JP6385201B2 - 核酸増幅に適した試料の調製方法及び試薬キット - Google Patents

Description

本発明は、生体試料等に含有する核酸を増幅するのに適した試料の調製方法及び試薬キットに関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた核酸の増幅法の確立は、核酸を用いる生化学分野での革新的な技術をもたらし、特に生体試料中の核酸の有無を検出するときに高感度で有用な技術を提供している。また、核酸をより効率よく増幅するための技術（ ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰ 等） の開発に伴い、核酸の増幅法は、研究、診断、治療薬の開発等のツールとして、多様な用途において更なる有用性が見出されている。

核酸の抽出方法は、その後の核酸増幅反応の検出感度や測定結果に影響を及ぼすため、遺伝子を対象とした研究・検査を精確に行うためには、血液などの生体試料等から核酸を簡易にかつ高効率に抽出することが必要不可欠である。それゆえ、核酸の抽出方法は遺伝子検査において重要な工程になっている。

一般的に、核酸は血液等の中に遊離して存在しておらず、例えば、生体試料の場合は、標的とする核酸が細胞内に存在し細胞膜や細胞壁で覆われているため、核酸を覆う細胞膜等を溶解して核酸を遊離させた後、遊離した核酸を抽出し、核酸増幅反応に適した試料に調製する必要がある。

核酸を含む生体試料から核酸を抽出する方法として、これまで多くの技術が開発されている。代表的な方法としては、フェノール、クロロホルム等の有機溶媒によりタンパク質等の夾雑物を変性させて沈殿させた後、水相中の核酸を回収する有機抽出法、いわゆるプロテアーゼＫ／フェノール法（非特許文献１、特許文献１）、核酸を含む溶液に沈殿剤（エタノール、イソプロパノール等）または共沈剤（高分子多糖類）を加え、沈殿となった核酸を遠心分離によって回収する沈殿法（非特許文献２）等が知られている。その他、簡易的な方法としては、試料をイオン交換水で希釈した後に凍結融解を繰り返し、アルカリ溶液を添加後、油液分離、加熱処理等を行うアルカリ溶解法、細胞または組織を不活性化するだけの方法等（煮沸法）が知られている。

有機抽出法は、フェノール等の毒性の強い有機溶媒を使用するため、試薬の取り扱いに注意が必要である。また、遠心分離後すみやかに液層を分取する必要があり、その手順は、特にサンプル数が多い場合煩雑となる等の問題があった。

そのため、有毒なフェノール等の有機化合物を使用せず、核酸に親和性の高い共沈剤を使用することで、核酸の抽出効率を向上させる方法として、沈殿法が提案されている。沈殿法としてはキャリアーとして高分子多糖類（例えば、デキストランまたはグリコーゲンなど） 等の共沈剤を加えて沈殿を行う方法（特許文献２）、陽イオン界面活性剤を用いて核酸を有機相（アルコール等）に溶解し、無機塩溶液を加えて沈殿させる方法（特許文献３）、２価以上の遷移金属イオンを接触させることにより、試料中の夾雑物を沈殿させ、上清に残る核酸を回収する方法（特許文献４、５）等が提案されている。

また近年、核酸をより簡易に回収するための方法として、特に遠心分離機等の特殊な装置を必要とせずに、しかも簡単な工程により、安全にかつ高精度の核酸を迅速に回収する方法が提案されている（特許文献６）。

以上のように、核酸を含む試料の種類あるいは抽出された核酸の使用目的により、様々な核酸抽出法が提案されているが、いずれの場合においても、沈殿、分離、洗浄、精製等の煩雑な操作を組み合わせて行う必要があるが、簡易的と言われるアルカリ溶解法や煮沸法でも凍結、煮沸等の温度制御が要求される。

特開平１１−２５３１５８号公報 特開平７−５９５７２号公報 特開平２−３１６９６号公報 特表２００１ −５１６７６３号公報 特開２００８−７２９０４号公報 特開２００９−１５３４６７号公報

Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）７−１２〜７−１５ Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）１６２，１５６−１５９

しかしながら、核酸を抽出することが簡易であったとしても、核酸増幅反応に供する試料中に細胞から核酸と共に溶出された脂質等の夾雑物質が、核酸の増幅反応を部分的又は完全に阻害するため、再現性のない結果となり、標的核酸の有無を正確に評価できない問題が生じるため、夾雑物質を除去するためには更に、沈殿、分離、洗浄、精製等の操作が必要となる。

