TWI671407B - 微生物核酸萃取方法 - Google Patents

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陳光悅
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Abstract

本發明公開了一種微生物核酸萃取方法，應用於生物分子領域，包含以下步驟：將一生物樣本加入研磨裝置中與洗滌緩衝液混合；對所述生物樣本與所述洗滌緩衝液的混合液進行震盪處理；對所述經震盪處理後的混合液進行離心處理；於所述經離心處理後含微生物樣品的下層沉澱物溶液加入裂解液，然後震盪處理；對所述經震盪處理後裂解液與含微生物樣品的下層沉澱物溶液的混合液進行加熱處理；對所述經加熱處理後的混合液進行離心處理，收取上清液，獲得萃取的核酸樣品。本發明提供的微生物核酸萃取方法，同時結合物理和化學方式，僅需使用單管配合研磨裝置、洗滌緩衝液及裂解液可快速且簡易地萃取核酸，並無需經純化步驟即可進行後續相關核酸試驗。

Description

微生物核酸萃取方法
本發明涉及生物分子領域，尤其涉及微生物核酸的萃取方法。
分子檢測為近年新興的檢測方法，具有早期發現、快速篩檢與準確度高等特性，因此分子檢測已成為檢驗的重要工具之一。所有生物均以核酸為其遺傳物質，不同物種所具有的核酸，於序列組成及數量上，均有其特異性。核酸組成簡單，相對而言，較為容易被偵測。而要對核酸進行檢測，首先需要將生物樣品中的核酸提取出來。
核酸的提取一般包括核酸的釋放及核酸的純化。核酸的釋放為提取核酸首要步驟，核酸的釋放一般包括機械法、物理法和化學法。其中機械法實現核酸的釋放的方法，為將生物樣品用機械性的方法溶出，例如利用研缽、研磨管、研磨罐或者研磨瓶、均質機等，將生物樣品放入內裝研磨珠子的管、罐、瓶中配合研磨專用均質機進行高能震盪將微生物細胞溶出。傳統使用研缽研磨樣品前，研缽需使用化學藥劑處理去除去氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)等干擾因素，且研磨過程需使用液態氮進行，全程需要保持低溫以避免回溫潮解而造成核酸降解。雖均質機搭配研磨管、研磨罐或者研磨瓶的操作方便且快速，但研磨均質機設備與傳統研磨方式相較，設備體積龐大、價格昂貴、取得不便、機動便利性不高等，且在微生物細胞溶出後，如要將此核酸運用於後續實驗，進入後續實驗前還需進行核酸純化步驟。
核酸的純化主要採用兩大類溶劑進行。一種為有機溶劑，另一種為非有機溶劑。有機溶劑純化法，利用苯酚(phenol)及氯仿(Chloroform)將細胞裂解，經過超高速離心使溶液分層，DNA會存於水相層與其他RNA和蛋白等物質分開。用酒精或異丙醇沉澱，將核酸清洗沉澱出，最後以緩衝液回溶。因此方法過程中會使用到大量的有機溶劑，操作過程如未將有機溶劑去除，將會成為後續試驗的抑制劑，且苯酚及氯仿都具有高揮發性，容易影響操作者健康。
非有機溶劑純化法，使用離子或非離子介面活性劑等緩衝液分離核酸，利用離液鹽(chaotropic agent)使核酸結合離心管柱(spin column)中的二氧化矽(silica)，反復進行清洗，減少試劑殘留，最後將結合於二氧化矽的核酸從離心管柱洗脫出。雖然此方法比傳統法快速，但操作上依然是繁鎖的步驟，尤其當有大量的樣品需要進行核酸萃取純化時，人為的誤差影響會隨之放大，產物的品質也變得難以兼顧且有多種昂貴機台需求。試劑的殘留更是會影響後續的DNA擴增。
有鑑於此，有必要提供一種快速、簡易萃取核酸的方法。
一種微生物核酸萃取方法，包括以下步驟：將一生物樣本加入研磨裝置中與洗滌緩衝液混合；對所述生物樣本與所述洗滌緩衝液的混合液進行震盪處理；對所述經震盪處理後的生物樣本與洗滌緩衝液的混合液進行離心處理；於所述經離心處理後的置放於研磨裝置中的下層溶液中加入裂解液，然後對所述裂解液與下層溶液的混合液震盪處理；對所述經震盪處理後裂解液與下層溶液的混合液進行加熱處理；對所述經加熱處理後的混合液進行離心處理，收取上清液，獲得萃取的核酸樣品。
進一步地，所述洗滌緩衝液包含三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline)，所述洗滌緩衝液的濃度範圍為0.05mM-0.5M，所述洗滌緩衝液的pH值範圍為6.5-9.2。
進一步地，所述裂解液包含介面活性劑、酵素、和鹽類中的一種或多種。
進一步地，所述介面活性劑為聚乙二醇單辛基苯基醚(4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)、乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸鈉(Dodecyl sodium sulfate)中的一種或多種，所述介面活性劑的濃度範圍為0.01mM-0.5M。
