CN111982629A - 一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法 - Google Patents

一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法。本发明公开的食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法，包括：将食用菌样品于固定液中固定，得到固定好的样品；将固定好的样品置于冷冻保护剂中进行预处理，得到预处理的样品，冷冻保护剂由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在冷冻保护剂中的浓度分别为5％(质量百分比)海藻糖和10％(体积百分比)甘油；将预处理的样品利用冷冻切片组织包埋剂进行包埋，得到包埋好的样品；将包埋好的样品进行切片，完成食用菌的超薄冷冻切片。本发明的方法可以最大程度地保证食用菌组织结构的完整性，且操作简便，处理时间短，无包埋剂残留污染，不易掉片，适用于多种食用菌子实体和菌丝体。

Description

一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法
技术领域
本发明涉及生物组织学技术领域中，一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法。
背景技术
细胞显微结构观察常用的切片方法有徒手切片法、石蜡切片法和冷冻切片法等。徒手切片法不需要专门的仪器设备和特殊化学试剂(脱水剂、包埋剂等)处理，但对切片技术要求高，在制片过程中易破坏样品的组织结构。石蜡切片法步骤多、耗时长，溶蜡高温操作易引起样品染色体或其它组织结构损伤，并且石蜡自发荧光的干扰使其不适于荧光染色或其它免疫荧光染色观察。冷冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比，它不经脱水、透明、浸蜡等步骤，易保持原有生活形态，具有快速、简便、易操作等优点，常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究。
食用菌子实体的形成和发育机制是近年来食用菌领域的研究热点。从细胞生物学层面对子实体结构进行观察是研究子实体形成发育最为有效和直观的方法。食用菌的子实体和菌丝体较软，尤其是子实体的菌褶部分较小、易碎且含水量高，常规的冷冻切片技术无法获得效果较好的子实体切片。故，目前急需一种更好的食用菌冷冻切片方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何对食用菌进行超薄冷冻切片。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种食用菌的超薄冷冻切片方法，所述方法包括：
1)将食用菌样品于固定液中固定，得到固定好的样品；
2)将所述固定好的样品置于冷冻保护剂中进行预处理，得到预处理的样品，所述冷冻保护剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述冷冻保护剂中的浓度分别为5％(质量百分比)海藻糖和10％(体积百分比)甘油；
3)将所述预处理的样品利用冷冻切片组织包埋剂进行包埋，得到包埋好的样品；
4)将所述包埋好的样品进行切片，完成食用菌的超薄冷冻切片。
上述方法中，所述预处理可通过将所述固定好的样品置于所述冷冻保护剂中抽真空再室温孵育1小时完成。
上述方法中，所述固定液可由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述固定液中的浓度分别为2.5％(体积百分比)戊二醛、0.1M KH2PO4和0.1M Na2HPO4·12H2O。
上述方法中，所述将食用菌样品于固定液中固定可通过将所述食用菌样品置于所述固定液中抽真空再4℃孵育20分钟完成。
上述方法中，步骤3)中，包埋可在-10℃下进行。
所述包埋可采用Leica冷冻切片组织包埋剂进行。
上述方法中，所述食用菌可为丝球小奥德蘑(Oudemansiella apalosarca)、平菇(Pleurotus ostreatus)或香菇(Lentinula edodes)。
上述方法中，所述食用菌样品可为丝球小奥德蘑子实体、平菇子实体、香菇子实体或香菇菌丝体。
上述方法中，所述食用菌为丝球小奥德蘑，所述切片厚度为8-12μm；
所述食用菌为平菇，所述切片厚度为6-8μm；
所述食用菌为香菇，所述切片厚度为4-6μm。
上述方法中，所述食用菌的超薄冷冻切片方法还包括在换液体处理前后利用0.1MPBS和/或水清洗。
上述方法中，所述冷冻切片组织包埋剂可为Leica冷冻切片组织包埋剂(LeicaTissue Freezing Medium,REF:14020108926)。
本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括所·述冷冻保护剂和/或所述固定液。
所述成套试剂还可包括所述冷冻切片组织包埋剂。
所述成套试剂可仅由所述冷冻保护剂和所述固定液中的任一种组成，还可由所述冷冻保护剂和所述固定液组成，还可以由所述冷冻保护剂、所述固定液和所述冷冻切片组织包埋剂。
所述成套试剂可用于食用菌超薄冷冻切片。