特に、生体試料中に含まれる核酸の量が微量である場合は、標的核酸の沈殿は微量であるため、夾雑物質を除去する操作が多いとその回収率が大きく低下する。また、目視による沈殿の確認は困難であり、誤って上清とともに捨ててしまうおそれがある。

核酸の抽出効率を高めるためには、アルコール沈殿させる時間や遠心分離する時間を長くする必要があるが、前記方法ではこれらの核酸は不溶化されているため、核酸増幅反応への試料として使用するためには再可溶化しなければならず、操作効率の面で問題がある。

また、従来キャリアーとして使用されているグリコーゲン等では、血清や血液のような生体試料である場合、前記物質に包含されるアミラーゼ等の酵素により分解される結果、核酸抽出効率が低下するため、核酸増幅反応を阻害する要因になりかねない。

そこで、生体試料等に含有される核酸を煩雑な操作を必要とすることなく、核酸増幅反応を阻害する物質を除去し、かつ、生体試料に含まれる核酸が微量であっても安定して抽出することができ、そのまま核酸増幅反応へ使用することができる試料の調製方法を提供することが課題となっている。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、操作が容易で工程が少なく短時間に実施可能であり、試料に含有される核酸量が微量の場合であっても核酸を抽出することができ、核酸増幅効率が安定である核酸試料を調製する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）生体試料等に含有する核酸の増幅反応に使用する核酸試料の調製方法であって、（ａ）前記生体試料に核酸抽出試薬を加える工程、（ｂ）中和処理を行う工程、（ｃ）遠心分離により上清を得る工程、において、（ａ）および／又は（ｂ）工程にタンパク質を添加することを特徴とする、（ａ）から（ｃ）工程を備える、調製方法。
（２）前記工程に、熱処理を行う工程を含む、（１）記載の調製方法。
（３）前記タンパク質が、セリシンである（１）又は（２）に記載の調製方法。
（４）前記核酸抽出試薬が、金属イオンを含む、（１）から（３）のいずれか１項に記載の調製方法。
（５）前記セリシンが、核酸増幅反応液中０．０９％以下の濃度である（２）から（４）のいずれか１項に記載の調製方法。
（６）金属イオンが、鉄イオン又はアルミニウムイオンである（４）又は（５）に記載の調製方法。
（７）前記生体試料が、全血、喀痰、唾液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、尿、便、血清、血漿である、（１）から（６）のいずれか１項に記載の調製方法。
（８）前記生体試料等に含有する核酸の増幅反応に使用する核酸抽出キットであって、核酸抽出試薬、熱処理試薬および中和試薬のいずれかにタンパク質を含有することを特徴とする抽出キット。
（９）タンパク質が、セリシンである、（８）記載の抽出キット。
（１０）核酸増幅反応液中のセリシンの濃度が、０．０９％以下である（９）記載の抽出キット。
（１１）前記核酸抽出試薬又は熱処理試薬に、金属イオンを含む（８）から（１０）のいずれか１項に記載の抽出キット。
（１２）金属イオンが、鉄イオン又はアルミニウムイオンである、（１１）記載の抽出キット。
（１３）前記生体試料が、全血、喀痰、唾液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、尿、便、血清、血漿である、（８）から（１２）のいずれか１項に記載の抽出キット。

本発明は、上記方法によれば、生体試料等に含有される核酸増幅反応を阻害する夾雑物質を金属イオンと共沈させることで除去することができる。また、試料中に含有される阻害物質量が少なく、かつ、核酸の濃度も低い場合においては、キャリアーとしてセリシンを添加することで、該核酸を再現性よく検出できる核酸増幅反応のための核酸試料を調製することができる。生体試料が全血、喀痰、唾液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、尿、便、血清、血漿であっても、安定した核酸の増幅を行うことができる核酸試料を調製することができる。

従来用いられているキャリアーでは標的の核酸が金属イオンと共に共沈する問題があるが、セリシンを添加することで該核酸が共沈することを妨げ、また、セリシンはある一定濃度においては、核酸増幅反応を阻害せず、生体試料中に含有する成分により分解されないため、核酸抽出効率が低下することはない。

