CN114923755A - 一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，包括以下步骤：样品固定；样品脱色；浸蜡与包埋；LCM切片样品制备；激光显微切割。有益效果：组织切片制备后，样品细胞结构完整清晰，便于组织结构观察和后期激光切割部位精细定位；与LCM结合冷冻切片相比，将LCM于石蜡切片结合能够实现连续获得切片样品，让样品一次性固定在膜片上，轻松实现多张样品取样；分离的样品后期进行RNA提取验证，质量和数量达到后续实验操作的要求；实现了从含水量较高的白菜组织中分离特定细胞群。
Description
技术领域
本发明涉及分离组织细胞技术领域，具体涉及一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法。
背景技术
大白菜(Brassicarapa ssp.pekinensis)是我国蔬菜栽培最早的芸薹属蔬菜作物，已逐渐成为世界性蔬菜。作为一种复杂的高等植物，包含多种组织结构，且组织中包含各种类型的细胞，进而形式不同功能。为了研究不同组织部位中不同细胞类型的特殊功能，分离、提取单一或特定部位的细胞将为后续分子研究和功能分析提供精确的实验材料，提高研究精度。
激光捕获显微切割技术是在显微镜下利用激光从组织样本中分离出特定的单细胞或特定区域的组织的非接触式和无污染的方法，是目前最为成功的解决组织中细胞异质性问题的技术。切割部分可用于进一步的分子生物学实验，如PCR、荧光定量PCR、转录组、蛋白质组学等分析技术。显微切割技术(LCM)主要应用于动物中，通过组织冷冻切片，既在低温条件下使组织快速冷却。常用的骤冷剂有：CO2气(－78℃)、干冰冷却的乙烷(－80℃)、液氮(－190℃)、液氮冷却的丙烷(－19℃)等。样品冷却达到一定硬度后进行切片、分离动物细胞。LCM所分离的组织也多种多样，包括单个细胞、单一细胞群、多个细胞群等类型。然而，在植物中此方法应用较少，且受到植物品种及不同组织器官结构差异的限制，尤其是在组织细胞中含水量较高的大白菜上未见应用。
大白菜组织含水量高，冷冻切片易导致组织破碎，无法保持细胞形态，破碎的细胞会释放内源酶，从而降解RNA。另外，冷冻切片不易实现连续切片，且单张切片厚度较厚，易出现结构重叠，分辨率低，难以对微小结构和单细胞成像。同时，组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞形态结构导致切片中组织结构不清晰。与冷冻切片不同，石蜡切片在组织学中广泛应用，可以切出很薄的组织切片，用于观察细胞组织的形态结构，但是石蜡制片程序及环节复杂繁琐，包括样品取材、固定、洗涤与脱水、脱色透明、浸蜡、包埋、切片、贴片与烤片、切片脱蜡及水化、染色等过程。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种。然而，高温浸蜡渗透会导致样品中RNA降解，影响RNA的保留，阻碍后续RNA含量分析或基因表达(mRNA)水平检测。
因此，为解决上述问题，亟需一种分离、收集大白菜特定组织细胞的方法，达到最大限度的保证切片植物组织细胞形态完整及样品中RNA的数量和质量。
发明内容
为全面解决上述问题，尤其是针对现有技术所存在的不足，本发明提供了一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法能够全面解决上述问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，包括以下步骤：
(1)、样品固定：
样品置于固定剂中，放置于冰上抽真空，4度低温过夜固定；
(2)、样品脱色：
将固定后的样品依次浸泡在30％酒精，70％酒精，96％酒精，100％酒精中进行脱色，每次浸泡时间为20分钟；
(3)、浸蜡与包埋：
将脱色后的样品先放置于Steedman wax石蜡与100％乙醇的混合液中，然后再放入100％Steedman wax石蜡中浸泡，100％Steedman wax石蜡需多次更换新液，最后使用Steedman wax石蜡将样品进行包埋，制备成石蜡模块；
(4)、LCM切片样品制备：
将包埋好的样品切成石蜡切片，然后在无RNA酶的水中展片，并置于使用UV处理过的覆膜载玻片上，使用100％乙醇清洗浸泡脱蜡，并通风处晾干；
(5)、激光显微切割：
切片干燥后，将切片至于激光显微切割显微镜的载物台上，使用激光将目标细胞切割下来，使用离心管盖收集样品，离心管盖子中加入RLT缓冲液，其中RLT缓冲液中加入二硫苏糖醇。
