JP2021129591A

JP2021129591A - 血液サンプルをプールする方法

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Publication number: JP2021129591A
Application number: JP2021090181A
Authority: JP
Inventors: ジェフリーエム．リネン，; M Linnen Jeffrey; ジジュモンシェリーセリー，; Chelliserry Jijumon
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2021-09-09
Also published as: AU2016262545A1; EP3294912A4; JP2023106506A; JP2018518162A; CA2983415A1; EP3294912A1; US20180143115A1; WO2016183282A1; US20220221382A1; AU2016262545B2

Abstract

【課題】全血球サンプルのような赤血球を含むサンプルのプール分析の方法を提供する。【解決手段】病原体の存在に関して、血球を含むサンプルアリコートを試験する方法であって、（ａ）複数のサンプルの各々からサンプルアリコートを提供する工程；（ｂ）前記複数のサンプルアリコートの各々と、溶解試薬とを別個に接触させる工程であって、それによって、前記複数のサンプルアリコートの各々の中の前記血球のうちの少なくとも一部が溶解する、工程；（ｃ）工程（ｂ）の前記溶解したサンプルアリコートをプールする工程；（ｄ）前記プールした溶解物を病原体の存在に関して試験する工程であって、それによって、前記プールした溶解物中の前記病原体の存在の同定が、前記サンプルアリコートのうちの少なくとも１つにおける前記病原体の存在を示す工程、を包含する、方法である。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年５月１２日に出願された米国仮出願第６２／１６０，５９１号（これは、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。

（背景）
輸血は、患者管理において必須の役割を有する。輸血に使用される血液はしばしば、多くのボランティアから集められる。このようなサンプルは、伝染性の感染症（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、梅毒トレポネーマ、Ａｎａｐｌａｓｍａｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、ならびに地域的有病率に依存して、とりわけＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種）に関してスクリーニングされる。

さらなる病原体に関するスクリーニングが望ましい。例えば、ヒトバベシア症は、ダニ媒介性赤血球内感染である新興感染症である。Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉは、米国におけるヒトバベシア症の最も一般的な原因であり、北東部の州および北中西部の州では、広く流行している。この種は、米国での輸血感染性バベシア症（ＴＴＢ）の症例の大部分に関係付けられており、現在、ＦＤＡに最も多く報告されている輸血感染性疾患である。Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉＴＴＢの１５９の十分に記録された症例が、１９７９〜２００９年の間に米国で報告された（Ｈｅｒｗａｌｄｔら，ＡｎｎＩｎｔｅｒｎＭｅｄ２０１１）。伝染した注入物のうちの８７％が、米国の固有の７州で起こった。ＴＴＢと関連した１２名の輸血関連死が、２００５年以来発生している。

感染サンプルの割合は低いことから、サンプルをプールすることによってスクリーニングが単純化され得る。プールサンプルが感染している場合には、そのプールはデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）されて、個々のサンプルにおいて感染源を同定し得るが、そのプールが感染していない場合には、そのプールに寄与する全てのサンプルは、個々の試験なしに感染がないと想定され得る。

ミニプール（６〜２４の）における核酸試験は、全血を血漿または血清へと分離した後に、供与された血液においてウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＩＶ）に関してスクリーニングするために慣用的に使用される。しかし、血漿および血清は、赤血球の病原体を検出するために使用することはできない。さらに、全血は、異なる患者に由来するサンプルが混合される場合に、凝固する傾向に直接起因して、プールすることはできない。血餅はまた、サンプルのコンシステンシーを変化させ、そして自動化装置を詰まらせることによって、アッセイにおけるその後の工程に干渉し得る。

（要旨）
サンプルアリコート中の標的を検出するための方法であって、前記方法は、サンプルアリコートを、複数の血液細胞サンプルの各々から提供し、それによって、複数のサンプルアリコートを提供する工程；前記サンプルアリコートの各々に対して溶解する反応を別個に行う工程であって、ここで前記溶解する工程は、前記サンプルアリコートの各々と以下：（ｉ）緩衝剤、（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２、ＥＧＴＡ、およびこれらの組み合わせからなる群より選
択される抗凝固薬のうちの少なくとも１つ；を含む溶解試薬とを接触させる工程を包含し、ここで前記試薬は、５．５より高いｐＨを有し、それによって、前記サンプルアリコートの各々における血球のうちの少なくとも一部が溶解する、工程；前記溶解したサンプルアリコートを、単一のプールしたサンプルへと合わせて、プールした溶解物を形成する工程；前記プールした溶解物から標的を分離する工程；ならびに前記プールした溶解物からの前記分離した標的を検出するために反応を行う工程であって、ここで前記プールした溶解物中の前記標的の存在の検出は、最初に提供されたサンプルアリコートのうちの少なくとも１つの中に前記標的が存在することを示す、工程を包含する、方法が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記標的がプールした溶解物中で検出される場合、別個の血液サンプルを個々に試験して、血球サンプルのうちのどれが上記標的を含むのかを同定する工程をさらに包含する。いくつかの局面において、血球サンプルが標的を含まず、よって、上記標的を含むと決定されたサンプルが廃棄されることは、望ましい。この局面の非限定的例において、血液バンクで使用するための血球サンプルは、標的が上記サンプル中に存在することが決定される場合に廃棄される。いくつかの局面において、上記血球サンプルは、標的を有し、よって上記標的を含むと決定されたサンプルは保持されることは、望ましい。この局面の非限定的例において、治療標的を得るために使用される血球サンプルは、上記標的が上記サンプル中に存在することが決定される場合に保持される。

複数のサンプルアリコートから標的を分離するための方法であって、前記方法は、（ａ）サンプルアリコートを、複数の全血サンプルの各々から提供し、それによって、複数のサンプルアリコートを提供する工程；
（ｂ）前記サンプルアリコートの各々に対して溶解する反応を別個に行う工程であって、ここで前記溶解する工程は、前記サンプルアリコートの各々と以下：（ｉ）緩衝剤、（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および（ｉｉｉ）塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２、ＥＧＴＡ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される抗凝固薬のうちの少なくとも１つ；を含む溶解試薬とを接触させる工程を包含し、ここで前記試薬は、５．５より高いｐＨを有し、それによって、前記サンプルアリコートの各々における血球のうちの少なくとも一部が溶解する、工程；（ｃ）前記溶解したサンプルアリコートを、単一のプールしたサンプルへと合わせて、プールした溶解物を形成する工程；および（ｄ）前記プールした溶解物から標的を分離する工程を包含する、方法が開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記プールした溶解物と、上記標的を固定化するように構成された固体支持体とを接触させる工程；および上記固定化された標的を上記プールした溶解物から分離する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記標的は、核酸標的であり、そして上記固体支持体は、付着された固定化プローブを含む。上記標的が核酸標的であるいくつかの実施形態において、上記方法は、上記プールした溶解物と、上記核酸標的に相補的な第１のセグメントおよび上記固定化プローブに相補的な第２のセグメントを含む捕捉プローブとを接触させる工程をさらに包含する。一部の局面において、方法は、上記捕捉プローブの第１のセグメントと上記核酸標的との間でのハイブリダイゼーション複合体の形成に都合の良いハイブリダイゼーション条件を提供する工程をさらに含む。一部の局面において、方法は、上記捕捉プローブの第２のセグメントと上記固体支持体に付着した固定化プローブとの間でのハイブリダイゼーション複合体の形成に都合の良いハイブリダイゼーション条件を提供する工程をさらに含む。一部の実施形態において、上記固体支持体は、磁性ビーズ固体支持体である。一部の実施形態において、上記固体支持体は、シリカ固体支持体である。一部の局面において、上記シリカ固体支持体は、ガラスウールである。一部の局面において、上記シリカ固体支持体は、ビーズである。一部の実施形態において、上記固体支持体は、カラム内に収容される。

上記方法の一実施形態において、上記標的は、核酸標的であり、そして上記プールした溶解物は、核酸増幅反応および検出反応を使用して上記核酸標的の存在または非存在に関
して試験される。一局面において、上記増幅反応は、等温増幅反応である。一局面において、上記増幅反応は、転写媒介性増幅反応を行って、増幅生成物を生成する工程を包含し、ここで上記検出反応は、検出プローブで上記増幅生成物を検出する工程を包含する。一局面において、上記増幅反応および上記検出反応は、同時に行われる。一実施形態において、上記方法のうちの１もしくはこれより多くの工程は、自動化デバイスで行われる。一局面において、上記増幅反応および上記検出反応は、自動化デバイスで行われる。一局面において、上記標的を上記プールした溶解物から分離する工程は、自動化デバイスで行われる。一局面において、上記溶解する反応、プールする反応、標的を分離する反応、および核酸分析の反応は、全て自動化デバイスで行われる。一局面において、上記自動化デバイスは、自動化工程のうちの全てを行う統合型デバイスである。一局面において、上記自動化デバイスは、上記自動化工程のうちの１もしくはこれより多くを各々が行う、空間的に分離したデバイスの収集物である。

上記方法の一実施形態において、上記溶解する反応は、少なくとも４個のサンプルアリコートに対して行われる。上記方法の一実施形態において、上記溶解する反応は、少なくとも１６個のサンプルアリコートに対して行われる。上記方法の一実施形態において、上記溶解する反応は、少なくとも２０個のサンプルアリコートに対して行われる。上記方法の一実施形態において、上記溶解する反応は、最大２００個のサンプルアリコートに対して行われる。上記方法の一実施形態において、上記溶解する反応は、約４個のサンプルアリコート〜約２００個のサンプルアリコートに対して行われる。

上記方法のうちの一実施形態において、上記緩衝剤は、炭酸水素ナトリウムである。一局面において、上記緩衝剤は、炭酸水素ナトリウムであり、上記試薬は、塩化アンモニウムである塩化物含有塩を含む。一態様において、前記緩衝剤は、炭酸水素ナトリウムであり、前記試薬は、塩化アンモニウムである塩化物含有塩を含み、前記試薬のｐＨは、約７．０〜約８．０である。一局面において、前記塩化アンモニウムは、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で、または約２５０ｍＭの濃度で、前記試薬中に存在する。一局面において、前記炭酸水素ナトリウムは、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で、または約１４ｍＭの濃度で、前記試薬中に存在する。一局面において、前記試薬は、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在するＥＤＴＡ−Ｎａ_２、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在するＥＧＴＡを含むか、またはＥＤＴＡ−Ｎａ_２およびＥＧＴＡの組み合わせであって、ここで前記ＥＤＴＡ−ＮＡ_２は、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在し、そして前記ＥＧＴＡは、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在する組み合わせである抗凝固薬である。一局面において、前記溶解試薬は、（ｉ）約１４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、（ｉｉ）約５％（ｖ／ｖ）ＬＬＳ、（ｉｉｉ）塩化物含有塩および抗凝固薬を含み、ここで前記塩化物含有塩は、塩化アンモニウムであり、前記塩化アンモニウムは、約２５０ｍＭの濃度で前記試薬中に存在し、そしてここで前記抗凝固薬は、ＥＤＴＡであり、前記ＥＤＴＡは、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で前記試薬中に存在し、そしてここで前記試薬のｐＨは、約７．２〜約７．５である。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