実施例１の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例２の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例３の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例４の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例５の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例６の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例７の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例８の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例９の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例１０の方法によるＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅反応においての濁度の立ち上がりの時間をプロットしたグラフである。 実施例１１の方法によるリアルタイムＰＣＲ法を用いた核酸増幅反応においてサイクル数に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。

以下、本発明の好適な実施形態について説明する。

本発明は、生体試料等に含まれる核酸の増幅反応に使用する核酸試料の調製方法であって、生体試料等に核酸抽出試薬を加えて、加熱処理によって核酸を抽出する工程と、核酸抽出液を中和する工程及び、遠心分離により目的とする核酸試料を分離する工程を備え、前記工程のうち、抽出工程および／又は中和工程にキャリアータンパク質を添加することを特徴とする方法である。

本発明に用いられるキャリアーとして使用するタンパク質としては、セリシンを選択することができる。セリシンの濃度は、核酸増幅反応液中で、０．３６%以下が好ましく、より好ましくは、０．０９%以下である。セリシンの濃度が０．３６％以上であると、増幅効率は低下する。

本発明の核酸抽出工程において、生体試料等に金属イオンを含む核酸抽出試薬を加えて核酸を抽出することが好ましく、金属イオンとしては、鉄イオン又はアルミニウムイオンより選択される1種の化合物であることが好ましい。

鉄イオンとしては、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第一鉄、硝酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄等の無機鉄塩から選ばれる少なくとも１種を成分とする水溶液として使用することが好ましい。

鉄イオンの濃度は、核酸増幅反応液中で、０．１〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。鉄イオンの濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌより低い、又は１．０ｍｍｏｌ／Ｌより高いと核酸増幅反応の速度が減少する。

アルミニウムイオンとしては、硫酸アルミニウム水溶液であることが好ましい。

アルミニウムイオンの濃度は、核酸増幅反応液中で、０．１〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．４５ｍｍｏｌ／Ｌである。アルミニウムイオンの濃度が１．０ｍｍｏｌ／Ｌより高いと核酸増幅反応の速度が減少する。

本発明に用いられる生体試料は、全血、喀痰、唾液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、尿、便、血清、血漿等を挙げることができるが、これらに特に限定されない。

本発明で用いる核酸増幅法としては、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法等を挙げることができるが、これらの方法に何ら限定されるものではない。

以下にＬＡＭＰ法について説明する。ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６つの領域に対して４種類のプライマー（２種類のインナープライマーと、２種類のアウタープライマー）を設定し、鎖置換型のＤＮＡ合成酵素による反応を利用して一定温度で遺伝子を増幅させることを特徴とした方法である。

ＬＡＭＰ法を原理とした試薬キットには、例えば、マイコプラズマ検出試薬キット、レジオネラ検出試薬キットまたは百日咳菌検出試薬キットが市販されており、目的とする菌の検出に合わせたキットを使用することができる。なお、これらのキットは栄研化学株式会社から販売されている。

本発明における実施形態の一例を示す。先ず、１．５ｍＬチューブに一定量の水酸化ナトリウム水溶液、一定量の鉄イオンを含む水溶液を予め混和しておく。次いで、一定量の喀痰検体、もしくは咽頭拭い液を採取したスワブを生理食塩水に懸濁後その一定量を先のチューブに添加した後、よく混合する。その後、９５℃で一定時間加熱処理を行い、冷却後、セリシンを含む一定量の緩衝液を添加する。さらに遠心処理を施し、得られた上清の一部を試料として採取する。このような処理により、生体試料中の僅かな核酸をも効果的に抽出することができ、その結果、遺伝子増幅反応に適した核酸試料を調製する方法を提供することが可能となる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

