。
此类大型前瞻性基因筛查研究需要比使用FTA™和903™纸介质可能的更多的每名患者的DNA。典型地，前瞻性基因筛查研究需要在10-200μg基因组DNA的区域中。许多团体(group)勉强保持冷冻的Vacutainer™管。
共同未决的专利申请号GB1313146.1教导了用于将细胞核在周围温度下储存在可渗透膜上达延长时段内的方法。该方法涉及选择性地溶解存在于细胞样本中的细胞质膜和小比例的核膜来使大比例的细胞核完好，接着将细胞样本收集在可渗透的膜上，以及接着清洗可渗透的膜，以及在周围温度下将完好的核储存在可渗透的膜上。可渗透的膜还可在储存之前浸没在有机溶剂，如乙醇或异丙醇中。该方法叙述为可应用于处理具有大于10ml的体积的细胞样本和达到20年的储存时段。在实例中，2ml的人全血(收集在EDTA管中)加至溶解缓冲液，并且核使用多个Nuclitips™捕获，在周围温度下清洗并且储存达60天，其中核酸质量在储存时段内被保持。
尽管实现较大量的核酸的周围温度储存，但专利申请号GB1313146.1中的利用多个Nuclitips™的例举方法为相对麻烦的。因此，所需的是针对目前和未来的分析研究在周围温度下储存大体积的细胞核的改进手段。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种装置(1)，其包括：
(i)容器(2)，其具有开口的上端(3)和密封的下端(4)，以及由室壁(6)限定在其间的室(5)；
(iii)插棒(7)，其包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本体(8)，其中所述壁(9)具有对应于所述室(5)的形状和小于所述室(5)的直径，密封所述插棒本体(8)的顶端(11a)的隔膜盖(10)，以及跨越所述插棒本体(8)的直径(d)的固体支承物(12)。
在本发明的装置(1)的一个实施例中，所述容器(2)包括中空管(13)和可除去的底座(14)。
在一个实施例中，所述室容纳溶解试剂。用于在本发明的背景下使用的特定溶解试剂是红细胞溶解缓冲液，其非限制性实例是包含非离子表面活性剂的缓冲液，如，蔗糖-聚氧乙烯醚类缓冲液，即，包含蔗糖和Triton X-100(聚氧乙烯辛基苯酚)的缓冲液。此类红细胞溶解缓冲液是在本发明的装置用于下文中所述的本发明的方法中的情况下所需的，其中引入到容器中的细胞样本是全血样本。溶解试剂可为水，其中本发明的装置用于本发明的方法中，其中细胞样本为唾液样本。在一个实施例中，溶解试剂为阴离子表面活性剂，其非限制性实例包括十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂醇硫酸酯铵盐、月桂醇醚硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠和硬脂酸钠。
在本发明的装置(1)的一个实施例中，所述室(5)还包含收集缓冲液。
在装置(1)的一个实施例中，所述固体支承物(12)为可渗透的膜，其例如选自由聚酯膜、聚酰胺膜、聚碳酸酯膜和纤维素膜构成的组。在特定实施例中，所述固体支承物为聚酯膜。
在本发明的装置(1)的一个实施例中，所述固体支承物(12)位于所述插棒本体(8)的底端(11b)处。在装置(1)的特定实施例中，所述插棒本体(8)的所述底端(11b)密封所述容器(2)的上端(3)，并且其中所述室(5)包括真空。
根据本发明的第二方面，提供了一种方法，其包括：
(i)将细胞样本(15)引入到容器(2)中，其中所述容器(2)具有开口的上端(3)和密封的下端(4)，以及由室壁(6)限定在其间的室(5)，其中所述容器(2)容纳收集缓冲液，其包括溶解试剂，该溶解试剂在足以选择性地溶解存在于细胞样本(15)中的细胞质膜和小比例的核膜并且使大比例的细胞核完好的浓度下；
(ii)将插棒(7)插入到所述容器(2)的上端(3)中，其中所述插棒(7)包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本体(8)，其中所述壁(9)具有对应于所述室(5)的形状和小于所述室(5)的直径，密封所述插棒本体(8)的顶端(11a)的隔膜盖(10)，以及跨越所述插棒本体(8)的直径(d)的固体支承物(12)；
(iii)朝所述容器(2)的所述下端(4)压制所述插棒(7)，以使所述固体支承物(12)穿过所述细胞样本(15)，并且细胞核和其它细胞组分粘合于固体支承物，留下滤液；以及
(iv)除去所述滤液。
在本发明的方法的各种实施例中，所述溶解试剂和所述固体支承物如下文中关于本发明的装置的各种实施例限定。
在该方法的一个实施例中，所述细胞样本(15)具有大于1ml，特别是大于5ml并且更特别是大于10ml的体积。
在该方法的一个实施例中，所述完好的细胞核包含核酸。所述核酸具体包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
在一个实施例中，该方法还包括在周围温度下将完好的核储存在固体支承物(12)上的步骤(v)。
在一个实施例中，该方法包括在所述清洗步骤(iv)之后和所述储存步骤(v)之前将固体支承物(12)浸没在有机溶剂中的附加步骤。有机溶剂可为酒精。适合的酒精的非限制性实例包括乙醇和异丙醇。
在该方法的一个实施例中，所述固体支承物(12)在所述储存步骤(v)之前被空气干燥。