所述成套试剂在食用菌超薄冷冻切片中的应用，也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明的食用菌的超薄冷冻切片方法可以最大程度地保证食用菌组织结构的完整性，并且操作流程简便，处理时间短，从样品采集到切片制片完成仅需不到两小时，大大缩短了实验周期；本发明的方法适用于多种食用菌子实体和菌丝体，并且切片厚度较薄最薄可达1μm；本发明的方法可进行连续切片，连续观察食用菌子实体组织各层面显微结构，为后期合成3D构象图提供前期技术基础；本发明的方法不使用二甲苯、丙酮等高毒透明剂，包埋剂为水溶性，用水稍加清洗即可去除不会有残留，染色处理时无包埋剂残留污染，操作简单，并且不易掉片；为食用菌子实体、菌丝体组织结构研究提供强有力的保障。
附图说明
图1为冷冻切片流程示意图。a为使用Leica组织包埋剂进行样品包埋的示意图；b为制备的显微玻片；c为抽真空处理样品，可以很好的将组织内的空气抽出；d为抽真空后的组织样品可以完全浸入固定液及保护液液体中；e为经过预处理的丝球小奥德蘑显微镜观察结果，菌褶部位细胞组织结构完整无损伤，担子轮廓清晰。
图2为未预处理对照丝球小奥德蘑冷冻切片组织图片。
图3为DAPI荧光染色后丝球小奥德蘑冷冻切片菌褶组织。S：孢子；B：担子；N：细胞核。左图Bar＝50μm，右图Bar＝20μm。
图4为不同固定条件下冷冻切片观察结果。Bar＝50μm。
图5为不同冷冻保护剂处理后冷冻切片观察结果。
图6为不同切片厚度对食用菌子实体冷冻切片影响。
图7为平菇和香菇冷冻切片结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的丝球小奥德蘑(Oudemansiella apalosarca)为2016年07月20日公布的申请公布号为CN 105769938A的中国发明专利申请中的淡褐奥德蘑(Oudemansiellacanarii)JZB2115055”，以下简称丝球小奥德蘑。
0.1M PBS：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在0.1M PBS中的浓度分别为0.1M KH2PO4和0.1M Na2HPO4·12H2O，PH 7.2。
固定液(GA)(即戊二醛固定液)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在固定液(GA)中的浓度分别为2.5％(体积百分比)戊二醛、0.1M KH2PO4和0.1M Na2HPO4·12H2O。
多聚甲醛固定液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在多聚甲醛固定液中的浓度分别为4％(质量百分比)多聚甲醛、1.9mM NaH2PO4·2H2O、8.1mM Na2HPO4·12H2O。其中多聚甲醛为Sigma产品,货号为158127。
冷冻保护剂由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在冷冻保护剂中的浓度分别为5％(质量百分比)海藻糖和10％(体积百分比)甘油。
冷冻保护剂1：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在冷冻保护剂中的浓度分别为10％(质量百分比)海藻糖和5％(体积百分比)甘油。
冷冻保护剂2：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在冷冻保护剂中的浓度分别为20％(质量百分比)蔗糖和10％(体积百分比)甘油。
实施例1、丝球小奥德蘑的冷冻切片
一、丝球小奥德蘑的冷冻切片
1)固定：
用镊子选取丝球小奥德蘑子实体上稍厚的菌褶组织切成0.5×1.0cm小块作为待处理样品放入1.5ml离心管中，用0.1M PBS清洗2次，弃液体，得到清洗好的样品；将清洗好的样品吸干水分，向样品中加入500μL固定液(GA)，使固定液(GA)没过样品，然后在离心管口包裹5层封口膜，用牙签扎三个小孔，用抽真空泵抽出离心管内样品组织细胞中的空气，使样品完全浸没入固定液，抽真空结束后将样品继续于4℃下固定20min，弃液体，得到固定好的样品。
2)预处理：
将步骤1)所得固定好的样品，用0.1M PBS清洗2-3次后，加入冷冻保护剂，使冷冻保护剂没过样品，然后在离心管口包裹5层封口膜，用牙签扎三个小孔，用抽真空泵抽真空，使样品完全浸没入冷冻保护剂，室温孵育1h，弃液体，得到预处理的样品。
3)包埋：
将Leica冷冻切片样品拖放入样品准备台上预冷5min，预冷后在样品拖底层加入Leica冷冻切片组织包埋剂(Leica Tissue Freezing Medium,REF:14020108926)，铺平底部后放在样品准备台上冷冻10min钟，待样品拖底部包埋剂全部冷冻后将步骤2)所得预处理的样品竖直放在冷冻好的包埋剂上，放入样品台上冷冻10s。待下部固定后，在其周围滴加Leica冷冻切片组织包埋剂逐层包埋，直至样品全部被包埋，在样品台上继续冷冻直至包埋剂凝固，包埋凝固好样品的样品拖(带有包埋好的样品)。样品准备台温度设定为-10℃。
4)切片：
采用Leica冷冻切片机CM1950进行切片。箱体温度和冷刀温度设定为-20℃，将步骤3)所得包埋凝固好样品的样品拖固定在样品台上，保持样品材料表面与刀平行。对样品进行修样，厚度参数为35μm，切掉样品块上表面包埋剂，并将表面修饰平整。完成修样后，调整切片厚度参数进行切片，切片厚度为12μm。
5)制作显微玻片：
步骤4)完成后，用毛笔或牙签轻柔地挑取切下来的材料放置于粘附性载玻片上(后期清洗染色时不易掉片，如选用普通载玻片需在载玻片表面涂抹粘片剂)，晾干1min。
6)清洗：
步骤5)完成后，将制好的显微载玻片用ddH2O清洗2次，0.1M PBS清洗1次，去除残留的包埋剂，并用滤纸吸净液体，得到清洗后的载玻片。
7)染色：
步骤6)完成后，向载玻片上滴加品红染液，盖盖玻片，在光学显微镜下观察。