セリシンが核酸抽出に与える効果（１）

（１）核酸の抽出
１．口腔内上皮細胞を３００μＬの生理食塩水に懸濁した溶液を４５μＬ分取し、核酸増幅反応液中に１３ゲノム相当となる様に調製したマイコプラズマ菌液５μＬを混合し、擬似生体試料を調製した。
２．また、３００μＬの生理食塩水を４５μＬ分取し、核酸増幅反応液中に１３ゲノム相当となる様に調製したマイコプラズマ菌液５μＬを混合し、生理食塩水試料を調製した。
３．１．５ｍL ＰＣＲチューブ（以下「ＰＣＲチューブ」と略す）に水酸化ナトリウム水溶液および硫酸第二鉄溶液を加えて、総量４０μＬになるように混和した。
４．次いで、前記擬似生体試料、あるいは生理食塩水試料を添加し、ボルテックスにて十分混和し、スピンダウンをした。ヒートブロックにて９５℃で５分間加熱処理した後、氷上冷却し、スピンダウンをした。
５．スピンダウンをした後に、生理食塩水試料については５％のセリシン（ＴＯＹＯＢＯ社製）水溶液を１μＬ又は０．９μｇのｓｓＤＮＡ（ニッポンジーン社製）を添加した系と、セリシン又はｓｓＤＮＡを添加する替わりに生理食塩水を１μＬ添加した系を用意した。
６．次いで、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して中和した後、ボルテックスした。
７．その後に、遠心機プチまるはちＭｏｄｅｌ２８１６型（ＷＡＫＥＮ社製）を用いて、２５℃、２，０００ｒｐｍ、３０秒の条件で遠心処理を行い、得られた上清を加熱処理試料とした。
８．別に、加熱処理を行わずに、同様の操作を行って得られた試料を非加熱処理試料とした。
９．上記、セリシン又はｓｓＤＮＡを添加する処理を行わないで核酸抽出を行った生理食塩水試料を対照１とした。

（２）核酸増幅反応
試料５μＬを、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）マイコプラズマＰ検出試薬キット( 栄研化学株式会社製 )から調製したＬＡＭＰ反応試薬２０μＬ（ リアクションミックスＭｙｃＰ.と鎖置換型ＤＮＡ酵素を混合した溶液 ）に添加し、リアルタイム濁度測定計ＬＡ−３２０Ｃ（ テラメックス社製 ）を用い、波長６５０ｎｍおける濁度（吸光度）変化を指標として、６５℃、１時間ＬＡＭＰ反応を行った。

ＬＡＭＰ反応液（ＬｏｏｐａｍｐマイコプラズマＰ検出試薬キット( 栄研化学株式会社製 )） の基本組成
リアクションミックスＭｙｃＰ（ＲＭ ＭｙｃＰ.） ２０．０μＬ
鎖置換型ＤＮＡ合成酵素（Ｂｓｔ Ｐｏｌ） １．０μＬ

プライマー
マイコプラズマＰ検出試薬キット
ＦＩＰ：ＣＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＴＣＡＣＡＴＡＣＧＧＣＣＣＧＡＴＴＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＴ （配列番号１）
ＢＩＰ：ＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＣＧＡＣＴＴＡＣＣＣＧＧＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣ （配列番号２）
Ｆ３ ：ＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＣ（配列番号３）
Ｂ３ ：ＡＡＣＴＧＴＴＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧ（配列番号４）
ＦＬＰ：ＧＣＡＡＡＧＧＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号５）
ＢＬＰ：ＧＴＣＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣ（配列番号６）

（３）結果
図１は、セリシンの有無が核酸抽出に与える効果について試験した結果である。縦軸は、ＬＡＭＰ反応液の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）が０．１に到達するまでの時間（分）（Ｔｔ値）を示し、横軸は、対照１、セリシンを添加して核酸の抽出を行った試料（セリシン）およびｓｓＤＮＡを添加して核酸の抽出を行った試料（ｓｓＤＮＡ）を示している。

セリシン又はｓｓＤＮＡを添加しないで核酸を抽出した対照１と、セリシンを添加し核酸を抽出した試料（セリシン）との比較例において、セリシンの場合のＴｔ値が、２４．３から２８．３分の間に確認できたが、対照１のＴｔ値は２８．１から３９．１分の間もしくは、未検出であった。

一方、ｓｓＤＮＡを添加し核酸の抽出をした試料の（ｓｓＤＮＡ）場合におけるＴｔ値は、２７．３から４３分の間もしくは、未検出であった。

セリシンは、対照１に比べ、安定した核酸増幅反応を示しているため、核酸量の少ない試料から核酸を抽出する方法として有用であることを示唆している。また、ＤＮＡキャリアー剤として汎用されているｓｓＤＮＡを添加し核酸抽出した場合と比べ、セリシンのＴｔ値の時間が早く、かつ、ばらつきが少ないため、セリシンを添加して核酸を抽出することで、核酸増幅反応に適した核酸試料を調製する方法であることが認められた。