在一个实施例中，该方法包括从完好的核回收核酸的附加步骤(vi)。在特定实施例中，所述回收步骤包括溶解固体支承物(12)上的完好的核。在另一个实施例中，所述回收步骤包括在完好的核的溶解之后的离心分离(具体是使用微型离心机)。在另一个实施例中，所述回收步骤前接被动清洗所述固体支承物(12)。
在一个实施例中，所述细胞样本(15)直接从受验者引入到所述容器(2)中。
根据本发明的第三方面，提供了一种套件，其包括本发明的装置和用于执行本发明的方法的指令。下文中所述的本发明的方法和装置的所有实施例适用于本发明的套件。
附图说明
图1示出了样本可如何使用移液管(末梢由"p"指出)加至本发明的装置(1)的容器(2)的室(5)。
图2示出了本发明的装置(1)和插棒(7)插入到图1的容器(2)中。
图3示出了图2的装置(1)，其中插棒(7)向下推入容器(2)的室(5)中。
图4示出了来自图2和3的装置(1)，其中容器(2)的可除去的底座(14)被除去，容许了接近跨越插棒本体(8)的直径(d)的固体支承物(12)。
图5示出了本发明的装置(1)，其中插棒(7)插入到容器(2)中，并且真空在容器(2)的室(5)内产生(由箭头指出)。
图6示出了图5的装置(1)在真空在容器(2)的室(5)中产生之后收集细胞样本(15)的使用。
图7示出了图5和6的装置，其中插棒(7)向下推入容器(2)中，以使固体支承物(12)穿过收集的细胞样本中的一些(15b)，并且在进一步推动时，将穿过其余的细胞样本(15a)。
具体实施方式
为了更清楚且简明地描述和指出要求权利的本发明的主题，定义在下文中的描述中提供用于遍及本说明书和权利要求使用的特定用语。本文中的特定用语的任何例举应当看作是非限制性实例。
用语"容器"是指适合于收集细胞样本的任何容器。适合的容器由塑料制成，并且是大致圆柱形的。出于该目的的适合塑料的非限制性实例包括聚丙烯和聚碳酸酯。容器的室具有在2到10ml的范围中，在一个实施例中在4到10ml的范围中，并且在另一个实施例中在4到8ml的范围中的容积。在某些实施例中，容器包括真空室。容器可包括连接于可除去的不透液体的底座的中空管。
在一个实施例中，本发明的装置可按类似于用于采血的已知Vacutainer™管的方式向最终使用者提供已经存在于室中的真空。在该实施例中，真空使用本领域技术人员公知的方法在制造过程期间产生。随着时间的过去，此类装置中的真空释放，故在另一个实施例中，可提供本发明的装置，其中最终使用者可在室中产生真空。在该后一实施例中，还可能在不在室中产生真空的情况下制造装置，以使最终使用者产生真空，例如仅在使用装置之前。用于最终使用者产生真空的一种方式可在插棒处于降低位置的情况下开始，并且接着在向上拉插棒的同时闭合装置上的任何端口。一旦产生真空，则将需要保持直至装置的使用并且包括装置的使用。保持真空的方法包括简单地保持插棒向上。作为备选，设想的是，装置包括固持机构，以一旦产生真空则保持插棒向上，但这可容易中断，以允许装置用于收集细胞样本。适合的固持机构的非限制性实例包括在本领域技术人员的知识内的类型的销、套环和弹簧机构。
用语"密封的"本文中意思是不透液体的，但不一定是永久地密封的。在一些实施例中，装置充分地密封来保持室中的真空，例如，以一个或更多个密封环，如，置于室壁与插棒之间的空间中的O形环。
用语"插棒"是指本发明的装置的构件，其配合到容器中并且包括固体支承物，该固体支承物在下端处跨越整个内径，以使固体支承物在插棒压下时穿过容器中的细胞样本。插棒本体的壁理想地具有略小于容器的室的直径的直径。
"隔膜盖"可理解为并入可刺穿的隔膜的任何盖(例如，由硅橡胶制成)。隔膜盖为插棒的集成部分，并且用于保持装置内的任何真空，以及容许样本或滤液在需要的情况下除去。此外，隔膜盖容许使用装置用于以类似于Vacutainer™管的方式直接从受验者收集细胞样本，即，其中蝶形针具有刺破受验者的静脉的一端处的针和另一端处的管座，包括室中的真空的本发明的装置可插入到该管座中，以便收集细胞样本。
如本文中使用的用语"固体支承物"包括但不限于基于纤维素的产品、纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维、聚酯、聚酰胺和聚碳酸酯或它们的任何组合。本发明的固体支承物可为多孔的。
用语"溶解试剂"是指可用于溶解细胞膜并且选择性地溶解细胞样本中的细胞的核膜的任何试剂。用语"溶解"在本文中用于描述使结构(如，细胞或亚细胞膜(包括核膜))破裂、变性或刺破的过程。
如本文中使用的用语"收集缓冲液"是指适合于收集细胞样本用于随后处理核和/或核酸的任何缓冲液。适合的收集缓冲液的非限制性实例包括柠檬酸盐、肝素、酸柠檬酸、右旋糖和乙二胺四乙酸(EDTA)。在特定实施例中，收集缓冲液为EDTA。
在本发明的装置的一个实施例中，室容纳溶解缓冲液，但不包含收集缓冲液。该实施例特别适合于使用本发明的装置来直接从受验者收集细胞样本。
在本发明的上下文中，"受验者"为包含核的任何适合的真核生物，如，人类、动物、植物、鸟类、昆虫和鱼。