进一步的，在步骤(1)中，所述固定剂为75％酒精与25％醋酸的混合液。
上述的有益效果在于，75％酒精与25％醋酸混合后与传统福尔马林-醋酸-酒精固定液相比，剔除了福尔马林，增加了冰醋酸含量，防止植物材料收缩。
进一步的，在步骤(1)中，所述样品在固定剂中抽真空的时间为15分钟。
上述的有益效果在于，这种设置使得固定剂能够完全渗入组织，方便后面脱水彻底，使得蜡完全浸入组织。
进一步的，在步骤(2)中，将固定后的样品依次浸泡在30％酒精1次，70％酒精1次，96％酒精1次，100％酒精3次中进行脱色，每次浸泡时间为20分钟。
上述的有益效果在于，样品在酒精脱水过程中，减少酒精浓度梯度及时间，防止细胞破裂。
进一步的，在步骤(3)中，所述Steedman wax石蜡由90％的聚乙二醇400二硬脂酸酯和10％的1-十六烷醇混合而成。
上述的有益效果在于，这种设置的Steedman wax石蜡是一种多脂蜡，它的熔点低(35～37℃)，具有与石蜡相同的切片性质，能够切成不同厚度的连续切片，且低温处理能防止样品中RNA降解，并且针对大白菜组织进行了浸蜡过程时间上的优化。
进一步的，在步骤(4)中，将包埋好的样品切成9μm厚的石蜡切片。
上述的有益效果在于，这种设置能够减少切片厚度从而增加后续激光切割效率。
进一步的，在步骤(5)中，切片干燥后，将切片至于Leica LMD7000激光显微切割显微镜的载物台上，使用激光将目标细胞切割下来，使用2ml离心管盖收集样品，离心管盖子中加入70μL的RLT缓冲液，其中RLT缓冲液中加入40mM二硫苏糖醇。
上述的有益效果在于，Leica LMD7000激光显微切割显微镜的切割效果，切割效率高，RLT缓冲液中加入二硫苏糖醇能够有效防止RNA降解。
本发明的有益效果：
本发明组织切片制备后，样品细胞结构完整清晰，便于组织结构观察和后期激光切割部位精细定位。
本发明在样品制备、切片过程中，保证样品、切片中的RNA无降解，保证了RNA的完整性，为后续研究特异性细胞提供技术支持。
本发明与LCM结合冷冻切片相比，将LCM于石蜡切片结合能够实现连续获得切片样品，让样品一次性固定在膜片上，轻松实现多张样品取样。
本发明分离的样品后期进行RNA提取验证，质量和数量达到后续实验操作的要求。
本发明实现了从含水量较高的大白菜组织中分离特定细胞群。
附图说明
图1是本发明石蜡切片的效果图；
图2是本发明冷冻切片的效果图；
图3是本发明完整的茎尖石蜡切片；
图4是本发明激光显微切割后的切片；
图5是本发明测序数据质量值的分布图；
图6是本发明碱基含量的分布图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，包括以下步骤：
(1)、样品固定：
样品置于75％酒精加25％醋酸的固定剂中，放置于冰上抽真空15分钟，4度过夜固定；
(2)、样品脱色：
将固定后的样品依次浸泡在30％酒精1次，70％酒精1次，96％酒精1次，100％酒精3次中进行脱色，每次浸泡时间为20分钟；
(3)、浸蜡与包埋：
将脱色后的样品先放置于Steedman wax石蜡与100％乙醇的1:1混合液中，混合液中的比例为1：1，在37度的混合液中浸泡5个小时，然后再放入37度的100％Steedman wax石蜡中浸泡36小时，浸泡过程中每12h更换一次新鲜100％Steedman wax石蜡，共更换3次，最后使用Steedman wax石蜡将样品进行包埋，制备成石蜡模块，并保存在4度条件下；
(4)、LCM切片样品制备：
将包埋好的样品切成9μm厚的石蜡切片，然后在无RNA酶的水中(水中含有40mMDTT)，展片，并置于使用UV处理过的4μm Leica激光显微切割覆膜载玻片上，即金属框的专用Pen Membrane片，使用100％乙醇清洗浸泡3分钟脱蜡，并通风处晾干；
(5)、激光显微切割：
切片干燥后，将切片至于Leica LMD7000激光显微切割显微镜的载物台上，使用激光将目标细胞切割下来，使用2ml离心管盖收集样品，离心管盖子中加入70μL的RLT缓冲液，其中RLT缓冲液中加入40mM二硫苏糖醇，防止RNA降解。
实施例2
含水量较大的大白菜茎尖组织的低温石蜡切片制备：如图1至图2所示，石蜡切片效果对比冷冻切片效果。
效果说明：大白菜叶柄和胚轴部位的薄壁细胞含水量很高。在冷冻切片中能明显看出叶柄和胚轴部位细胞破碎，形成多处空洞，无法清晰分辨。在石蜡切片中，叶柄和胚轴部位的薄壁细胞形态完整且能看到单个细胞轮廓轮廓，为后续激光显微切割提供清晰的样品结构视野，便于精确切割、提取目的细胞。
实施例3
从大白菜茎尖中分离顶端分生组织细胞