上記方法のうちの一実施形態において、前記緩衝剤は、ＴＲＩＳ緩衝剤である。一局面において、前記試薬は、塩化マグネシウムである塩化物塩を含み、そして前記塩化マグネシウムは、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で、または約３０ｍＭの濃度で、前記試薬中に存在する。一局面において、上記ＴＲＩＳ緩衝剤は、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で、または約１００ｍＭの濃度で、上記試薬中に存在する。一局面において、上記試薬は、ＴＲＩＳ緩衝剤を含み、塩化マグネシウムである塩化物塩をさらに含み、そして上記塩化マグネシウムは、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で、または約３０ｍＭの濃度で、上記試薬中に存在する。一局面において、前記溶解試薬は、約１００ｍＭＴＲＩＳ緩衝剤および約６％（ｖ／ｖ）ＬＬＳを含み、ここで前記試薬のｐＨは、約７．５である。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

上記試薬のうちの一実施形態において、前記ＬＬＳは、約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で、または約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で、または約８％（ｖ／ｖ）の濃度で、または約６％（ｖ／ｖ）の濃度で、または約５％（ｖ／ｖ）の濃度で、前記試薬中に存在する。一局面において、前記緩衝剤は、炭酸水素ナトリウム緩衝剤である。一局面において、前記緩衝剤は、ＴＲＩＳ緩衝剤である。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

一実施形態において、前記試薬は、リン酸ナトリウム緩衝剤を含み、約１０％（ｖ／ｖ）ＬＬＳ、および抗凝固薬を含み、ここで前記抗凝固薬は、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在するＥＤＴＡ−Ｎａ_２、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在するＥＧＴＡ、またはＥＤＴＡ−Ｎａ_２およびＥＧＴＡの組み合わせであって、ここで前記ＥＤＴＡ−ＮＡ_２は、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在し、そして前記ＥＧＴＡは、約１ｍＭの濃度で前記試薬中に存在する組み合わせである。

一実施形態において、上記血球サンプルは、全血サンプルである。一局面において、上記血球サンプルは、ヒト全血サンプルである。一局面において、上記血球サンプルのうちの１個もしくはこれより多くは、ヒト全血サンプルであり、上記血球サンプルのうちの１個もしくはこれより多くは、非ヒト全血サンプルである。一局面において、上記血球サンプルは、赤血球を含む。一局面において、上記血球サンプルは、白血球を含む。

一実施形態において、各サンプルアリコートは、約１：２〜約１：１０（ｖ／ｖ）であるサンプルアリコート対溶解試薬の容積比で上記溶解試薬と接触される。一局面において、サンプルアリコート対溶解試薬の容積比は、１：２（ｖ／ｖ）、１：３（ｖ／ｖ）、１：４（ｖ／ｖ）、１：５（ｖ／ｖ）、１：６（ｖ／ｖ）、１：７（ｖ／ｖ）、１：８（ｖ／ｖ）、１：９（ｖ／ｖ）および１：１０（ｖ／ｖ）からなる群から選択される。一局面において、サンプルアリコート対溶解試薬の容積比は、約１：３（ｖ／ｖ）である。一局面において、サンプルアリコート対溶解試薬の容積比は、約１：４（ｖ／ｖ）である。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

一実施形態において、前記標的は、宿主由来の標的である。一実施形態において、前記標的は、病原体由来の標的である。一局面において、前記標的は、赤血球から放出される。一局面において、前記標的は、タンパク質標的である。一局面において、前記標的は、核酸標的である。一局面において、前記標的は、ＲＮＡ標的である。一局面において、前記標的は、リボソームＲＮＡ標的である。一局面において、前記標的は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、および寄生生物からなる群より選択される病原体に由来する病原体由来の標的である。一局面において、前記標的は、Ｂａｂｅｓｉａ属に由来する寄生生物、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属に由来する寄生生物、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属に由来する寄生生物、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属に由来する寄生生物、Ａｎａｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂａｂｅｓｉａｄｕｎｃａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉからなる群より選択される寄生生物に由来する病原体由来の標的である。

標的が核酸標的である方法の一実施形態では、分離する工程は、前記プールされた溶解物と、捕捉プローブおよび固定化プローブとを接触させる工程を包含し、該捕捉プローブは、該核酸標的に相補的な第１のセグメントおよび該固定化プローブに相補的な第２のセグメントを有し、ここで該核酸標的は、該捕捉プローブに結合し、そしてここで該結合さ
れた捕捉プローブは、該固定化プローブに結合する。一局面において、上記固定化プローブは、固体支持体に付着される。一局面において、上記プールした溶解物は、上記標的を固定化するように構成された固体支持体と接触される；そして上記固定化した標的を上記プールした溶解物から分離する。一局面において、上記捕捉プローブの第１のセグメントと上記核酸標的との間でのハイブリダイゼーション複合体の形成に都合の良いハイブリダイゼーション条件が提供される。一局面において、上記捕捉プローブの第２のセグメントと上記固体支持体に付着した固定化プローブとの間でのハイブリダイゼーション複合体の形成に都合の良いハイブリダイゼーション条件が提供される。一局面において、上記固体支持体は、磁性ビーズ固体支持体である。一局面において、上記固体支持体は、シリカ固体支持体である。一局面において、上記シリカ固体支持体は、ガラスウールである。一局面において、上記シリカ固体支持体は、ビーズである。一局面において、上記固体支持体は、カラム内に収容される。一局面において、上記方法は、遠心分離工程なしで行われる。

一実施形態において、上記溶解したサンプルアリコートの容積全体が、合わせられる。一局面において、上記溶解したサンプルアリコートの容積のうちの２５％もしくは２５％未満が、合わせられる。一局面において、上記血球のうちの少なくとも５０％は、上記サンプルアリコートと上記溶解試薬とを接触させた後、５分間もしくは５分未満で溶解される。

（定義）
「病原体」とは、ヒトおよび他の動物における疾患の原因となる、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、および他の微生物を包含する。例示的な病原体として、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、および寄生生物が挙げれるが、これらに限定されない。例示的な寄生生物として、Ｂａｂｅｓｉａ属に由来する寄生生物、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属に由来する寄生生物、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属に由来する寄生生物、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属に由来する寄生生物、Ａｎａｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂａｂｅｓｉａｄｕｎｃａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「標的」とは、単一のタイプの分子（例えば、病原体または宿主細胞に由来する特異的タンパク質または核酸）であり得る。あるいは、標的は、分子のクラス（例えば、病原体または宿主細胞に由来する任意のタンパク質標的または核酸標的）であり得る。例えば、病原体に由来する核酸標的の単一のタイプである標的は、寄生生物に由来するリボソームＲＮＡ標的（例えば、Ｂａｂｅｓｉａ生物由来の１８Ｓ
ｒＲＮＡ標的）であり得るか、または病原体に由来する核酸のクラスである標的は、病原体に感染していると疑われる全血サンプルに由来する全ＲＮＡであり得る。宿主細胞に由来する標的は、治療標的（例えば、抗体またはタンパク質（例えば、凝固因子）のような）であり得る。複数の別個の標的（例えば、ＲＮＡ標的およびタンパク質標的、または２種の別個のＲＮＡ標的（例えば、２種の異なるｍＲＮＡ標的、もしくはｍＲＮＡ標的およびｒＲＮＡ標的））もまた、分析され得る。標的は、宿主の血液細胞（宿主由来標的）の内因性成分、および感染赤血球の病原性感染の結果として生じ、感染している病原体によって代表的にコードされる成分（すなわち、「病原性」または「病原体由来」標的）を包含する。

本明細書で使用される場合、「溶解試薬」は、全血サンプル、赤血球を含むサンプル、白血球を含むサンプル、および赤血球生成物（例えば、ペレット化赤血球）を含むサンプルが挙げられるサンプル中の血液細胞の溶解を誘導するために有効な、（しばしば溶液の形態で提供される）試薬である。一部の例では、溶解試薬は、赤血球を優先的に溶解する。赤血球を、血液の他の細胞成分よりも優先的に溶解することは、溶解した赤血球のパーセンテージが、分析されるサンプル中に存在する他の細胞成分（他の細胞タイプは、凝集物中で評価される）のパーセンテージより高いことを意味する。多くの溶解試薬は、本明細書で記載される溶解物をプールする方法に有用である。好ましい溶解試薬は、以下から構成される：緩衝剤、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２、ＥＧＴＡ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される抗凝固薬のうちの少なくとも一方；ここで上記試薬は、５．５より高いｐＨを有する。

本明細書で使用される場合、「サンプルアリコート」とは、サンプルのより小さい容積に言及する。代表的には、上記サンプルアリコートは、試験のためにより大きなサンプル容積から取り出される。上記サンプルアリコートの各々は、好ましくは、本明細書で記載されるとおりの溶解試薬を使用して別個に溶解される。次いで、溶解したサンプルアリコートは、プールした溶解物を形成するために合わせられる。上記プールした溶解物は、上記血球内からから放出される非標的物質のような他の構成要素、および溶解されていない血球とともに、その今溶解したサンプルアリコートのうちの１個もしくはこれより多くに存在する任意の標的を含む。本明細書で使用される場合、複数のサンプルアリコートとは、２個もしくはこれより多くのサンプルアリコートであって、上記サンプルアリコートの各々は、２個もしくはこれより多くのサンプルから引き抜かれているものに言及する。上記サンプルアリコートは、好ましくは、上記サンプルアリコート中の血球のうちの少なくとも一部の溶解を促進する条件下で上記サンプルアリコートが上記溶解試薬と混合されてしまった後までは、合わされない。

アニオン性界面活性剤（ａｎｉｏｎｉｃｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）は、負に荷電した、アニオン性のヘッド基および長い炭化水素テールを有し、しばしばアルカリ金属またはアンモニウムイオンとの塩として提供される化合物である。

抗凝固薬は、全血の凝固を阻害する。抗凝固薬としては、ヘパリンおよびカルシウムキレート化剤が挙げられる。ヘパリンは、トロンビンおよび血液凝固に関与する他のプロテアーゼの活性を阻害するアンチトロンビンＩＩＩを活性化する。カルシウムキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジニトリロ）四酢酸）、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物）、ＥＧＴＡ（エチレン−ビス（オキシエトレンニトリロ）四酢酸）、およびシトレート）は、血液凝固に必要とされるカルシウムイオンを結合する。

緩衝剤は、溶液のｐＨを維持するために使用される弱酸または弱塩基をいう。本明細書での使用に好ましい緩衝剤としては、炭酸水素ナトリウム、ＴＲＩＳ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、リン酸水素ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。

核酸とは、一緒に結合されてポリマーを形成する窒素性複素環式塩基もしくは塩基アナログを有する、ヌクレオチドまたはアナログを含むマルチマー化合物（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびこれらのアナログが挙げられる）をいう。

この窒素性複素環式塩基は、核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）といわれ得る。核酸塩基は、従来のＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、塩基アナログなどで
あり得る（例えば、ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ５−３６；Ａｄａｍｓｅｔａｌ．，ｅｄ．，１１．ｓｕｐ．ｔｈｅｄ．，１９９２；ｖａｎＡｅｒｓｃｈｏｔｔｅｔａｌ．，１９９５，
Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３（２１）：４３６３−７０；Ｎａｉｒｅｔａｌ．，２００１，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，２０（４−７）：７３５−８；Ｈｉｌｌｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５（８）：４２５８−６３；ＬｉｎａｎｄＢｒｏｗｎ，１９９２，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０（１９）：５１４９−５２；Ｏｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，２００２，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２（１）：９７−９；Ｎｇｕｙｅｎｅｔａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６（１８）：４２４９−５８；Ｋｉｏｐｆｆｅｒ＆Ｅｎｇｅｌｓ，２００５，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，２４（５−７）６５１−４；Ｂａｂｕ＆Ｗｅｎｇｅｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）２０：２１１４−５；Ｈｒｄｌｉｃｋａｅｔａｌ．，２００５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（３８）：１３２９３−９；米国特許第５，３７８，８２５号；ＷＯ９３／１３１２１；Ｇａｍｐｅｒｅｔａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３（３１）：１０２２４−３６；ａｎｄＢｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８（１５）：２９１１−４を参照のこと）。多くの誘導体化および修飾された核酸塩基またはアナログは、市販されている（例えば、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．）。

糖に付着した核酸塩基ユニットは、核酸塩基ユニット、またはモノマーといわれ得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または類似化合物（例えば、２’メトキシまたは２’ハライド置換を有する）であり得る。ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、核酸塩基ユニットの例である。この核酸塩基ユニットは、種々の結合またはコンホメーション（ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート結合、ペプチド−核酸結合（ＰＮＡ；Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９４，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５（１）：３−７；ＰＣＴ番号ＷＯ９５／３２３０５）、および二環式フラノースユニットを有するヌクレオチドモノマーがＲＮＡ摸倣糖コンホメーションの中にロックされているロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）（ＬＮＡ）コンホメーション（Ｖｅｓｔｅｒら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（４２）：１３２３３−４１；Ｈａｋａｎｓｓｏｎ＆Ｗｅｎｇｅｌ，２００１，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１（７）：９３５−８）、または核酸鎖の中のこのような結合の組み合わせが挙げられる）によって連結され得る。核酸は、１個もしくはこれより多くの「脱塩基」残基を含み得る。すなわち、その骨格は、１個もしくはこれより多くの位置に窒素性塩基を含まない（米国特許第５，５８５，４８１号）。

核酸は、従来のＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基および結合のみを含んでいてもよいし、従来の成分および置換の両方を含んでいてもよい（例えば、２’−Ｏ−メチル結合を有する従来のＲＮＡ塩基、または従来の塩基およびアナログの混合物）。ＰＮＡ、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換されたＲＮＡ、または全体的な電荷、電荷密度、もしくはハイブリダイゼーション複合体の立体的な会合に影響を及ぼす構造（荷電した結合を含むオリゴマー（例えば、ホスホロチオエート）または中性基（例えば、メチルホスホネート）が挙げられる）を含めることは、核酸によって形成される二重鎖の安定性に影響を及ぼし得る。

オリゴマーは、全体的な長さおよび他の特性において実質的に同じであるが、そのオリ
ゴマーのうちの少なくとも一部が、特定の長さに対して異なる塩基のランダム組み込みによって合成されているオリゴマーの集団（例えば、ＤＮＡオリゴマー中の全４種の標準的塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）のランダムアソートメント、またはより大きなオリゴマーの規定された部分におけるいくつかの塩基（ＵまたはＴおよびＧ）のランダムアソートメント）をいう「ランダムポリマー」配列を含み得る。その得られるオリゴマーは、実際には、メンバーの有限の数が、そのランダム部分を構成する塩基の長さおよび数によって決定されるオリゴマーの集団である（例えば、２種の異なる塩基を使用することによって合成された６ｎｔランダム配列を含むオリゴマーの集団においては２^６種のオリゴマー）。

核酸の相補性は、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基の基の配向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列に水素結合することを意味する。相補的な塩基は、代表的には、ＤＮＡでは、ＡとＴおよびＣとＧであり、ＲＮＡでは、ＣとＧ、およびＵとＡである。相補性は、完全（すなわち、正確）または実質的／十分であり得る。２つの核酸の間の完全な相補性は、その２つの核酸が、二重鎖の中のあらゆる塩基が、ワトソン−クリック対合によって相補的塩基に結合される二重鎖を形成し得ることを意味する。「実質的」または「十分」な相補性は、一方の鎖の配列が対向する鎖の配列に完璧におよび／または完全に相補的であるわけではないが、この２つの鎖上の塩基間でこの十分な結合が起こって、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）において安定なハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列および標準的な数学的計算を使用して、ハイブリダイズされる鎖のＴｍを推定することによってか、または慣用的方法を使用することによるＴｍの経験的決定によって、推定され得る。Ｔｍとは、２つの核酸鎖の間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性される温度をいう。Ｔｍ未満の温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるのに対して、Ｔｍより高い温度では、このハイブリダイゼーション複合体における鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって、水性１ＭＮａＣｌ溶液中で既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸に関して概算され得るが、他の公知のＴｍ計算法は、核酸の構造特性を考慮に入れる。

「分離する」または「単離する」または「精製する」とは、１種またはこれより多くの成分を、複雑な混合物（例えば、サンプル）から取り出すことをいう。好ましくは、分離する工程、単離する工程または精製する工程は、他のサンプル成分から、標的核酸のうちの少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも９０％、およびより好ましくは、少なくとも９５％ｗ／ｗを取り出す。分離する工程、単離する工程または精製する工程は、必要に応じて、非標的サンプル成分を除去するために、さらなる洗浄工程を含み得る。

捕捉ハイブリッドの「放出」とは、捕捉ハイブリッドの１種またはこれより多くの成分を互いから分離すること、例えば、標的核酸を捕捉プローブから、および／または捕捉プローブを固定化プローブから分離することをいう。標的核酸鎖の放出は、標的を、捕捉ハイブリッドの他の成分から分離し、この標的を、検出プローブへの結合に利用可能にする。この捕捉ハイブリッドの他の成分は、標的検出に影響を及ぼすことなく、例えば、捕捉プローブ鎖を捕捉支持体上の固定化プローブに結合したままにし得る。

「標識」とは、例えば、検出可能なシグナルを生成する反応を触媒することによって、検出可能な応答またはシグナルを、直接的にまたは間接的に、検出可能であるかまたは生成する分子部分をいう。標識としては、発光部分（例えば、蛍光、生物発光、または化学発光化合物）、放射性同位体、特異的結合対（例えば、ビオチンおよびアビジン）のメンバー、酵素もしくは酵素基質、反応性の基、または発色団（例えば、検出可能な色を生じる色素または粒子）が挙げられる。

「捕捉プローブ」は、配列の標的相補性領域を含む第１のセグメント、およびこの捕捉プローブ（またはこの捕捉プローブを含むハイブリダイゼーション複合体）を固定化プローブに付着させるための第２のセグメントを含む。この第１のセグメントは、第１のセグメントおよび標的核酸がハイブリダイズして、ハイブリダイズする条件（例えば、実施例に記載されるもの）下で安定な（すなわち、検出可能な融解点を有する）二重鎖を形成し得るように、特定の標的核酸配列に実質的に相補性であるように構成され得る。あるいは、この第１のセグメントは、ハイブリダイズする条件下で、サンプル中の核酸配列に非特異的に結合するように構成され得る（ＷＯ２００８／０１６９８８を参照のこと）。この第２のセグメントは、固定化プローブの配列に相補的である配列の領域を含む。好ましくは、キメラ捕捉プローブは、核酸ホモポリマー（例えば、ポリ−Ａまたはポリ−Ｔ）であって、捕捉プローブの標的相補性領域に共有結合されかつ先に記載される（Ｗｅｉｓｂｕｒｇらの米国特許第６，１１０，６７８号）ように、固定化プローブの相補的ホモポリマー（例えば、それぞれ、ポリ−Ｔまたはポリ−Ａ）に適切な条件下でハイブリダイズするものを含む。捕捉プローブは、クロージング配列（ｃｌｏｓｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）として作用して、捕捉反応において結合されていない標的捕捉プローブを不活性化する第３のセグメントをさらに含み得る。この第３のセグメントは、上記第２のセグメントに対向する上記第１のセグメントに隣接し得る（例えば、捕捉配列：標的ハイブリダイズする配列：クロージング配列）か、またはこの第３のセグメントは、上記第１のセグメントに対向する上記第２のセグメントに隣接し得る（例えば、クロージング配列：捕捉配列：標的ハイブリダイズする配列）。ＷＯ２００６／００７５６７およびＵＳ２００９−０２８６２４９を参照のこと。

「固定化プローブ」は、支持体に直接的にまたは間接的に結合される核酸を含む。この核酸は、上記捕捉プローブ中の核酸に相補的であるが、上記捕捉プローブにおける長さと同じ長さ（核酸塩基ユニットの数）であってもよいし、そうでなくてもよい。この固定化プローブ中の核酸は、好ましくは、少なくとも６個連続した核酸塩基のユニットを含み、例えば、１０〜４５個または１０〜４０個または１０〜３０個または１０〜２５個または１５〜２５個（両端を含む）のＬ−核酸塩基ユニットを含み得る。上記核酸は、好ましくはホモポリマーであり、より好ましくは、アデニンまたはチミンのホモポリマーである。固定化プローブの好ましい形態は、アデニン残基のホモポリマーを有する第２のセグメントを含む捕捉プローブと組み合わせて使用するための、１４個のチミン残基のホモポリマーであるか、または１４個のチミン残基のホモポリマーを含む。固定化プローブの核酸部分は、代表的には、１本鎖形態で提供されるか、またはそうでなければ、使用前もしくは使用中に、１本鎖形態へと変性される。

本明細書において使用される場合、「固体支持体」は、固定化プローブのための支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、シリカ、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および磁気で引きつけられ得る物質から作製されるマトリクスまたは粒子）として有用な種々の材料のうちの任意のものである。シート、ビーズ／スフェア、ウール／ファイバーの形状および他の一般的な形状の固体支持体は、この方法に有用である。単分散性磁性ビーズは好ましい支持体である。なぜならそれらは、サイズが比較的均質であり、好ましくは自動化システムにおいて反応容器へと磁力を印加することによって、溶液から容易に回収されるからである。固体支持体は、スラリー中に広範に分散させられていてもよいし、またはカラムに充填されていてもよい。固定化プローブは、その捕捉支持体へと、例えば、種々の共有結合、キレート化、もしくはイオン性相互作用のうちのいずれかを使用することによって直接結合されてもよいし、上記支持体に結合された１もしくはこれより多くのリンカーを介して間接的に結合されてもよい。このリンカーは、捕捉プローブにハイブリダイズすることは意図しないが、固定化プローブの核酸とその支持体との間のスペーサーとして作用することが意図される、１個もしくはこれより多くのヌクレオチドを含み得る。

「検出プローブ」は、標的配列に特異的に結合しかつこの結合が、この標的配列の存在を示す検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じる、核酸または他の分子である。検出プローブは、検出可能なシグナルを生成するために標識される必要はない（例えば、プローブがその標的配列に結合することから生じる電気インパルスが、検出可能なシグナルであり得る）。「標識されたプローブ」は、標識を含むか、または直接的にまたは間接的に標識に結合されているプローブである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｈａｐｔ．１０；米国特許第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；米国特許第５，５４７，８４２号、Ｈｏｇａｎら；米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；米国特許第４，５８１，３３３号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら；米国特許第５，７３１，１４８号、Ｂｅｃｋｅｒら）。例えば、検出プローブは、非ヌクレオチドリンカーおよびこのリンカーに付着された化学発光標識を含み得る（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄら）。検出プローブの例は、均質系の反応（例えば、結合しているかまたは結合していないプローブ上の標識の差次的加水分解を使用するもの）において検出される付着された標識を有する約５〜５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む。

検出プローブは、アッセイの形式に依存して、標的配列と同じセンスまたは対向センス配列であるヌクレオチド配列を有し得る。検出プローブは、捕捉プローブと、標的配列の同じまたは異なるセグメントにハイブリダイズし得る。いくつかの検出プローブは、付着された化学発光マーカー、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物を有する（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号）。いくつかの検出プローブにおいて、アクリジニウムエステル標識は、ヌクレオチド塩基のアミンをＡＥの両側に拘束しかつインターカレーションのための部位を提供する非ヌクレオチドリンカーを使用することによって、ＡおよびＴ／Ｕの塩基対の領域の近くにあるプローブの中心領域に付着される（米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６５６，７４４号、Ａｒｎｏｌｄら）。あるいは、ＡＥ標識は、検出プローブの３’末端または５’末端に付着され得、この検出プローブは、標的核酸上の検出プローブに隣接してハイブリダイズして、標的核酸によって与えられる近くのアミンの効果を制限する第２のオリゴマーとともに使用される。いくつかの検出プローブにおいて、関連する非標的ポリヌクレオチド配列とのミスマッチの部位にまたはこの部位の近くにあるＡＥ標識は、僅か１個のヌクレオチドが異なり得る関連する配列と標的配列との間の区別を可能にする。なぜならこのミスマッチ部位の周辺の二重鎖の領域は、その関連する非標的配列にハイブリダイズしたプローブ上のＡＥを、加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に感受性にするために十分に不安定化されるからである。ＨＩＶ−１およびＨＣＶは、ＧｒｉｆｏｌｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓ．Ａ．（スペイン）による市販のＰＲＯＣＬＥＩＸ^{（登録商標）} ＵＬＴＲＩＯａｓｓａｙの改変形態を使用して検出され得る。この改変は、捕捉プローブおよび固定化プローブにおけるＤ−ポリＡおよびＤ−ポリＴの配列を、それぞれ、Ｌ−ポリＡおよびＬ−ポリＴで置き換えることを要する。

「ハイブリダイゼーション条件」とは、１本の核酸鎖が相補的な鎖の相互作用および水素結合によって第２の核酸鎖に結合して、ハイブリダイゼーション複合体を生成する累積的環境をいう。このような条件は、核酸を含む水性または有機性の溶液の化学的成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート化剤、ホルムアミド）、ならびにこの混合物の温度を含む。他の要因（例えば、インキュベーション時間の長さまたは反応チャンバの寸法）は、その環境に寄与し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄｅｄ．，ｐｐ．１．９０−１．９１，９．４７−９．５１，１１．４７−１１．５７
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９））。

１つのまたは複数の標的核酸への標的捕捉オリゴマーの特異的結合は、安定な二重鎖を形成する、標的捕捉オリゴマーの第１のセグメント中の１つの規定された配列と標的核酸上の正確にもしくは実質的に相補性のセグメントとの間の結合を意味する。このような結合は、その単一の規定された標的捕捉オリゴマー配列に正確にもしくは実質的に相補的なセグメントを欠いている、そのサンプル中の他の核酸への結合よりも検出可能に強い（より高いシグナルまたは融解温度）。標的核酸への標的捕捉オリゴマーの非特異的結合は、その標的捕捉オリゴマーが、単一の規定された標的捕捉オリゴマー配列に対して正確なもしくは実質的な相補性を有するセグメントを共有しない標的配列の集団に結合し得ることを意味する。例えば、その捕捉プローブの第１のセグメントにおけるランダム化配列を使用することによって、このようなことが達成され得る。

捕捉ハイブリッドの「放出」とは、捕捉ハイブリッドの１またはこれより多くの成分を互いから分離すること（例えば、標的核酸を捕捉プローブから、および／または標的捕捉オリゴマーを固定化プローブから分離すること）をいう。その標的核酸鎖の放出は、標的を、捕捉ハイブリッドの他の成分から分離し、その標的を検出プローブへの結合のために利用可能にする。この捕捉ハイブリッドの他の成分は、標的検出に影響を及ぼすことなく、例えば、標的捕捉オリゴマー鎖を、捕捉支持体上の固定化プローブに結合したままにし得る。

「感度」とは、それ自体として正確に特定された真の陽性の割合である（例えば、感染を有する感染血液サンプルのパーセンテージ）。感度はまた、検出下限によって特徴付けられ得る。例えば、プールする前の１粒子／ｍＬ血液という病原体濃度において、アッセイは、感染したサンプルのうちの少なくとも９５％を検出する。検出限界が低いほど、アッセイ感度は高くなる。特異度とは、正確に特定された真の陰性の割合を測定する（例えば、感染を有さないと正確に特定された非感染血液サンプルのパーセンテージ）。

値の範囲への言及はまた、範囲内の整数およびその範囲の中の整数によって規定される部分範囲を含む。任意の数値または数値範囲への言及は、他の代表的な使用条件を評価する測定時において本質的であるように、任意のこのようなバリエーションを包含すると理解されるものとする。

詳細な説明
Ｉ．一般
本開示は、血球を含むサンプル（例えば、全血球サンプル）のプール分析の方法を提供する。上記方法は、輸血などに使用される予定の多くの個体から集められた全血サンプルをスクリーニングするために特に有用である。プールする前に、このようなサンプルのアリコートは、溶解試薬（以下でさらに記載される）と個々に接触されて、上記サンプル中の赤血球を溶解させる。プールした後、その合わせられた溶解物またはその標本は、病原体に特徴的な標的の存在について試験される。プールする前に溶解することによって、複数の標的分子（例えば、ＲＮＡ）はプールする前に放出され得、一緒にプールされた非感染サンプルのバックグラウンドに対して感染サンプルが検出される確率が増大する。上記方法は、赤血球の病原体を同定するために特に有用であるが、背景において記載される代表的な標的のうちの全てに関して少なくとも含む試験の完全なパネルを実行するためにも使用され得る。

ＩＩ．溶解試薬
溶解試薬（これは、同時係属中の出願ＷＯ２０１６／０６４８８７（２０１５年１０月２０日に出願され、参考として援用される）に最初に記載された）は、少なくとも緩衝剤、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２、ＥＧＴＡおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される抗凝固薬のうちの少なくとも一方を含む。

いくつかの実施形態において、緩衝剤は、炭酸水素ナトリウム緩衝剤である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ＴＲＩＳ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）緩衝剤である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、炭酸水素ナトリウム緩衝剤である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、リン酸ナトリウム緩衝剤である。一部の実施形態において、緩衝剤は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度の試薬中の炭酸水素ナトリウム緩衝剤である。一部の実施形態において、緩衝剤は、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１２５ｍＭ、または約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度の試薬中のＴＲＩＳ緩衝剤である。一部の実施形態において、緩衝剤は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度の試薬中のリン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＰＯ_４）緩衝剤である。一部の実施形態において、試薬中のリン酸ナトリウムの濃度は、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである。一部の実施形態において、試薬中のリン酸一ナトリウムの濃度は、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである。一部の実施形態において、試薬中のリン酸二ナトリウムの濃度は、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである。範囲は、範囲中の全ての整数および小数（ｐａｒｔｉａｌ
ｎｕｍｂｅｒ）を含む。

いくつかの実施形態において、抗凝固薬は、ＥＤＴＡ（（エチレンジニトリロ）四酢酸）、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物）、ＥＧＴＡ（エチレン−ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸）、ヘパリン、またはシトレートのうちの１種もしくはこれより多くである。一部の実施形態において、抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度の試薬中のＥＤＴＡを含む。一部の実施形態において、抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度の試薬中のＥＤＴＡである。一部の実施形態において抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度の試薬中のＥＤＴＡ−Ｎａ_２である。一部の実施形態において、抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度の試薬中のＥＧＴＡである。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

いくつかの実施形態において、塩は、以下のイオンのうちの１種もしくはこれより多くを含む：ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、および塩化物イオン。いくつかの実施形態において、塩は、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、または塩化ナトリウムである。一部の実施形態において、塩は、塩化物イオンと、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンまたはカリウムイオンのうちの１つとを含み、試薬中の塩の濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３５ｍＭである。一部の実施形態において、塩は、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、または約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の試薬中の塩化アンモニウムである。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のうちの１種である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ＬＬＳまたはＳＤＳである。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、約１．５％（ｖ／ｖ）より高い濃度で試薬中に存在する。一部の実施形態において、界面活性剤は、約１５．５％（ｖ／ｖ）未満の濃度で試薬中に存在する。一部の実施形態において、界面活性剤は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で試薬中に存在する。一部の実施形態において、界面活性剤は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で試薬中に存在する。一部の実施形態において、界面活性剤はＬＬＳであり、試薬中のＬＬＳの濃度は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）、約４％〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約５％〜約８％（ｖ／ｖ）である。一部の実施形態において、界面活性剤はＬＬＳであり、約１４ｍＭ〜約５０ｍＭで試薬中に存在する。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

いくつかの実施形態において、試薬のｐＨは、ｐＨ５．５より高い。いくつかの実施形態において、試薬のｐＨは、ｐＨ１０．５より低い。一部の実施形態において、試薬のｐＨは、約６．０〜約１０．０である。一部の実施形態において、試薬のｐＨは、約６．５〜約８．０、または約７．０〜約８．０、または約７．２〜約７．６、または約６．７〜約７．５、または約６．７、または約７．３または約７．５である。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

試薬のいくつかの実施形態において、炭酸水素ナトリウムの濃度は、１４ｍＭであり、塩化アンモニウムの濃度は、２５０ｍＭであり、ＬＬＳの濃度は、８％（ｖ／ｖ）であり、ＥＤＴＡの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、ｐＨは、７．２〜７．６である。試薬のいくつかの実施形態において、緩衝剤は、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびＴＲＩＳからなる群より選択され、界面活性剤は、約５％〜約１０％（ｖ／ｖ）であり、ｐＨは、約６．５〜約８．０であり、塩は、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、および塩化カリウムからなる群より選択される。試薬のいくつかの実施形態において、緩衝剤は、リン酸ナトリウムおよびＴＲＩＳからなる群より選択され、塩は、塩化マグネシウムおよび塩化アンモニウムからなる群より選択される。この実施形態のうちのいくつかの局面において、抗凝固薬の濃度は、約０ｍＭ〜約１ｍＭである。この実施形態のうちのいくつかのさらなる局面において、界面活性剤は、約６％〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のＬＬＳである。この実施形態のうちのいくつかのさらなる局面において、緩衝剤は、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度でのＴＲＩＳであり、試薬のｐＨは、約７．２〜約７．５である。この実施形態のうちのいくつかのさらなる局面において、抗凝固薬は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度にあり、そしてＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２またはこれらの組み合わせである。

溶解試薬は、血液細胞を溶解し、放出された標的を溶解物中でのヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる分解から保護するように働き、その標的の使用のためのその後の工程（例えば、標的捕捉、増幅、検出、および／または配列決定）と適合性である。上記溶解試薬は、赤血球に感染する病原体由来のＲＮＡ（ＢａｂｅｓｉａおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓのような寄生生物が挙げられる）の分析に特に適している。溶解試薬は、サンプルから溶解試薬を除去することなく核酸検出の方法と適合性である。

（ＩＩＩ．溶解試薬の使用）
血液細胞は、任意の利用可能な供給源（例えば、全血、または赤血球を含むものを含むその任意の画分（例えば、ペレット化赤血球））から得られ得る。全血は、ヒト全血、もしくは非ヒト全血、またはこれらの組み合わせであり得る。

溶解試薬は、細胞溶解を誘導し、細胞からの、望ましい標的の放出を引き起こすために十分な時間にわたって、血液細胞と混合され得る。溶解試薬と混合して血液細胞を維持するための例示的時間としては、１〜３０分間、２〜１５分間、３〜１０分間、４〜６分間、または５分間が挙げられる。好ましくは、その時間は、少なくとも５分間である。好ましくは、上記混合物は、溶解後に目に見える粒子を欠いている。

溶解試薬を血液細胞とともにインキュベートする温度は、変動し得る。その温度は、好ましくは、溶解の程度および速度を最大限にしかつ標的の分解を最小限にするかまたはその後の加工処理の阻害を防止するように、選択される。例示的な温度範囲としては、０〜５０℃、５〜４５℃、１０〜４０℃、１５〜３７℃、２０〜３０℃、２２〜２７℃、または２５℃が挙げられる。周囲温度は適切である。血液細胞の溶解は、本明細書で記載される方法によって検出可能であるに十分な量の標的分子を放出するべきである。好ましくは、溶解は、溶解されるサンプル中の血液細胞のうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の溶解を生じる。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

血液細胞サンプルが溶解試薬と合わされる比は、細胞溶解の程度および速度、ならびに溶解した細胞からの放出後の分解からの標的分子の保護に影響を及ぼし得る。血液細胞サンプルが上記溶解試薬と混合される例示的な比としては、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、または１：１〜１：５または１：１０（ｖ／ｖ；サンプル：試薬）の間の比の範囲の中の比が挙げられる。好ましい比は、約１：３（ｖ／ｖサンプル：試薬）の比でサンプルアリコートが溶解試薬と混合される。別の好ましい比は、約１：４（ｖ／ｖサンプル：試薬）の比でサンプルアリコートが溶解試薬と混合される。上記サンプルが全血から単離された赤血球（例えば、ペレット化赤血球）を含む場合、この赤血球は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０の、または１：１〜１：１０（ｖ／ｖ；赤血球：試薬）の間の比の範囲にある例示的な比で、上記溶解試薬と混合され得る。範囲は、範囲中の全ての整数および小数を含む。

ＩＶ．標的
本発明の溶解試薬によって血球から放出される標的は、宿主由来の標的および病原体由来の標的を含み得る。標的としては、タンパク質標的（例えば、ペプチド標的および抗体標的）、核酸標的（例えば、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的）、全粒子、脂質および炭水化物が挙げられる。ＲＮＡ標的は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）標的、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的、または不均一核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）標的であり得る。病原体由来の標的に好ましい標的は、リボソームＲＮＡ標的、特に、１８ＳｒＲＮＡ標的、５Ｓ
ｒＲＮＡ標的、５．８ＳｒＲＮＡ標的、または２８ＳｒＲＮＡ標的である。標的は、白血球、赤血球から放出され得るか、または血漿中に存在し得る。標的は、治療標的を含む。治療標的は、好ましくは、宿主由来の標的（例えば、ペプチド標的（例えば、トロンビン）および抗体標的）である。

例示的な病原生物として、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、および寄生生物が挙げれる。例示的な寄生生物として、Ｂａｂｅｓｉａ属に由来する寄生生物、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属に由来する寄生生物、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属に由来する寄生生物、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属に由来する寄生生物、Ａｎａｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂａｂｅｓｉａｄｕｎｃａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ、
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉが挙げられる。

（Ｖ．アッセイ）
血液細胞を含むサンプルアリコートの溶解から放出される標的分子は、分析に供される。標的分子は、分析の前に、溶解試薬から（遠心分離または他の方法によって）分離されてもよいし、分離されなくてもよい。分離工程の省略は、そのアッセイを行うにあたって、効率的な作業フローを容易にし得る。アッセイのタイプは、標的に依存する。アッセイは、リアルタイムまたはエンドポイントのアッセイであり得る。

（Ａ．核酸）
核酸標的の分析はしばしば、捕捉、増幅および検出の工程を伴う。あるいは、増幅法および検出法は、事前の標的捕捉なしで行われ得る。好ましくは、増幅、ならびに検出および標的捕捉（行われる場合）は、標的分子を溶解試薬から分離することなく起こる。従って、プロセス全体は、１つの容器中で行われ得る。

（１．標的捕捉アッセイ）
例示的な標的捕捉アッセイは、以下のとおりに１またはこれより多くの捕捉プローブ、固定化プローブ、サンプル、および適切な媒体を使用して行われて、標的核酸への標的捕捉オリゴマーの、および固定化プローブへの標的捕捉オリゴマーのハイブリダイゼーションを可能にし得る。標的サンプル（本明細書において好ましくは、標的サンプルはプールされた溶解物である）は、上記アッセイを行う前に（例えば、６５℃から９５℃へと）加熱されて、２本鎖形態にあるあらゆる核酸を変性し得る。その成分は、任意の順序で混合され得る。例えば、上記標的捕捉オリゴマーは、上記標的サンプルに加えられ得、上記固定化プローブを加える前に上記標的サンプル中の核酸標的とハイブリダイズされ得る。しかし、自動化アッセイに関しては、上記標的捕捉オリゴマーおよび固定化プローブを、同時または実質的に同時に供給することによって、加える工程の回数を最小限にすることが好ましい。この場合には、ハイブリダイゼーションの順序は、第１のセグメントの標的捕捉オリゴマーと核酸標的との間で二重鎖を形成し得るが、捕捉プローブの第１のセグメントと第２のセグメントとの間で、および標的捕捉オリゴマーと固定化プローブとの間で形成する二重鎖の融解温度を超える条件下で第１のハイブリダイゼーションを行うことによって、制御され得る。次に、低減したストリンジェンシー、好ましくは、第１のセグメントの標的捕捉オリゴマーと核酸標的との間で形成される二重鎖の融解温度未満の条件下で第２のハイブリダイゼーションを行う。第２のハイブリダイゼーション条件下では、二重鎖は、捕捉プローブの第２のセグメントと固定化プローブとの間で形成され得る。ストリンジェンシーは、アッセイミックスの温度を低下させることによって低減され得る。例えば、より高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６０℃でまたは６０℃付近で行われ得、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、室温または２５℃へと冷却させることによって行われ得る。ストリンジェンシーはまた、塩濃度を低下させるか、またはカオトロピック溶媒を加えるかもしくはその濃度を増大させることによって、低減され得る。いくつかの方法では、全ての工程（２本鎖標的を変性させる、より高温での最初の変性工程を除くことはあり得る）が、等温で行われ得る。

核酸標的：捕捉プローブ：固定化プローブハイブリッド（捕捉複合体）の形成後に、捕捉複合体は、他のサンプル成分から分離される。捕捉複合体を他のサンプル成分から分離する１つの方法は、種々の公知の方法のうちのいずれか（例えば、遠心分離、濾過、または磁性捕捉支持体の磁気誘引）を使用することによって、捕捉複合体を含む固体支持体を他のサンプル成分から物理的に分離することによる。上記分離は、好ましくは、核酸標的、標的捕捉オリゴマーおよび固定化プローブの間に形成される二重鎖の融解温度未満の温度で行われる。いくつかの方法では、上記分離は、ハイブリダイゼーション条件のストリ
ンジェンシーおよびマッチした標的核酸とマッチしていない標的核酸とを区別する必要な能力を維持するために、このステム−ループ構造の融解温度より低いが、この融解温度の１０℃以内の温度で（例えば、６０℃で）行われる。別の方法は、サンプル構成要素がカラムからそして１個もしくはこれより多くの容器の中へと溶離する間に、捕捉複合体をカラム中に入れられた固体支持体へと付着したままであることを可能にする工程を包含する。次いで、その捕捉複合体を含むカラムは、溶離条件へと供されて、捕捉核酸標的が別個の容器へと溶離することを可能にする（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号を参照のこと）。

捕捉ハイブリッドの任意の部分に非特異的に接着する他のサンプル成分から標的核酸を単離することをさらに容易にするために、上記捕捉ハイブリッドは、他のサンプル成分を希釈および除去するために、１回もしくはこれより多く洗浄され得る。洗浄は、適切な水溶液（例えば、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む溶液。例えば、米国特許第６，１１０，６７８号を参照のこと）および適切な条件（例えば、上記成分のＴ_ｍより高い温度）において、捕捉ハイブリッドをその個々の成分へと解離し、次いで、その条件を再調節して、捕捉ハイブリッドの再形成を可能にすることによって達成され得る。しかし、取り扱いやすくし、工程を最小限にするために、洗浄は、好ましくは、上記捕捉支持体に付着した無傷の捕捉ハイブリッドを、この捕捉ハイブリッドを維持する条件を使用することによって溶液中ですすぐ。好ましくは、行われる場合、洗浄での標的核酸の捕捉は、上記標的核酸のうちの少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも９０％、およびより好ましくは、約９５％を、他のサンプル成分から単離する。単離された核酸は、核酸増幅のような多くの下流プロセスのために使用され得る。

標的捕捉アッセイはまた、リアルタイムの二相性標的捕捉および増幅法の一部として行われ得る。このような方法において、５００μＬのサンプルおよび４００μＬの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）が、反応チューブに加えられる。このＴＣＲは、磁性粒子、上記サンプル中に存在する生物を溶解するための成分、捕捉オリゴ、Ｔ７開始プロモーター、および内部較正因子を含む。反応チューブ中の流体は、特定の時間にわたって特定の速度で混合され、上記混合物が均質であることを担保する。次いで、反応チューブは、反応チューブの中の流体を予備加熱するために、４３．７℃のトランジションインキュベーター（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｃｕｂａｔｏｒ）へと移される。反応チューブは、次いで、６４℃に設定したアニールインキュベーターへと移される。６４℃でのインキュベーションの間に、溶解試薬によって事前に破壊されなかった、上記サンプル中に存在する任意の生物が破壊され、標的の放出を引き起こす。次いで、反応チューブは、クールダウンプロセスを開始するために移行インキュベーターへと移され、冷却機勾配（１７℃〜１９℃）の中でさらに冷却され、Ｔ７開始プロモーターの結合、ならびに捕捉オリゴを介する磁性粒子への標的および内部較正因子の両方の捕捉をもたらす。上記反応チューブは、磁気パーキングステーション（ｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｋｉｎｇｓｔａｔｉｏｎ）に移され、このステーションでは、上記チューブは、洗浄ステーションに入る前に、磁性粒子をチューブの側面に引きつける磁石に供される。洗浄ステーションでは、潜在的な妨害物質を、磁性粒子を洗浄することによって上記反応物から除去する。

２．増幅
核酸分析物は、等温増幅反応（例えば、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介性等温増幅、ポリメラーゼスパイラル反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｐｉｒａｌｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＳＲ）（Ｌｉｕ，Ｗ．らＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＳｐｉｒａｌＲｅａｃｔｉｏｎ（ＰＳＲ）：Ａｎｏｖｅｌｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１２７２３；（２０１５））、リガーゼ連鎖反応、および他の等温増幅法）、または温度サイクリング増幅反応（例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＴ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＴ）、または他の温度サイクリング増幅法）、あるいは他の増幅法のような方法を使用して、増幅され得る。増幅されたＲＮＡ分析物生成物の検出は、増幅の間に（リアルタイムで）または増幅後に（エンドポイントで）行われ得る。

（ｉ．転写媒介性増幅）
ＴＭＡは、以前に記載されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，８２４，５１８号、および同第７，８３３，７１６号；そしてまた、例えば、Ｆ．ＧｏｎｚａｌｅｓａｎｄＳ．ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｏＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＧｅｎｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１９９８Ｅｄ．ＦｒａｎｃｏｉｓＦｅｒｒｅ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ．ＰＰ．１８９−２０４）。ＴＭＡでは、増幅されるべき配列を含む標的核酸は、１本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。２本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を１本鎖核酸へと変換する任意の従来の方法が、使用され得る。プロモータープライマーは、上記標的核酸へとその標的配列において特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、テンプレートとして上記標的鎖を使用して上記プロモータープライマーの３’末端を伸長して、ｃＤＮＡコピーを作りだし、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖を生じる。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅＨ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを消化し、第２のプライマーが、上記プロモーター−プライマー末端から下流にある、このｃＤＮＡ中のその標的配列に特異的に結合する。次いで、ＲＴは、テンプレートとしてそのｃＤＮＡを使用して第２のプライマーの３’末端を伸長して、機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作り出すことによって、新たなＤＮＡ鎖を合成する。機能的プロモーターに対して特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、最初の標的鎖に相補的な約１００〜１０００個のＲＮＡ転写物（増幅されたコピーまたはアンプリコン）を生成する。この第２のプライマーは、各アンプリコン中のその標的配列に特異的に結合し、ＲＴは、このアンプリコンＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを作り出して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖を生成する。ＲＮａｓｅは、上記アンプリコンＲＮＡを、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖から消化し、このプロモータープライマーの標的特異的配列は、その新たに合成されたＤＮＡ中のその相補的配列に結合し、ＲＴは、上記プロモータープライマーの３’末端および上記ｃＤＮＡの３’末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、その標的鎖に相補的なさらなるアンプリコンを転写する機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作り出す。反応の間にこれら工程を反復して使用する自動触媒サイクルは、その最初の標的配列の約１０億倍の増幅を生じる。必要に応じて、アンプリコンは、上記アンプリコン中に含まれる配列に特異的に結合するプローブを使用することによって増幅の間（リアルタイム検出）に、または反応のエンドポイント（エンドポイント検出）で、検出され得る。その結合したプローブから生じるシグナルの検出は、上記サンプル中の標的核酸の存在を示す。

ＴＭＡはまた、リアルタイムの二相性標的捕捉および増幅法の一部として行われ得る。このような方法において、ＴＭＡは、増幅試薬（５０μＬ／試験）を、捕捉された標的分子を含む反応チューブに加え、そして増幅ロードステーションにおいて混合することによって、行われ得る。この増幅試薬は、核酸を作るために必要なオリゴおよび成分を含む。この反応チューブは、反応チューブ中の液体の温度を上昇させるために４３．７℃の移行インキュベーターに移され、次いで、それは、増幅ロードステーションへと戻されて、このステーションにおいて酵素（２５μＬ／試験）が加えられる。反応チューブは、４２．７℃に設定した増幅インキュベーターへと移され、インキュベーターの中に５分間留まり、その間に、第１回の増幅が開始される。反応チューブは、増幅ロードステーションへと戻され、このステーションにおいて、プロモーター試薬（２５μＬ／試験）が加えられる。反応チューブは、標的増幅のさらなる回のために、増幅インキュベーターへと戻される
。このプロモーター試薬は、オリゴおよびトーチ（ｔｏｒｃｈ）を含む。このトーチは、上記標的または内部較正因子に相補的であり、結合した場合には、蛍光を発し、リアルタイムでシグナルを生成する。上記標的および内部較正因子に関するシグナルは、好ましくは、異なる波長を有し、区別され得る。

（ｉｉ．ポリメラーゼ連鎖反応）
あるいは、ＰＣＲ増幅（例えば、逆転写酵素またはリアルタイムＰＣＲ）が、増幅のために使用され得る。ＰＣＲは、標的核酸を捕捉複合体から事前に放出してまたは放出せずに、行われ得る。このＰＣＲ反応は、捕捉工程と同じ容器（例えば、微量遠心チューブ）の中で行われ得る。このＰＣＲ反応は、解離のための約９５℃（例えば、９０〜９９℃）という高温から、アニーリングのための約６０℃という低温（例えば、４０〜７５℃、または５０〜７０℃または５５〜６４℃）の間でのサーモサイクリングを含む。代表的には、完全サーモサイクルの数は、少なくとも１０、２０、３０または４０である。ＰＣＲ増幅は、１またはこれより多くのプライマー対を使用して行われる。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマー対は、配列決定されることが望まれる領域に隣接する標的核酸の対抗する鎖に相補的な２つのプライマーを含む。ウイルスゲノムの大部分（例えば、５０、７５または９９％より多く）を配列決定するために、プライマーは、好ましくは、ウイルスゲノムの末端の近くに位置する。関連分子（例えば、患者サンプル中に存在する同じウイルスの変異形態）の増幅のために、プライマーは、好ましくは、その集団の大部分のメンバーに存在する可能性が高い標的核酸の保存された領域に相補的である。ＰＣＲ増幅は、以下に記載される：ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１，１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号。

（３．検出）
核酸標的の検出は、捕捉後にかつ任意の公知の方法を使用することによって、増幅の間（リアルタイム）または増幅後（エンドポイント）のいずれかで行われ得る。ＲＮＡの増幅生成物はしばしば、ＲＴ−ＰＣＲから生じるＤＮＡ、またはＴＭＡから生じるＲＮＡコピーの形態にある。増幅された核酸は、液相中で検出され得るか、またはそれらをマトリクス中でまたはマトリクス上で濃縮し、上記核酸と関連した標識（例えば、臭化エチジウムのようなインターカレーティング剤）を検出することによって検出され得る。いくつかの検出法は、増幅された生成物中の配列に相補的なプローブを使用してプローブ：生成物複合体の存在を検出するか、またはプローブの複合体を使用して、増幅された生成物から検出されるシグナルを増幅する（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号および同第５，８４９，４８１号）。他の検出法は、シグナル生成が標的配列の存在に結び付いているプローブを使用する。なぜならシグナルの変化は、分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブ（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，２１０，０１５号、同第５，３１２，７２８号、同第５，５３８，８４８号、同第５，５４１，３０８号、同第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，３６１，９４５号、同第６，５３４，２７４号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号；ならびに米国公開番号２００６／０１９４２４０Ａ１）におけるように、上記標識されたプローブが増幅された生成物に結合する場合にのみ生じるから
である。このようなプローブは、代表的には、このプローブの一方の末端に付着された標識（例えば、発蛍光団）、およびこのプローブが、増幅された生成物にハイブリダイズされていないことを示すあるコンホメーションにある（「閉じている」）ときの標識からのシグナル生成を阻害するが、プローブがそのコンホメーションを（「開いている」へと）変化させる増幅された生成物にハイブリダイズしているときに検出可能なシグナルが生成されるようにこのプローブの別の位置に付着される相互作用化合物（例えば、クエンチャー）を使用する。この増幅された生成物と特異的に会合する直接的にまたは間接的に標識されたプローブからのシグナルの検出は、増幅された標的核酸の存在を示す。

（４．配列決定）
増幅後に、標的核酸は、定性的もしくは定量的な検出をされるとともに、または定性的もしくは定量的な検出をされる代わりに、配列決定され得る。精製は、望ましい場合、シリカカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ重力流カラム）上で行われ得る。この標的核酸は、カラムに結合し、ここでこの標的核酸は、洗浄され得、次いで溶離され得る。あるいは、精製は、核酸プローブベースの精製システム（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号もしくは同第８，０３４，５５４号、ＵＳ２０１３／０２０９９９２もしくはＵＳ２００９／０２８６２４９、またはＷＯ２０１２／０３７５３１もしくはＷＯ２０１３／１１６７７４）を使用して行われ得る。その増幅された標的ＤＮＡはまた、アダプターの付着によって、いくつかの配列決定形式に適合させられ得る。その増幅されたＤＮＡは、ヌクレオチド（通常は、ホモポリマー）のクレノウ媒介性付加によってテール付加され得、続いて、その付加されたテールに相補的なオリゴヌクレオチドにアニールされ得、ライゲーションされ得る。使用される配列決定プラットフォームに依存して、特別なアダプターが、配列決定前にテンプレートにライゲーションされる。例えば、ＳＭＲＴベルアダプターは、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ’ ＰａｃＢｉｏＲＳ配列決定機での配列決定のために、サンプルテンプレートにライゲーションされる（例えば、ＴｒａｖｅｒｓらＮｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１０）３８（１５）：ｅ１５９を参照のこと）。

その増幅された標的核酸は、種々の技術による配列分析に適している。標的核酸の捕捉は、いわゆる次世代および第三世代の配列決定法のいくつかの異なる形式につなげられ得る。このような方法は、数百万もの標的テンプレートを並行して配列決定し得る。このような方法は、標的核酸が改変体の不均一な混合物である場合に、特に有用である。その多くの利点の中でも、改変体を並行して配列決定することで、このサンプル内に比較的小さな割合で薬物変異が存在しても、サンプル中の薬物耐性変異のプロフィールが提供される。

いくつかの次世代配列決定法は、エマルジョンＰＣＲによって増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）。標的捕捉オリゴマーを介してビーズに固定化された標的核酸は、エマルジョンＰＣＲに適切な出発物質を提供する。そのビーズは、単一のビーズを含む個々のマイクロリアクターを作るために、ＰＣＲ試薬およびエマルジョンオイルと混合される（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ４３７，３７６−８０（２００５））。次いで、このエマルジョンは破壊され、増幅されたＤＮＡを有するその個々のビーズが配列決定される。この配列決定は、例えば、Ｒｏｃｈｅ４５４ＧＳＦＬＸ配列決定機（４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ０６４０５）を使用して行われるパイロシーケンシングであり得る。あるいは、配列決定は、例えば、ＡＢＩＳＯＬｉＤＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ９２００８）を使用して行われるライゲーション／検出であり得る。別のバリエーションにおいて、標的核酸は、標的捕捉オリゴマーを有するビーズから溶離され、アレイ上の異なる位置に固定化される（例えば、ＨｉＳｃａｎＳＱ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ９２１２１））。その標的核酸は、ブリッ
ジ増幅によって増幅され、アレイ形式で、標識されたヌクレオチドのテンプレート指向性組み込みによって配列決定される（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）。別のアプローチでは、標的核酸は、標的捕捉オリゴマーから溶離され、単一の分子が、リアルタイムで、ポリメラーゼによるヌクレオチドの組み込みを検出することによって分析される（単一分子リアルタイム配列決定またはＳＭＲＴ配列決定）。このヌクレオチドは、組み込まれた場合にシグナルを放出する標識されたヌクレオチドであり得る（例えば、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｉｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ３２３ｐｐ．１３３−１３８（２００９））か、または標識されていないヌクレオチドであり得る（この場合、上記システムは、組み込みの際の化学変化を測定する（例えば、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。

捕捉された標的核酸が、任意の技術によって配列決定され得るが、第三世代、次世代または大規模並列処理法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌｍｅｔｈｏｄ）は、ＳａｎｇｅｒａｎｄＭａｘａｍＧｉｌｂｅｒｔ配列決定を上回るかなりの利点を提供する。いくつかのグループは、超ハイスループットＤＮＡ配列決定手順を記載している（例えば、Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ、米国特許第５，３０２，５０９号、Ｍｅｔｚｋｅｒら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：４２５９（１９９４）を参照のこと）。４種の天然のヌクレオチド（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはチミン（Ｔ）という塩基を含む）および合成によってＤＮＡを配列決定するためのいくつかの他の酵素を使用するパイロシーケンシングアプローチは、今や変異検出のために広く使用されている（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１，３６３（１９９８）；Ｂｉｎｌａｄｉｎら，ＰＬｏＳＯＮＥ，ｉｓｓｕｅ２，ｅ１９７（Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００７）；Ｒｅｈｍａｎら，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，８６，３７８（Ｍａｒｃｈ２０１０）；Ｌｉｎｄら，ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎｔｙｐｉｎｇ，Ｈｕｍ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０），ｄｏｉ１０．１０１６／ｊｈｕｍｉｍｍ．２０１０．０６．０１６（印刷中）；Ｓｈａｆｅｒら，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．１；１９９（５）：６１０（２００９））。このアプローチにおいて、検出は、ＤＮＡポリメラーゼ反応の間に放出されるピロホスフェート（ＰＰｉ）、スルフリラーゼによるピロホスフェートのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）への定量的変換、およびその後のホタルルシフェラーゼによる可視光の生成に基づく。より近年の研究は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の３’−ＯＨ基にキャップをするために蛍光色素に連結される光切断可能な化学部分に大部分は焦点を当てた合成法によってＤＮＡ配列決定を行う（ＷｅｌｃｈらＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８，１９７（１９９９）＆ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ，５：９５１−９６０（１９９９）；Ｘｕら、米国特許第７，７７７，０１３号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、米国特許第７，６４５，５９６号；Ｋａｏｅｔａｌ，米国特許第６，３９９，３３５号；Ｎｅｌｓｏｎら，米国特許第７，０５２，８３９号および同第７，０３３，７６２号；Ｋｕｍａｒら，米国特許第７，０４１，８１２号；Ｓｏｏｄｅｔａｌ，
米国特許出願番号２００４−０１５２１１９；Ｅｉｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２３，１３３（２００９））。合成による配列決定方法論（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）では、ＤＮＡ配列は、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を別個にかつ逐次的に用いてＤＮＡ／ポリメラーゼ複合体を試験する際のピロホスフェート放出を測定することによって導き出されている。Ｒｏｎａｇｈｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：３６３３６５（１９９８）；Ｈｙｍａｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４，４２３（１９８８）；Ｈａｒｒｉｓ、米国特許第７，７６７，４００号を参照のこと。

（Ｂ．他の標的）
抗体、タンパク質、粒子および他の標的は、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、競合アッセイおよび免疫測定アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ）のような形式によって検出され得る。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣＳＨＰＮＹ，１９８８）；米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８７９，２６２号；同第４，０３４，０７４号、同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４，０９８，８７６号を参照のこと。サンドイッチアッセイは、好ましい形式である（米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号、および同第５，９６５，３７５号を参照のこと）。

競合アッセイがまた使用され得る。いくつかの方法では、サンプル中の標的抗原は、外因的に供給された、標識された標的抗原と抗体検出試薬への結合に関して競合する。その抗体に結合される標識された標的抗原の量は、サンプル中の標的抗原の量に逆比例する。その抗体は、検出する前に、サンプルからの結合した複合体の分離を容易にするために固定化され得る。

接線流デバイスはまた、標的を検出するために使用され得る。流体は、標的が存在し得るサンプルで処理された試験ストリップに適用される。標識された結合分子は、このストリップを通り、標的を有するサンプルを含む特定のゾーンに入るにつれて捕捉され得る。

（ＶＩ．感度）
本発明の方法は、血球を含むサンプルアリコート（例えば、全血、白血球、赤血球、または赤血球の他の調製物）からの標的の高い検出感度を提供し得る。病原体由来ＲＮＡ標的に関しては、感度は、ある容積の全血に存在する病原体ＲＮＡコピーの最小数として表され得る。全血の容積は、溶解試薬と直接接触され得るものであるか、または血液画分（例えば、ペレット化赤血球）を調製するために使用され得るものであり、この血液画分は、翻って、この溶解試薬と接触させられる。好ましくは、上記方法は、全血中の病原性ＲＮＡの存在を、約２×１０^３コピーのリボソームＲＮＡ／ｍＬ（１寄生生物／１ｍＬに等しい）全血もしくはこれより良好、２×１０^３コピー／５ｍＬ全血もしくはこれより良好、２×１０^３コピー／１０ｍＬ全血もしくはこれより良好、２×１０^３コピー／５０ｍＬ全血もしくはこれより良好、または２×１０^３コピー／１００ｍＬ全血もしくはこれより良好な感度で検出する。好ましくは、上記方法は、全血中の病原性ＲＮＡの存在を、約８×１０^３コピーのリボソームＲＮＡ／ｍＬ（４寄生生物／１ｍＬに等しい）全血もしくはこれより良好、８×１０^３コピー／５ｍＬ全血もしくはこれより良好、８×１０^３コピー／１０ｍＬ全血もしくはこれより良好、８×１０^３コピー／５０ｍＬ全血もしくはこれより良好、または８×１０^３コピー／１００ｍＬ全血もしくはこれより良好な感度で検出する。好ましくは、上記方法は、全血中の病原性ＲＮＡの存在を、約２４×１０^３コピーのリボソームＲＮＡ／ｍＬ（１２寄生生物／１ｍＬに等しい）全血もしくはこれより良好、２４×１０^３コピー／５ｍＬ全血もしくはこれより良好、２４×１０^３コピー／１０ｍＬ全血もしくはこれより良好、２４×１０^３コピー／５０ｍＬ
全血もしくはこれより良好、または２４×１０^３コピー／１００ｍＬ全血もしくはこれより良好な感度で検出する。

ＶＩＩ．作業フロー
複数の血液サンプルから個々に溶解したアリコートを、プールする。異なる血球サンプ
ルは、代表的には、異なる被験体に由来し、しばしば異なるヒトに由来する。個々の血液サンプルの例示的容積は、約２００〜５００ｍｌである。プールするためのサンプルアリコートは、代表的には、血球サンプルの小さな割合（例えば、１μＬ〜２ｍｌもしくは１００μＬ〜１ｍｌ、または血球サンプルの容積のうちの１％未満もしくは０．１％未満）を表す。アリコートは、２個、４個、８個、１６個、２４個、または２００個のサンプル（数の中でもとりわけ）からの個々の溶解後にプールされ得る。いくつかの方法において、少なくとも４個のサンプルから溶解したアリコートがプールされる。いくつかの方法において、２〜２００個、４〜２４個、１４〜１６個、または４〜２０個のサンプルから溶解したアリコートは、プールされる。溶解後に、個々の溶解したサンプルアリコートは、全体においてまたは部分的に、プールされ得る。全体においてプールするとは、各溶解したサンプルアリコートの完全な容積がプールされることを意味する。プールするとは、各溶解したサンプルアリコートの標本（すなわち、画分）は、プールした溶解物を形成するためにプールされることを意味する。次いで、分析は、血球サンプル中に存在し得る標的を検出するために行われ得る。分析は、赤血球に感染する病原体（例えば、Ｂａｂｅｓｉａ種およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種）の標的のみを探し得るか、または血漿または血清中におそらく存在する任意の病原体（例えば、ＨＩＶ−１および−２、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、西ナイル、デング、梅毒トレポネーマ、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種およびＡｎａｐｌａｓｍａ）の標的をも探し得るか、あるいは治療標的を探し得る。このような標的は、別個にまたは一緒に分析され得る（例えば、マイクロアレイ上での多重増幅および検出によって）。

方法の感度は、部分的には、１回もしくはこれより多くのサンプル採取（ここで元のサンプルのほんの一部が、その後の分析に進められる）の前に、血球の溶解を行うことから生じる。このようなサンプル採取は、プールするために各溶解したサンプルアリコートのほんの一部を使用して、または分析もしくは他の希釈のためにプールした溶解物のほんの画分を使用して、生じ得る。溶解と検出との間に行われる任意のまたは全てのサンプル採取によって行われる分画は、最終的に分析されるアリコートの最初の容積のうちの０．５（すなわち、５０％）、０．２５（２５％）、０．２（２０％）、０．１２５（１２．５％）、０．１（１０％）、０．０６２５（６．２５％）、０．０５（５％）、０．０４１６（４．１６％）または０．０１（１％）未満またはこれらに等しくてもよい。標的を含む血球の数は、抽出比の逆数と同じ次数またはこれより小さい可能性があるので、溶解なしのサンプル採取のためには、標的を全く含まない細胞が、サンプルアリコートからのその後の分析に進められる確率は高い。例えば、サンプルが、１ｍｌあたり２個の感染細胞を有し、サンプルのうちの０．１ｍｌが分析のために使用される場合、平均して、分析に使用されるわずか１／５サンプルが、陽性の結果を可能にする粒子を含む。しかし、サンプル採取して標的分子を血球から放出する前に溶解が行われる場合には、状況は異なる。各血球が、溶解の際に１０００個の異なる標的分子を生じる場合、標的分子の数は、サンプル採取された割合の逆数を大きく超え、標的を検出する確率は高い。

標的が、血球サンプル中に望ましくない病原体由来の標的である場合、およびプールした溶解物が、試験される標的に関して陰性である場合、プールを生じる血球サンプルが使用され得る（例えば、輸血などのためにまたはこのような使用のために預けられる）。逆に、プールした溶解物が、望ましくない標的に関して陽性であることが見出される場合、予め合わされたサンプルからの個々のアリコートは、そのプールされたサンプルのうちのどれがその病原体を与えたのかをデコンボリューションするために試験され得る。その病原体を与える血球サンプルは、血球サンプルの収集物から取り出され、これらの他の血球サンプルが使用され得る（例えば、輸血などのために）。標的が望ましいものである場合、試験は、デコンボリューションする際に、その標的を含む血球サンプルが維持されるかつ使用され得る（例えば、その血球サンプルに関しておよび／またはそのドナーからタンパク質標的を採取する）ことを除いて、類似である。

実施例１
この実施例は、感染したハムスター血液を溶解し、次いで、溶解したサンプルをさらなる溶解緩衝剤で希釈する方法と、同じハムスター血液が正常な血液で最初に希釈され、次いで溶解される方法とを比較する。条件Ａ（溶解−希釈）、１０μＬＢａｂｅｓｉａ感染ハムスター全血（その細胞のうちの５９％が感染していた）を、２０μＬＰＴＭ培地（２５０ｍＭ塩化アンモニウム、１４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、および８％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ｐＨは、７．２〜７．６の範囲）中で溶解し、次いで、ＰＴＭ中で段階希釈した。条件Ｂ（希釈−溶解）、１０μＬの同じ感染ハムスター血液を、ヒト全血で最初に段階希釈し、次いで、ＰＴＭ（１：３（ｖ／ｖ））で溶解する。感染したハムスター血液の寄生虫血症を、顕微鏡検査によって、およびＰＣＲによって決定した。ここで感染したハムスター血液からのＰＣＲ結果を、インビトロ転写希釈曲線のＰＣＲ結果と比較した。感染したハムスター血液の寄生虫血症は、４３，１３０寄生生物／ｍＬ（ｐ／ｍＬ）であることが決定され、条件ＡおよびＢの両方に関する希釈率は、以下を生じた：４，３１３ｐ／ｍＬ、４３１ｐ／ｍＬ、４３ｐ／ｍＬ、４．８ｐ／ｍＬ、１．６ｐ／ｍＬ、０．５ｐ／ｍＬ、０．１８ｐ／ｍＬ、０．０６ｐ／ｍＬ、０．０２ｐ／ｍＬ、および０．０１ｐ／ｍＬ。溶解を、周囲温度で５分間行った。上記希釈物における各サンプルからの５個の５００μＬアリコートを、標的捕捉およびリアルタイム転写媒介性増幅（ＴＭＡ）アッセイを使用して、Ｂａｂｅｓｉａに関して試験した。％反応性を、１００，０００より高いＲＬＵシグナルを有する増幅／検出反応がＢａｂｅｓｉａ標的の検出に関して陽性であるとして決定した。

標的捕捉を、米国特許第６，１１０，６７８号に一般に記載されるように行った。Ｂａｂｅｓｉａ１８ＳｒＲＮＡを、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，８２４，５１８号および同第７，８３３，７１６号に一般に記載されるように各サンプル中で増幅および検出した。サンプル中のＢａｂｅｓｉａ１８ＳｒＲＮＡを増幅するために使用されるプライマーは、以下のとおりであった：

その結果を、表２に示す。これは、％サンプル反応性と、試験した希釈での粒子数／ｍｌとを比較する。全血中で希釈したサンプルに関しては、その反応性は、４．８粒子／ｍｌと１．６粒子／ｍｌの最終濃度間でゼロへと低下する。対照的に、サンプルをＰＴＭ中で希釈する場合、１００％反応性が、０．１８粒子／ｍｌという少なくとも最終濃度まで得られる。これは、約２００１８ＳリボソームＲＮＡコピー／ｍｌに相当する。さらに、０．０６ｐ／ｍＬおよび０．０２ｐ／ｍＬでは、ＰＴＭ中で希釈したサンプルは、それぞれ、６０％反応性および４０％反応性を提供した。

実施例２

２４個のＢａｂｅｓｉａ陽性臨床ＲＢＣサンプルを、ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｄＣｒｏｓｓ（ＡＲＣ）から得た。これらの臨床サンプルを、各々Ａｄｓｏｌ溶液（食塩水、アデニン、デキストロースおよびマンニトールを含む保存溶液（ＦｅｎｗａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））に入れ、受け取ったら−２０℃で貯蔵した。上記サンプルを試験日に解凍し、操作する前に反転させることによって徹底的に混合した。各サンプルを、個々に試験する（個々のドナーを試験するまたはＩＤＴ）、および予備溶解プール法（ｐｒｅ−ｌｙｓｅｄｐｏｏｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）を使用してプールで試験するために調製することができた。

ＲＢＣサンプルの個々の溶解
臨床サンプルを溶解するために、サンプルのうちの５００μＬアリコートを、３．５ｍＬの寄生生物輸送培地（ｐａｒａｓｉｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｍｅｄｉｕｍ）（ＰＴＭ）とともに混合し、次いで、周囲温度で少なくとも３回穏やかに反転させることによって混合し、５分間静置した。この溶解物は、ＩＤＴ溶解物サンプルである。

この実施例において使用したＰＴＭは、２５０ｍＭ塩化アンモニウム、１４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、および８％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含み、ｐＨは、７．２〜７．６の範囲にある。

全血ドナーの１５個の正常陰性サンプルを、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩｎｃ．（ＬｏｎｇＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）から得、全血の１ｍＬアリコート対３ｍＬのＰＴＭの比を使用することによって溶解した。各陰性ドナーの溶解したサンプルのアリコートを、陰性コントロール用としてとっておいた。

プールの調製
１：４、１：８および１：１６のドナープールを、各臨床サンプルに関してＩＤＴ溶解物を使用して調製した。各プールしたサンプルの総容積は、４．８ｍＬであった。
・１：４のプールを、溶解した臨床サンプル１２００μＬと３個の溶解した陰性ドナーの各々１２００μＬとを合わせることによって調製した。
・１：８のプールを、溶解した臨床サンプル６００μＬと７個の溶解した陰性ドナーの各々６００μＬとを合わせることによって調製した。
・１：１６のプールを、溶解した臨床サンプル３００μＬと１５個の溶解した陰性ドナーの各々３００μＬとを合わせることによって調製した。

サンプルを一旦調製した後、それらを試験する前に数回反転させることによって混合した。

各ＩＤＴ溶解物、プールしたサンプル、および陰性コントロールサンプルに関して５００μＬの３個の複製物を、上記のＢａｂｅｓｉａＴＭＡアッセイを使用して自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステムで試験した。１００ｃ／ｍＬでのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉＩＶＴパネルを、陽性コントロールとして含めた。

結果を以下の表３に示す。データは、プールされた方法が１：４のプール係数を有する全ての臨床サンプル中で、および１：１６までのプール係数を有するサンプルの大部分において、Ｂａｂｅｓｉａ感染を検出できたことを示す。プール法、続いて標的捕捉およびＴＭＡに伴う感度は、個々のサンプルのＰＣＲの感度に匹敵した。

実施例３
この実施例において、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ感染ハムスター血液を、１寄生生物／ｍＬへと希釈し、プールし、核酸増幅およびプールしたサンプル中の検出限界に関する検出を使用して試験した。Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ感染ハムスター血液の近似の寄生虫血症を、顕微鏡検査を使用して計算した。最初の寄生虫血症概算に基づいて、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ感染ハムスター血液の段階希釈を、ヒト全血中で調製した。９個の別個の１ｍＬアリコートを、約１ｐ／ｍＬのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉを有すると概算したハムスター血液希釈レベルで作製した。その別個のアリコートの各々を、１ｍｌアリコートと３ｍＬの血球溶解溶液（約１００ｍＭＴＲＩＳ、２５〜３０ｍＭＭｇＣｌ_２、６％（ｖ／ｖ）ラウリル硫酸リチウムを含む水性溶液（約７．３〜７．６の間のｐＨ））とを合わせることによって溶解した。これらの９個の溶解物を、１：２０および１：２００プールにおいて直接試験した
。

上記９個の溶解物の各１：２０プールを、２５０μＬの溶解物をさらなる４．７５ｍＬの溶解試薬の中へと合わせることによって調製した。１：２００プールを、５００μＬのこの１：２０プールと、４．５ｍＬの溶解試薬とを合わせることによって調製した。溶解物のその９個のアリコートを、自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）での等温増幅および検出アッセイを使用して、５個の複製物で試験した。その９個の溶解物の各々から作製した１：２０プールおよび１：２００プールを、自動化Ｐａｎｔｈｅｒシステムでの等温増幅および検出アッセイを使用して７個の複製物で試験した。結果を表４に示す。

これらのデータは、わずか１ｐ／ｍＬ程度を含むサンプル中で、１：２０プールが１００％反応性であることを示す。さらに、１：２００プールは、良好な感度を示したが、１００％反応性ではなかった。従って、１００％での検出限界感度要件を有するアッセイに関しては、この実施例で示される溶解物プール結果は、少なくとも１：２０プールがその要件を満たすことを示す。１００％未満の感度要件を有するアッセイに関しては、この実施例は、１：２００程度の希薄なプールが顕著に良好な結果を提供することを示す。

本発明は、理解を明瞭にする目的で詳細に記載されてきたが、ある種の改変が、添付の請求項の範囲内で実施され得る。本出願において引用されるアクセッション番号、ウェブサイトなどを含む全ての刊行物、および特許文書は、引用により各々が個々に援用されると示されているのと同程度まで、全ての目的のためにそれらの全体において参考として援用される。配列、ウェブサイトまたは他の参考文献の種々のバージョンが、種々の時間で存在し得る程度まで、有効な出願日での上記参考文献と関連するバージョンが意味を持つ。有効な出願日は、発行時のアクセッション番号が開示される最も早い優先日を意味する。文脈から別段明らかでなければ、本発明の任意の要素、実施形態、工程、特徴または局面が、任意の他のものと組み合わせて実施され得る。

Claims

病原体の存在に関して、血球を含むサンプルアリコートを試験する方法であって、前記方法は、
（ａ）複数のサンプルの各々からサンプルアリコートを提供し、それによって、複数のサンプルアリコートを提供する工程；
（ｂ）前記複数のサンプルアリコートのうちのサンプルアリコートの各々と、溶解試薬とを別個に接触させる工程であって、それによって、前記複数のサンプルアリコートの各々の中の前記血球のうちの少なくとも一部が溶解する、工程；
（ｃ）工程（ｂ）の前記溶解したサンプルアリコートをプールして、プールした溶解物を形成する工程；
（ｄ）前記プールした溶解物を病原体の存在に関して試験する工程であって、それによって、前記プールした溶解物中の前記病原体の存在の同定が、前記サンプルアリコートのうちの少なくとも１つにおける前記病原体の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
前記溶解試薬は、（ｉ）緩衝剤；（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）；ならびに（ｉｉｉ）塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２、ＥＧＴＡ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される抗凝固薬のうちの一方または両方を含み、そして前記試薬は、５．５より高いｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
前記緩衝剤は、５ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で、または１４ｍＭの濃度で前記試薬中に存在する炭酸水素ナトリウムであり、前記試薬は、１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度、または２５０ｍＭの濃度の塩化アンモニウムである塩化物含有塩を含み、前記試薬のｐＨは、７．０〜８．０である、請求項２に記載の方法。
前記緩衝剤は、７５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度で、または１００ｍＭの濃度で前記試薬中に存在するＴＲＩＳ緩衝剤であり、前記塩化物含有塩は、２０ｍＭ〜３５ｍＭの濃度で、または３０ｍＭの濃度で前記試薬中に存在する塩化マグネシウムであり、前記ＬＬＳは、４％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度で前記試薬中に存在する、請求項２に記載の方法。
前記溶解したサンプルアリコートの各々の容積全体がプールされるか、または前記溶解したサンプルアリコートの各々の容積のうちの２５％までがプールされる、請求項１に記載の方法。
前記複数のサンプルアリコートは、４個のサンプルアリコートから２００個のサンプルアリコートまでである、請求項１に記載の方法。
前記複数のサンプルアリコートは、２０個までのサンプルアリコートであるか、または前記複数のサンプルアリコートは、１６個までのサンプルアリコートである、請求項６に記載の方法。
前記試験する工程（ｄ）において、病原体が前記プールした溶解物に存在することが決定される場合、前記方法は、前記サンプルアリコートを個々に試験して、前記サンプルのうちのどれが前記病原体に感染しているのかを同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記サンプルアリコートの各々は、全血、赤血球を含むサンプルアリコートおよび白血球を含むサンプルアリコートからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
各サンプルアリコートは、１：２〜１：１０（ｖ／ｖ）であるサンプルアリコート対溶解試薬の容積比で、前記溶解試薬と接触される、請求項１に記載の方法。
前記試験する工程（ｄ）は、前記試薬によって前記血球から放出される病原体由来の標的の存在に関して試験し、前記病原体由来の標的は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、および寄生生物からなる群より選択される病原体に由来する、請求項１に記載の方法。
前記病原体由来の標的は、核酸標的である、請求項１１に記載の方法。
前記病原体は、Ｂａｂｅｓｉａ属に由来する寄生生物、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属に由来する寄生生物、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属に由来する寄生生物、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属に由来する寄生生物、Ａｎａｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属に由来する寄生生物、Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂａｂｅｓｉａｄｕｎｃａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｋｎｏｗｌｅｓｉからなる群より選択される寄生生物である、請求項１１に記載の方法。
前記病原体由来の標的は、ＲＮＡ標的である、請求項１２に記載の方法。
前記試験する工程（ｄ）は、プールした溶解物と、捕捉プローブおよび固定化プローブとを接触させる工程であって、前記捕捉プローブは、前記核酸標的に相補的な第１のセグメントおよび前記固定化プローブに相補的な第２のセグメントを有する工程を包含し、ここで前記核酸標的は、前記捕捉プローブに結合し、そしてここで前記結合した捕捉プローブは、前記固定化プローブに結合する、請求項１２に記載の方法。
前記核酸標的の転写媒介性増幅を行う工程および得られた増幅生成物を検出プローブで検出する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
前記試験する工程（ｄ）は、核酸増幅および検出反応を行って、前記プールした溶解物中の病原体由来の標的を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
前記方法は、遠心分離工程なしで行われる、請求項１に記載の方法。