在用于将细胞核收集到固体支承物上的已知方法中，细胞样本在单独的步骤中收集到采血管中，并且接着储存在制冷温度下直到处理。通常，此类冷冻的样本从收集地点运输至位于别处的处理地点。在该背景下，需要具有存在的收集缓冲液来避免样本的退化，例如，全血样本的凝结，这将阻碍随后的处理。在本发明的方法的一个实施例中，样本直接从受验者在原地收集，并且收集到装置中。就此而言，不存在对待存在的收集缓冲液的要求。新鲜细胞样本立即收集到溶解试剂中，故细胞样本的任何退化(例如，血样的凝结)没有时间产生任何影响，并且因此不需要借助于收集缓冲液来抑制。细胞样本可在体温下收集到装置的室中到溶解缓冲液中，并且相比于其中低温样本将花费较久来开始溶解的已知方法，相当比例的血细胞将立刻溶解。以该方式，清楚地相比于其中单独地收集细胞样本的已知方法，收集和处理完全新鲜的细胞样本。根据该实施例收集的细胞样本不包括收集缓冲液，并且因此包含较少化学杂质，继而意味着细胞样本中存在可干扰其成功处理的较少杂质，以及为完全新鲜的。
如本文中使用的，用语"细胞样本"在本文中用于表示包含细胞材料的流体样本。细胞材料可源自如上文中限定的任何适合的受验者。例如，细胞材料可为血液、唾液、尿液、血浆。
如本文中使用的"核酸"是指所有形式的RNA(例如，mRNA, InRNA, miRNA等)和DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA)，以及重组的RNA和DNA分子或使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物，或它们的混合物。核酸分子可为单链的或双链的。在一个实施例中，用语核酸具体是指基因组核酸。
本发明中的用语"其它细胞组分"是指在使用溶解试剂溶解之后的除存在于细胞样本中的细胞核之外的其它固体细胞组分。除其它已知组分以外，这些细胞组分将包括破坏的细胞膜、其它细胞器、来自血样的血红蛋白以及蛋白质如组蛋白。
用语"滤液"是指在本发明的方法中在固相穿过细胞样本之后留下的流体。在本发明的方法中，该滤液将为在固相穿过细胞样本之后并未变得粘合于固相的细胞样本的任何组分。
如本文中使用的，词语"储存"用于描述将核酸保持或保存在稳定状态中的过程。
如本文中使用的用语"有机溶剂"是指适合于在细胞核储存在固体支承物上时使用的任何烃基溶剂。
如本文中使用的，用语"周围温度"意思是在10℃到30℃，优选15℃到26℃，更优选18℃到23℃的范围中的温度。
用语"空气干燥"是指在不施加附加的热或压力的情况下允许溶剂在周围条件下从固体支承物蒸发的过程。
用语"回收"是指大体上在储存时段之后从固体支承物除去核酸的步骤。在该步骤中，粘合于固体支承物的任何细胞核被溶解，例如，由K蛋白酶消化或本领域技术人员已知的其它手段，并且接着从固体支承物除去从细胞核释放的核酸(例如，使用离心分离)。
用语"被动清洗"意思是将固体支承物浸泡在清洗缓冲液中，而不采用任何其它主动步骤如振动。被动清洗可执行为从固体支承物回收核酸的部分，并且可在储存之前或之后执行。在一个实施例中，被动清洗在储存之后和在粘合固体支承物的细胞核溶解来释放核酸之后执行。释放的核酸具有高分子量，并且粘性高，因此保持结实地附接于固体支承物。因此，被动清洗作用成从固体支承物释放其它细胞组分，同时使释放的核酸仍粘合。清洗缓冲液通过倾析或通过移液在浸泡之后连同其中的其它细胞组分除去。用语"清洗缓冲液"是指适合于从固体支承物除去其它细胞组分的任何缓冲溶液。适合的清洗缓冲液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)和TE-1(TE-1为本领域技术人员已知的、典型地包括10mM TRIS和1mM EDTA的10倍稀释的TE缓冲液)。可执行被动清洗的一个或更多个步骤。
用语"离心分离"在本文中是指使用离心力来从固体支承物除去选择的组分。当具有细胞核的固体支承物经受短的离心分离自旋时，这用于除去粘合于固体支承物的任何流体中的大多数，并且可用作本发明的方法的所述除去步骤的部分。离心分离还可用作在储存、溶解细胞核和被动清洗之后从固体支承物回收核酸的部分。典型地，微型离心机足以执行用于本发明的离心分离。
用语"套件"是指收集一起提供的组分和试剂以便执行本发明的方法。
图1示出了适合于本发明的装置(1)的容器(2)，其具有开口的上端(3)和密封的下端(4)，其中室(5)由室壁(6)限定在其间。所示容器包括中空管(13)和可除去的底座(14)。可除去的底座(14)形成围绕中空管(13)的不透液体的密封，以便产生适合于细胞样本在容器(2)中的储存和处理的室(5)。细胞样本可单独地收集在采血管(例如，EDTA管)中，并且样本接着使用移液管(图1中所示的移液管末梢"p")加至容器(2)。
图2示出了与插棒(7)相关联来形成本发明的装置(1)的图1的容器(2)。室(2)的构件如上文针对图1所述。插棒(7)包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本体(8)，其中这些壁(9)构造成以使插棒本体(8)与容器(2)的室(5)相容地配合，并且可向下推入室(5)中，而不施加太大的力。插棒本体(8)的直径(d)因此应当仅小于室(5)的直径。在顶端(11a)处，插棒(7)包括隔膜盖(10)。固体支承物(图2中不可见)定位在插棒的底端(11b)处。
图3示出了图2的装置(1)，其中插棒(7)推入容器(2)的室(5)中。插棒本体(8)的底端(11b)邻近容器(2)的下端(4)，在使固体支承物(图3中不可见)穿过收集在所述容器(2)中的细胞样本(图3中不可见)之后将所处的位置。该位置还将为用于装置(1)的储存的位置。底座(14)可除去来容易接近粘合于固体支承物的核酸和/或核。图4示出了在底座(14)除去的该状态中的装置(1)。
