JP6767374B2 - 赤血球溶解溶液 - Google Patents

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Description

（背景）
血液中のＲＮＡを検出するための市販のアッセイが存在するが、このようなアッセイにおいて検出されるＲＮＡは、通常、細胞外形態で存在する（例えば、血液中のＨＩＶまたはＨＣＶ粒子）。赤血球内からのＲＮＡまたは他の標的分子の検出は、より困難だがやりがいがある。溶解によって放出される多くの非標的分子、特に、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼは標的分子を分解し得るので、溶解に使用される試薬は、その後の加工処理を妨げ得る。
ＲＮＡの本質的な不安定性および全血中のＲＮＡｓｅの存在は、ＲＮＡの単離を困難な仕事にする。高純度の無傷のＲＮＡの使用は、感度の高い臨床診断アッセイを容易にする。既存のアプローチは、代表的には、いくつかの一連の工程を要する：細胞を破壊する工程、タンパク質を変性する工程、ＲＮＡの安定化およびＲＮＡｓｅからの保護のための別の工程、ならびに、その後、ＲＮＡを単離するための工程。
テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート（ＴＤＴＭＡＯ）は、血液の輸送、貯蔵および加工処理のために一般に使用される（米国特許第６，６０２，７１８号および同第６，６１７，１７０号）。この四級アミンは、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の中に含まれ、細胞に浸透し、細胞内標的ＲＮＡを安定化することによって働く。そのＲＮＡは、次いで、後に、標準的技術を使用して、全血の成分から精製および分析され得る。細胞を溶解し、グアニジニウム塩を使用してＲＮａｓｅを阻害するための方法もまた、公知である（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら （１９８７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９）。
ヒトバベシア症は、赤血球のダニ媒介性赤血球内感染から生じる新興感染症である。Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉは、米国におけるバベシア症の最も一般的な原因であり、北東部の州および北中西部の州では、広く流行している。この種は、米国での輸血感染性バベシア症（ＴＴＢ）の症例の大部分に関係付けられており、現在、ＦＤＡに最も多く報告されている輸血感染性疾患である。２００５〜２０１０年の間に、ＦＤＡに報告された輸血関連死のうちの３．６％は、ＴＴＢが原因であった。しかし、この因子が米国の血液供給に与えるリスクにも拘わらず、今日までにＢａｂｅｓｉａの血液スクリーニングのためにＦＤＡが認可した検査は存在しない。
米国特許第６，６０２，７１８号明細書 米国特許第６，６１７，１７０号明細書
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら （１９８７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９
（特許請求される発明の要旨）
本発明は、塩化アンモニウム、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および抗凝固薬を含む試薬を提供する。一部の実施形態では、前記試薬は、緩衝剤をさらに含む。一部の実施形態では、前記緩衝剤は、重炭酸ナトリウムである。一部の実施形態では、前記緩衝剤のｐＨは、７〜８または７．２〜７．６である。一部の実施形態では、前記抗凝固薬は、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはシトレートである。
一部の実施形態では、前記試薬中の塩化アンモニウムの濃度は、１００〜５００ｍＭ、２００〜３００ｍＭまたは２５０ｍＭである。一部の実施形態では、前記試薬中のＬＬＳの濃度は、４〜１５％（ｖ／ｖ）、５〜８％（ｖ／ｖ）または５％（ｖ／ｖ）である。一部の実施形態では、前記試薬中の重炭酸ナトリウムの濃度は、５〜３０ｍＭ、１０〜２０ｍＭまたは１４ｍＭである。一部の実施形態では、塩化アンモニウムの濃度は、２５０ｍＭであり、ＬＬＳの濃度は、５％（ｖ／ｖ）であり、重炭酸ナトリウムの濃度は、１４ｍＭであり、ｐＨは、７．２〜７．６である。
一部の実施形態では、前記試薬は、赤血球または赤血球に由来する生成物と混合される。一部の実施形態では、 前記試薬は、全血と混合される。一部の実施形態では、前記試薬は、３：１（ｖ／ｖ）の比で全血と混合される。一部の実施形態では、前記全血は、ヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である。
本発明はさらに、赤血球に由来する標的を分析する方法を提供し、該方法は、（ａ）赤血球と、塩化アンモニウムおよびアニオン性界面活性剤を含む試薬とを接触させる工程であって、該試薬は、該赤血球を溶解し、かつ該赤血球から放出された標的の分解を阻害するために有効である、工程；ならびに（ｂ）該赤血球から放出された該標的を分析する工程を包含する。
一部の方法では、前記標的は、病原体由来の標的である。一部の方法では、前記標的は、ＲＮＡである。
一部の方法では、前記赤血球のうちの少なくとも５０％は、５分またはそれ未満で溶解される。一部の方法では、溶解された赤血球のパーセンテージは、溶解された白血球のパーセンテージより高い。
一部の方法では、前記標的を分析する工程は、前記放出された標的と、捕捉プローブおよび固定化プローブとを接触させる工程を包含し、該捕捉プローブは、該標的に相補的な第１のセグメントおよび該固定化プローブに相補的な第２のセグメントを有し、ここで該標的は、該捕捉プローブに結合し、そしてここで該結合された捕捉プローブは、該固定化プローブに結合する。一部の方法は、前記標的の転写媒介性増幅を行う工程および該得られた増幅生成物を検出プローブで検出する工程をさらに包含する。
一部の方法は、前記試薬を、前記赤血球から放出された前記標的から分離するための遠心分離工程なしで行われる。
一部の方法では、前記標的は、Ｂａｂｅｓｉａ属の病原性生物に由来する１８Ｓ ｒＲＮＡである。一部の方法では、前記病原性生物は、種Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉのものである。一部の方法では、検出限界は、全血１ｍＬあたりＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ １８Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも２×１０３コピーのＢａｂｅｓｉａである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
塩化アンモニウム、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および抗凝固薬を含む試薬。
（項目２）
緩衝剤をさらに含む、項目１に記載の試薬。
（項目３）
前記緩衝剤は、重炭酸ナトリウムである、項目２に記載の試薬。
（項目４）
前記緩衝剤のｐＨは、７〜８である、項目２または項目３に記載の試薬。
（項目５）
前記抗凝固薬は、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはシトレートである、先行する項目のいずれか１項に記載の試薬。
（項目６）
塩化アンモニウムの濃度は、１００〜５００ｍＭである、項目１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
（項目７）
塩化アンモニウムの濃度は、２００〜３００ｍＭである、項目１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
（項目８）
塩化アンモニウムの濃度は、２５０ｍＭである、項目１〜７のいずれか１項に記載の試薬。
（項目９）
ＬＬＳの濃度は、４〜１５％（ｖ／ｖ）である、項目１〜８のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１０）
ＬＬＳの濃度は、５〜８％（ｖ／ｖ）である、項目１〜９のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１１）
ＬＬＳの濃度は、５％（ｖ／ｖ）である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１２）
重炭酸ナトリウムの濃度は、５〜３０ｍＭである、項目３〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１３）
重炭酸ナトリウムの濃度は、１０〜２０ｍＭである、項目３〜１２のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１４）
重炭酸ナトリウムの濃度は、１４ｍＭである、項目３〜１３のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１５）
前記緩衝剤のｐＨは、７．２〜７．６である、項目３〜１４のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１６）
塩化アンモニウムの濃度は、２５０ｍＭであり、ＬＬＳの濃度は、５％（ｖ／ｖ）であり、重炭酸ナトリウムの濃度は、１４ｍＭであり、ｐＨは、７．２〜７．６である、項目３〜１５のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１７）
前記試薬は、赤血球または赤血球に由来する生成物と混合される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１８）
前記試薬は、全血と混合される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１９）
前記試薬は、３：１（ｖ／ｖ）の比で全血と混合される、項目１８に記載の試薬。
（項目２０）
前記全血は、ヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、項目１８または項目１９に記載の試薬。
（項目２１）
赤血球に由来する標的を分析する方法であって、該方法は、
（ａ）赤血球と、塩化アンモニウムおよびアニオン性界面活性剤を含む試薬とを接触させる工程であって、該試薬は、該赤血球を溶解し、かつ該赤血球から放出された標的の分解を阻害するために有効である、工程；ならびに
（ｂ）該赤血球から放出された該標的を分析する工程、
を包含する方法。
（項目２２）
前記標的は、病原体由来の標的である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記標的は、ＲＮＡである、項目２１または項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記赤血球のうちの少なくとも５０％は、５分またはそれ未満で溶解される、項目２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
溶解された赤血球のパーセンテージは、溶解された白血球のパーセンテージより高い、項目２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記試薬は、項目１〜２０のいずれかに定義されるとおりである、項目２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記標的を分析する工程は、前記放出された標的と、捕捉プローブおよび固定化プローブとを接触させる工程を包含し、該捕捉プローブは、該標的に相補的な第１のセグメントおよび該固定化プローブに相補的な第２のセグメントを有し、ここで該標的は、該捕捉プローブに結合し、そしてここで該結合された捕捉プローブは、該固定化プローブに結合する、項目２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記標的の転写媒介性増幅を行う工程および該得られた増幅生成物を検出プローブで検出する工程をさらに包含する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記試薬を、前記赤血球から放出された前記標的から分離するための遠心分離工程なしで行われる、項目２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記標的は、Ｂａｂｅｓｉａ属の病原性生物に由来する１８Ｓ ｒＲＮＡである、項目２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記病原性生物は、種Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉのものである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
検出限界は、全血１ｍＬあたりＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ １８Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも２×１０ ３ コピーである、項目３１に記載の方法。
図１は、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加（spike）したヒト全血中のＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの検出を示す。サンプルを、２５０ｍＭの濃度の緩衝化塩化アンモニウム（ＡＣＬ）の溶解試薬で溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ標的捕捉試薬（ＴＣＲ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ）を使用して検出した。
図２ａ、２ｂおよび２ｃは、種々の溶解試薬の分析、およびそれら試薬が分析のためにＴＣＲに加えられたときの、細胞沈殿も、細胞集塊化も、細胞デブリも、磁性ビーズ喪失も引き起こすことなく、全血サンプルを溶解するその能力を示す。 図２ａ、２ｂおよび２ｃは、種々の溶解試薬の分析、およびそれら試薬が分析のためにＴＣＲに加えられたときの、細胞沈殿も、細胞集塊化も、細胞デブリも、磁性ビーズ喪失も引き起こすことなく、全血サンプルを溶解するその能力を示す。 図２ａ、２ｂおよび２ｃは、種々の溶解試薬の分析、およびそれら試薬が分析のためにＴＣＲに加えられたときの、細胞沈殿も、細胞集塊化も、細胞デブリも、磁性ビーズ喪失も引き起こすことなく、全血サンプルを溶解するその能力を示す。
図３は、種々の溶解試薬の組成、およびＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの検出のために全血サンプルを溶解するためのそれら試薬の潜在的使用を示す。
図４は、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを検出する前に全血サンプルを溶解するにあたって使用するためのＰＴＭ２．４（２５０ｍＭ ＡＣＬ、１４ｍＭ 重炭酸ナトリウム、５％ ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ））とＩＣ緩衝剤（１０％ ＬＬＳ）との間の比較を示す。
図５は、全血サンプル中のＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの検出のための緩衝化ＡＣＬ溶液におけるＬＬＳの効果を示す。
図６Ａは、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液の連続希釈物を添加したヒト全血サンプル中でＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを検出するためのアッセイ感度を示す。サンプルを、検出する前に、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬で溶解した。任意（arbitrary）カットオフ＝５０，０００ ＲＬＵ；任意の活性＞５０，０００ ＲＬＵを、１００％反応性とみなす。
図６Ｂは、ヒト全血へと添加したＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡインビトロ転写物を検出するためのアッセイの感度を示す。添加したサンプルを、検出する前に、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳの溶解試薬で溶解した。任意カットオフ＝５０，０００ ＲＬＵ；任意の活性＞５０，０００ ＲＬＵを、１００％反応性とみなす。
図７は、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの検出のためにヒト全血に対する溶解試薬の２つの比の間の比較を示す。緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬を、細胞溶解のために使用した。実験において評価したヒト全血 対 溶解試薬の比は、１：２および１：３（血液：試薬）であった。任意カットオフ＝５０，０００ ＲＬＵ；任意の活性＞５０，０００ ＲＬＵを、１００％反応性とみなす。
図８は、６名の異なるドナーから得られたヒト全血サンプル中でＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを検出するためのアッセイの再現性を示す。任意カットオフ＝５０，０００ ＲＬＵ；任意の活性＞５０，０００ ＲＬＵを、１００％反応性とみなす。
図９は、ヒト全血中のＢａｂｅｓｉａ寄生生物の安定性を示す。Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液の連続希釈物を、ヒト全血へと添加した。一方の群を、分析する前に２５℃で５日間貯蔵した。別の群を、寄生生物感染血液を加えた直後に分析した。その感染全血サンプルを、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを検出する前に、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳの溶解試薬で溶解した。任意カットオフ＝５０，０００ ＲＬＵ；任意の活性＞５０，０００ ＲＬＵを、１００％反応性とみなす。
図１０は、赤血球から放出されたＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの安定性を示す。Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液の連続希釈物を、ヒト全血へと添加した。サンプルを、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬で溶解した。溶解の後、サンプルを、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを分析する前に、０日間、１日間、３日間、または４日間、４℃で貯蔵した。任意カットオフ＝５０，０００ ＲＬＵ；任意の活性＞５０，０００ ＲＬＵを、１００％反応性とみなす。
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、非Ｔ７プライマーの核酸配列を示す。
配列番号２は、Ｔ７プライマーの核酸配列を示す。
配列番号３は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）プローブの核酸配列を示す。
配列番号４は、標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）プローブの核酸配列を示す。
配列番号５は、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡのインビトロ転写物コピーの核酸配列を示す。
（定義）
病原体とは、ヒトおよび他の動物における疾患の原因となる、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、および他の微生物を包含する。
標的は、単一のタイプの分子（例えば、Ｂａｂｅｓｉａのタンパク質または１８Ｓ ｒＲＮＡ）、または分子の一クラス（例えば、Ｂａｂｅｓｉａに由来する任意のタンパク質もしくはＲＮＡ、または赤血球に由来する任意のタンパク質もしくはＲＮＡ）であり得る。複数の別個の標的（例えば、ＲＮＡ標的およびタンパク質標的、または２種の別個のＲＮＡ標的（例えば、２種の異なるｍＲＮＡ標的、もしくはｍＲＮＡ標的およびｒＲＮＡ標的））もまた、分析され得る。標的は、赤血球の内因性成分、および感染赤血球の病原性感染の結果として生じ、感染している病原体によって代表的にコードされる成分（すなわち、「病原性」または「病原体由来」標的）を包含する。
溶解試薬は、全血または赤血球生成物（例えば、ペレット化赤血球）中の赤血球の溶解を誘導するために有効な、（しばしば溶液の形態で提供される）試薬である。
赤血球を、血液の他の細胞成分よりも優先的に溶解することは、溶解した赤血球のパーセンテージが、分析されるサンプル中に存在する他の細胞成分（他の細胞タイプは、凝集物中で評価される）のパーセンテージより高いことを意味する。
アニオン性界面活性剤（anionic detergent）は、負に荷電した、アニオン性のヘッド基および長い炭化水素テールを有し、しばしばアルカリ金属またはアンモニウムイオンとの塩として提供される化合物である。
抗凝固薬は、全血の凝固を阻害する。抗凝固薬としては、ヘパリンおよびカルシウムキレート化剤が挙げられる。ヘパリンは、トロンビンおよび血液凝固に関与する他のプロテアーゼの活性を阻害するアンチトロンビンＩＩＩを活性化する。カルシウムキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡおよびシトレート）は、血液凝固に必要とされるカルシウムイオンを結合する。
緩衝剤（buffer）とは、溶液のｐＨを維持するために使用される弱酸または弱塩基をいう。
核酸とは、一緒に結合されてポリマーを形成する窒素性複素環式塩基もしくは塩基アナログを有する、ヌクレオチドまたはアナログを含むマルチマー化合物（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびこれらのアナログが挙げられる）をいう。
この窒素性複素環式塩基は、核酸塩基（nucleobase）といわれ得る。核酸塩基は、以下であり得る：従来のＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、塩基アナログ（例えば、イノシン、５−ニトロインダゾールＬ−ヌクレオチド、および他（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５−３６， Ａｄａｍｓら， ｅｄ．， １１．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．， １９９２； ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔｔら， １９９５， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３（２１）： ４３６３−７０））、イミダゾール−４−カルボキサミド（Ｎａｉｒら， ２００１， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ， ２０（４−７）：７３５−８）、ピリミジンもしくはプリン誘導体（例えば、修飾ピリミジン塩基６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（ときおり、ＡまたはＧを結合する「Ｐ」塩基と表される）および修飾プリン塩基Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン（ときおりＣまたはＴを結合する「Ｋ」塩基と表される））、ヒポキサンチン（Ｈｉｌｌら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５（８）：４２５８−６３， Ｌｉｎ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， １９９２， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（１９）：５１４９−５２）、２−アミノ−７−デアザ−アデニン（これはＣおよびＴと対合する； Ｏｋａｍｏｔｏら， ２００２， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １２（１）：９７−９）、Ｎ−４−メチルデオキシグアノシン（Ｎ−４−ｍｅｔｈｙｌ ｄｅｏｘｙｇａｕｎｏｓｉｎｅ）、４−エチル−２’−デオキシシチジン（Ｎｇｕｙｅｎら， １９９８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６（１８）：４２４９−５８）、４，６−ジフルオロベンゾイミダゾールおよび２，４−ジフルオロベンゼンヌクレオシドアナログ（Ｋｉｏｐｆｆｅｒ ＆ Ｅｎｇｅｌｓ， ２００５， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ， ２４（５−７） ６５１−４）、ピレン官能化ＬＮＡヌクレオシドアナログ（Ｂａｂｕ ＆ Ｗｅｎｇｅｌ， ２００１， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． （Ｃａｍｂ．） ２０： ２１１４−５； Ｈｒｄｌｉｃｋａら， ２００５， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２７（３８）： １３２９３−９）、デアザ修飾またはアザ修飾されたプリンおよびピリミジン、５位または６位で置換基を有するピリミジン、および２位、６位または８位で置換基を有するプリン、２−アミノアデニン（ｎＡ）、２−チオウラシル（ｓＵ）、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ−６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、ならびにＯ−４−アルキル−ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２５号；ＰＣＴ番号ＷＯ ９３／１３１２１； Ｇａｍｐｅｒら， ２００４， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４３（３１）： １０２２４−３６）、ならびに水素結合なしの二重鎖ＤＮＡを形成する疎水性核酸塩基（Ｂｅｒｇｅｒら， ２０００， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８（１５）： ２９１１−４）。多くの誘導体化および修飾された核酸塩基またはアナログは、市販されている（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， Ｖａ．）。
糖に付着した核酸塩基ユニットは、核酸塩基ユニット、またはモノマーといわれ得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または類似化合物（例えば、２’メトキシまたは２’ハライド置換を有する）であり得る。ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、核酸塩基ユニットの例である。
この核酸塩基ユニットは、種々の結合またはコンホメーション（ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート結合、ペプチド−核酸結合（ＰＮＡ； Ｎｉｅｌｓｅｎら， １９９４， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ５（１）： ３−７； ＰＣＴ番号ＷＯ ９５／３２３０５）、および二環式フラノースユニットを有するヌクレオチドモノマーがＲＮＡ摸倣糖コンホメーションの中にロックされているロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）コンホメーション（Ｖｅｓｔｅｒら， ２００４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３−４１； Ｈａｋａｎｓｓｏｎ ＆ Ｗｅｎｇｅｌ， ２００１， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １１ （７）：９３５−８）、または核酸鎖の中のこのような結合の組み合わせが挙げられる）によって連結され得る。核酸は、１個もしくはこれより多くの「脱塩基」残基を含み得る。すなわち、その骨格は、１個もしくはこれより多くの位置に窒素性塩基を含まない（米国特許第５，５８５，４８１号）。
核酸は、従来のＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基および結合のみを含んでいてもよいし、従来の成分および置換の両方を含んでいてもよい（例えば、２’−Ｏ−メチル結合を有する従来のＲＮＡ塩基、または従来の塩基およびアナログの混合物）。ＰＮＡ、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換されたＲＮＡ、または全体的な電荷、電荷密度、もしくはハイブリダイゼーション複合体の立体的な会合に影響を及ぼす構造（荷電した結合を含むオリゴマー（例えば、ホスホロチオエート）または中性基（例えば、メチルホスホネート）が挙げられる）を含めることは、核酸によって形成される二重鎖の安定性に影響を及ぼし得る。
オリゴマーは、全体的な長さおよび他の特性において実質的に同じであるが、そのオリゴマーのうちの少なくとも一部が、特定の長さに対して異なる塩基のランダム組み込みによって合成されているオリゴマーの集団（例えば、ＤＮＡオリゴマー中の全４種の標準的塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）のランダムアソートメント、またはより大きなオリゴマーの規定された部分におけるいくつかの塩基（ＵまたはＴおよびＧ）のランダムアソートメント）をいう「ランダムポリマー」配列を含み得る。その得られるオリゴマーは、実際には、メンバーの有限の数が、そのランダム部分を構成する塩基の長さおよび数によって決定されるオリゴマーの集団である（例えば、２種の異なる塩基を使用することによって合成された６ｎｔランダム配列を含むオリゴマーの集団においては２６種のオリゴマー）。
核酸の相補性は、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基の基の配向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列に水素結合することを意味する。相補的な塩基は、代表的には、ＤＮＡでは、ＡとＴおよびＣとＧであり、ＲＮＡでは、ＣとＧ、およびＵとＡである。相補性は、完全（すなわち、正確）または実質的／十分であり得る。２つの核酸の間の完全な相補性は、その２つの核酸が、二重鎖の中のあらゆる塩基が、ワトソン−クリック対合によって相補的塩基に結合される二重鎖を形成し得ることを意味する。「実質的」または「十分」な相補性は、一方の鎖の配列が対向する鎖の配列に完璧におよび／または完全に相補的であるわけではないが、この２つの鎖上の塩基間でこの十分な結合が起こって、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）において安定なハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列および標準的な数学的計算を使用して、ハイブリダイズされる鎖のＴｍを推定することによってか、または慣用的方法を使用することによるＴｍの経験的決定によって、推定され得る。Ｔｍとは、２つの核酸鎖の間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性される温度をいう。Ｔｍ未満の温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるのに対して、Ｔｍより高い温度では、このハイブリダイゼーション複合体における鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）を使用することによって、水性１Ｍ ＮａＣｌ溶液中で既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸に関して概算され得るが、他の公知のＴｍ計算法は、核酸の構造特性を考慮に入れる。
「分離する」または「単離する」または「精製する」とは、１種またはこれより多くの成分を、複雑な混合物（例えば、サンプル）から取り出すことをいう。好ましくは、分離する工程、単離する工程または精製する工程は、他のサンプル成分から、標的核酸のうちの少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも９０％、およびより好ましくは、少なくとも９５％ ｗ／ｗを取り出す。分離する工程、単離する工程または精製する工程は、必要に応じて、非標的サンプル成分を除去するために、さらなる洗浄工程を含み得る。
捕捉ハイブリッドの「放出」とは、捕捉ハイブリッドの１種またはこれより多くの成分を互いから分離すること、例えば、標的核酸を捕捉プローブから、および／または捕捉プローブを固定化プローブから分離することをいう。標的核酸鎖の放出は、標的を、捕捉ハイブリッドの他の成分から分離し、この標的を、検出プローブへの結合に利用可能にする。この捕捉ハイブリッドの他の成分は、標的検出に影響を及ぼすことなく、例えば、捕捉プローブ鎖を捕捉支持体上の固定化プローブに結合したままにし得る。
「標識」とは、例えば、検出可能なシグナルを生成する反応を触媒することによって、検出可能な応答またはシグナルを、直接的にまたは間接的に、検出可能であるかまたは生成する分子部分をいう。標識としては、発光部分（例えば、蛍光、生物発光、または化学発光化合物）、放射性同位体、特異的結合対（例えば、ビオチンおよびアビジン）のメンバー、酵素もしくは酵素基質、反応性の基、または発色団（例えば、検出可能な色を生じる色素または粒子）が挙げられる。
捕捉プローブは、配列の標的相補性領域を含む第１のセグメント、およびこの捕捉プローブ（またはこの捕捉プローブを含むハイブリダイゼーション複合体）を固定化プローブに付着させるための第２のセグメントを含む。この第１のセグメントは、第１のセグメントおよび標的核酸がハイブリダイズして、ハイブリダイズする条件（例えば、実施例に記載されるもの）下で安定な（すなわち、検出可能な融解点を有する）二重鎖を形成し得るように、特定の標的核酸配列に実質的に相補性であるように構成され得る。あるいは、この第１のセグメントは、ハイブリダイズする条件下で、サンプル中の核酸配列に非特異的に結合するように構成され得る（ＷＯ ２００８／０１６９８８を参照のこと）。この第２のセグメントは、固定化プローブの配列に相補的である配列の領域を含む。好ましくは、キメラ捕捉プローブは、核酸ホモポリマー（例えば、ポリ−Ａまたはポリ−Ｔ）であって、捕捉プローブの標的相補性領域に共有結合されかつ先に記載される（Ｗｅｉｓｂｕｒｇらの米国特許第６，１１０，６７８号）ように、固定化プローブの相補的ホモポリマー（例えば、それぞれ、ポリ−Ｔまたはポリ−Ａ）に適切な条件下でハイブリダイズするものを含む。捕捉プローブは、クロージング配列（ｃｌｏｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として作用して、捕捉反応において結合されていない標的捕捉プローブを不活性化する第３のセグメントをさらに含み得る。この第３のセグメントは、上記第２のセグメントに対向する上記第１のセグメントに隣接し得る（例えば、捕捉配列：標的ハイブリダイズする配列：クロージング配列）か、またはこの第３のセグメントは、上記第１のセグメントに対向する上記第２のセグメントに隣接し得る（例えば、クロージング配列：捕捉配列：標的ハイブリダイズする配列）。ＷＯ ２００６／００７５６７およびＵＳ ２００９−０２８６２４９を参照のこと。
固定化プローブは、支持体に直接的にまたは間接的に結合される核酸を含む。この核酸は、上記捕捉プローブ中の核酸に相補的であるが、上記捕捉プローブにおける長さと同じ長さ（核酸塩基ユニットの数）であってもよいし、そうでなくてもよい。この固定化プローブ中の核酸は、好ましくは、少なくとも６個連続した核酸塩基のユニットを含み、例えば、１０〜４５個または１０〜４０個または１０〜３０個または１０〜２５個または１５〜２５個（両端を含む）のＬ−核酸塩基ユニットを含み得る。上記核酸は、好ましくはホモポリマーであり、より好ましくは、アデニンまたはチミンのホモポリマーである。固定化プローブの好ましい形態は、アデニン残基のホモポリマーを有する第２のセグメントを含む捕捉プローブと組み合わせて使用するための、１４個のチミン残基のホモポリマーであるか、または１４個のチミン残基のホモポリマーを含む。固定化プローブの核酸部分は、代表的には、１本鎖形態で提供されるか、またはそうでなければ、使用前もしくは使用中に、１本鎖形態へと変性される。
種々の材料のうちのいずれも、固定化プローブのための支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および磁気で引きつけられ得る物質から作製されるマトリクスまたは粒子）として使用され得る。単分散性磁性スフェアは好ましい支持体である。なぜならそれらは、サイズが比較的均質であり、好ましくは自動化システムにおいて反応容器へと磁力を印加することによって、溶液から容易に回収されるからである。固定化プローブは、その捕捉支持体へと、例えば、種々の共有結合、キレート化、もしくはイオン性相互作用のうちのいずれかを使用することによって直接結合されてもよいし、上記支持体に結合された１もしくはこれより多くのリンカーを介して間接的に結合されてもよい。このリンカーは、捕捉プローブにハイブリダイズすることは意図しないが、固定化プローブの核酸とその支持体との間のスペーサーとして作用することが意図される、１個もしくはこれより多くのヌクレオチドを含み得る。
「検出プローブ」は、標的配列に特異的に結合しかつこの結合が、この標的配列の存在を示す検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じる、核酸または他の分子である。検出プローブは、検出可能なシグナルを生成するために標識される必要はない（例えば、プローブがその標的配列に結合することから生じる電気インパルスが、検出可能なシグナルであり得る）。「標識されたプローブ」は、標識を含むか、または直接的にまたは間接的に標識に結合されているプローブである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｈａｐｔ． １０；米国特許第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；米国特許第５，５４７，８４２号、Ｈｏｇａｎら；米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；米国特許第４，５８１，３３３号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら；米国特許第５，７３１，１４８号、Ｂｅｃｋｅｒら）。例えば、検出プローブは、非ヌクレオチドリンカーおよびこのリンカーに付着された化学発光標識を含み得る（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄら）。検出プローブの例は、均質系の反応（例えば、結合しているかまたは結合していないプローブ上の標識の差次的加水分解を使用するもの）において検出される付着された標識を有する約５〜５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む。
検出プローブは、アッセイの形式に依存して、標的配列と同じセンスまたは対向センス配列であるヌクレオチド配列を有し得る。検出プローブは、捕捉プローブと、標的配列の同じまたは異なるセグメントにハイブリダイズし得る。いくつかの検出プローブは、付着された化学発光マーカー、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物を有する（米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号）。いくつかの検出プローブにおいて、アクリジニウムエステル標識は、ヌクレオチド塩基のアミンをＡＥの両側に拘束しかつインターカレーションのための部位を提供する非ヌクレオチドリンカーを使用することによって、ＡおよびＴの塩基対の領域の近くにあるプローブの中心領域に付着される（米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６５６，７４４号、Ａｒｎｏｌｄら）。あるいは、ＡＥ標識は、検出プローブの３’末端または５’末端に付着され得、この検出プローブは、標的核酸上の検出プローブに隣接してハイブリダイズして、標的核酸によって与えられる近くのアミンの効果を制限する第２のオリゴマーとともに使用される。いくつかの検出プローブにおいて、関連する非標的ポリヌクレオチド配列とのミスマッチの部位にまたはこの部位の近くにあるＡＥ標識は、僅か１個のヌクレオチドが異なり得る関連する配列と標的配列との間の区別を可能にする。なぜならこのミスマッチ部位の周辺の二重鎖の領域は、その関連する非標的配列にハイブリダイズしたプローブ上のＡＥを、加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に感受性にするために十分に不安定化されるからである。ＨＩＶ−１およびＨＣＶは、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅによる市販のＰＲＯＣＬＥＩＸ（登録商標） ＵＬＴＲＩＯ ＨＩＶ−１／ＨＣＶ／ＨＢＶ Ａｓｓａｙの改変形態を使用して検出され得る。この改変は、捕捉プローブおよび固定化プローブにおけるＤ−ポリＡおよびＤ−ポリＴの配列を、それぞれ、Ｌ−ポリＡおよびＬ−ポリＴで置き換えることを要する。
「ハイブリダイゼーション条件」とは、１本の核酸鎖が相補的な鎖の相互作用および水素結合によって第２の核酸鎖に結合して、ハイブリダイゼーション複合体を生成する累積的環境をいう。このような条件は、核酸を含む水性または有機性の溶液の化学的成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート化剤、ホルムアミド）、ならびにこの混合物の温度を含む。他の要因（例えば、インキュベーション時間の長さまたは反応チャンバの寸法）は、その環境に寄与し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．， ｐｐ． １．９０−１．９１， ９．４７−９．５１， １１．４７−１１．５７ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９））。
１つのまたは複数の標的核酸への標的捕捉オリゴマーの特異的結合は、安定な二重鎖を形成する、標的捕捉オリゴマーの第１のセグメント中の１つの規定された配列と標的核酸上の正確にもしくは実質的に相補性のセグメントとの間の結合を意味する。このような結合は、その単一の規定された標的捕捉オリゴマー配列に正確にもしくは実質的に相補的なセグメントを欠いている、そのサンプル中の他の核酸への結合よりも検出可能に強い（より高いシグナルまたは融解温度）。標的核酸への標的捕捉オリゴマーの非特異的結合は、その標的捕捉オリゴマーが、単一の規定された標的捕捉オリゴマー配列に対して正確なもしくは実質的な相補性を有するセグメントを共有しない標的配列の集団に結合し得ることを意味する。例えば、その捕捉プローブの第１のセグメントにおけるランダム化配列を使用することによって、このようなことが達成され得る。
核酸の間の結合を欠いていることは、実質的な相補性を欠いているが問題の核酸と同じ長さの核酸のランダムに選択された対の間で起こる非特異的結合から区別不能な結合によって明らかになり得る。
捕捉ハイブリッドの「放出」とは、捕捉ハイブリッドの１またはこれより多くの成分を互いから分離すること（例えば、標的核酸を捕捉プローブから、および／または標的捕捉オリゴマーを固定化プローブから分離すること）をいう。その標的核酸鎖の放出は、標的を、捕捉ハイブリッドの他の成分から分離し、その標的を検出プローブへの結合のために利用可能にする。この捕捉ハイブリッドの他の成分は、標的検出に影響を及ぼすことなく、例えば、標的捕捉オリゴマー鎖を、捕捉支持体上の固定化プローブに結合したままにし得る。
「感度」とは、それ自体として正確に特定された真の陽性の割合である（例えば、感染を有すると正確に特定された感染患者のパーセンテージ）。特異度とは、正確に特定された真の陰性の割合を測定する（例えば、感染を有さないと正確に特定された非感染患者のパーセンテージ）。
値の範囲への言及はまた、範囲内の整数およびその範囲の中の整数によって規定される部分範囲を含む。任意の数値または数値範囲への言及は、他の代表的な使用条件を評価する測定時において本質的であるように、任意のこのようなバリエーションを包含すると理解されるものとする。
（詳細な説明）
（Ｉ．一般）
本発明は、赤血球を溶解することによってＲＮＡまたは他の標的を分析に適切な形態で放出するための溶解試薬を提供する。この溶解試薬は、少なくとも塩化アンモニウムおよびアニオン性界面活性剤を含み、そして抗凝固薬を含み得る。上記試薬は、赤血球を溶解し、放出された標的を溶解物中での分解から保護するように働き、その標的の分析のためのその後の工程（例えば、標的捕捉、増幅、検出、および／または配列決定）と適合性である。好ましくは、上記溶解試薬は、サンプル（例えば、全血）中の赤血球を、存在する白血球または他の細胞と比較して優先的に溶解して、他の細胞タイプの溶解物に由来する汚染を低減しかつ均質なサンプルを生成する。上記溶解試薬は、赤血球に感染する病原体由来のＲＮＡ（ＢａｂｅｓｉａおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ speciesのような寄生生物が挙げられる）の分析に特に適している。
本発明は、病原体由来ＲＮＡを赤血球から調製および分析するための種々の公知の溶解因子にともなう欠陥を特定することから一部生じる。公知の溶解因子は、溶解したサンプルを捕捉試薬に添加した場合に、細胞集塊化、沈殿物の出現、および磁性ビーズの喪失を引き起こして、病原体由来ＲＮＡを分析するための試薬および方法と不適合であることが見出された。それとは対照的に、本発明の溶解試薬は、これら方法と適合性であり、全血サンプル中の赤血球の優先的溶解、ならびに標的捕捉および転写媒介性増幅後のその放出される病原体由来ＲＮＡの感度の高い検出を可能にした。本発明の溶解試薬はまた、溶解後のヌクレアーゼおよびプロテアーゼによる病原体由来ＲＮＡの分解を阻害し、サンプル間での再現性を示した。
（ＩＩ．溶解試薬）
本発明の溶解試薬は、少なくとも塩化アンモニウムおよびアニオン性界面活性剤、ならびに好ましくは、抗凝固薬を含む。塩化アンモニウム（ＡＣＬ）は、溶解因子として作用する。全血において、塩化アンモニウムは、赤血球を、白血球よりも優先的に溶解し、従って、サンプルの汚染および検出アッセイの工程の妨害を低減する。塩化アンモニウムに関する例示的濃度範囲としては、１００〜１０００ｍＭ、１００〜８００ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、１５０〜３００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２５０ｍＭが挙げられる。
上記アニオン性界面活性剤は、溶解因子および赤血球の溶解後の標的分解のインヒビターの両方として作用し得る。上記アニオン性界面活性剤は、核酸の分解を阻害するために特に有用である。例示的アニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。ＬＬＳが好ましい。例示によれば、ＬＬＳに関する１４．７ｍＭ〜５５ｍＭの濃度範囲は、ストックＬＬＳ溶液の４〜１５％（ｖ／ｖ）、５〜８％（ｖ／ｖ）、または約５％（ｖ／ｖ）である。
上記抗凝固薬は、存在する場合には、サンプル（例えば、全血または赤血球）の凝固を阻害するために十分な濃度で使用される。凝固を阻害することによって、この抗凝固薬は、赤血球を単離する方法の間にサンプルを遠心分離する必要性を排除する。例示的な抗凝固薬としては、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはシトレートが挙げられる。ＥＤＴＡが好ましい。ＥＤＴＡの例示的な濃度としては、０．０１〜１０ｍＭ、０．０５〜１．０ｍＭ、０．０５〜０．５０ｍＭ、０．０７５〜０．１２５ｍＭ、または０．１ｍＭが挙げられる。
溶解試薬はまた、緩衝剤を含み得る。重炭酸ナトリウムは、適切な緩衝剤の一例である。他の適切な緩衝剤は、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＰＳＯ、イミダゾール、Ｔｒｉｓ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＢＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、トリエタノールアミン、ピロホスフェート、ＨＥＰＰＳＯ、およびＰＯＰＳＯである。重炭酸ナトリウムまたは他の緩衝剤は、例えば、５〜３０ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、１２〜１６ｍＭまたは１４ｍＭの濃度において、上記試薬の中に存在し得る。上記試薬において使用される緩衝剤のｐＨは、例えば、７〜８、または７．２〜７．６であり得る。
好ましい溶解試薬は、粉末形態で、または溶媒（例えば、水）中に、上記で示される濃度のうちのいずれかで、塩化アンモニウム、ＬＬＳ、ＥＤＴＡおよび重炭酸ナトリウムを含む。好ましくは、塩化アンモニウムは、１００〜５００ｍＭまたは２５０ｍＭの濃度にあり、ＬＬＳは、４〜１５％または５％（ｖ／ｖ）の濃度にあり、ＥＤＴＡは、０．０１〜１０ｍＭまたは０．１ｍＭの濃度にあり、重炭酸ナトリウムは、１２〜１６ｍＭまたは１４ｍＭの濃度にあり、ｐＨは、７．２〜７．６である。必要に応じて、この溶解試薬は、塩化アンモニウム、ＬＬＳ、ＥＤＴＡ、重炭酸ナトリウムおよび水から本質的になる。
上記溶解試薬は、赤血球から単離されるべき標的（以下で記載される標的のうちのいずれかを含む）に対するアッセイを行うためのプローブおよび／またはプライマーもまた含むキットとして提供され得る。このようなキットは、上記溶解試薬を使用するための、および／または赤血球から単離された標的に対してアッセイを行うための指示を含み得る。
（ＩＩＩ．溶解試薬の使用）
赤血球は、任意の利用可能な供給源（例えば、全血または赤血球を含むその任意の画分（例えば、ペレット化赤血球））から得られ得る。全血は、ヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの組み合わせであり得る。
溶解試薬は、細胞溶解を誘導し、細胞からの、望ましい標的の分子の放出を引き起こすために十分な時間にわたって、赤血球と混合され得る。溶解試薬と混合して赤血球を維持するための例示的時間としては、１〜３０分間、２〜１５分間、３〜１０分間、４〜６分間、または５分間が挙げられる。好ましくは、その時間は、３０分間以下、１５分間以下、１０分間以下または５分間以下である。好ましくは、上記混合物は、溶解後に目に見える粒子を欠いている。
溶解試薬を赤血球とともにインキュベートする温度は、変動し得る。その温度は、好ましくは、サンプル中の白血球または他の細胞と比べた赤血球の溶解および優先度の程度および速度を最大限にしかつ標的の分解を最小限にするかまたはその後の加工処理の阻害を防止するように、選択される。例示的な温度範囲としては、０〜５０℃、５〜４５℃、１０〜４０℃、１５〜３７℃、２０〜３０℃、２２〜２７℃、または２５℃が挙げられる。周囲温度は適切である。赤血球の溶解は、本明細書で記載される方法によって検出可能であるに十分な量の標的分子を放出するべきである。好ましくは、溶解は、溶解されるサンプル中の赤血球のうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の溶解を生じる。
全血が溶解試薬と合わされる比は、細胞溶解の程度および速度、ならびに溶解した細胞からの放出後の分解からの標的分子の保護に影響を及ぼし得る。全血が上記溶解試薬と混合される例示的な比としては、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、または１：１〜１：１０（ｖ／ｖ； 全血：試薬）の間の比の範囲の中の比が挙げられる。好ましい比は、約１：３（ｖ／ｖ）の比で全血が溶解試薬と混合される。上記サンプルが全血から単離された赤血球（例えば、ペレット化赤血球）を含む場合、この赤血球は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０の、または１：１〜１：１０（ｖ／ｖ； 赤血球：試薬）の間の比の範囲にある例示的な比で、上記溶解試薬と混合され得る。
（ＩＶ．標的）
本発明の溶解試薬によって赤血球から放出される標的としては、内因性もしくは病原性の核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、粒子全体、病原性のウイルスもしくは生物に由来するタンパク質、ならびに／または抗体、脂質および炭水化物が挙げられ得る。病原体由来ＲＮＡ標的が好ましい。種々のタイプのＲＮＡが検出され得る。このＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または異種の核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）であり得る。病原体の好ましい標的は、リボソームＲＮＡ、特に、１８Ｓ ｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ、５．８Ｓ ｒＲＮＡ、または２８Ｓ ｒＲＮＡである。
例示的な病原性生物としては、Ｂａｂｅｓｉａ属、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、Ａｎａｐｌａｓｍａ属、またはＴｏｘｏｐｌａｓｍａ属の寄生生物が挙げられる。ヒトにおいて疾患を引き起こすＢａｂｅｓｉａ属の生物は、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、またはＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉであり得る。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の生物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉであり得る。
（Ｖ．アッセイ）
赤血球の溶解から放出される標的分子は、分析に供される。標的分子は、分析の前に、溶解試薬から（遠心分離または他の方法によって）分離されてもよいし、分離されなくてもよい。分離工程の省略は、そのアッセイを行うにあたって、効率的な作業フローを容易にし得る。アッセイのタイプは、標的に依存する。
（Ａ．核酸）
核酸標的の分析はしばしば、捕捉、増幅および検出の工程を伴う。あるいは、増幅法および検出法は、事前の標的捕捉なしで行われ得る。好ましくは、増幅、ならびに検出および標的捕捉（行われる場合）は、標的分子を溶解試薬から分離することなく起こる。従って、プロセス全体は、１つの容器中で行われ得る。
（１．標的捕捉アッセイ）
例示的な標的捕捉アッセイは、以下のとおりに１またはこれより多くの捕捉プローブ、固定化プローブ、サンプル、および適切な媒体を使用して行われて、標的核酸への標的捕捉オリゴマーの、および固定化プローブへの標的捕捉オリゴマーのハイブリダイゼーションを可能にし得る。標的サンプルは、上記アッセイを行う前に（例えば、６５℃から９５℃へと）加熱されて、２本鎖形態にあるあらゆる核酸を変性し得る。その成分は、任意の順序で混合され得る。例えば、上記標的捕捉オリゴマーは、上記サンプルに加えられ得、上記固定化プローブを加える前に上記サンプル中の標的核酸とハイブリダイズされ得る。しかし、自動化アッセイに関しては、上記標的捕捉オリゴマーおよび固定化プローブを、同時または実質的に同時に供給することによって、加える工程の回数を最小限にすることが好ましい。この場合には、ハイブリダイゼーションの順序は標的捕捉オリゴマーと標的核酸との間で二重鎖を形成し得るが、捕捉プローブの第１のステムセグメントと第２のステムセグメントとの間で、および標的捕捉オリゴマーと固定化プローブとの間で形成する二重鎖の融解温度を超える条件下で第１のハイブリダイゼーションを行い、次いで、低減したストリンジェンシー、好ましくは、第１のステムセグメントと第２のステムセグメントとの間で、および標的捕捉オリゴマーと固定化プローブとの間で形成される二重鎖の融解温度未満の条件下で第２のハイブリダイゼーションを行うことによって、制御され得る。ストリンジェンシーは、アッセイミックスの温度を低下させることによって低減され得る。より高温では、標的結合部位は、標的核酸と二重鎖を形成する。より低い温度では、標的核酸に結合しなかった捕捉プローブの第１のおよび第２のステムセグメントが、互いと二重鎖を形成し、そして標的核酸に結合した捕捉プローブの第１のステムセグメントは、固定化プローブと二重鎖を形成する。例えば、より高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６０℃でまたは６０℃付近で行われ得、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、室温または２５℃へと冷却させることによって行われ得る。ストリンジェンシーはまた、塩濃度を低下させるか、またはカオトロピック溶媒を加えるかもしくはその濃度を増大させることによって、低減され得る。いくつかの方法では、全ての工程（２本鎖標的を変性させる、より高温での最初の変性工程を除くことはあり得る）が、等温で行われ得る。
標的核酸：捕捉プローブの形成後に、固定化プローブハイブリッド（捕捉ハイブリッド複合体）は、他のサンプル成分から、種々の公知の方法のうちのいずれか（例えば、遠心分離、濾過、または磁性捕捉支持体の磁気誘引）を使用して、捕捉支持体を物理的に分離することによって、分離される。上記分離は、好ましくは、空の標的捕捉オリゴマーが変性する機会をもたず、従って、捕捉プローブに結合するように、標的捕捉オリゴマーによって形成されるステム−ループ構造の融解温度未満の温度で行われる。いくつかの方法では、上記分離は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーおよびマッチした標的核酸とマッチしていない標的核酸とを区別する必要な能力を維持するために、このステム−ループ構造の融解温度より低いが、この融解温度の１０℃以内の温度で（例えば、６０℃で）行われる。
捕捉ハイブリッドの任意の部分に非特異的に接着する他のサンプル成分から標的核酸を単離することをさらに容易にするために、上記捕捉ハイブリッドは、他のサンプル成分を希釈および除去するために、１回もしくはこれより多く洗浄され得る。洗浄は、適切な水溶液（例えば、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む溶液。例えば、米国特許第６，１１０，６７８号を参照のこと）および適切な条件（例えば、上記成分のＴｍより高い温度）において、捕捉ハイブリッドをその個々の成分へと解離し、次いで、その条件を再調節して、捕捉ハイブリッドの再形成を可能にすることによって達成され得る。しかし、取り扱いやすくし、工程を最小限にするために、洗浄は、好ましくは、上記捕捉支持体に付着した無傷の捕捉ハイブリッドを、この捕捉ハイブリッドを維持する条件を使用することによって溶液中ですすぐ。好ましくは、行われる場合、洗浄での標的核酸の捕捉は、上記標的核酸のうちの少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも９０％、およびより好ましくは、約９５％を、他のサンプル成分から単離する。単離された核酸は、核酸増幅のような多くの下流プロセスのために使用され得る。
標的捕捉アッセイはまた、リアルタイムの二相性標的捕捉および増幅法の一部として行われ得る。このような方法において、５００μＬのサンプルおよび４００μＬの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）が、反応チューブに加えられる。このＴＣＲは、磁性粒子、上記サンプル中に存在する生物を溶解するための成分、捕捉オリゴ、Ｔ７開始プロモーター、および内部較正因子を含む。反応チューブ中の流体は、特定の時間にわたって特定の速度で混合され、上記混合物が均質であることを担保する。次いで、反応チューブは、反応チューブの中の流体を予備加熱するために、４３．７℃のトランジションインキュベーター（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）へと移される。反応チューブは、次いで、６４℃に設定したアニールインキュベーターへと移される。６４℃でのインキュベーションの間に、溶解試薬によって事前に破壊されなかった、上記サンプル中に存在する任意の生物が破壊され、標的の放出を引き起こす。次いで、反応チューブは、クールダウンプロセスを開始するために移行インキュベーターへと移され、冷却機勾配（１７℃〜１９℃）の中でさらに冷却され、Ｔ７開始プロモーターの結合、ならびに捕捉オリゴを介する磁性粒子への標的および内部較正因子の両方の捕捉をもたらす。上記反応チューブは、磁気パーキングステーション（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｋｉｎｇ ｓｔａｔｉｏｎ）に移され、このステーションでは、上記チューブは、洗浄ステーションに入る前に、磁性粒子をチューブの側面に引きつける磁石に供される。洗浄ステーションでは、潜在的な妨害物質を、磁性粒子を洗浄することによって上記反応物から除去する。
（２．増幅）
核酸標的は、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベースの増幅、リガーゼ連鎖反応または他の増幅法のような方法を使用して増幅され得る。増幅された標的ＲＮＡ生成物の検出は、増幅の間に（リアルタイムで）または増幅後に（エンドポイントで）行われ得る。
（ｉ．転写媒介性増幅）
ＴＭＡは、以前に記載されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，８２４，５１８号、および同第７，８３３，７１６号；そしてまた、例えば、Ｆ． Ｇｏｎｚａｌｅｓ ａｎｄ Ｓ． ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． １９９８ Ｅｄ． Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｆｅｒｒｅ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ． ＰＰ． １８９−２０４）。ＴＭＡでは、増幅されるべき配列を含む標的核酸は、１本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。２本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を１本鎖核酸へと変換する任意の従来の方法が、使用され得る。プロモータープライマーは、上記標的核酸へとその標的配列において特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、テンプレートとして上記標的鎖を使用して上記プロモータープライマーの３’末端を伸長して、ｃＤＮＡコピーを作りだし、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖を生じる。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅ Ｈ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを消化し、第２のプライマーが、上記プロモーター−プライマー末端から下流にある、このｃＤＮＡ中のその標的配列に特異的に結合する。次いで、ＲＴは、テンプレートとしてそのｃＤＮＡを使用して第２のプライマーの３’末端を伸長して、機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作り出すことによって、新たなＤＮＡ鎖を合成する。機能的プロモーターに対して特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、最初の標的鎖に相補的な約１００〜１０００個のＲＮＡ転写物（増幅されたコピーまたはアンプリコン）を生成する。この第２のプライマーは、各アンプリコン中のその標的配列に特異的に結合し、ＲＴは、このアンプリコンＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを作り出して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖を生成する。ＲＮａｓｅは、上記アンプリコンＲＮＡを、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖から消化し、このプロモータープライマーの標的特異的配列は、その新たに合成されたＤＮＡ中のその相補的配列に結合し、ＲＴは、上記プロモータープライマーの３’末端および上記ｃＤＮＡの３’末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、その標的鎖に相補的なさらなるアンプリコンを転写する機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作り出す。反応の間にこれら工程を反復して使用する自動触媒サイクルは、その最初の標的配列の約１０億倍の増幅を生じる。必要に応じて、アンプリコンは、上記アンプリコン中に含まれる配列に特異的に結合するプローブを使用することによって増幅の間（リアルタイム検出）に、または反応のエンドポイント（エンドポイント検出）で、検出され得る。その結合したプローブから生じるシグナルの検出は、上記サンプル中の標的核酸の存在を示す。
ＴＭＡはまた、リアルタイムの二相性標的捕捉および増幅法の一部として行われ得る。このような方法において、ＴＭＡは、増幅試薬（５０μＬ／試験）を、捕捉された標的分子を含む反応チューブに加え、そして増幅ロードステーションにおいて混合することによって、行われ得る。この増幅試薬は、核酸を作るために必要なオリゴおよび成分を含む。この反応チューブは、反応チューブ中の液体の温度を上昇させるために４３．７℃の移行インキュベーターに移され、次いで、それは、増幅ロードステーションへと戻されて、このステーションにおいて酵素（２５μＬ／試験）が加えられる。反応チューブは、４２．７℃に設定した増幅インキュベーターへと移され、インキュベーターの中に５分間留まり、その間に、第１回の増幅が開始される。反応チューブは、増幅ロードステーションへと戻され、このステーションにおいて、プロモーター試薬（２５μＬ／試験）が加えられる。反応チューブは、標的増幅のさらなる回のために、増幅インキュベーターへと戻される。このプロモーター試薬は、オリゴおよびトーチ（ｔｏｒｃｈ）を含む。このトーチは、上記標的または内部較正因子に相補的であり、結合した場合には、蛍光を発し、リアルタイムでシグナルを生成する。上記標的および内部較正因子に関するシグナルは、好ましくは、異なる波長を有し、区別され得る。
（ｉｉ．ポリメラーゼ連鎖反応）
あるいは、ＰＣＲ増幅（例えば、逆転写酵素またはリアルタイムＰＣＲ）が、増幅のために使用され得る。ＰＣＲは、標的核酸を捕捉複合体から事前に放出してまたは放出せずに、行われ得る。このＰＣＲ反応は、捕捉工程と同じ容器（例えば、微量遠心チューブ）の中で行われ得る。このＰＣＲ反応は、解離のための約９５℃（例えば、９０〜９９℃）という高温から、アニーリングのための約６０℃という低温（例えば、４０〜７５℃、または５０〜７０℃または５５〜６４℃）の間でのサーモサイクリングを含む。代表的には、完全サーモサイクルの数は、少なくとも１０、２０、３０または４０である。ＰＣＲ増幅は、１またはこれより多くのプライマー対を使用して行われる。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマー対は、配列決定されることが望まれる領域に隣接する標的核酸の対抗する鎖に相補的な２つのプライマーを含む。ウイルスゲノムの大部分（例えば、５０、７５または９９％より多く）を配列決定するために、プライマーは、好ましくは、ウイルスゲノムの末端の近くに位置する。関連分子（例えば、患者サンプル中に存在する同じウイルスの変異形態）の増幅のために、プライマーは、好ましくは、その集団の大部分のメンバーに存在する可能性が高い標的核酸の保存された領域に相補的である。ＰＣＲ増幅は、以下に記載される：ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ編， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ＮＹ， １９９２）； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９０）； Ｍａｔｔｉｌａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４９６７ （１９９１）； Ｅｃｋｅｒｔら， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １， １７ （１９９１）； ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号。
（３．検出）
核酸標的の検出は、捕捉後にかつ任意の公知の方法を使用することによって、増幅の間（リアルタイム）または増幅後（エンドポイント）のいずれかで行われ得る。ＲＮＡの増幅生成物はしばしば、ＲＴ−ＰＣＲから生じるＤＮＡ、またはＴＭＡから生じるＲＮＡコピーの形態にある。増幅された核酸は、液相中で検出され得るか、またはそれらをマトリクス中でまたはマトリクス上で濃縮し、上記核酸と関連した標識（例えば、臭化エチジウムのようなインターカレーティング剤）を検出することによって検出され得る。いくつかの検出法は、増幅された生成物中の配列に相補的なプローブを使用してプローブ：生成物複合体の存在を検出するか、またはプローブの複合体を使用して、増幅された生成物から検出されるシグナルを増幅する（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号および同第５，８４９，４８１号）。他の検出法は、シグナル生成が標的配列の存在に結び付いているプローブを使用する。なぜならシグナルの変化は、分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブ（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，２１０，０１５号、同第５，３１２，７２８号、同第５，５３８，８４８号、同第５，５４１，３０８号、同第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，３６１，９４５号、同第６，５３４，２７４号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号；ならびに米国公開番号２００６／０１９４２４０ Ａ１）におけるように、上記標識されたプローブが増幅された生成物に結合する場合にのみ生じるからである。このようなプローブは、代表的には、このプローブの一方の末端に付着された標識（例えば、発蛍光団）、およびこのプローブが、増幅された生成物にハイブリダイズされていないことを示すあるコンホメーションにある（「閉じている」）ときの標識からのシグナル生成を阻害するが、プローブがそのコンホメーションを（「開いている」へと）変化させる増幅された生成物にハイブリダイズしているときに検出可能なシグナルが生成されるようにこのプローブの別の位置に付着される相互作用化合物（例えば、クエンチャー）を使用する。この増幅された生成物と特異的に会合する直接的にまたは間接的に標識されたプローブからのシグナルの検出は、増幅された標的核酸の存在を示す。
（４．配列決定）
増幅後に、標的核酸は、定性的もしくは定量的な検出をされるとともに、または定性的もしくは定量的な検出をされる代わりに、配列決定され得る。精製は、望ましい場合、シリカカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ重力流カラム）上で行われ得る。この標的核酸は、カラムに結合し、ここでこの標的核酸は、洗浄され得、次いで溶離され得る。あるいは、精製は、核酸プローブベースの精製システム（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号もしくは同第８，０３４，５５４号、ＵＳ ２０１３／０２０９９９２もしくはＵＳ ２００９／０２８６２４９、またはＷＯ ２０１２／０３７５３１もしくはＷＯ ２０１３／１１６７７４）を使用して行われ得る。その増幅された標的ＤＮＡはまた、アダプターの付着によって、いくつかの配列決定形式に適合させられ得る。その増幅されたＤＮＡは、ヌクレオチド（通常は、ホモポリマー）のクレノウ媒介性付加によってテール付加され得、続いて、その付加されたテールに相補的なオリゴヌクレオチドにアニールされ得、ライゲーションされ得る。使用される配列決定プラットフォームに依存して、特別なアダプターが、配列決定前にテンプレートにライゲーションされる。例えば、ＳＭＲＴベルアダプターは、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ’ ＰａｃＢｉｏ ＲＳ配列決定機での配列決定のために、サンプルテンプレートにライゲーションされる（例えば、Ｔｒａｖｅｒｓら Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２０１０） ３８ （１５）： ｅ１５９を参照のこと）。
その増幅された標的核酸は、種々の技術による配列分析に適している。標的核酸の捕捉は、いわゆる次世代および第三世代の配列決定法のいくつかの異なる形式につなげられ得る。このような方法は、数百万もの標的テンプレートを並行して配列決定し得る。このような方法は、標的核酸が改変体の異種混合物である場合に、特に有用である。その多くの利点の中でも、改変体を並行して配列決定することで、このサンプル内に比較的小さな割合で薬物変異が存在しても、サンプル中の薬物耐性変異のプロフィールが提供される。
いくつかの次世代配列決定法は、エマルジョンＰＣＲによって増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）。標的捕捉オリゴマーを介してビーズに固定化された標的核酸は、エマルジョンＰＣＲに適切な出発物質を提供する。そのビーズは、単一のビーズを含む個々のマイクロリアクターを作るために、ＰＣＲ試薬およびエマルジョンオイルと混合される（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ ４３７， ３７６−８０ （２００５））。次いで、このエマルジョンは破壊され、増幅されたＤＮＡを有するその個々のビーズが配列決定される。この配列決定は、例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４ ＧＳ ＦＬＸ配列決定機（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ ０６４０５）を使用して行われるパイロシーケンシングであり得る。あるいは、配列決定は、例えば、ＡＢＩ ＳＯＬｉＤ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ ９２００８）を使用して行われるライゲーション／検出であり得る。別のバリエーションにおいて、標的核酸は、標的捕捉オリゴマーを有するビーズから溶離され、アレイ上の異なる位置に固定化される（例えば、ＨｉＳｃａｎＳＱ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ ９２１２１））。その標的核酸は、ブリッジ増幅によって増幅され、アレイ形式で、標識されたヌクレオチドのテンプレート指向性組み込みによって配列決定される（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）。別のアプローチでは、標的核酸は、標的捕捉オリゴマーから溶離され、単一の分子が、リアルタイムで、ポリメラーゼによるヌクレオチドの組み込みを検出することによって分析される（単一分子リアルタイム配列決定またはＳＭＲＴ配列決定）。このヌクレオチドは、組み込まれた場合にシグナルを放出する標識されたヌクレオチドであり得る（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｉｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３２３ ｐｐ． １３３−１３８ （２００９））か、または標識されていないヌクレオチドであり得る（この場合、上記システムは、組み込みの際の化学変化を測定する（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。
捕捉された標的核酸が、任意の技術によって配列決定され得るが、第三世代、次世代または大規模並列処理法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｍｅｔｈｏｄ）は、Ｓａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｍａｘａｍ Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定を上回るかなりの利点を提供する。いくつかのグループは、超ハイスループットＤＮＡ配列決定手順を記載している（例えば、Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ、米国特許第５，３０２，５０９号、Ｍｅｔｚｋｅｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ４２５９ （１９９４）を参照のこと）。４種の天然のヌクレオチド（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはチミン（Ｔ）という塩基を含む）および合成によってＤＮＡを配列決定するためのいくつかの他の酵素を使用するパイロシーケンシングアプローチは、今や変異検出のために広く使用されている（Ｒｏｎａｇｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１， ３６３ （１９９８）； Ｂｉｎｌａｄｉｎら， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ｉｓｓｕｅ ２， ｅ１９７ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７）； Ｒｅｈｍａｎら， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８６， ３７８ （Ｍａｒｃｈ ２０１０）； Ｌｉｎｄら， Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｙｐｉｎｇ， Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１０）， ｄｏｉ １０．１０１６／ｊｈｕｍｉｍｍ．２０１０．０６．０１６ （印刷中）； Ｓｈａｆｅｒら， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １；１９９（５）：６１０ （２００９））。このアプローチにおいて、検出は、ＤＮＡポリメラーゼ反応の間に放出されるピロホスフェート（ＰＰｉ）、スルフリラーゼによるピロホスフェートのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）への定量的変換、およびその後のホタルルシフェラーゼによる可視光の生成に基づく。より近年の研究は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の３’−ＯＨ基にキャップをするために蛍光色素に連結される光切断可能な化学部分に大部分は焦点を当てた合成法によってＤＮＡ配列決定を行う（Ｗｅｌｃｈら Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８， １９７ （１９９９） ＆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ， ５：９５１−９６０ （１９９９）； Ｘｕら、米国特許第７，７７７，０１３号； Ｗｉｌｌｉａｍｓら、米国特許第７，６４５，５９６号； Ｋａｏ ｅｔ ａｌ， 米国特許第６，３９９，３３５号； Ｎｅｌｓｏｎら， 米国特許第７，０５２，８３９号および同第７，０３３，７６２号； Ｋｕｍａｒら， 米国特許第７，０４１，８１２号； Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ， 米国特許出願番号２００４−０１５２１１９； Ｅｉｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３， １３３ （２００９））。合成による配列決定方法論（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）では、ＤＮＡ配列は、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を別個にかつ逐次的に用いてＤＮＡ／ポリメラーゼ複合体を試験する際のピロホスフェート放出を測定することによって導き出されている。Ｒｏｎａｇｈｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１： ３６３ ３６５ （１９９８）； Ｈｙｍａｎ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７４， ４２３ （１９８８）； Ｈａｒｒｉｓ、米国特許第７，７６７，４００号を参照のこと。
（Ｂ．他の標的）
抗体、タンパク質、粒子および他の標的は、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、競合アッセイおよび免疫測定アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）のような形式によって検出され得る。Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （ＣＳＨＰ ＮＹ， １９８８）； 米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８７９，２６２号；同第４，０３４，０７４号、同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４，０９８，８７６号を参照のこと。サンドイッチアッセイは、好ましい形式である（米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号、および同第５，９６５，３７５号を参照のこと）。
競合アッセイがまた使用され得る。いくつかの方法では、サンプル中の標的抗原は、外因的に供給された、標識された標的抗原と抗体検出試薬への結合に関して競合する。その抗体に結合される標識された標的抗原の量は、サンプル中の標的抗原の量に逆比例する。その抗体は、検出する前に、サンプルからの結合した複合体の分離を容易にするために固定化され得る。
接線流デバイスはまた、標的を検出するために使用され得る。流体は、標的が存在し得るサンプルで処理された試験ストリップに適用される。標識された結合分子は、このストリップを通り、標的を有するサンプルを含む特定のゾーンに入るにつれて捕捉され得る。
（ＶＩ．感度）
本発明の方法は、赤血球に由来する標的の高感度の検出を提供し得る。病原体由来ＲＮＡ標的に関しては、感度は、ある体積の全血に存在する病原体ＲＮＡコピーの最小数として表され得る。全血の体積は、溶解試薬と直接接触され得るものであるか、または血液画分（例えば、ペレット化赤血球）を調製するために使用され得るものであり、この血液画分は、翻って、この溶解試薬と接触させられる。好ましくは、上記方法は、全血中の病原性ＲＮＡの存在を、１寄生生物に等しい２×１０３コピーのＲＮＡ／１ｍＬ 全血もしくはこれより良好、２×１０３コピー／５ｍＬ 全血もしくはこれより良好、２×１０３コピー／１０ｍＬ 全血もしくはこれより良好、２×１０３コピー／５０ｍＬ 全血もしくはこれより良好、または２×１０３コピー／１００ｍＬ 全血もしくはこれより良好な感度で検出する。いくつかの方法では、溶解したサンプル中の病原体ＲＮＡの範囲は、２×１０３〜２×１０７コピー／１ｍＬ サンプルの間で変動する。
（実施例１。細胞溶解のための試薬の分析およびＢａｂｅｓｉａ ＲＮＡの安定化）
本実施例の目的は、溶解試薬であって、ヒト全血中の赤血球を有効に溶解し、この溶解したサンプル中のＢａｂｅｓｉａ由来ｒＲＮＡを安定化し、そしてＲＮＡｓｅの活性を阻害する溶解試薬を特定することであった。磁性ビーズを使用するＧｅｎ−ＰｒｏｂｅのＴａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙと適合性であるためには、上記溶解試薬は、好ましくは、効率的標的捕捉のために均質な溶解物を生じるべきである。
ＰＡＸｇｅｎｅＴＭ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、Ｂａｂｅｓｉａサンプル調製のために最初に評価した。各チューブに含まれるＰＡＸｇｅｎｅ試薬は、細胞膜を溶解しかつ安定化試薬として作用することが公知の第四級アンモニウム塩である活性化合物テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート（ＴＤＴＭＡＯ）を含む。
調製のために使用したサンプルは、１×１０−１〜１×１０−６の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加したヒト全血であった。血液サンプル（１ｍＬ）を、ＰＡＸｇｅｎｅチューブからの３ｍＬの溶解試薬に室温で加え、５分間振盪させて、細胞溶解を誘導した。次いで、溶解したサンプルのうちの５００μＬを、５００μＬの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）に加えた。Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ、およびＡｐｔｉｍａ ＴＣＲを評価した。溶解したサンプルをＴＣＲに加えた後、白色の沈殿物が形成された。従って、このＰＡＸｇｅｎｅシステムは、全血溶解およびＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅの標的捕捉試薬を使用するＢａｂｅｓｉａの検出には不適切であった。
次の実験では、１４ｍＭ 重炭酸ナトリウムで緩衝化した２５０ｍＭ 塩化アンモニウム（ＡＣＬ）の溶解試薬を評価した。ヒト全血に、１×１０−５〜１×１０−８の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。添加した全血のうちの１ｍＬを、３ｍＬの緩衝化ＡＣＬ溶液とともに５分間、２５℃で混合して、赤血球溶解を誘導した。この溶解したサンプルのうちの５００μＬを、５００μＬ ＴＣＲに加えた後、沈殿物は観察されなかった。標的捕捉を、米国特許第６，１１０，６７８号に一般に記載されるように行った。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、転写媒介性増幅（米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，８２４，５１８号および同第７，８３３，７１６号）によって各サンプル中で検出した。サンプル中のＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを増幅するために使用されるプライマーは、以下のとおりであった：
図１に示されるように、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、１×１０−８という少なさへの希釈において、添加したヒト全血サンプル中で検出した。しかし、血液の齢（３〜５日齢）に関して性能に大きな変動性が観察された。これら結果は、全血溶解およびＢａｂｅｓｉａの検出に緩衝化ＡＣＬ溶液が使用される予定である場合には、安定化成分が含まれるべきであることを示唆した。
さらなる溶解試薬を、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅのＴａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙとのそれらの適合性に関して評価した。評価した溶解試薬は、以下を含んだ：１０％ ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含むＩＣ緩衝剤；Ｒｏｃｈｅ ＲＢＣ溶解緩衝剤；４％ テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＤＴＭＡＢ）、２５０ｍＭ 酒石酸、および５％ Ｔｗｅｅｎ ２０とともに製剤化した緩衝化ＡＣＬ（ＨＢ＋ＰＴＭ１．１）；５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、グアニジニウムチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および還元化合物を有するＲｏｃｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ；０．２％ サポニン；４％ ＴＤＴＭＡＢ、２５０ｍＭ 酒石酸、および１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０とともに製剤化した０．２％ サポニン；４％ ＴＤＴＭＡＢ、２５０ｍＭ 酒石酸、および１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０；ならびにＰＡＸｇｅｎｅ溶解溶液。図２に示されるように、Ｒｏｃｈｅ ＲＢＣ溶解緩衝剤およびＩＣ緩衝剤のみが、この実験において、ＴＣＲに加えた場合に、沈殿物の出現も磁性ビーズの喪失もなしに細胞溶解を誘導した。
異なる溶解試薬のさらなる分析を、ＰｒｏｃｌｅｉｘおよびＡｐｔｉｍａ ＴＣＲ溶液（Ｇｒｉｆｏｌｓ ＳＡ， カタログ番号３０２５７３およびＨｏｌｏｇｉｃ， Ｉｎｃ．， カタログ番号３０２１７８）との適合性に関して、図３に示されるように行った。多くの試薬は、一方または両方のＴＣＲにおいて全く活性を示さなかったかまたは減少した活性を示した（５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ありおよびなしのサポニン；ＰＡＸｇｅｎｅ溶解溶液；ＰＴＭ１．０、１．１、および１．２）。いくらかは、ＴＣＲを加えた場合に沈殿物（ＰＰＴ）を生成した。他のものは、一方または両方のＴＣＲにおいて妥当な候補であった一方で、ＴＰＭ２．４（２５０ｍＭ ＡＣＬ、１４ｍＭ 重炭酸ナトリウム、および５％ ＬＬＳ）は、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲにおいて良好な候補であり、ＩＣ緩衝剤は、両方のＴＣＲにおいて良好な候補であった。
ＰＴＭ ２．４溶液およびＩＣ緩衝剤（１０％ ＬＬＳ）を使用する研究を行って、Ｂａｂｅｓｉａを検出するためのこれら溶解試薬の有効性を比較した。ヒト全血に、１×１０−３〜１×１０６の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。血液サンプルを、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬、またはＩＣ緩衝剤という溶解試薬で、１：３（血液：試薬）の比において溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して、各サンプル中で検出した。図４に示されるように、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡ検出は、血液がＰＴＭ２．４またはＩＣ緩衝剤を使用して溶解される場合に匹敵している。しかし、これら実験では、赤血球を全血からペレット化するための最初の遠心分離工程なしでは、ＩＣ緩衝剤は、溶解工程後に細胞デブリを生じ、これは、標的捕捉および磁性ビーズ洗浄工程を潜在的に妨害し得ることが観察された。従って、ＰＴＭ２．４（「緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳ」）を、さらなる評価のために選択した。
（実施例２。ＡＣＬ溶解溶液中のＬＬＳの評価）
緩衝化ＡＣＬ溶液中のＬＬＳの必要性を、本実施例において試験した。ＬＬＳを、緩衝化ＡＣＬ溶液中に、０％（コントロール）、１％、２％、３％、および５％という濃度で含めた。ヒト全血に、１×１０−７〜１×１０−９の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。添加された全血サンプルを、上記緩衝化ＡＣＬ／ＬＬＳ溶液の各々で溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して、各サンプル中で検出した。図５に示されるように、ＬＬＳの濃度の低下は、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの検出のより大きな変動性を生じる。これは、おそらくＴＭＡによる増幅の前に、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡ標的を安定化するために存在するＬＬＳの不十分な量に起因する。
（実施例３。Ｂａｂｅｓｉａの検出感度）
緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳを使用して、ヒト全血におけるＢａｂｅｓｉａの検出感度を調べた。ヒト全血に、１×１０−４〜１×１０−１１の希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。血液サンプルを、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳの溶解試薬で溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して、各サンプルにおいて検出した。図６Ａに示されるように、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡは、この溶解試薬およびアッセイプロコトルを使用した場合に、１×１０−８〜１×１０−９という希薄さの希釈において、ヒト全血中で検出できた。
この方法によって検出可能なインビトロ転写物（ＩＶＴ）の数もまた、決定した。この実験において使用されるインビトロ転写物は、以下の配列を有した：
上記アッセイの分析感度を、Ｂａｂｅｓｉａ １８ｓ ｒＲＮＡ標的のインビトロ転写物（ＩＶＴ）を使用することによって決定した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの１０、１００、１０００、または１０，０００のＩＶＴコピーを、ＩＣ緩衝剤へと添加した。ＩＶＴを、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよび上記ＩＶＴを捕捉するための手順を使用し、続いて、上記のようにその捕捉されたＩＶＴのＴＭＡ増幅によって、検出した。図６Ｂに示されるように、１ｍＬあたり１０ ＩＶＴコピーという希薄なものが検出できた。
上記アッセイによって検出可能なＢａｂｅｓｉａ寄生生物の数を、これら結果に基づいて計算した。Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液の寄生虫血症のスメア（ｐａｒａｓｉｔｅｍｉｃ ｓｍｅａｒ）から示されるように、１μＬあたり７．２０×１０６個の赤血球のうちの約５．０４×１０６個が感染していた（ＲＢＣのうちの約７０％）。従って、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡが緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳを使用するアッセイによって検出可能である１×１０−６〜１×１０−７の希釈において、約１〜１０の寄生生物が、添加したヒト全血サンプルのうちの体積１ｍＬ中で検出可能であった。図６Ａで示されるように、上記方法は、１×１０−９という希薄さの希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを検出し得る。これは、上記方法の感度が、ヒト全血１００ｍＬあたり２×１０３〜２×１０４ １８ｓ ｒＲＮＡコピーに相関する、サンプル１００ｍＬあたり１〜１０個の寄生生物またはこれより少ないという、少ない寄生生物を検出できることを示す。
（実施例４．血液 対 溶解試薬の最適比の決定）
本実施例の目的は、上記方法において使用するための、全血 対 溶解試薬の最適比を決定することであった。ヒト全血に、１×１０−４〜１×１０−１１の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。次いで、上記サンプルを、１：２または１：３（血液：試薬）の比において、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳの溶解試薬で溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、 上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して各サンプルにおいて検出した。図７に示されるように、１：３（血液：試薬）の比は、１×１０−９という希薄さでの感度で、ヒト全血中の低濃度のＢａｂｅｓｉａを検出するのに優れていた。対照的に、１：２（血液：試薬）の比を使用する場合には、検出感度は低下した。
（実施例５．サンプル間のＢａｂｅｓｉａ検出の再現性）
Ｂａｂｅｓｉａ検出アッセイの再現性を、ドナー血液の複数サンプルにわたって決定した。この実験では、ヒト全血を、６名の異なるドナー患者から集めた。各サンプルに、１×１０−６〜１×１０−１２の間の希釈においてＢａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。次いで、サンプルを、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬で溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して、各サンプル中で検出した。図８で示されるように、このプロトコルでの溶解試薬の使用は、１×１０−６および１×１０−８という希薄さの希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの検出に関して異なるドナーサンプル間で優れた再現性を生じた。
（実施例６．Ｂａｂｅｓｉａ寄生生物および核酸の安定性）
実験を行って、ヒト全血中のＢａｂｅｓｉａ寄生生物の安定性を経時的に決定した。寄生生物安定性を決定するために、ヒト全血に、１×１０−２〜１×１０−９の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。分析する前に、サンプルの一方の群を、添加後に２５℃で５日間貯蔵した。別の群を、ヒト全血に添加したその同じ日に分析した。添加した全血サンプルを、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬を使用して溶解した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して各サンプル中で検出した。図９で示されるように、感度の顕著な喪失が、２５℃で５日間の貯蔵後に、特に１×１０−７および１×１０−８の希釈において、観察された。
さらなる研究を行って、ＲＢＣ溶解後のサンプル中のＢａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡの安定性を決定した。ヒト全血に、１×１０−６〜１×１０−９の間の範囲に及ぶ希釈において、Ｂａｂｅｓｉａ感染ハムスター血液を添加した。上記サンプルを、緩衝化ＡＣＬおよび５％ ＬＬＳという溶解試薬を使用して溶解した。溶解したサンプルを、分析する前に、４℃で０〜４日間貯蔵した。Ｂａｂｅｓｉａ １８Ｓ ｒＲＮＡを、上記のようにＰｒｏｃｌｅｉｘ ＴＣＲおよびＴＭＡによる増幅を使用して各サンプル中で検出した。図１０で示されるように、感度の喪失が、４℃での貯蔵後に、特に、３日間および４日間の貯蔵後に観察された。感度のこの喪失は、１×１０−９の希釈を有するサンプルでは容易に観察できた。
本発明は、理解を明瞭にする目的で詳細に記載されてきたが、ある種の改変が、添付の請求項の範囲内で実施され得る。本出願において引用されるアクセッション番号、ウェブサイトなどを含む全ての刊行物、および特許文書は、引用により各々が個々に援用されると示されているのと同程度まで、全ての目的のためにそれらの全体において参考として援用される。配列、ウェブサイトまたは他の参考文献の種々のバージョンが、種々の時間で存在し得る程度まで、有効な出願日での上記参考文献と関連するバージョンが意味を持つ。有効な出願日は、発行時のアクセッション番号が開示される最も早い優先日を意味する。文脈から別段明らかでなければ、本発明の任意の要素、実施形態、工程、特徴または局面が、任意の他のものと組み合わせて実施され得る。

Claims (32)

  1. 塩化アンモニウム、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および抗凝固薬を含む、赤血球を溶解するための試薬であって、該抗凝固薬がヘパリンまたはカルシウムキレート化剤である、試薬。
  2. 緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の試薬。
  3. 前記緩衝剤は、重炭酸ナトリウムである、請求項２に記載の試薬。
  4. 前記緩衝剤のｐＨは、７〜８である、請求項２または請求項３に記載の試薬。
  5. 前記抗凝固薬は、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはシトレートである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
  6. 塩化アンモニウムの濃度は、１００〜５００ｍＭである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
  7. 塩化アンモニウムの濃度は、２００〜３００ｍＭである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
  8. 塩化アンモニウムの濃度は、２５０ｍＭである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の試薬。
  9. ＬＬＳの濃度は、４〜１５％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試薬。
  10. ＬＬＳの濃度は、５〜８％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の試薬。
  11. ＬＬＳの濃度は、５％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試薬。
  12. 重炭酸ナトリウムの濃度は、５〜３０ｍＭである、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
  13. 重炭酸ナトリウムの濃度は、１０〜２０ｍＭである、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の試薬。
  14. 重炭酸ナトリウムの濃度は、１４ｍＭである、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の試薬。
  15. 前記緩衝剤のｐＨは、７．２〜７．６である、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の試薬。
  16. 塩化アンモニウムの濃度は、２５０ｍＭであり、ＬＬＳの濃度は、５％（ｖ／ｖ）であり、重炭酸ナトリウムの濃度は、１４ｍＭであり、ｐＨは、７．２〜７．６である、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の試薬。
  17. 前記試薬は、赤血球と混合されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の試薬。
  18. 前記試薬は、全血と混合されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の試薬。
  19. 前記試薬は、３：１（ｖ／ｖ）の比で全血と混合されることを特徴とする、請求項１８に記載の試薬。
  20. 前記全血は、ヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、請求項１８または請求項１９に記載の試薬。
  21. 赤血球に由来する標的を分析する方法であって、該方法は、
    （ａ）赤血球と、塩化アンモニウムおよびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含む試薬とを接触させる工程であって、該試薬は、該赤血球を溶解し、かつ該赤血球から放出された標的の分解を阻害するために有効である、工程；ならびに
    （ｂ）該赤血球から放出された該標的を分析する工程、
    を包含する方法。
  22. 前記標的は、病原体由来の標的である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記標的は、ＲＮＡである、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
  24. 前記赤血球のうちの少なくとも５０％は、５分またはそれ未満で溶解される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 溶解された赤血球のパーセンテージは、溶解された白血球のパーセンテージより高い、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記試薬は、請求項１〜２０のいずれかに定義されるとおりである、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記標的を分析する工程は、前記放出された標的と、捕捉プローブおよび固定化プローブとを接触させる工程を包含し、該捕捉プローブは、該標的に相補的な第１のセグメントおよび該固定化プローブに相補的な第２のセグメントを有し、ここで該標的は、該捕捉プローブに結合し、そしてここで該結合された捕捉プローブは、該固定化プローブに結合する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記標的の転写媒介性増幅を行う工程および該得られた増幅生成物を検出プローブで検出する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記試薬を、前記赤血球から放出された前記標的から分離するための遠心分離工程なしで行われる、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記標的は、Ｂａｂｅｓｉａ属の病原性生物に由来する１８Ｓ ｒＲＮＡである、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記病原性生物は、種Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉのものである、請求項３０に記載の方法。
  32. 検出限界は、全血１ｍＬあたりＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ １８Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも２×１０３コピーである、請求項３１に記載の方法。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3448998B1 (en) * 2016-04-27 2020-06-03 Gen-Probe Incorporated Blood cell lysis reagent
US11667978B2 (en) 2017-06-07 2023-06-06 Gen-Probe Incorporated Detecting Babesia species nucleic acid in a sample
EP3538650A1 (en) 2018-01-29 2019-09-18 Grifols Diagnostic Solutions Inc. A method to determine parvovirus b19 in clinical samples
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
CA3147297A1 (en) * 2019-07-16 2021-01-21 Meliolabs Inc. Methods and devices for single-cell based digital high resolution melt

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
FR2422956A1 (fr) 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US4935342A (en) 1986-12-01 1990-06-19 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
US5639604A (en) 1987-09-21 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Homogeneous protection assay
US5283174A (en) 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5185439A (en) 1987-10-05 1993-02-09 Gen-Probe Incorporated Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US5118801A (en) 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
US5656207A (en) 1989-06-24 1997-08-12 Gen Probe Incorporated Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5849481A (en) 1990-07-27 1998-12-15 Chiron Corporation Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
DK0618925T4 (da) 1991-12-24 2012-07-09 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense-oligonukleotider
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5346994A (en) 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
KR100249110B1 (ko) 1992-05-06 2000-04-01 다니엘 엘. 캐시앙 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트
US5914241A (en) 1993-01-19 1999-06-22 Biosite Diagnostics, Inc. Assays and kits for detecting analytes in the presence of cross-reacting substances
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
WO1995032305A1 (en) 1994-05-19 1995-11-30 Dako A/S Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis
DE69535240T2 (de) 1994-10-28 2007-06-06 Gen-Probe Inc., San Diego Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen
US5731148A (en) 1995-06-07 1998-03-24 Gen-Probe Incorporated Adduct protection assay
US5945515A (en) 1995-07-31 1999-08-31 Chomczynski; Piotr Product and process for isolating DNA, RNA and proteins
US5973137A (en) * 1996-02-13 1999-10-26 Gentra Systems, Inc. Low pH RNA isolation reagents, method, and kit
JP3898228B2 (ja) 1996-04-12 2007-03-28 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 検出プローブ、キット及びアッセイ
US5965375A (en) 1997-04-04 1999-10-12 Biosite Diagnostics Diagnostic tests and kits for Clostridium difficile
EP0975807B1 (en) 1997-05-02 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6111096A (en) * 1997-10-31 2000-08-29 Bbi Bioseq, Inc. Nucleic acid isolation and purification
ATE396279T1 (de) 1998-02-02 2008-06-15 Qiagen North American Holdings Verfahren zur isolierung, amplifizierung und charakterisierung von dns
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
ATE440963T1 (de) 1998-07-02 2009-09-15 Gen Probe Inc Molekulare fackeln
DE19856064C2 (de) * 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
US6399335B1 (en) 1999-11-16 2002-06-04 Advanced Research And Technology Institute, Inc. γ-phosphoester nucleoside triphosphates
US6602718B1 (en) 2000-11-08 2003-08-05 Becton, Dickinson And Company Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
US20020068280A1 (en) 2000-12-06 2002-06-06 Jeff Fairman Compositions and methods for DNA purification from whole blood
ZA200201446B (en) * 2001-03-06 2002-09-02 Akzo Nobel Nv Babesia canis vaccine.
US7052839B2 (en) 2001-08-29 2006-05-30 Amersham Biosciences Corp Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use
DK1421213T3 (da) 2001-08-29 2010-06-07 Ge Healthcare Bio Sciences Mærkede nukleosidpolyphosphater
US7033762B2 (en) 2001-08-29 2006-04-25 Amersham Biosciences Corp Single nucleotide amplification and detection by polymerase
US7247484B2 (en) * 2002-11-01 2007-07-24 Streck, Inc. Hematology reagent and methods
CN101384729B (zh) 2003-02-05 2014-09-10 通用电气医疗集团生物科学公司 固相测序
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
EP1529840A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-11 Qiagen GmbH A rapid and low cost method for isolating nucleic acid
US20050208501A1 (en) 2004-03-16 2005-09-22 Ambion, Inc. Process and reagents for extraction of RNA from fractionated blood leukocytes
DK1778867T3 (da) 2004-07-01 2010-08-02 Gen Probe Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til detektering af nucleinsyrer i en biologisk prøve
WO2006031544A2 (en) * 2004-09-09 2006-03-23 New England Medical Center Hospitals, Inc. Methods for detection of pathogens in red blood cells
CA2599013A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods of detecting an analyte by using a nucleic acid hybridization switch probe
DE102005040259A1 (de) * 2005-08-24 2007-03-01 Qiagen Gmbh Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Blut
JP4956727B2 (ja) * 2005-08-30 2012-06-20 倉敷紡績株式会社 Ｒｎａ分離精製方法
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US7927798B2 (en) * 2005-10-05 2011-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
JP2007132776A (ja) * 2005-11-10 2007-05-31 Kyurin Pacell:Kk 細胞固定液およびそれを含有する容器
US7833716B2 (en) * 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
US9051601B2 (en) 2006-08-01 2015-06-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
EP2191012A1 (en) 2007-09-21 2010-06-02 Streck, Inc. Nucleic acid isolation in preserved whole blood
WO2009086343A2 (en) * 2007-12-31 2009-07-09 3M Innovative Properties Company Microorganism-capturing compositions and methods
US7767400B2 (en) 2008-02-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Paired-end reads in sequencing by synthesis
DE102008020258A1 (de) * 2008-04-22 2009-10-29 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Stabile Lysepuffermixtur zur Extraktion von Nukleinsäuren
AU2009246363B2 (en) 2008-05-13 2013-10-24 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
US9938590B2 (en) 2010-09-16 2018-04-10 Gen-Probe Incorporated Capture probes immobilizable via L-nucleotide tail
US8409807B2 (en) * 2010-10-22 2013-04-02 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
WO2012054588A2 (en) * 2010-10-22 2012-04-26 T2 Biosystems, Inc. Conduit-containing devices and methods for analyte processing and detection
AU2013205603B2 (en) 2012-02-01 2016-03-17 Gen-Probe Incorporated Asymmetric hairpin target capture oligomers
US9580679B2 (en) 2012-09-21 2017-02-28 California Institute Of Technology Methods and devices for sample lysis
BR112015032838A2 (pt) * 2013-07-25 2017-11-07 Basf Enzymes Llc fitase

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