進一步地，所述酵素為蛋白酶K (proteinase K)，所述酵素的濃度範圍為1mg/ml -50mg/ml。
進一步地，所述鹽類為乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)、三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)中的一種或多種，所述鹽類的濃度範圍為0.05mM-0.5M。
進一步地，所述加熱處理為水浴，加熱的溫度範圍為35-105℃。
進一步地，所述研磨裝置包含研磨管與微粒，所述研磨管為聚丙烯螺旋管或微量離心管，所述微粒為礦物質微粒、陶瓷微粒、玻璃微粒、金屬微粒中的一種或多種。
進一步地，所述生物樣本為含微生物的樣品，具體為痰液、尿液、血液、胸膜腔液、支氣管抽洗液，或者已分離出的微生物樣品。
進一步地，生物樣本與洗滌緩衝液的混合液進行離心處理後分為上層清液與下層溶液，該離心處理後還包括移除該上層清液，以保留該下層溶液的步驟。
本發明提供的微生物核酸萃取方法，僅需使用單管配合研磨裝置、洗滌緩衝液及裂解液可快速且簡易地萃取核酸，並無需經純化步驟即可進行後續相關核酸試驗的核酸萃取改良方法，其避免使用傳統技術所採用之離液鹽及乙醇或異丙醇等會抑制後續DNA增幅之試劑，無需經過二氧化矽(silica)管柱萃取，也無需使用研磨專用的均質機，本發明可短時間將萃取出之核酸直接進行後續DNA增幅、偵測等應用。
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬於本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發明之說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在於限制本發明。
為了進一步解釋本發明的技術方案，下面通過具體實施例對本發明進行詳細闡述。
本發明提供的微生物核酸的萃取方法，包括生物樣本的預處理與核酸的萃取，該生物樣本的預處理即為核酸的釋放，該預處理包括如下步驟S1至S3，具體的包括以下步驟：
步驟S1，將一生物樣本加入研磨裝置中與洗滌緩衝液混合。其中，所述生物樣本可以是痰液、尿液、血液、胸膜腔液、支氣管抽洗液等含微生物或已分離出之微生物的樣品。所述研磨裝置包含研磨管與微粒，所述研磨管可以是聚丙烯螺旋管或微量離心管等可供研磨處理的容器。所述微粒可以為礦物質微粒、陶瓷微粒、玻璃微粒、金屬微粒中的一種或多種。其中，所述洗滌緩衝液包含三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline)等。所述洗滌緩衝液的濃度範圍為0.05mM-0.5M，所述洗滌緩衝液的pH值範圍為6.5-9.2。所述研磨可以是採用美国Scientific Industries的SI Vortex-Genie 2涡旋振荡器或漩渦混勻儀(Vortex Mixer(LMS) )等進行研磨。
步驟S2，對所述生物樣本與所述洗滌緩衝液的混合液進行震盪處理，以使生物細胞從痰液樣品中溶出。
步驟S3，對所述經震盪處理後的生物樣本與洗滌緩衝液的混合液進行離心處理。離心轉速大於13000rpm，離心處理時間為5-10min，以將所述混合液分為上下兩層，移除上層清液，留下下層含微生物樣品沉澱物溶液於所述研磨裝置中。
所述核酸的萃取包括如下步驟S4~S6。其中步驟S4為，於所述經離心處理後的置放於研磨裝置中的下層含微生物樣品沉澱物溶液中加入裂解液，然後對所述裂解液與下層含微生物樣品沉澱物溶液的混合液震盪處理，震盪時間5-10min。所述裂解液包含介面活性劑，酵素和鹽類的一種或其混合液。其中介面活性劑的溶度範圍為0.001%-5%。酵素的濃度範圍為1mg/ml -50mg/ml。鹽類的濃度範圍為0.05mM-0.5M。所述介面活性劑可以為聚乙二醇單辛基苯基醚(4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)、乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸鈉(Dodecyl sodium sulfate)的一種或其混合液，所述介面活性劑用以溶解細胞質和細胞膜。所述酵素可以為蛋白酶K (proteinase K)，用以分解蛋白質。所述鹽類可以為乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)、三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)的一種或者其混合液，用以穩定核酸。