图5示出了本发明的装置(1)的真空收集实施例。箭头示出了容器(2)的室(5)中的真空的产生。在所示实施例中，容器(2)包括中空管(13)和底座(14)，其中中空管(13)包括将室(5)连接于装置(1)的外部的端口(13a)。端口(13a)如图5中所示用于产生真空(以箭头示出)，并且还如图6中所示用于使细胞样本(15)进入到室(5)中。作为备选，当侧端口未使用时，图2中所示的标准装置(1)可使用，其中当隔膜盖(10)和容器(2)密封时，插棒(7)的拉动产生负压，并且接着插棒(7)升高。
图6为如图5中所示，但在真空在室(5)中产生之后，并且在将细胞样本(15)经由端口(13a)收集到室(5)中的过程中的同一装置(1)。插棒(7)在本发明的方法的该阶段处仍处于升高位置。图7示出了方法的下一个阶段，其中细胞样本(15)被收集，并且插棒(7)向下压入室(5)中，以使固体支承物(12)穿过细胞样本(15)。
本发明利用了已知的能力来从几毫升血液收获细胞核，以用于典型地需要10到200μg基因组DNA的前瞻性基因筛查研究。相比于FTA™纸，核捕获实现了80倍的提高。这是由于仅捕获为高度密集的核染质组的核。很可能的是，亚铁血红素和其它污染物的减轻的负担将向基因组DNA提供更好质量用于下游的处理。
在一个实施例中，本发明的装置为Mini-UniPrep™类型的装置(GE Healthcare)，其设计成能够充分地密封来耐受内部负压，并且允许血样从受验者抽取，如一般利用Vacutainer™采血管(Becton Dickinson)的。本发明的该实施例包括特殊的缓冲液来溶解红细胞，并且允许将白细胞或白细胞核捕获在膜上。另外，本发明的实施例包括可除去的顶部和底座来允许接近捕获的核。
在本发明的方法中，在以血液填充装置并且与红细胞溶解缓冲液倾覆地混合之后，插棒向上和向下移动，以在想起(reminiscent)使用Nuclitip™和移液管来将流体来回泵送横跨膜(US5447864中详述)的过程中将细胞捕获在膜上。一旦这执行，则装置开启，并且除去细胞或核的血液倒至废物，并且由PBS和/或100%乙醇(或备选溶剂)以规定方式替换，以清洗和快速干燥捕集的细胞/核。
如共同未决的专利申请号GB1313146.1中陈述的原理实验的证据显示出干燥的核可在周围温度下保持8周以上，而不影响DNA质量，并且可预计到DNA的质量将在许多年内都很好。在本发明的一个实施例中，液体-FTA缓冲液(具有包括SDS、尿酸、TRIS和EDTA的典型成分的已知缓冲液)可在细胞核收集在固体支承物上之后施加于固体支承物，后接干燥，或者干有机溶剂如乙醇或工业变性酒精或异丙醇或类似物可加入，以将管永久地保持在周围温度下，直到可能在收集之后的几十年，需要样本。生物标本储存在酒精中遍及自然历史博物馆使用，并且是认可的方法。
根据本发明的方法处理的保存的核可在周围温度下运输并且接着放置来长期储存或置于生物样本库中。
当样本将处理时，存在两个模式：
1. 整体制备。执行简单SDS K蛋白酶消化和除去污染物来产生高产量的优异质量的基因组DNA用于所有下游分子生物应用。这很可能需要装置短暂离心分离来回收很大粘性的高分子量的基因组DNA。
2. 单个样本的子部分。倒置管(干的或包含溶剂)，拧开管的底座来露出核/细胞捕集在其中的膜的外顶面，并且使用小铲或研磨棒，扭转或刮擦来人工地或通过自动系统除去附连的细胞或核的子部分。所述除去的样本可进一步处理或分配至生物样本库的客户，同时大量原料可返回储存(一旦端盖放回原位并且管倒置在储存位置)。猜想达到200个样本(假定每次采样100μg和0.5μg)可从一个装置使用该方法获得。
附图中所述和所示的装置可与自动系统对接，以提供至常温储存库中的成百上千的样本的无人监管的存取。装置将具有与理想储存密度和根据关键意见领袖的需要的所需产量相称的外径。相比于运营基于低温或液氮的生物样本库所需的大量金钱，该途径是备选方法，以该方式，可在最小花费下使用和维护基因储存库。作为维护成本的实例，当代的生物样本库可预计每年花费几百万英镑来扩展它们的运转，花费电力来用于低温储存和维护，以及具有氮的超低温杜瓦瓶。该解决方案提供了剥离这些设施的运营成本中的一些同时保持储存的采样材料的完整性的机会。关于使用FTA™的限制利用本发明可行地解决，这是用于血液和生物样本的储存手段的可行解决方案。
本文中提供的设计和描述允许了在资源有限的区域中现场收集和预先处理血液，以及在周围温度下的运输和生物样本库中的管理。

Claims (24)

1.一种方法，其包括：
(i)将细胞样本(15)引入到容器(2)中，其中所述容器(2)具有开口的上端(3)和密封的下端(4)，以及由室壁(6)限定在其间的室(5)，其中所述容器(2)容纳收集缓冲液，其包括溶解试剂，所述溶解试剂在足以选择性地溶解存在于所述细胞样本(15)中的细胞质膜和小比例的核膜并且使大比例的细胞核完好的浓度下；
(ii)将插棒(7)插入到所述容器(2)的所述上端(3)中，其中所述插棒(7)包括由插棒壁(9)限定的中空插棒本体(8)，其中所述插棒壁(9)具有对应于所述室(5)的形状和小于所述室(5)的直径，密封所述插棒本体(8)的顶端(11a)的隔膜盖(10)，以及跨越所述插棒本体(8)的直径(d)的固体支承物(12)；