按照上述步骤1)、3)-7)，将步骤1)得到的固定好的样品直接进行包埋，然后切片、制作显微玻片和清洗，作为未预处理对照。
冷冻切片流程示意图如图1所示。
通过上述步骤1)-7)切片的丝球小奥德蘑菌褶部位细胞组织结构完整无损伤，担子轮廓清晰(图1中e)，不经处理直接进行冷冻切片的未预处理对照中，子实体菌丝组织极易破损变形(图2)。
二、步骤一的冷冻切片用于荧光染色
1)取按照步骤一中1)-6)所得清洗后的载玻片，在其染色区域，滴加30μl DAPI染色液，将盖玻片盖于染色区域，在盖玻片四周涂抹指甲油以封片。
2)指甲油凝固后将载玻片置于冰盒里静置1小时。
3)步骤2)完成后，将载玻片置于荧光显微镜下，在激发波长405nm、发射波长488nm下进行观察。
结果表明，通过DAPI染色后可清晰观察到丝球小奥德蘑菌褶中完整的菌丝、担子、担孢子细胞组织结构，及其中的细胞核，并且无背景色污染。上述结果表明利用上述方法制备的冷冻切片适用于荧光染色。
实施例2、固定液及固定时间对切片的影响
1)固定：
同实施例1步骤一中1)，得到抽真空戊二醛固定20min样品。
按照实施例1步骤一中1)的方法，将固定液(GA)替换为多聚甲醛固定液，其他步骤均不变，进行固定，得到抽真空多聚甲醛固定20min样品。
按照实施例1步骤一中1)的方法，将样品在未经抽真空泵抽真空时在戊二醛固定液中固定24小时，其他步骤均不变，得到未抽真空戊二醛固定24小时样品。
按照实施例1步骤一中1)的方法，将固定液(GA)替换为多聚甲醛固定液，将样品在未经抽真空泵抽真空时在多聚甲醛固定液中固定24小时，其他步骤均不变，得到未抽真空多聚甲醛固定24小时样品。
将实施例1步骤一中1)中清洗好的样品的直接进行下一步实验，作为未固定对照。
将所得五种样品分别按照如下步骤2)-6)进行实验。
2)预处理：
同实施例1步骤一中2)。
3)包埋：
同实施例1步骤一中3)。
4)切片：
同实施例1步骤一中4)。
5)制作显微玻片：
同实施例1步骤一中5)。
6)清洗：
同实施例1步骤一中6)。
步骤6)完成后，在光学显微镜下观察，结果见图4。
结果表明，未固定样品组织细胞破损严重，且担子细胞轮廓不清晰，无法进行观察分析。抽真空后固定样品细胞结构清晰，整体结构相对完整。但多聚甲醛固定液相对于戊二醛固定液固定后样品，少部分组织仍易出现破损情况。在戊二醛固定液固定20min后担子细胞轮廓清晰，并且组织完整，可适用于大部分光学染色和荧光染色需要，但戊二醛固定液不能用于免疫组化实验。不经抽真空处理组织在固定液中固定时间超过24h，组织可浸入固定液中，但均可对细胞组织造成严重破坏，影响组织完整性。
实施例3、冷冻保护剂对切片的影响
1)固定：
同实施例1步骤一中1)。
2)预处理：
同实施例1步骤一中2)，得到冷冻保护剂预处理的样品。
按照实施例1步骤一中2)的方法，将冷冻保护剂替换为冷冻保护剂1，得到冷冻保护剂1预处理的样品。
按照实施例1步骤一中2)的方法，将冷冻保护剂替换为冷冻保护剂2，得到冷冻保护剂2预处理的样品。
将步骤1)所得固定好的样品，用0.1M PBS清洗2-3次后，依次利用30％、40％、50％、60％和70％的乙醇水溶液进行处理，每种浓度乙醇水溶液的处理时间均为10min，处理结束后得到梯度酒精脱水样品。
将步骤1)所得固定好的样品不经任何处理直接进行下一步实验，作为无预处理对照。
将所得五种样品分别按照如下步骤3)-6)进行实验。
3)包埋：
同实施例1步骤一中3)。
4)切片：
同实施例1步骤一中4)。
5)制作显微玻片：
同实施例1步骤一中5)。
6)清洗：
同实施例1步骤一中6)。
步骤6)完成后，在光学显微镜下观察，结果见图5。
实验结果表明，无预处理样品细胞组织破碎，损伤严重；酒精梯度脱水，细胞内失水严重，造成孢子大面积皱缩损伤；冷冻保护剂2作为冷冻保护剂，可以一定程度保持组织完整性，但担子细胞失水皱缩严重，细胞界限不清晰；冷冻保护剂1处理的担子细胞界限明显清晰便于观察，但海藻糖浓度过高仍会出现担子细胞失水皱缩现象。
实施例4、切片厚度对组织的影响
1)固定：
同实施例1步骤一中1)。
2)预处理：
同实施例1步骤一中2)。
3)包埋：
同实施例1步骤一中3)。
4)切片：
按照实施例1步骤一中4)的方法，将切片厚度分别定为8、10、12和20μm，其他步骤均不变。
5)制作显微玻片：
同实施例1步骤一中5)。
6)清洗：
同实施例1步骤一中6)。
7)染色：
同实施例1步骤一中7)。
步骤7)完成后，在光学显微镜下观察，结果见图6。
结果表明，切片厚度越薄，菌褶中心部菌丝组织越容易破碎，切片厚度超过20μm易出现多层担子细胞现象。如观察单个担子细胞内情况丝球小奥德蘑最适切片厚度为8μm，如观察整体菌褶组织情况最适切片厚度为12μm，因此丝球小奥德蘑最适切片厚度为8-12μm。
实施例5、不同食用菌子实体的冷冻切片
1)固定：
按照实施例1步骤一中1)中的方法，将丝球小奥德蘑子实体分别替换为平菇(Pleurotus ostreatus)子实体、香菇(Lentinula edodes)子实体和香菇菌丝体，其他步骤均不变，分别进行固定，得到平菇子实体固定样品、香菇子实体固定样品和香菇菌丝体固定样品，将所得三种样品分别按照如下步骤2)-6)进行进一步实验。
2)预处理：
同实施例1步骤一中2)。
3)包埋：
同实施例1步骤一中3)。
4)切片：
按照实施例1步骤一中4)的方法，调整切片厚度分别为4、6、8、10、12和20μm，其他步骤均不变。
5)制作显微玻片：
同实施例1步骤一中5)。
6)清洗：
同实施例1步骤一中6)。
步骤6)完成后，在光学显微镜下观察，结果见图7。
