CN112522250B - 一种核酸纯化辅助剂及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种核酸纯化辅助剂及使用方法，所述辅助剂为聚丙烯腈粉，其添加量为核酸提取液的3‑8%，可显著改进核酸纯化方法，其优点为：便于操作，提高得率和纯度，降低污染，同时减少了操作人员与有害苯酚的接触概率。

Description

一种核酸纯化辅助剂及使用方法

技术领域

本发明属于核酸纯化技术领域，具体为一种核酸纯化辅助剂及使用方法。

背景技术

分子生物学实验室中，最常用的核酸纯化方法有两种，一种是使用苯酚抽提，另一种是基于silica的纯化方式。尽管后者被越来越到的实验室采用，但前者因操作简单、成本低廉和纯化质量高，而仍有较广泛的使用和发展空间。

在DNA纯化的步骤中，水相和有机相之间的蛋白层相对不稳定。在吸取水相的过程中，需要特别小心，避免吸到蛋白层。目前人们通常，将移液器枪头的末端剪掉1~2mm，以增大其口径，减少其单位面积上的吸力，进而更平缓地转移上层水相；或者，尽量少吸取一些水相，以牺牲得率为代价换取较高纯度的DNA，二者均不甚方便。

基于上述问题，目前需针对苯酚抽提的操作方法进行改进。

发明内容

（一）解决的技术问题

为解决现有的，苯酚抽提法核酸纯化不方便的问题，本发明提供一种辅助剂，可显著改进核酸纯化方法，其优点为：便于操作，提高得率和纯度，降低污染，同时减少了操作人员与有害苯酚的接触概率。

（二）技术方案

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种核酸纯化辅助剂，所述辅助剂为聚丙烯腈粉。

优选方案为，所述聚丙烯腈粉的添加量为核酸提取液的3-8%。

一种核酸纯化辅助剂的使用方法，包括如下步骤：

S1. 在核酸提取液中，加入终浓度为5%的辅助剂；

S2. 将步骤S1所得溶液按照核酸提取步骤，采用苯酚或苯酚-氯仿抽提，离心后其水相与有机相之间形成一层白色的（辅助剂+蛋白质）界面；

S3. 使用移液器将界面以下的有机相移除，无需更换试管；

S4. 加入氯仿抽提，以去除残余的苯酚；

S5. 吸取上层水相至新的试管或容器，加入乙醇或异丙醇沉淀核酸。

本发明的有益效果是：

1.方便操作，辅助剂的加入，可以加固水相和有机相之间的界面，并使该界面更加清晰，使操作更加简单。

2.因为中间界面更加清晰牢固，相比较传统方法中容易坍塌的界面，可以减少界面中蛋白的污染，并能提高核酸的回收得率。

3.清晰牢固的中间界面，减少了操作者接触有害有机相的机率，更利于健康。

附图说明

图1为聚丙烯腈对苯酚/氯仿抽提过程的辅助影响效果图；

图2为不同方法提取纯化的质粒DNA酶切比较图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：细菌基因组DNA的提纯，步骤如下：

S1. 转移1.5ml过夜培养（LB液体培养基）的E.coli培养物到1.5ml Eppendorf管，最大离心转速离心1分钟，收集细菌细胞，去上清；

S2. 加入600µl裂解液，重悬细胞；所述裂解液（10ml）：包括9.34mL TE 缓冲剂600µL 10% SDS，60µl 蛋白酶K (20mg/mL)，0.5g聚丙烯腈粉；37℃温育1小时；

S3. 加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)，充分混合，室温下离心5分钟，水相跟有机相之间会形成一层白色的（辅助剂+蛋白层）“界面”；

S4. 用移液器，将“界面”以下的有机相移除，无需更换试管；

S5. 为去除样品中残余的苯酚，加入等体积的氯仿（至上述移除有机相的试管），充分混匀后，最大转速离心5分钟；

S6. 转移上层水相至一个新的Eppondorf管，为沉淀纯化的DNA，加入2.5~3倍体积的-20℃的无水乙醇；放入-20℃，30分钟以上；

S7. 最高转速4℃离心15分钟，去上清，并用室温70%的乙醇洗涤DNA沉淀；最高转速离心2分钟，去上清，室温干燥DNA；

S8. 在TE中重悬溶解DNA。

实施例2：植物基因组DNA的提取与纯化，步骤如下：

S1. 取适当新鲜叶片放入1.5mL离心管中，加入500µL的裂解液，所述裂解液(10mL)：包括1mL 10%SDS，0.5mL 0.5M EDTA，1mL 1M Tris盐酸，2mL 1M NaCl，5.5mLddH20，0.5g聚丙烯腈，pH=8.5)；