また、加熱処理（図中、○）を行った場合のセリシンのＴｔ値は、２５．３から２８．３分の間、ｓｓＤＮＡの場合は、２７．３から４３．０分の間に観察された。セリシンを添加せずに核酸の抽出を行った対照１のＴｔ値は、３０．５から３９．１分の間であった。対照１と比べ、セリシンを添加した場合、Ｔｔ値は最大１２．０分早かった。

一方、非加熱処理（図中、△）におけるＴｔ値は、セリシンのＴｔ値は、２４．３から２７．８分の間、ｓｓＤＮＡの場合は、２５．４から３６．７分の間に観察されたのに対し、対照１においては、未検出もしくは３２．４分であった。対照１と比べ、セリシンを添加した場合、最大２４．３分早く核酸増幅反応が認められた。

以上の結果より、加熱処理および非加熱処理のいずれの場合においても、セリシンを添加して核酸抽出した試料において安定した核酸増幅反応が得られ、又、ｓｓＤＮＡよりもセリシンのＴｔ値の方が安定しているため、セリシンを核酸抽出工程に添加することにより、前記反応に適した試料を調製する方法であることが認められた。

セリシンが核酸抽出に与える効果（２）

（１）核酸の抽出
キャリアータンパク質としてはセリシンを用い、水酸化ナトリウム水溶液（以下、１液とする）、硫酸第二鉄溶液（以下、２液とする）又はＴｒｉｓ塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）（以下、３液とする）のいずれか一つに５％セリシン水溶液１μＬを混和した前記水溶液を使用し、実施例１．（１）１〜４、７〜８と同様に行った。セリシンを含まない各溶液で処理した生理食塩水試料を対照２とした。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図２は、１液、２液又は３液を添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、対照２および１液、２液又は３液を示している。１液、２液又は３液を用いて核酸の抽出を行った場合、Ｔｔ値は、２４．７〜３２．７分であった。一方、対照２のＴｔ値は、２９．８〜４５．２分であった。

このことより、対照２と比べ、セリシンを添加して核酸抽出を行った方が、より核酸増幅反応に適した核酸試料の調製方法であることが示唆された。更に、セリシンは、溶液中に存在する他の物質の影響を受けることなく、安定したＴｔ値が得られているので、セリシンを添加した核酸抽出試薬が有用であることを示唆している。

全血検体からの核酸抽出において、セリシンが核酸抽出に与える効果

（１）核酸の抽出
１．約８０μLのヒト全血試料（ヒト全血検体１〜５）を３００μＬの生理食塩水に懸濁した溶液を４５μＬ分取し、核酸増幅反応液中に１３ゲノム相当となる様に調製したマイコプラズマ菌液５μＬを混合し、擬似生体試料を調製した。
２．ＰＣＲチューブに水酸化ナトリウム水溶液および硫酸第二鉄溶液を加えて、総量４０μＬになるように混和した。
３．次いで、前記擬似生体試料をボルテックスにて十分混和し、スピンダウンをした。ヒートブロックにて９５℃で５分間加熱処理した後、氷上冷却し、スピンダウンをした。
４．スピンダウンをした後に、５％のセリシン（ＴＯＹＯＢＯ社製）水溶液１μＬを添加した。
５．次いで、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して中和した後、ボルテックスした。
６．その後に、遠心機プチまるはちＭｏｄｅｌ２８１６型（ＷＡＫＥＮ社製）を用いて、２５℃、２，０００ｒｐｍ、３０秒の条件で遠心処理を行い、得られた上清を加熱処理試料とした。
７．上記、セリシンを添加する替わりに生理食塩水を１μＬ添加した系を対照３とした。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図３はヒト全血検体からセリシンを添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、ヒト全血検体１から５を示している。

その結果、ヒト全血検体間の影響を受けることなく核酸抽出を行うことができ、核酸増幅反応が認められＴｔ値は２３．８〜２８．２分であった。このことより、ヒト全血からでも核酸を抽出することができ、又、セリシンを添加した工程を経ることで、安定した核酸増幅反応に適した核酸試料を調製し得ることが認められた。

喀痰検体からの核酸抽出において、セリシンが核酸増幅反応に与える効果

（１）核酸の抽出
試料として喀痰検体１〜５を用いた以外は、実施例３（１）１〜６と同様にして実験を行った。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図４は、喀痰検体からセリシンを添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、喀痰検体１から５を示している。