结果表明，实施例1的方法适用于平菇、香菇等多种食用菌子实体冷冻切片需要，且适用于菌丝体切片。但根据不同食用菌子实体担子及菌丝直径不同，因此最适切片厚度不同。经实验证明，平菇子实体最适切片厚度为6-8μm，香菇子实体及菌丝体为4-6μm。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种食用菌的超薄冷冻切片方法，包括：
1)将食用菌样品于固定液中固定，得到固定好的样品；
2)将所述固定好的样品置于冷冻保护剂中进行预处理，得到预处理的样品，所述冷冻保护剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述冷冻保护剂中的浓度分别为5％(质量百分比)海藻糖和10％(体积百分比)甘油；
3)将所述预处理的样品利用冷冻切片组织包埋剂进行包埋，得到包埋好的样品；
4)将所述包埋好的样品进行切片，完成食用菌的超薄冷冻切片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理通过将所述固定好的样品置于所述冷冻保护剂中抽真空再室温孵育1小时完成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述固定液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述固定液中的浓度分别为2.5％(体积百分比)戊二醛、0.1MKH2PO4和0.1M Na2HPO4·12H2O。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述将食用菌样品于固定液中固定通过将所述食用菌样品置于所述固定液中抽真空再4℃孵育20分钟完成。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤3)中，包埋在-10℃下进行。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述食用菌为丝球小奥德蘑、平菇或香菇。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述食用菌样品为丝球小奥德蘑子实体、平菇子实体、香菇子实体或香菇菌丝体。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述食用菌为丝球小奥德蘑，所述切片厚度为8-12μm；
所述食用菌为平菇，所述切片厚度为6-8μm；
所述食用菌为香菇，所述切片厚度为4-6μm。
9.成套试剂，包括权利要求1中所述冷冻保护剂和/或权利要求3中所述固定液。
10.权利要求9所述成套试剂在食用菌超薄冷冻切片中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114563432A (zh) * 2022-01-14 2022-05-31 浙江大学 一种用于扫描电子显微镜三维结构重建实验的冷冻样品处理方法

Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004037215A (ja) * 2002-07-02 2004-02-05 Japan Science & Technology Corp 組織標本の製造方法
CN1587959A (zh) * 2004-09-23 2005-03-02 上海交通大学 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法
CN102175501A (zh) * 2011-01-07 2011-09-07 山东省农业科学院作物研究所 用于显微镜观察的植物样品的前处理方法
TW201205455A (en) * 2010-07-21 2012-02-01 Dna Winner Anti Counterfeit Technology Co Ltd Method for carrying out anti-counterfeit effect by using Gilson's solution as a stabilizer to biological tissue
CN102573945A (zh) * 2009-09-11 2012-07-11 翰林大学校产学协力团 冷冻保存无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质
CN102869392A (zh) * 2010-02-26 2013-01-09 Cg生物技术有限公司 无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质
RU2484446C1 (ru) * 2011-12-28 2013-06-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе
US20130252240A1 (en) * 2012-03-21 2013-09-26 Ventana Medical Systems, Inc. Cryoembedded cell concentrates, methods for making, and methods for using
US20140030231A1 (en) * 2010-05-04 2014-01-30 The General Hospital Corporation Methods and compositions for preserving tissues and organs