(iii)朝所述容器(2)的所述下端(4)压制所述插棒(7)，以使所述固体支承物(12)穿过所述细胞样本(15)，并且所述细胞核和其它细胞组分粘合于所述固体支承物，留下滤液；以及
(iv)除去所述滤液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解试剂为红细胞溶解试剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述红细胞溶解试剂为蔗糖-聚氧乙烯醚类缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解试剂为水。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解试剂为阴离子表面活性剂。
6.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞样本(15)具有大于1ml的体积。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞样本(15)具有大于5ml的体积。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞样本(15)具有大于10ml的体积。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述完好的细胞核包含核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在周围温度下将所述完好的核储存在所述固体支承物(12)上的步骤(v)。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括在除去步骤(iv)之后和储存步骤(v)之前将所述固体支承物(12)浸没在有机溶剂中的附加步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为酒精。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为异丙醇。
15.根据权利要求11至权利要求14中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体支承物(12)在储存步骤(v)之前被空气干燥。
16.根据权利要求11至权利要求14中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体支承物(12)为可渗透的膜。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述固体支承物(12)为选自由聚酯膜、聚酰胺膜、聚碳酸酯膜和纤维素膜构成的组的可渗透的膜。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述固体支承物(12)为聚酯膜。
19.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括从所述完好的核回收所述核酸的附加步骤(vi)。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，回收步骤(vi)包括溶解所述固体支承物(12)上的所述完好的核。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，回收步骤(vi)包括离心分离。
22.根据权利要求19至权利要求21中任一项所述的方法，其特征在于，回收步骤前接被动清洗所述固体支承物(12)。
23.根据权利要求1-5,9-14,19-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞样本(15)直接从受验者引入到所述容器(2)中。
24.一种套件，其包括用于执行根据权利要求1至权利要求23中任一项所述的方法的指令。
CN201580035640.9A 2014-06-30 2015-06-17 用于细胞核制备的装置及方法 Active CN106660043B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1411615.6 2014-06-30
GBGB1411615.6A GB201411615D0 (en) 2014-06-30 2014-06-30 Device and method for cell nuclei preparation
PCT/EP2015/063574 WO2016000960A1 (en) 2014-06-30 2015-06-17 Device and method for cell nuclei preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106660043A CN106660043A (zh) 2017-05-10
CN106660043B true CN106660043B (zh) 2022-03-15

Family