その結果、喀痰検体間の影響を受けることなく核酸増幅反応が認められＴｔ値は２６．０〜４３．５分であった。このことより、喀痰からでも核酸を抽出することができ、又、セリシンを添加した工程を経ることで、安定した核酸増幅反応に適した核酸試料を調製し得ることが認められた。

尿検体からの核酸抽出において、セリシンが核酸増幅反応に与える効果

（１）核酸の抽出
試料として尿検体１〜５を用いた以外は、実施例３（１）１〜６と同様にして実験を行った。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図５は、尿検体からセリシンを添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、尿検体１から５を示している。

その結果、尿検体間の影響を受けることなく核酸増幅反応が認められＴｔ値は３０．５〜３３．６分であった。このことより、尿からでも核酸を抽出することができ、又、セリシンを添加した工程を経ることで、安定した核酸増幅反応に適した核酸試料を調製し得ることが認められた。

便検体からの核酸抽出において、セリシンが核酸増幅反応に与える効果

（１）核酸の抽出
試料として便検体１〜３を用い、便検体を１０％懸濁液とした以外は、実施例３（１）１〜６と同様にして実験を行った。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図６は、便検体からセリシンを添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、便検体１から３を示している。

その結果、便検体間の影響を受けることなく核酸増幅反応が認められＴｔ値は２７．０〜４５．０分であった。このことより、便からでも核酸を抽出することができ、又、セリシンを添加した工程を経ることで、安定した核酸増幅反応に適した核酸試料を調製し得ることが認められた。

血清検体からの核酸抽出において、セリシンが核酸増幅反応に与える効果

（１）核酸の抽出
試料として血清検体１〜３を用いた以外は、実施例３（１）１〜６と同様にして実験を行った。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図７は、血清検体からセリシンを添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、血清検体１から３を示している。

その結果、血清検体間の影響を受けることなく核酸増幅反応が認められＴｔ値は２４．８〜３８．９分であった。このことより、血清からでも核酸を抽出することができ、又、セリシンを添加した工程を経ることで、安定した核酸増幅反応に適した核酸試料を調製し得ることが認められた。

血漿検体からの核酸抽出において、セリシンが核酸増幅反応に与える効果

（１）核酸の抽出
試料として血漿検体１〜３を用いた以外は、実施例３（１）１〜６と同様にして実験を行った。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図８は、血漿検体からセリシンを添加して核酸抽出し、その核酸試料を用いて核酸増幅反応を行った結果である。横軸は、血清検体１から３を示している。

その結果、血漿検体間の影響を受けることなく核酸増幅反応が認められＴｔ値は３１．７〜３５．１分であった。このことより、血漿からでも核酸を抽出することができ、又、セリシンを添加した工程を経ることで、安定した核酸増幅反応に適した核酸試料を調製し得ることが認められた。

セリシンの濃度が核酸抽出に与える効果

（１）核酸の抽出
セリシンの核酸反応液中の濃度が２段階希釈系列（０．０００００３６％〜０．３６％）になるように調製したセリシン水溶液を用いた以外は、実施例１（１）２〜５と同様にして実験を行った。セリシンの替わりに、生理食塩水を１μＬ添加し、前記処理を行って得られた試料を対照３とした。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図９は、セリシンの濃度が核酸抽出に与える効果について試験した結果である。横軸は、対照３および、セリシンの濃度（０．０００００３６％〜０．３６％）を示している。

核酸増幅反応中のセリシン濃度が０．０００００３６％〜０.３６％となるようにセリシンを添加し核酸抽出を行った場合、Ｔｔ値は２５．３から５５．７分であったが、対照３では未検出であった。以上の結果より、０．０００００３６％〜０．３６％のセリシンの添加は、核酸の抽出効率を向上させ、核酸増幅反応に適した試料を調製する方法であることが認められた。

硫酸アルミニウムの核酸抽出に与える効果

（１）核酸の抽出
硫酸第二鉄溶液の替わりに硫酸アルミニウム水溶液を用いた以外、実施例１（１）２〜５、７〜８と同様にして実験を行った。硫酸アルミニウムを含まない各溶液を処理したものを対照４とした。

（２）核酸増幅反応
実施例１．（２）と同様に行った。

（３）結果
図１０は、硫酸アルミニウムの核酸抽出に与える効果について試験した結果である。横軸は、対照４および、硫酸第二鉄水溶液又は硫酸アルミニウム水溶液を添加し核酸抽出した系を示す。

その結果、核酸抽出試薬に含む金属イオンとして鉄イオンの替わりにアルミニウムイオンを用いた場合でも、核酸増幅反応に適した核酸試料の調製が可能であることが認められた。

セリシンを添加した核酸抽出試料がＰＣＲ法による核酸増幅反応に与える影響

（１）核酸の抽出
キャリアータンパク質としてセリシンを用いた以外は、実施例１．（１）１〜５と同様にして実験を行った。セリシンを添加する替わりに、生理食塩水を１μＬ添加し、上記処理によって得られた生理食塩水試料を対照５とした。

（２）核酸増幅反応
試料５μＬを以下のＰＣＲ反応液２０μＬ を加え、以下の条件により核酸を増幅した。

ＰＣＲ反応液の基本組成：
２×ＰｒｅＭｉｘ（タカラバイオ社） １２．５μＬ
１０ｍＭ Ｆ ２．２５μＬ
１０ｍＭ Ｒ ２．２５μＬ
１０ｍＭ プローブ ０．６３μＬ
ＲＯＸ ｄｙｅ ２ ０．５０μＬ
ＤＷ １．９μＬ

リアルタイムＰＣＲ測定装置： Ｍｘ３００５Ｐ（ アジレントテクノロジー社製）

プライマー配列：
Ｆ ＧＴＡＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＧ （配列番号７）
Ｒ ＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＡＣＡＣ （配列番号８）

プローブ配列：
ＦＡＭ-ＣＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣＧＣＧ-ＢＨＱ１ （配列番号９）

ＰＣＲ条件：
９５ ℃ 、３０ｓｅｃ− ５０℃、３０ｓｅｃ− ７５℃、３０ｓｅｃ を４５サイクル行った。

（３）結果
図１１は、リアルタイムＰＣＲ法による結果を示すグラフである。縦軸はサイクル数（Ｃｔ値）を示している。

セリシンを添加していない対照５においては、増幅サイクルが認められなかった。一方、核酸増幅反応中の濃度が０．００９％もしくは０．０９％になるように、セリシンを添加し核酸抽出を行った場合には、平均増幅サイクル数はそれぞれ、２２および５６サイクルであった。以上より、セリシンを添加して核酸抽出を行うことで、リアルタイムＰＣＲ法にも適した核酸試料の調製が可能であることが確認された。

本発明は、核酸を含有する生体試料から核酸を抽出し、核酸増幅反応に適した試料を調製する方法に関するものであり、詳しくは、臨床診断分野で利用することができる核酸抽出方法および前記方法に用いる試薬である。

Claims (9)

1. 生体試料に含有する核酸の増幅反応に使用する核酸試料の調製方法であって、
   （ａ）前記生体試料に鉄イオン又はアルミニウムイオンを含む核酸抽出試薬を加える工程、
   （ｂ）中和処理を行う工程、
   （ｃ）遠心分離により上清を得る工程、
   において、（ａ）および／又は（ｂ）工程にセリシンを添加することを特徴とする、（ａ）から（ｃ）工程を備える、調製方法。
2. 前記工程に、加熱処理を行う工程を含む、請求項１記載の調製方法。
3. 前記セリシンが、核酸増幅反応液中０．３６％以下の濃度である請求項１又は２に記載の調製方法。
4. 前記セリシンが、核酸増幅反応液中０．０９％以下の濃度である請求項１又は２に記載の調製方法。
5. 前記生体試料が、全血、喀痰、唾液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、尿、便懸濁液、血清、血漿である、請求項１から４のいずれか１項に記載の調製方法。
6. 生体試料に含有する核酸の増幅反応に使用する核酸抽出キットであって、鉄イオン又はアルミニウムイオンを含む核酸抽出試薬、熱処理試薬および中和試薬のいずれかにセリシンを含有することを特徴とする抽出キット。
7. 核酸増幅反応液中の前記セリシンの濃度が、０．３６％以下である請求項６記載の抽出キット。
8. 核酸増幅反応液中の前記セリシンの濃度が、０．０９％以下である請求項６記載の抽出キット。
9. 前記生体試料が、全血、喀痰、唾液、口腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、尿、便懸濁液、血清、血漿である、請求項６、７又は８に記載の抽出キット。