CN110618018A - 一种获取植物木质部的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获取植物木质部的方法。它是将含有木质部的植物组织采用直接液氮速冻后半包埋方式获得冰冻切片，再用激光显微切割方法获取其中的木质部。本发明通过冰冻切片和激光显微切割技术相结合，成功的分离到黄梁木的纯的木质部组织。本发明公开的方法相比于前人的木质部细胞获得方法定位更加精确，细胞同质性较高，为进一步研究木质部的分子生物学及基因组学研究奠定基础。

Description

一种获取植物木质部的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获取植物木质部的方法。
背景技术：
木质部是维管植物输导组织的重要组成部分，担负将根吸收的水分及溶解于水里的养分往上运输，供其他器官组织使用，并兼具一定的支撑作用。木质部导管和管胞最显著的特点是在初生壁和质膜之间由纤维素、半纤维素和木质素沉积形成环状、螺旋、网状或者孔纹的次生细胞壁，成熟时细胞死亡，细胞内含物全部消失，形成空洞的管子。利用细胞学和分子生物学的方法研究木质部的发育和物质运输功能具有重要的意义。
黄梁木(Neolamarckia cadamba)是热带亚热带地区广泛分布的茜草科团花属速生阔叶树种，不仅生长十分迅速而且材质致密。其快速生长依赖于包括初生木质部和次生木质部在内的整个木质部细胞的发育进程。因此，解析木质部细胞生长与发育的分子调控机制对于促进热带亚热带阔叶树种的遗传改良与应用具有重要作用。然而，在木本植物中尤其是速生树种中如何获得高质量的特定组织或细胞仍然是一道技术难题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能够成功的分离到纯的木质部组织的获取植物木质部的方法。
本发明的获取植物木质部的方法，是将含有木质部的植物组织采用直接液氮速冻后半包埋方式获得冰冻切片，再用激光显微切割方法获取其中的木质部。
所述的植物为黄粱木。
所述的含有木质部的植物组织是试管苗移栽后三月龄幼苗的茎节。
所述的含有木质部的植物组织采用直接液氮速冻后半包埋方式获得冰冻切片包括将含有木质部的植物组织进行预处理、包埋、切片，粘片与脱水的步骤。
所述的将含有木质部的植物组织进行预处理是首先卡诺氏固定液固定植物组织，然后用质量分数15～25％蔗糖PBS溶液保护材料，再用液氮速冻材料30～60s。
所述的包埋为半包埋方式，只对材料接触样品陀的部分进行包埋，所用的包埋剂为OTC包埋剂。
所述的冰冻切片厚度为14μm-18μm，最优选是14μm。
所述的粘片是切片在滴有无水酒精的聚乙烯萘(PEN)的RNase-free膜玻片上粘片。
所述的脱水条件是将玻片放在装有无菌二氧化硅的切片盒中干燥10-20min。
所述的激光显微切割采用的是LeicaAS LMD 7000激光显微切割系统，在5-10倍物镜下，所使用的激光参数为：power(能量)37-46，Aperture(孔径)1-8，Speed(速度)6-7，Head Current(发射强度)100％，Pulse Frequency(脉冲频率)1101。
本发明通过冰冻切片和激光显微切割技术相结合，成功的分离到黄梁木的纯的木质部组织。本发明公开的方法相比于前人的木质部细胞获得方法定位更加精确，细胞同质性较高，为进一步研究木质部的分子生物学及基因组学研究奠定基础。
附图说明：
图1是黄粱木幼苗茎段取材示意图
图2是卡诺氏固定液固定后加入15％蔗糖PBS溶液的冰冻切片显微结构图：A.茎节横切切片显微结构图，B.A图中木质部局部放大图
图3是不同包埋方式的冰冻切片显微结构图，A.半包埋后的冰冻切片图；B.图A中木质部局部放大图；C.全包埋后的冰冻切片图；D.图C中木质部局部放大图。
图4是激光显微切割黄梁木第一茎节木质部细胞，A切割前；B切割后；C切割收集的木质部细胞
图5是激光显微切割黄梁木第二茎节木质部细胞，A切割前；B切割后；C切割收集的木质部细胞
图6是卡诺氏固定液固定后加入25％蔗糖PBS溶液的冰冻切片显微结构图，A.茎节横切切片显微结构图，B.A图中木质部局部放大图
图7是激光显微切割黄梁木第四茎节木质部细胞，A切割前；B切割后；C切割收集的木质部细胞。
具体实施方式：
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。
实施例1.冰冻切片和激光显微切割技术相结合精确获取黄梁木茎的初生木质部
一、冰冻切片的制备