(1)、采用实施例1中描述的低温石蜡包埋法，对大白菜茎尖进行包埋，并对切片进行激光切割、捕获局部的顶端分生组织细胞，如图3所示；
从上面切片中，使用激光切割下局部顶端分生组织细胞，细胞样品收集到RLT缓冲液中，防止RNA降解；切片上其他部位仍保持完好，仅采样部位产生空洞，如图4所示。
(2)、采用此方法完成细胞采集后，提取细胞中的RNA，质量达到RNA建库质量。
使用RNA提取试剂盒RNeasy Micro kit(Qiagen)从收集的细胞中提取RNA，并使用微量扩增试剂盒SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNAKit(Clontech)进行RNA扩增后完成转录组建库及测序。测序质量分析如下：
a)、Illumina高通量测序平台的碱基质量值用Phred quality score表示。测序仪在碱基识别时，会给出每个碱基错误识别的概率P，碱基的Phred quality score则为-10log10P，如某个碱基的错误识别的概率为0.001，则其质量值为30。本样品中质量值大于35，意味着样品测序碱基正确率高于99.9％。可以进行后续RNA-seq数据分析，解析生物学问题，如图5所示。
b)、理想情况下，根据碱基互补配对原则，测序数据的GC(AT)碱基含量理论上应该相等。本样品中没有出现GC分离现象，如图6所示。效果说明：证明RLT缓冲液在细胞采集过程中对细胞中RNA起到了保护作用，保证采集的细胞中RNA完成、无降解，可用于后续分析
本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围中。
Claims (7)
1.一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、样品固定：
样品置于固定剂中，放置于冰上抽真空，4度低温过夜固定；
(2)、样品脱色：
将固定后的样品依次浸泡在30％酒精，70％酒精，96％酒精，100％酒精中进行脱色，每次浸泡时间为20分钟；
(3)、浸蜡与包埋：
将脱色后的样品先放置于Steedman wax石蜡与100％乙醇的混合液中，然后再放入100％Steedman wax石蜡中浸泡，100％Steedman wax石蜡需多次更换新液，最后使用Steedman wax石蜡将样品进行包埋，制备成石蜡模块；
(4)、LCM切片样品制备：
将包埋好的样品切成石蜡切片，然后在无RNA酶的水中展片，并置于使用UV处理过的覆膜载玻片上，使用100％乙醇清洗浸泡脱蜡，并通风处晾干；
(5)、激光显微切割：
切片干燥后，将切片至于激光显微切割显微镜的载物台上，使用激光将目标细胞切割下来，使用离心管盖收集样品，离心管盖子中加入RLT缓冲液，其中RLT缓冲液中加入二硫苏糖醇。
2.根据权利要求1所述的一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述固定剂为75％酒精与25％醋酸的混合液。
3.根据权利要求2所述的一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述样品在固定剂中抽真空的时间为15分钟。
4.根据权利要求1所述的一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将固定后的样品依次浸泡在30％酒精1次，70％酒精1次，96％酒精1次，100％酒精3次中进行脱色，每次浸泡时间为20分钟。
5.根据权利要求1所述的一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述Steedman wax石蜡由90％的聚乙二醇400二硬脂酸酯和10％的1-十六烷醇混合而成。
6.根据权利要求1所述的一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将包埋好的样品切成9μm厚的石蜡切片。
7.根据权利要求1所述的一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，其特征在于，在步骤(5)中，切片干燥后，将切片至于Leica LMD7000激光显微切割显微镜的载物台上，使用激光将目标细胞切割下来，使用2ml离心管盖收集样品，离心管盖子中加入70μL的RLT缓冲液，其中RLT缓冲液中加入40mM二硫苏糖醇。
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