ID=51410365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580035640.9A Active CN106660043B (zh) 2014-06-30 2015-06-17 用于细胞核制备的装置及方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10370649B2 (zh)
EP (1) EP3160643B1 (zh)
CN (1) CN106660043B (zh)
GB (1) GB201411615D0 (zh)
WO (1) WO2016000960A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201716135D0 (en) * 2017-10-03 2017-11-15 Ge Healthcare Uk Ltd Improvements in the storage of nucleic acids
CN110272807B (zh) * 2018-03-13 2020-11-24 武汉医蒂生物科技有限公司 一种核酸提取纯化正压装置
WO2023043673A1 (en) * 2021-09-14 2023-03-23 Illumina, Inc. Well assemblies and related methods
CN115433764A (zh) * 2022-08-19 2022-12-06 杭州联川生物技术股份有限公司 一种植物细胞核提取的试剂盒及其应用
CN117106698B (zh) * 2023-10-24 2024-01-26 中国海洋大学三亚海洋研究院 海洋鱼类肝、鳃组织细胞核的提取方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102498069A (zh) * 2009-03-09 2012-06-13 商标专利企业有限公司唯一股东 用于将固体物质溶解于水中的方法和装置
WO2013036819A1 (en) * 2011-09-07 2013-03-14 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Methods of increasing the number of target cells recovered from a fluid sample
CN103370134A (zh) * 2010-12-21 2013-10-23 通用电气医疗集团英国有限公司 过滤装置和方法
WO2014064921A1 (ja) * 2012-10-22 2014-05-01 パナソニック株式会社 フィルターデバイス

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4921618A (en) 1987-07-01 1990-05-01 Basf Corporation Inverted separation and transfer device, and process for using same
US5429803A (en) * 1991-04-18 1995-07-04 Lamina, Inc. Liquid specimen container and attachable testing modules
EP0587951B1 (en) 1992-09-18 1997-12-17 AMERSHAM INTERNATIONAL plc Cell nuclei capture method and device used therefor
US20070284300A1 (en) 2006-06-08 2007-12-13 Bidlingmeyer Brian A Removing material from liquid sample within a sample vessel
US9102911B2 (en) * 2009-05-15 2015-08-11 Biofire Diagnostics, Llc High density self-contained biological analysis
EP2140001A2 (en) * 2007-04-25 2010-01-06 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid amplification
US20120085006A1 (en) * 2010-10-06 2012-04-12 Quoizel, Inc. Lighting fixture comprising integrated tile array
JP5870532B2 (ja) * 2011-08-09 2016-03-01 セイコーエプソン株式会社 物理量検出素子、物理量検出装置および電子機器
EP2695656A1 (de) 2012-08-09 2014-02-12 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren sowie eine Separationsvorrichtung zur Abtrennung eines Filtrats von einer Probenflüssigkeit