1、材料准备：将生长一个月后的黄梁木无菌试管苗，移栽到土中，在温室中继续培养三个月后作为实验材料。温室培养生长条件为：光照强度1000～1500lX，昼夜时间12h/12h，培养温度(25±2)℃。
2、取生长良好的黄梁木移栽三个月幼苗，取材部位如图1所示，用RNaseZap擦拭过的单面刀片切去叶子，留下第一茎节和第二茎节，每个茎节均切成4-6mm的小段，立即投入到卡诺氏固定液中。取材过程尽力减少实验过程中存在的RNAase，取材过程要迅速，固定液事先在冰上预冷，固定液的体积是样品体积的20倍以上。
3、冰上抽真空(98kpa)处理15min，共三次，每次更换新的固定液，直到全部茎段沉入管底并且不再有密集气泡冒出。更换固定液后4℃固定4h，每隔1h更换固定液。
4、材料经过4h固定后，将材料取出，用DEPC水洗净后，投入到15％蔗糖PBS溶液中，冰上真空(98kpa)处理1h，4℃过夜。在将茎节材料进行30秒的液氮速冻处理。多次实验显示，只有将材料用15％蔗糖PBS溶液处理后液氮速冻30秒，茎节才能切出木质部细胞结构完整和清洗的切片，切片如图2所示。
5、包埋：采用半包埋方式对材料进行包埋处理，即在完成对黄梁木茎段的前期处理后，待冰冻切片机的机箱温度降至设定温度(-24℃)后，将OCT包埋剂先滴加到样品陀上，在包埋剂完全凝固之前，用镊子将茎段垂直放在样品坨上，利用未干的包埋剂固定住茎段的下端，直至包埋剂完全凝固。半包埋方式即只对材料接触样品陀的部分进行包埋，切片如图3A和3B所示，大大提高了成片率并更好地保护了切片形态的完整性；当黄梁木幼苗茎段进行全包埋处理时，切片如图3C和3D所示，切片易与包埋剂分离导致成片率较低，即使成片，切片的木质部遭到挤压，髓部因为受力不均产生破裂而形成空洞。因此，本发明采用半包埋的方法对黄梁木茎段进行切片前处理。
6、修块：摇动冰冻切片机的手动轮进行修块，使切片平整，直到露出茎段完整的横切面。
并可用单面刀将多余的OCT包埋剂修成梯形，便于切片。修块时，注意要从包埋剂的开端开始修，以免整个样品因突然受力过大而掉落。
7、切片:不同切片厚度的冰冻切片直接影响实验的成败。当切片厚度低于14μm时，材料不易成片且容易造成肉眼可见的空洞。即使成片，由于切片强度低而不易贴片，如果在无水乙醇中展片，组织会迅速弥散开导致木质部破损严重。当切片厚度为18-24μm时，虽然较容易获得高质量切片，但是激光切割时需要更高的切割能量而导致灼烧木质部细胞，影响RNA质量。当切片厚度为24-30μm时，由于黄梁木材质致密，几乎不能成功切片。并且会造成对刀片较大的损耗，甚至材料磕碰到防卷板而掉落。所以黄梁木幼苗第一和第二茎节组织冰冻切片厚度设定为14μm，切片效果最佳。切片厚度确定后，开始切片，可放下防卷板，调整防卷板的位置直到能得到完整的切片。
8、粘片:选取形态完整的切片，整齐排列于滴有无水乙醇的聚乙烯萘(PEN)的RNase-free膜玻片上。
9、脱水：完成粘片后，将玻片放在装有无菌二氧化硅的切片盒中干燥20min，供下一步激光显微切割用。
二、激光显微切割样品及样品的观察
主要步骤按照Leica LMD7000说明书进行操作，主要步骤如下：
1、依次打开显微镜控制箱的开关和PC机，该系统在开机后会进行自检，等自检结束后打开软件LMD V7.5.1。在放置切片和收集管前，用RNaseZap(Ambion)对切片架和收集器进行擦拭。
2、将铺有样品的玻片朝下卡入切片架后，点击“Unload High”，将切片架插入载物台上，保证玻片的位置放置准确并且切片架顺畅卡入载物台。
3、安装收集管时，将管盖至收集架的末尾处，直至完全固定不能随意移动，收集管则向后折卡到收集器的别针处，点击“Unload Down”，将收集架放入载物台下方收集分离样品，并在收集管盖中加入60μL的RNA裂解保护液。点击软件界面中“10×”物镜对切片进行对焦直至画面清晰，选择收集管，载物台上的校准孔会自动转换至相应的收集管位置。
4、在软件界面右侧的菜单栏点击“Draw+Cut”后，选择切割目标图形，移动鼠标光标圈选目标切割部分，该轨迹显示在屏幕上，可在Shape List中选择切割目标后，点击“Start Cut”后开始切割，或者点击“Erase”键删除后重新勾选切割图形。若一次不能完全切割下来可选择“Move+Cut”对未切断部分进行边画边切。可根据切割效果，调整激光显微切割激光参数，包括以下几个方面：激光能量(power)、激光孔径(aperture)、切割速度(speed)、发射强度(Head Current)、脉冲频率(Pulse Frequency)。在保证能有效切割的情况下，尽量降低激光能量，以免灼烧细胞影响RNA质量。