S2. 加入2粒钢珠,振荡破碎仪上震荡1.5分钟，37℃，水浴30min；水浴过程中上下颠倒混匀；

S3. 加入500µL的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液，充分混匀，12000rpm，离心10min，水相跟有机相之间会形成一层白色的（辅助剂+蛋白层）界面；

S4. 用移液器，小心地将“界面”以下的有机相移除，无需更换试管；

S5. 加入500µL体积氯仿:异戊醇(24:1)溶液，至上述移除有机相的试管，充分混匀，12000rpm，离心10min；

S6. 吸取450µL的上清液至一干净的1.5ml离心管，加入450µL的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30min；12000rpm，离心10min；弃上清，加入600µL的75%乙醇溶液，洗涤两次；12000rpm离心10min；

S7. 弃上清液，用移液器吸尽残留乙醇溶液，室温干燥（约5min），加入100µL的1×TE或ddH2O溶解；采用紫外分光光度计法检测DNA的含量及纯度，1%琼脂糖凝胶检测DNA的质量。

实施例3：细菌质粒DNA的提取与纯化，步骤如下：

S1. 转移1.5mL过夜培养（LB液体培养基）的E.coli培养物到1.5mL离心管，5000rpm离心5分钟，收集细菌细胞；倒掉上清液，加入100µl溶液Ⅰ ，充分悬浮；加入200µl溶液Ⅱ，轻轻地颠倒离心管混匀；加入150µl 冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻地颠倒离心管混匀，置于冰上5min，12000rpm离心10分钟；吸取上清液至一新的1.5mL离心管。

S2. 加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液，涡旋震荡混匀，12000rmp离心10分钟；

S3. 小心移除下层有机相，不用转移至新的离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)溶液，至上述移除有机相的试管，涡旋震荡混匀，12000rmp离心10分钟，

S4. 吸取上清转移至一新的1.5mL离心管，加入两倍体积的无水乙醇沉淀质粒DNA；12000rmp离心20分钟，倒掉上清， 加入800µL的75%乙醇溶液，清洗两次；

S5. 弃上清液，用移液器吸尽残留酒精溶液，室温干燥（约5min），加入20µL的ddH2O溶解质粒DNA，测定质粒DNA的浓度。

所用试剂：

溶液I: 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris（pH 8.0），10mmol/L EDTA。

溶液II: 0.2mol/L NaOH，0.1%SDS （新鲜配置）。

溶液III: 3mol/L 醋酸钾，2mol/L 醋酸，5%聚丙烯腈粉。

图例说明：

图1. 聚丙烯腈对苯酚/氯仿抽提过程的辅助影响效果图

A为传统的方法，不添加聚丙烯腈；

B为本申请方法，添加5%的聚丙烯腈。

I 为样品加入苯酚涡旋混匀后，高速离心5分钟后的情形。加入聚丙烯腈的样品B，形成一个稳定坚固的界面。

II 为去除下层苯酚有机相，重新加入氯仿抽提，离心并吸取上清后的情形。加入聚丙烯腈的样品B，可以吸取更多的水相样品，而界面仍稳定成型。未加聚丙烯腈的样品A，吸取一定水相上清后，界面坍塌，无法继续吸取。

图2. 不同方法提取纯化的质粒DNA酶切比较

1为传统的碱法提取配合苯酚-氯仿纯化获得质粒DNA酶切后的情况

2为传统的碱法提取配合加入辅助剂的苯酚-氯仿纯化获得质粒DNA酶切后的情况

3 为商业试剂盒（基于硅基质膜）提取纯化质粒DNA酶切后的情况

4 为DNA Marker。

实验中的质粒DNA大小为5Kb，含有两个HindIII位点，酶切后产生3.5kb和1.5kb大小的两个片段。说明改进后的方法提取的质粒DNA纯度与传统的方法和商业试剂盒的方法相当，均满足接下来相关分子生物学操作。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种核酸纯化辅助剂的使用方法，其特征在于：所述辅助剂为聚丙烯腈粉，其包括如下步骤：

S1. 在核酸提取液中，加入终浓度为5%的辅助剂；

S2. 将步骤S1所得溶液按照核酸提取步骤，采用苯酚或苯酚-氯仿抽提，离心后其水相与有机相之间形成一层白色的辅助剂+蛋白质界面；

S3. 使用移液器将界面以下的有机相移除，无需更换试管；

S4. 加入氯仿抽提，以去除残余的苯酚；

S5. 吸取上层水相至新的试管或容器，加入乙醇或异丙醇沉淀核酸。