CN116656668A - 一种水稻叶片核酸的快速纯化及直接基因扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种分子生物学领域的快速纯化水稻核酸并以固体介质保存PCR反应模板的方法，步骤为：(1)将新鲜采集的水稻叶片切割，每块约1cm2大小；(2)以溶液Ⅰ固定染色质，以溶液Ⅱ进一步去除抑制PCR反应的各种杂质；(3)将叶片剪切成1‑2mm2的小块，保存于第三试剂中备用。少量样品的核酸纯化可在2ml指形管完成，但是如果样品量很大，也可以改用底部扎小孔的深孔板分批处理。将装有样品的深孔板依次置于溶液Ⅰ、溶液Ⅱ中作用，然后剪切、保存核酸组织块；最后，挑取组织块加到PCR反应体系，扩增产物电泳后以UVP检测。本发明具有简单、快速、可批量处理多个样本等优点，并且纯化后的核酸保存在组织块中，不易被破坏或污染。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种分子生物学技术领域的方法，具体的说，是将叶肉细胞染色质DNA固定并快速纯化，去除样品中的蛋白质、脂类等抑制PCR反应的成分，纯化后的组织块可直接加入到PCR反应体系扩增。
背景技术
在分子生物学研究中，对目标成分的分离纯化十分重要，是必不可少的。其中，DNA提取常常是深入进行分子生物学研究的前提。通常需要根据不同目的，保持其结构的相对完整性，并尽量排除其它大分子和小分子的污染和干扰。PCR(Polymerase ChainReaction)扩增技术是分子生物研究和转基因成分检测工作中的常用技术，对模板DNA的质量和数量要求较低,常规的DNA制备方法均能满足PCR基因扩增要求,但操作繁琐。随着基因编辑等新技术的普遍应用，人们修改遗传信息的方法越来越高效，生物学研究对DNA提取工作的速度和通量提出了更高的要求。另外，PCR扩增检测的灵敏度很高，对DNA污染很敏感。转基因成分检测实验室必须采取措施防止DNA污染，《检测和校准实验室能力认可准则》等文件对预防污染做了严格规定。如果同时处理多个样品，需要有更高效的DNA纯化技术，以克服工作量大，容易发生交叉污染和环境污染等难题。因此，开发简单、快速、抗污染的PCR模板制备方法，是适应分子生物学研究发展和开展转基因检测工作的需要。
传统的核酸提取方法是先用SDS等去垢剂破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验使用。此外，蛋白酶K消化裂解法、直接裂解法、碱变性法、煮沸法、碘化钠法、异硫氰酸胍法等也是近几年发展起来的标本消化处理方法，较为实用且简便有效，亦可满足PCR实验的要求。具体采用哪种方法消化处理标本，需要视PCR实验的目的(是科研还是检测)和环境条件而定。值得注意的是，在同时处理很多样品或需要检测CaMV35S启动子等广泛使用的元件时，很容易发生DNA污染，需要选择合适的DNA提取和纯化方法并谨慎操作。因此，开发简单、高效、低污染的模板制备方法，是PCR技术应用发展方面的重要课题。
植物拥有结实的细胞壁，比动物组织更难处理。另外，植物组织中的多糖及脂、萜等次生代谢产物能干扰DNA的提取，酚类物质会氧化成醌溶解在抽提液中，与蛋白质、DNA结合，从而影响DNA的解链或Taq酶活性。在DNA提取过程中，必须去除这些抑制PCR扩增的成分，并防止发生各种污染。经对现有技术文献的检索发现，Farshad Tamari与CraigS.Hinkley等在《Sample Preparation Techniques for Soil,Plant,and AnimalSamples》(pp 245-263)的第17章“Extraction of DNA from Plant Tissue:Review andProtocols”综述了从植物中提取DNA的各种方法和这些DNA的后续应用，以及一些商业化的DNA提取试剂盒。各有特色的DNA提取方法常与所处理的样品及下游的应用相适应，但是到目前为止，还没有报道涉及直接净化水稻叶片，然后以组织块保存的核酸作为PCR扩增模板的论述。