5、切割完成后，分离的样品会掉落到收集管盖中。为确保成功收集样品，在界面的上面点击“Collector”，视野便自动从载玻片转换到收集管盖，对焦后可观察是否有样品。
6、收集完一张玻片后，点击“Unload Down”，取出收集管，轻轻盖上管帽，防止裂解液溅出，如果不能直接进行实验，可以放入负80℃冰箱保存。点击“Unload High”将载物台上的载玻片夹弹出，取下玻片。在关闭软件之前，将“Light Intensity”调到最小，把物镜转换到5倍，将载物台降至最低。与开机相反的顺序依次关闭软件、显微镜控制器和激光器，待仪器散热后轻轻盖上保护罩。
适合的激光参数是在规定时间内提高激光显微切割效率以获得尽可能多目标细胞的关键因素。但是，激光显微切割的参数具有物种和组织特异性。黄梁木不同发育状态的木质部细胞具有不同属性，第一和第二茎节组织部位初生生长的木质部细胞含水量较高，未形成次生壁。经反复试验，得到了切割处于初生生长茎节的木质部细胞的最佳参数，在10倍物镜下切割可以尽量避免激光灼烧到面积小的木质部区域，激光显微切割的参数为：激光能量37、激光孔径1、切割速度7、发射强度100％、脉冲频率1101。第一茎节木质部细胞切割前、切割后以及切割收集到的木质部细胞如图4A、4B、4C所示。第二茎节木质部细胞切割前、切割后以及切割收集到的木质部细胞如图5A、5B、5C所示。
实施例2.冰冻切片和激光显微切割技术相结合精确获取黄梁木茎的次生木质部
1、材料准备：将生长一个月后的黄梁木无菌试管苗，移栽到土中，在温室中继续培养三个月后作为实验材料。温室培养生长条件为：光照强度1000～1500lX，昼夜时间12h/12h，培养温度(25±2)℃。
2、取生长良好的黄梁木移栽幼苗，取材部位如图1所示，用RNaseZap擦拭过的单面刀片切去叶子，留下第4茎节，每个茎节均切成4-6mm的小段，立即投入到卡诺固定液中。取材过程尽力减少实验过程中存在的RNAase，取材过程要迅速，固定液事先在冰上预冷，固定液的体积是样品体积的20倍以上。
3、冰上抽真空(98kpa)处理15min，共三次，每次更换新的固定液，直到全部茎段沉入管底并且不再有密集气泡冒出。更换固定液后4℃固定4h，每隔1h更换固定液。
4、材料经过4h固定后，将材料取出，用DEPC水洗净后，投入到质量分数25％蔗糖PBS保护剂中，冰上真空(98kpa)处理1h，4℃过夜。在将茎节材料进行60秒的液氮速冻处理。多次实验显示，只有将材料用25％蔗糖保护液处理后液氮速冻60秒，茎节才能切出木质部细胞结构完整和清洗的切片，切片如图7所示。
5、包埋：采用半包埋方式对材料进行包埋处理，即在完成对黄梁木茎段的前期处理后，待冰冻切片机的机箱温度降至设定温度(-24℃)后，将OCT包埋剂先滴加到样品陀上，在包埋剂完全凝固之前，用镊子将茎段垂直放在样品坨上，利用未干的包埋剂固定住茎段的下端，直至包埋剂完全凝固。半包埋方式即只对材料接触样品陀的部分进行包埋，大大提高了成片率并更好地保护了切片形态的完整性。
6、修块：摇动冰冻切片机的手动轮进行修块，使切片平整，直到露出茎段完整的横切面。
并可用单面刀将多余的OCT包埋剂修成梯形，便于切片。修块时，注意要从包埋剂的开端开始修，以免整个样品因突然受力过大而掉落。
7、切片:对黄梁木温室幼苗茎段用不同厚度(10μm到30μm)进行冰冻切片，发现黄梁木幼苗第四茎节组织冰冻切片厚度设定为18μm，切片效果最佳。切片厚度确定后，开始切片，可放下防卷板，调整防卷板的位置直到能得到完整的切片。
8、粘片:选取形态完整的切片，整齐排列于滴有无水乙醇的聚乙烯萘(PEN)的RNase-free膜玻片上。
9、脱水：完成粘片后，将玻片放在装有无菌二氧化硅的切片盒中干燥20min，供下一步激光显微切割用。
三、激光显微切割样品及样品的观察
主要步骤按照Leica LMD7000说明书进行操作，主要步骤如下：
1、依次打开显微镜控制箱的开关和PC机，该系统在开机后会进行自检，等自检结束后打开软件LMD V7.5.1。在放置切片和收集管前，用RNaseZap(Ambion)对切片架和收集器进行擦拭。
2、将铺有样品的玻片朝下卡入切片架后，点击“Unload High”，将切片架插入载物台上，保证玻片的位置放置准确并且切片架顺畅卡入载物台。
3、安装收集管时，将管盖至收集架的末尾处，直至完全固定不能随意移动，收集管则向后折卡到收集器的别针处，点击“Unload Down”，将收集架放入载物台下方收集分离样品，并在收集管盖中加入60μL的RNA裂解保护液。点击软件界面中“5×”物镜对切片进行对焦直至画面清晰，选择收集管，载物台上的校准孔会自动转换至相应的收集管位置。