步驟S5，對所述經震盪處理後裂解液與下層含微生物樣品沉澱物溶液的混合液進行加熱處理，以使蛋白質變性，細胞破裂，核酸釋出。加熱處理方式為水浴，加熱溫度為35-105℃，優選95-105℃。
步驟S6，對所述經沸水浴處理後的混合液進行離心處理，離心轉速大於13000rpm，優選14000rpm，離心處理時間為5-10min，以將所述混合液分為上下兩層，上層清液為核酸，移出含有核酸的上層清液，得到萃取後核酸，以備檢測。
本發明的微生物核酸的萃取方法的實施例，具體以一痰液樣品為例，所述具體實施例包括以下步驟：
將一洗滌緩衝液加入含微粒的研磨裝置中，然後將一痰液樣品於研磨裝置中與洗滌緩衝液進行混合。所述痰液樣品的體積为100-200ul，其中，所述痰液樣品與洗滌緩衝液的體積比為1:1，所述洗滌緩衝液的成分為Tris(hydroxymethyl)aminomethane，濃度範圍為1-100 mM， pH值为6.5-8.5。對所述痰液樣品與所述洗滌緩衝液的混合液進行震盪處理，震盪時間為10秒以使生物細胞從痰液樣品中溶出。
對所述經震盪處理後的痰液樣品與洗滌緩衝液的混合液進行離心處理，離心轉速為14000rpm，離心處理時間為5-10min，以將所述混合液分為上下兩層，移除上層清液，留下下層溶液在所述研磨裝置中。
在所述經離心處理後的置放於研磨裝置中的下層溶液中加入裂解液，然後對所述裂解液與下層溶液的混合液進行震盪處理，震盪時間為5-10min。所述裂解液為為聚乙二醇單辛基苯基醚(4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)，濃度範圍為0.01~10%。
對上述經震盪處理後的裂解液與下層溶液的混合液進行加熱處理，加熱處理方式為沸水浴，加熱時間為15min，加熱溫度為95-105℃。
對所述經沸水浴處理後的混合液進行離心處理，離心轉速為14000rpm，離心處理時間為5-10min，以將所述混合液分為上下兩層，移出上層清液為核酸，移出所述含核酸的上層清液，得到萃取後的核酸。
參閱圖2，將經過本實施例的所述萃取方法即經過預處理步驟得到的核酸樣品，與其他萃取方法即未經過預處理獲得的核酸樣品進行晶片測試，其他萃取方法所萃取的樣品的測試結果相較於本發明實施例所萃取的樣品出現了多處非預期的偵測點，說明本實施例所萃取的樣品有效減低了非預期偵測點，避免了後續直接運用於核酸實驗造成干擾。
參閱圖3，以相同樣品，使用5種不同濃度，3種方法進行平行比對。A為單純採用研磨裝置萃取的樣品、B為單純採用裂解液萃取的樣品、與C為本實施例的萃取方法即微粒研磨裝置結合緩衝液，並搭配結合裂解液所萃取的樣品，進行吸收光譜測試，以分光光度計量測的波長分別260nm與280nm來測試方法A、B、C所萃取的核酸吸收光譜，從而測定萃取核酸的濃度。在三種核酸萃取方法中，以微粒研磨裝置結合緩衝液，並搭配結合裂解液得到的核酸濃度最高，單使用研磨裝置，無法有效釋出大部分核酸，僅使用裂解液可得到比單使用研磨裝置多的核酸，而研磨裝置配合裂解液可至少增加1.25倍的核酸萃取量。
參閱圖4，為本實施例萃取方法的核酸樣品與測試方法A、B所萃取的核酸樣品利用聚合酶連鎖反應(PCR)進行分析確認，其中，M表示100bp DNA marker，以研磨裝置配合裂解液所萃取的核酸可得到最顯著的核酸條帶，次之為經裂解液萃取的核酸，最不顯著的為僅用研磨裝置萃取的核酸，同時使用AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit (D)作為對照組比對，結果研磨裝置配合裂解液所萃取的核酸條帶與強度與AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit (D)相當。
參閱圖5，為本實施例所使用的C萃取方法的核酸和AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit (D)分別使用Roche COBAS® TaqMan® MTB Test進行平行比對評估，樣品C與D相比，在樣品C的109件檢體當中，34件陽性，陽性率為31.2%(34/109)；無效檢體分別為11件與7件。以10倍稀釋後重測，結果皆為陰性，於109件檢體最終比對結果，一致性達100%。