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种快速固定水稻叶片并去除PCR反应抑制成分的方法，将核酸保存于固体介质并直接加入到PCR体系，从而降低了交叉污染的风险，并且其纯化与保存过程具有简单、快速的优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种核酸纯化试剂盒，所述核酸纯化试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂。
所述第一试剂包括5-20ml冰乙酸、10-40ml氯仿和50-80ml无水乙醇，混合而成溶液Ⅰ；
所述第二试剂包括60-100ml甲醇与10-40ml水,混合而成溶液Ⅱ；
所述第三试剂包括50-100ml乙醇与20-40ml水。
本发明所述核酸纯化试剂盒中的试剂以及组分是通过大量实验筛选，付出创造性劳动后获得的。其中，第一试剂具有快速固定核酸并去除一部分杂质的作用，第二、三试剂能进一步清洗叶片中的其它杂质，第三试剂还可以作为核酸及组织块的保存液。
本发明所述第一试剂、第二试剂和第三试剂彼此之间还具有良好的协同配合作用，使得所述试剂盒具有以下优点：
(1)良好的通用性，既可纯化水稻叶片本身的核酸，还可以纯化DNA型核酸病毒与RNA型核酸病毒以及致病菌的核酸。
(2)简化核酸提取纯化方法，将核酸提取纯化步骤由5-10步缩短为3步，且每步时间都相对极短，显著提高了提取效率。
(3)试剂盒本身具有良好的稳定性，同时，其在核酸纯化过程中表现出一致性好，重复性高的优点。
在一些具体的实施方式中，所述的第一试剂的所述冰乙酸体积为5-15ml，优选为10ml；所述氯仿体积为15-35ml，优选为30ml；所述的无水乙醇体积为55-70ml，优选为60ml。
在一些具体的实施方式中，所述的第二试剂的所述甲醇体积为70-95ml，优选为80ml；所述水的体积为15-30ml，优选为20ml。
在一些具体的实施方式中，所述的第三试剂的所述乙醇体积为65-80ml，优选为70ml；所述水的体积为25-35ml，优选为30ml。
本发明还涉及一种使用前述试剂盒纯化核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)取新鲜水稻叶片约1cm2放入2ml指形管中，加入1.5ml溶液Ⅰ，室温放置10-20分钟，倾去溶液Ⅰ；(2)加入溶液Ⅱ，作用10-20分钟；(3)取出叶片，切割成约1-2mm2的小块，放入1.5ml指形管中，加入1.0ml保存液，备用。
本发明还涉及一种多样本快速处理方法，所述方法包括以下步骤：(1)取一块96孔的深孔板，在每个孔的底部打一小孔，直径约1mm，备用；(2)取新鲜水稻叶片，每份约1cm2，依次放入上述深孔板，记录样品名及其所在位置；(3)96孔深孔板放入装有溶液Ⅰ玻璃盒中，样品应完全浸没在液面下，室温放置10-20分钟；取出深孔板，转移到装有溶液Ⅱ玻璃盒中，作用10-20分钟；取出叶片，切割成面积约1-2mm2的小块，放入1.5ml指形管中，加入1.0ml保存液，备用。
由于使用前述试剂盒，本发明所述核酸纯化方法具有通用性强、操作简易、一致性与稳定性好等优点，其中在简化操作步骤和优化纯化结果方面的效果尤为显著，具体表现为：
(1)本发明所述方法在核酸固定、洗涤等步骤相较于常见方法表现出显著的高效率(上述以溶液Ⅰ处理水稻叶片与可以与田间取样相结合，将现取的叶片样品直接放入装有溶液Ⅰ的指形管中固定)。
(2)本发明所述方法的所得样品DNA保存在固体组织块中，有效地防止了交叉污染和环境污染。
(3)本发明所述方法能够以96孔板同时制备多个样本，共享使用第一试剂与第二试剂，实现批处理。
(4)本发明所述方法所得的核酸组织块可直接加入PCR反应体系，进行分子扩增，产物经电泳后以UVP检测。
(5)本发明所述方法进过大量实验验证优化后，整体流畅性极高，反应步骤从“需要加热且裂解时间长”到本发明的“优化配方无需加热及等待反应即混及走”，整个纯化步骤一气呵成，保证了稳定性的同时也进一步的提高了效率，可在半小时内完成。
有益效果
综上所述，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)去除了PCR抑制成分的叶片组织取用方便、容易清洗，是一种新型的模板DNA保存方式。
(2)96孔深孔板可同时处理多个叶片样品，叶片剪切成小块状后保存在乙醇水溶液中，取用方便，且不易被污染。
(3)本发明所述的方法具有抗DNA污染能力强、操作简便、可快速处理多个样品等特点，适用于大批样品的快速筛选。
附图说明
图1为实施例2得到的PCR产物琼脂糖凝胶电泳与UVP凝胶成像图；
图2为实施例3得到的组织块中核酸的PCR扩增产物的电泳检测结果图；
图3为实施例4得到的组织块中白叶枯病核酸的PCR扩增产物的电泳检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1：水稻叶片核酸纯化试剂盒
本实施例提供一种简单核酸纯化试剂盒，所述试剂盒由第一试剂、第二试剂与第三试剂组成，其中
第一试剂的组分如下所示：冰乙酸10ml、氯仿20ml和无水乙醇50ml，混匀配制溶液Ⅰ；
第二试剂的组分如下所示：甲醇75ml与水25ml，混匀配制溶液Ⅱ；
第三试剂的组分如下所示：乙醇60ml与水30ml，配制保存液；
实施例2：水稻叶片纯化与核酸扩增
使用实施例1所提供的核酸纯化试剂盒纯化水稻叶片，所述方法包括以下步骤：
1、水稻叶片样品的制备与纯化
(1)取新鲜水稻叶片约1cm2放入2ml指形管中，加入1.5ml溶液Ⅰ，室温放置15分钟，倾去溶液Ⅰ。
(2)加入溶液Ⅱ，作用10分钟，取出叶片，切割成约1-2mm2的小块。
(3)放入1.5ml指形管中，加入1.0ml第三试剂，备用。
2、组织块中核酸的PCR扩增与检测。
(1)PCR反应体系
(2)PCR反应。程序为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35次循环；72℃延伸7分钟。
(3)琼脂糖凝胶制备。按20g/L的质量浓度称量琼脂糖加入0.5×TBE缓冲液中，加热溶解，配置成琼脂糖溶液，稍适溶解后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入0.5×TBE缓冲液中，垂直向上拔去梳板。把凝胶托盘移入电泳槽，加入缓冲液，使凝胶全部浸没。
(4)PCR产物琼脂糖凝胶电泳与UVP凝胶成像。吸取9μL PCR扩增产物，加入1μL 10×上样缓冲液(含1‰gel red)，吹吸混匀后加入凝胶点样孔，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，盖上泳槽上盖，接通电源，在2V/cm～5V/cm条件下电泳检测。电泳结束后，将凝胶放入UVP凝胶成像系统的灯台上，进行观察和拍照，如图1所示。
本发明制备的水稻叶片基因组DNA可以被SPS(水稻内源基因)引物正确PCR扩增，电泳条带的大小约277bp,无其它非特异性条带。
实施例3：在96孔深孔板中并行处理多个水稻叶片样本
使用实施例1所提供的核酸纯化试剂盒，在96孔深孔板中纯化水稻叶片，所述方法包括以下步骤：
1、水稻叶片样品的制备与纯化
(1)取一块96孔的深孔板，在每个孔的底部打一直径约1mm的小孔，取新鲜水稻叶片，剪切成约1cm2片段。
(2)将叶片组织块依次放入上述深孔板中，记录样品名及其所在位置；
(3)将96孔深孔板放入装有溶液Ⅰ玻璃盒中，样品应完全浸没在液面下，室温放置15分钟；取出深孔板，转移到装有溶液Ⅱ玻璃盒中，作用10分钟；取出叶片，切割成面积约1-2mm2的小块，放入1.5ml指形管中，加入1.0ml保存液，备用。
2、组织块中核酸的PCR扩增与检测
使用实施例2步骤2所述的方法扩增组织块中的核酸，注意以HPT引物替换PCR反应体系中的SPS基因引物，电泳后以UVP检测，结果如图2所示。