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102498069A (zh) * 2009-03-09 2012-06-13 商标专利企业有限公司唯一股东 用于将固体物质溶解于水中的方法和装置
CN103370134A (zh) * 2010-12-21 2013-10-23 通用电气医疗集团英国有限公司 过滤装置和方法
WO2013036819A1 (en) * 2011-09-07 2013-03-14 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Methods of increasing the number of target cells recovered from a fluid sample
WO2014064921A1 (ja) * 2012-10-22 2014-05-01 パナソニック株式会社 フィルターデバイス

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016000960A1 (en) 2016-01-07
US20170121703A1 (en) 2017-05-04
GB201411615D0 (en) 2014-08-13
US10370649B2 (en) 2019-08-06
EP3160643B1 (en) 2019-08-14
EP3160643A1 (en) 2017-05-03
CN106660043A (zh) 2017-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106660043B (zh) 用于细胞核制备的装置及方法
US10287570B2 (en) System and method for collecting a sample of nucleic acid
JP4801630B2 (ja) 液体の微生物分析用のサンプルを調製するための方法およびユニット
JP2022089877A (ja) サンプルの収集、安定化、および保存のためのシステム、方法およびデバイス
US7217513B2 (en) Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample
CN102137719B (zh) 核酸提取装置
KR20180048558A (ko) 생물학적 샘플로부터 바이오분자를 정제하고 테스트하는 디바이스의 구성요소, 디바이스 및 방법
US20140273058A1 (en) Integrated Membrane for Preservation of Biomolecules
US10668417B2 (en) Device having a filter layer and method for extracting nucleic acids from formalin-fixed and paraffin-embedded samples
JP2006083114A (ja) 核酸抽出方法、及び核酸遊離方法
CN104232616A (zh) 福尔马林固定石蜡包埋样本核酸萃取方法
CN116445258A (zh) 一种pcr管及其应用于靶标核酸分子的检测方法
WO2014065758A1 (en) A method of isolating nucleic acids in an aqueous sample using microfluidic device
JP2023138629A (ja) 核の保存方法
US10717022B2 (en) Integrated membrane device
US11891599B2 (en) Recovery of nucleic acids from solid supports
US20210130807A1 (en) Kit, system, and method for nucleic acid extraction from samples
KR102654881B1 (ko) 핵산 분리 장치 및 방법
US20230383281A1 (en) Filtration methods and devices for fast nucleic acid extraction
JP2006025724A (ja) 核酸の分離精製方法
JP2005270034A (ja) 核酸の分離精製方法
JP2005270033A (ja) 核酸の分離精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210326

Address after: England

Applicant after: Global life science solutions UK Limited

Address before: British platinum County

Applicant before: GE HEALTHCARE UK Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant