JP2022009735A - 固定生物学的試料から生体分子を抽出するためのターゲット細胞または組織を決定するための方法 - Google Patents
固定生物学的試料から生体分子を抽出するためのターゲット細胞または組織を決定するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(1)固定生物学的試料の少なくとも1つの部分を少なくとも1つの支持体に載置する(mount)工程、
(2)必要に応じて、前記試料の少なくとも1つの部分を試料処理剤で処理する工程であって、該処理を工程(6)より前の手順の任意の段階で実行することができる、工程、
(3)少なくとも1つの支持体に載置された前記固定生物学的試料の少なくとも1つの部分を染色する工程、
(4)工程2において染色された少なくとも1つの部分を検討して、対象となる生体分子を含むターゲット細胞または組織を決定する工程、
(5)相応の(according)ターゲット細胞または組織を、前記支持体に載置された前記固定試料の残部から分離する工程、
(6)分離された細胞または組織から生体分子を単離する工程。
固定生物学的試料を0,5から12μm厚の切片(薄片)に分割する、
工程(1)において、元の試料中では互いに隣接していた前記切片のうちの少なくとも2つをそれぞれ別々の透明支持体に載置する、
蝋包埋試料を使用した場合、場合によっては、前記手順の任意の工程において、互いに独立して、前記切片を工程(2)に従って脱蝋剤で処理する、
工程(3)において、前記切片のうちの少なくとも1つを少なくとも1つの組織染色剤で染色し、隣接切片は染色しない、
工程(4)において、染色された試料切片中の対象となる細胞または組織を決定して印を付け、染色していない試料切片を有する透明支持体を、その染色され印が付けられた試料切片の頂部に元の試料と同じ配向で積み重ねる、
工程(5)において、前記染色された試料の印の付いたエリアの頂部の染色していない試料の細胞または組織を該染色していない試料の残部から分離し、該残部を捨て、該染色された試料の印の付いたエリアに対応する細胞/組織を保持する、
工程(6)において、工程(5)において保持された細胞から核酸を単離または抽出する。
固定生物学的試料を0,5から12μm厚の切片(薄片)に分割する、
工程(1)において、前記切片のうちの少なくとも1つを透明支持体に載置する、
工程(2)において、蝋包埋試料を使用した場合には前記切片を脱蝋剤で処理する、
工程(3)において、上で説明したような「迅速染色」法に従って前記切片を少なくとも1つの組織染色剤で染色する、
工程(4)において、染色された試料切片の中の対象となる細胞または組織を決定する、
工程(5)において、対象となる細胞または組織をその染色された試料の残部から分離し、該残部を捨てる、
工程(6)において、工程(5)において得られた細胞から核酸を単離または抽出する。
a.任意選択の、少なくとも1つの透明支持体
b.任意選択の、少なくとも1つの組織染色剤
c.任意選択の、少なくとも1つの、上で説明したような、試料処理剤
d.請求項7、8または9に記載の方法のための指示書
e. 生体分子、好ましくは核酸、最も好ましくはRNAを含むもの、を単離するため
の少なくとも1つの緩衝液および/または器具。
(i)任意選択の、生物学的試料を固定するための指示書
(ii)任意選択の、ホルマリンを含まない固定剤または混合物
(iii)任意選択の、少なくとも1つの透明支持体
(iv)任意選択の、少なくとも1つの組織染色剤
(v)任意選択の、少なくとも1つの、上で説明したような、試料処理剤
(vi)ターゲット細胞または組織を場合により染色および選択するための方法についての指示書
(vii) 生体分子、好ましくは核酸、最も好ましくはRNAを含むもの、を単離す
るための少なくとも1つの緩衝液および/または器具。
実験手順:
組織固定:
PAXgene(登録商標)Tissue Fix(PreAnalytix)による固定:検討する組織検体を5mLの固定試薬に沈めた。室温で2~4時間インキュベーションを行い、その後、PAXgene(登録商標)Tissue Stabilizer溶液に移した。
固定組織検体を固定溶液から標準ヒストカセット(standard histocasette)に移した。生体分子の保存のために、PAXgene(登録商標)Tissue Containerハンドブックにおいて推奨されているようなプロトコル(15分70%、30分80%、60分90%そして2回99%エタノール、2回60分100%イソプロパノール、2回60分100%キシレン、その後、50℃で60分キシレン-パラフィン(50-50%)、そして56℃で2回60分パラフィンでの脱水)を用いて、Leica組織プロセッサTP1020で加工処理を行った。パラフィンとして、低融点Paraplast-XTRA(SPIが供給)を使用した。加工処理後、前記インキュベーションについてのものと同じパラフィンを使用して、パラフィンブロックに組織を包埋した。
スライドに載置した4~6μm切片の、キシレン中で5分間、続いて96%、80%、70%、60%エタノール中で各3分間のインキュベーション、水道水中で3分間のインキュベーション、ヘマトキシリン(Merck、使用準備済み)中で1分間のインキュベーション、3分水道水、エオシン(Merck、使用準備済み)中で1分間のインキュベーション、3分水道水、1分80%、2分96%、3分100%エタノールそして5分1005キシレンにより、手作業でヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。最後に、それらの切片にエンテラン(Merck)を上塗りし、カバーガラスをかぶせた。
スライドに載置した4~6μm切片のキシレン中で5分、続いて96%、80%、70%エタノール中で各1~3分間のインキュベーション、RNase不含水中で2~10秒間のインキュベーション、ヘマトキシリン(Gillに従って調製したもの)中で30秒間のインキュベーション、RNase不含水中で1秒間タッピング、 エオシン(RNase不含水中0.5%)中で1秒間のインキュベーション、RNase不含水中で1秒間タッピング、1分80%、2分96%、3分100%エタノールおよび5分キシレンにより、手作業でヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。顕微鏡検査だけのために、それらの切片を5分キシレン中でさらにインキュベートし、エンテラン(Merck)を上塗りし、カバーガラスで封止した。
Gillによるヘマトキシリン溶液
2gヘマトキシリン、0.2gヨウ素酸ナトリウムおよび17.6g硫酸アルミニウム(・18H2O)を250gエチレングリコールと730mL RNase不含水の混合物に溶解した。20mL氷酢酸を添加し、2時間、室温で攪拌した。
100gカリウムミョウバン(alaun)を攪拌および加熱により950mL RNase不含水に溶解した。水浴中で加熱しながら5gヘマトキシリンを50mLエタノールに溶解した。そのヘマトキシリン溶液を前記高温ミョウバン(alaun)溶液に添加し、沸騰させた。熱から外した後、370mgヨウ素酸ナトリウムを添加した。4mL氷酢酸を添加し、得られた溶液を使用前に濾過した。
5gエオシンYを1000mL RNase不含水に添加し、2時間、室温で攪拌した。攪拌しながら2mL氷酢酸を添加した。
水100mLあたり0.1mL DEPC(ピロ炭酸ジエチル)を添加した。DEPCを溶液にするために、それを激しく攪拌し、12時間37℃でインキュベートし、15分間オートクレーブ処理して残留DEPCを低減させた。
PAXgene(登録商標)Tissue RNAプロトコル「Purification of Total RNA from Sections of PAXgene
Treated,Paraffin-Embedded Tissue」に述べられているようにキシレンおよびエタノール中でのインキュベーションにより、4~6μm厚を有する切片からパラフィンを除去した(Leica RM2245 Microtomで行った)。キシレンおよびエタノールの除去後、ペレットを溶解緩衝液TR1、水で溶解し、10分間、55℃で消化した。PAXgene(登録商標)Shredderを使用して、均質化を行った。前記プロトコルに従って、エタノールを添加した後、溶解産物をPAXgene(登録商標)MinEluteカラムに移し、緩衝液TR2で洗浄し、そのカラム上でDNaseと共にインキュベートし、TR3および80%エタノールで洗浄した。RNAを15μL~40μLの緩衝液TR4で溶離した。
スライドガラスに載置した組織切片を5分間キシレン中および3分間100%エタノール中でのインキュベーションによって脱パラフィンした。組織の染色および/または望ましくないエリアの除去後、そのスライド上の選択された組織に、プロテアーゼ、水および緩衝液TR1(150μL TR1、10μLプロテアーゼ、290μL水)を含有する150μLの溶解用混合物を上塗りした。室温での10分のインキュベーションの後、ピペッティングによってその混合物および組織を微量遠心管に移した。残りの溶解用混合物を添加し、その後、10分、55℃でのインキュベーションを行った。PAXgene(登録商標)-Shredderを使用して、均質化を行った。前記プロトコルに従って、エタノールを添加した後、溶解産物をPAXgene(登録商標)MinEluteカラムに移し、緩衝液TR2で洗浄し、そのカラム上でDNaseと共にインキュベートし、TR3および80%エタノールで洗浄した。RNAを15μL~40μLの緩衝液TR4で溶離した。
RNAを15μL~40μLの緩衝液TR4で溶離した。純度および収量の分光光度分析をNanodrop光度計で行った。RNA 6000 Nanoアッセイを用いてAgilent BionanalyzerでRNA完全性を測定した。Quantitect Probe RT Mix(QIAGEN)と、ヒトベータアクチン遺伝子の294bpフラグメントを増幅および検出するためのプライマーおよびプローブとを使用して、一工程アプローチでのTaqMan 7700(Applied Biosystems)上でリアルタイムRT-PCRを行った。
最大3mm厚の小片に切断したラット肝臓を3時間、PAXgene(登録商標)Tissue Fix中でおよび52時間、PAXgene(登録商標)Tissue Stabilizer中で固定した。加工処理およびパラフィン包埋後、6μm切片を、PAXgene(登録商標)Tissue RNAキットハンドブックに従って微量遠心管の中での直接RNA抽出に使用したか、スライドガラスに載置した。スライドガラスに載置した切片を脱パラフィンし、漸増する試料の部分(切片の50%、75%および90%)をセルスクレーパで除去した。スライドに載置した切片からのRNA抽出のために改変したプロトコルでPAXgene(登録商標)Tissue RNAキットを使用して、残りの組織(元の切片の50%、25%、10%)からRNAを精製した。前記プロトコルは、スライドガラスに載置された(残りの)試料の頂部への溶解緩衝液の少なくとも一部の直接添加、そして10分のインキュベーション後、全組織を含む溶解用混合物の微量遠心管への移入、その後、前記キットハンドブックによるさらなる加工処理によって改変した。
ラット腎臓を最大4mm厚の小片に切断し、PAXgene(登録商標)Tissueシステムで処理した。加工処理およびパラフィン包埋後、1つの4μm切片の三連の試料を、PAXgene(登録商標)Tissue RNAキットを使用する直接RNA抽出に使用した、またはスライドガラスに載置してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色中のRNA分解を避けるために、ヘマトキシリンでの60秒染色およびエオシンでの1秒染色(染色1)またはヘマトキシリンでの30秒染色およびエオシンでの1秒染色(染色2)を含む、迅速染色法を用いた。染色後、染色された切片からRNAを直接単離した。
本発明は、例えば、以下を提供する。
(項目1)
固定生物学的試料からの生体分子の単離、抽出または精製のためのターゲット細胞または組織を決定するための方法であって、前記方法は:
(1)前記固定生物学的試料の少なくとも1つの部分を少なくとも1つの支持体に載置する工程、
(2)必要に応じて、前記試料の少なくとも1つの部分を試料処理剤で処理する工程であって、前記処理を工程(6)より前の手順の任意の段階で実行することができる、工程、
(3)少なくとも1つの支持体に載置された前記固定生物学的試料の少なくとも1つの部分を染色する工程、
(4)工程3において染色された前記少なくとも1つの部分を検討して、対象となる生体分子を含むターゲット細胞または組織を決定する工程、
(5)相応のターゲット細胞または組織を、前記支持体に載置された前記固定試料の残部から分離する工程、
(6)分離された前記細胞または組織から前記生体分子を単離する工程
を包含する、方法。
(項目2)
前記生体分子がRNAを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記固定生物学的試料が、蝋包埋試料、好ましくはパラフィン包埋試料、好ましくは非ホルマリン固定パラフィン包埋試料(非FFPE-試料)であり、かつ前記試料処理剤が、以下:脱蝋剤、好ましくは、トルエン、キシレン、線状C6~C16アルカン、分岐C6~C16アルカンおよび環式C6~C16アルカン、線状ジアルキルエーテル、分岐ジアルキルエーテルおよび環式ジアルキルエーテル(ここで、各アルキル鎖は6から16個の炭素原子を含む)および室温(23±2℃)で液体の油を含む群から選択される、さらに好ましくはC13~C16アルカン、一般式O(CnH2n+1)2(式中のnは8から12の整数である)のジアルキルエーテル、室温より下の融点を有する、好ましくは室温より下の融点を有する、鉱油、シリコン油およびパラフィンを含む群から選択される、ならびに最も好ましくはキシレンまたは市販のキシレン代用品またはヘキサデカン、ジオクチルエーテル、ヘプタンまたはそれらの混合物を含む群から選択される脱パラフィン剤から選択される、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記支持体が透明である、好ましくは、前記支持体がガラスまたは透明ポリマーから作製されている、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
工程(4)における前記試料(単数または複数)が、ライトまたはバックライトのもとで、好ましくは顕微鏡のもとで検討される、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。(項目6)
前記ターゲット細胞または組織が、工程(5)において顕微解剖、レーザー捕捉顕微解剖、擦過または切り出しによって分離される、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
固定生物学的試料、好ましくは蝋包埋非ホルマリン固定パラフィン包埋試料(非FFPE-試料)、さらに好ましくは非ホルマリン固定パラフィン包埋試料の0,5から12μm厚の少なくとも1つの切片、を染色するための方法であって、前記方法は:
前記試料を60秒以下、好ましくは45秒未満、さらに好ましくは30秒未満、最も好ましくは15秒未満、少なくとも1つの組織染色剤と接触させる工程、
前記試料を水ですすぐ工程、およびその後、
必要に応じて、前記試料を10秒未満、さらなる組織染色剤と接触させる工程を包含する、方法。
(項目8)
前記試料を、30秒以下ヘマトキシリンと接触させ、かつ3秒未満、好ましくは1秒、エオシンと接触させる、項目7に記載の方法。
(項目9)
項目1から6のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
固定生物学的試料を0,5から12μm厚の切片に分割し、かつ
工程(1)において、元の試料中では互いに隣接していた前記切片のうちの少なくとも2つをそれぞれ別々の透明支持体上に載置する、
蝋包埋試料を使用した場合には、必要に応じて、前記手順の任意の段階において、互いに独立して、前記切片を工程(2)に従って脱蝋剤で処理する、
工程(3)において、前記切片のうちの少なくとも1つを少なくとも1つの組織染色剤で染色し、隣接切片を染色しない、
工程(4)において、染色された前記試料切片中の対象となる細胞または組織を決定して印を付け、染色していない前記試料切片を有する前記透明支持体を、染色されかつ印が付けられた前記試料切片の頂部に前記元の試料の場合と同じ配向で積み重ねる、
工程(5)において、染色された前記試料の印の付いたエリアの頂部にある染色していない前記試料の前記細胞または組織を、染色していない前記試料の残部から分離し、前記残部を捨て、そして染色された前記試料の印の付いた前記エリアに対応する細胞/組織を保持する、
工程(6)において、工程(5)において保持された前記細胞から核酸を単離または抽出する、
方法。
(項目10)
項目1から6のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
固定生物学的試料を0,5から12μm厚の切片に分割し、かつ
工程(1)において、前記切片のうちの少なくとも1つを透明支持体に載置する、
工程(2)において、蝋包埋試料を使用した場合には前記切片を脱蝋剤で処理する、
工程(3)において、項目7または8に記載の方法に従って前記切片を少なくとも1つの組織染色剤で処理する、
工程(4)において、染色された前記試料切片中の対象となる細胞または組織を決定する、
工程(5)において、対象となる前記細胞または組織を、染色された前記試料の残部から分離し、前記残部を捨てる、
工程(6)において、工程(5)において得られた前記細胞から核酸を単離または抽出する、
方法。
(項目11)
項目7または8に記載の方法に従って染色された組織の使用であって、前記使用は、前記組織の少なくとも一部分から生体分子を単離するためのものである、使用。
(項目12)
前記生体分子の単離が、RNA単離を含む、項目1から6、9もしくは10のいずれか一項に記載の方法または項目11に記載の使用。
(項目13)
固定生物学的試料中のターゲット細胞または組織を含む生体分子を、前記ターゲット細胞または組織から生体分子を抽出、単離および/または精製するための方法の間、視覚化するためのキットであって、前記キットは:
b.任意選択の、少なくとも1つの透明支持体
c.任意選択の、少なくとも1つの組織染色剤
d.任意選択の、少なくとも1つの項目3に記載の試料処理剤
e.項目7、8、9または10に記載の方法のための指示書
f.生体分子、好ましくは核酸、最も好ましくはRNAを含むもの、を単離するための少なくとも1つの緩衝液および/または器具
を含む、キット。
(項目14)
生物学的試料から生体分子を抽出、単離および/または精製するためのキットであって、前記キットは:
(i)任意選択の、前記生物学的試料を固定するための指示書
(ii)任意選択の、ホルマリンを含まない固定剤または混合物
(iii)任意選択の、少なくとも1つの透明支持体
(iv)任意選択の、少なくとも1つの組織染色剤
(v)任意選択の、少なくとも1つの項目3に記載の試料処理剤
(vi)項目7、8、9または10に記載の方法のための指示書
(vii)生体分子、好ましくは核酸、最も好ましくはRNAを含むもの、を単離するための少なくとも1つの緩衝液および/または器具
を含む、キット。
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