綜上所述，本發明微生物核酸萃取方法同時結合物理和化學方式，第一階段的預處理步驟採用研磨裝置加上洗滌緩衝液處理，短時震盪可減低干擾物質對後續試驗影響並將微生物細胞從生物樣本溶出，第二階段的核酸萃取為加入裂解液配合研磨裝置，使萃取管中的微粒研磨該微生物樣本，破壞組織細胞(壁)，再透過高溫條件下使蛋白質變性，細胞破裂，核酸釋出，其釋出之核酸留在上清液體中。因此，本發明微生物核酸萃取方法，僅需使用單管配合研磨裝置、洗滌緩衝液及裂解液可快速且簡易地萃取核酸，並無需經純化步驟即可進行後續相關核酸試驗，避免了使用傳統技術所採用之離液鹽及乙醇或異丙醇等會抑制後續DNA增幅之試劑，無需經過silica管柱萃取，也無需使用研磨專用的均質機，可短時間將萃取出之核酸直接進行後續DNA增幅、偵測等應用。
以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和實質。
無
圖1為本發明一實施例的微生物核酸的萃取方法流程圖。 圖2為本發明晶片測試比對圖，其中，圖2(a)為未經過預處理的樣品晶片測試結果，圖2(b)為經過預處理的樣品晶片測試結果。 圖3為本發明吸收光譜測試圖。 圖4為本發明進行聚合酶連鎖反應(PCR)後的結果比對圖。 圖5為本發明使用Roche COBAS® TaqMan® MTB Test進行平行比對的比對結果。
無

Claims (10)

  1. 一種微生物核酸萃取方法，其改良在於，包括以下步驟： 將一生物樣本加入研磨裝置中與洗滌緩衝液混合； 對所述生物樣本與所述洗滌緩衝液的混合液進行震盪處理； 對所述經震盪處理後的生物樣本與洗滌緩衝液的混合液進行離心處理； 於所述經離心處理後的置放於研磨裝置中的下層溶液中加入裂解液，然後對所述裂解液與下層溶液的混合液震盪處理； 對所述經震盪處理後裂解液與下層溶液的混合液進行加熱處理； 對所述經加熱處理後的混合液進行離心處理，收取上清液，獲得萃取的核酸樣品。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述洗滌緩衝液包含三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline)，所述洗滌緩衝液的濃度範圍為0.05mM-0.5M，所述洗滌緩衝液的pH值範圍為6.5-9.2。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述裂解液包含介面活性劑、酵素、和鹽類中的一種或多種。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述介面活性劑為聚乙二醇單辛基苯基醚(4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)、乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、十二烷基硫酸鈉(Dodecyl sodium sulfate)中的一種或多種，所述介面活性劑的濃度範圍為0.01mM-0.5M。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述酵素為蛋白酶K (proteinase K)，所述酵素的濃度範圍為1mg/ml -50mg/ml。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述鹽類為乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)、三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)中的一種或多種，所述鹽類的濃度範圍為0.05mM-0.5M。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述加熱處理為水浴，加熱的溫度範圍為35-105℃。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述研磨裝置包含研磨管與微粒，所述研磨管為聚丙烯螺旋管或微量離心管，所述微粒為礦物質微粒、陶瓷微粒、玻璃微粒、金屬微粒中的一種或多種。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之微生物核酸萃取方法，其中所述生物樣本為含微生物的樣品，具體為痰液、尿液、血液、胸膜腔液、支氣管抽洗液，或者已分離出的微生物樣品。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之微生物核酸萃取方法，其中生物樣本與洗滌緩衝液的混合液進行離心處理後分為上層清液與下層溶液，該離心處理後還包括移除該上層清液，以保留該下層溶液的步驟。
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