4、在软件界面右侧的菜单栏点击“Draw+Cut”后，选择切割目标图形，移动鼠标光标圈选目标切割部分，该轨迹显示在屏幕上，可在Shape List中选择切割目标后，点击“Start Cut”后开始切割，或者点击“Erase”键删除后重新勾选切割图形。若一次不能完全切割下来可选择“Move+Cut”对未切断部分进行边画边切。可根据切割效果，调整激光显微切割激光参数，包括以下几个方面：激光能量(power)、激光孔径(aperture)、切割速度(speed)、发射强度(Head Current)、脉冲频率(Pulse Frequency)。在保证能有效切割的情况下，尽量降低激光能量，以免灼烧细胞影响RNA质量。
5、切割完成后，分离的样品会掉落到收集管盖中。为确保成功收集样品，在界面的上面点击“Collector”，视野便自动从载玻片转换到收集管盖，对焦后可观察是否有样品。
6、收集完一张玻片后，点击“Unload Down”，取出收集管，轻轻盖上管帽，防止裂解液溅出，如果不能直接进行实验，可以放入负80℃冰箱保存。点击“Unload High”将载物台上的载玻片夹弹出，取下玻片。在关闭软件之前，将“Light Intensity”调到最小，将载物台降至最低。与开机相反的顺序依次关闭软件、显微镜控制器和激光器，待仪器散热后轻轻盖上保护罩。
适合的激光参数是在规定时间内提高激光显微切割效率以获得尽可能多目标细胞的关键因素。但是，激光显微切割的参数具有物种和组织特异性。黄梁木不同发育状态的木质部细胞具有不同属性，次生生长的木质部细胞已经发生木质化，含有较多纤维，相比于其他细胞类型，激光更难切割，特别是细胞壁相邻的位置。经反复试验，得到了切割第四茎节的木质部细胞的最佳参数：在5倍物镜下完成切割，激光能量46、激光孔径8、切割速度6、发射强度100％、脉冲频率1101。第四茎节木质部细胞切割前、切割后以及切割收集到的木质部细胞如图8A、8B、8C所示。

Claims (10)

1.一种获取植物木质部的方法，其特征在于，将含有木质部的植物组织采用直接液氮速冻后半包埋方式获得冰冻切片，再用激光显微切割方法获取其中的木质部。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物为黄粱木。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的含有木质部的植物组织是试管苗移栽后三月龄幼苗的茎节。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有木质部的植物组织采用直接液氮速冻后半包埋方式获得冰冻切片，包括将含有木质部的植物组织进行预处理、包埋、切片，粘片与脱水的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的将含有木质部的植物组织进行预处理是首先卡诺氏固定液固定植物组织，然后用质量分数15～25％蔗糖PBS溶液保护材料，再用液氮速冻材料30～60s。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的包埋为半包埋方式，只对材料接触样品陀的部分进行包埋，所用的包埋剂为OTC包埋剂。
7.根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于，所述的冰冻切片厚度为14μm-18μm。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的粘片是切片在滴有无水酒精的聚乙烯萘的RNase-free膜玻片上粘片。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的脱水条件是将玻片放在装有无菌二氧化硅的切片盒中干燥10-20min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激光显微切割采用的是LeicaASLMD7000激光显微切割系统，在5-10倍物镜下，所使用的激光参数为：power(能量)37-46，Aperture(孔径)1-8，Speed(速度)6-7，Head Current(发射强度)100％，Pulse Frequency(脉冲频率)1101。
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