本发明制备的水稻叶片基因组DNA可以被HPT基因的引物正确PCR扩增，电泳条带的大小约472bp,无其它非特异性条带。
实施例4：纯化检测水稻白叶枯病的核酸
使用实施例1所提供的核酸纯化试剂盒纯化感染了水稻白叶枯病的叶片，所述方法包括以下步骤：
1、水稻白叶枯病叶片样品的制备与纯化，使用实施例2步骤1所述的方法纯化染病的水稻叶片，制备样品。
2、组织块中白叶枯病核酸的PCR扩增与检测，使用实施例2步骤2所述的方法扩增组织块中的核酸，注意以XOO2976引物替换PCR反应体系中的SPS基因引物，电泳后以UVP检测，结果如图3所示。
本发明制备的水稻白叶枯病样品被XOO2976引物正确扩增，PCR产物电泳条带的大小约337bp,无其它非特异性条带。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种去除水稻叶片中的PCR反应抑制成分，将组织块直接加入到PCR反应体系中进行分子扩增的方法，其特征在于，所述核酸纯化试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；
所述第一试剂包括5-20ml冰乙酸、10-40ml氯仿和50-80ml无水乙醇，混合而成溶液Ⅰ；
所述第二试剂包括60-100ml甲醇与10-40ml水,混合而成溶液Ⅱ；
所述第三试剂包括50-100ml乙醇与20-40ml水。
2.根据权利要求1所述的核酸纯化试剂盒，其特征在于，在所述的第一试剂中，所述冰乙酸体积为5-15ml，优选为10ml；所述氯仿体积为15-35ml，优选为30ml；所述的无水乙醇体积为55-70ml，优选为60ml。
在所述的第二试剂中，所述甲醇体积为70-95ml，优选为80ml；所述水的体积为15-30ml，优选为20ml。
在所述的第三试剂中，所述乙醇体积为65-80ml，优选为70ml；所述水的体积为25-35ml，优选为30ml。
3.一种使用权利要求1-2任一项所述试剂盒纯化核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)取新鲜水稻叶片放入2ml指形管中，加入溶液Ⅰ固定核酸，去除杂质；(2)倾去溶液Ⅰ，加入溶液Ⅱ，进一步去除干扰核酸扩增的物质；(3)取出叶片，切割后放入1.5ml指形管中，加入第三试剂，备用。
4.一种使用权利要求1-2任一项所述试剂盒纯化核酸的多样本并行处理方法，所述方法包括以下步骤：(1)取一块96孔的深孔板，在每个孔的底部打一小孔，直径约1mm，备用；(2)取新鲜水稻叶片，切割后依次放入上述深孔板，记录样品名及其所在位置；(3)96孔深孔板放入装有溶液Ⅰ玻璃盒中，样品应完全浸没在液面下，室温放置；取出深孔板，转移到装有溶液Ⅱ玻璃盒中，室温放置；取出叶片，切割后放入1.5ml指形管中，加入第三试剂，备用。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的叶片面积为1cm2，溶液Ⅰ的体积为1.5ml；步骤(2)所述的溶液Ⅱ的体积为1.5ml；步骤(3)所述切割后的叶片组织块面积为1-2mm2的。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)与步骤(2)所述的样品放置时间为10-20分钟，温度为室温；
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)在96孔深孔板每个孔的底部打孔，直径约1mm；步骤(2)与步骤(3)所述的样品放置时间为10-20分钟，温度为室温。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于提取水稻叶片基因组的核酸；转基因成分的核酸；水稻病原体细菌与病毒的核酸。
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