CN104749010A (zh) * 2015-03-31 2015-07-01 东华大学 一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法
CN104865115A (zh) * 2014-02-24 2015-08-26 百奇生物科技（苏州）有限公司 使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法
CN106018050A (zh) * 2016-05-20 2016-10-12 北京九州柏林生物科技有限公司 冷冻切片包埋剂
CN106008718A (zh) * 2016-03-31 2016-10-12 西北民族大学 重组人源性抗菌肽c16ll-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法
CN106501043A (zh) * 2016-10-26 2017-03-15 中国热带农业科学院椰子研究所 一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法
CN107132097A (zh) * 2017-06-29 2017-09-05 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法
CN107319304A (zh) * 2017-08-08 2017-11-07 山东省农业科学院农产品研究所 一种食用菌酶解工艺及其用于制备食用菌面粉的应用
CN108572105A (zh) * 2018-04-13 2018-09-25 山东中医药大学 一种脑组织冰冻切片的制备方法
CN108956253A (zh) * 2018-09-10 2018-12-07 生工生物工程（上海）股份有限公司 冰冻切片包埋剂及其制备方法和应用
CN109152863A (zh) * 2016-02-12 2019-01-04 渥太华大学 植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作为支架材料的用途
CN110441084A (zh) * 2019-09-04 2019-11-12 海南省农业科学院热带果树研究所 一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法
CN110618018A (zh) * 2019-09-19 2019-12-27 华南农业大学 一种获取植物木质部的方法
CN110616148A (zh) * 2019-10-08 2019-12-27 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所 海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用
US20200041389A1 (en) * 2015-11-13 2020-02-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Fixatives and methods of use
CN111238892A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 宁夏大学 一种地衣子实体显微结构的永久制片方法
CN111372450A (zh) * 2017-08-28 2020-07-03 福姆62有限责任公司 用于组织保存的方法和组合物

Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004037215A (ja) * 2002-07-02 2004-02-05 Japan Science & Technology Corp 組織標本の製造方法
CN1587959A (zh) * 2004-09-23 2005-03-02 上海交通大学 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法
CN102573945A (zh) * 2009-09-11 2012-07-11 翰林大学校产学协力团 冷冻保存无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质
CN102869392A (zh) * 2010-02-26 2013-01-09 Cg生物技术有限公司 无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质
US20140030231A1 (en) * 2010-05-04 2014-01-30 The General Hospital Corporation Methods and compositions for preserving tissues and organs
TW201205455A (en) * 2010-07-21 2012-02-01 Dna Winner Anti Counterfeit Technology Co Ltd Method for carrying out anti-counterfeit effect by using Gilson's solution as a stabilizer to biological tissue
CN102175501A (zh) * 2011-01-07 2011-09-07 山东省农业科学院作物研究所 用于显微镜观察的植物样品的前处理方法
RU2484446C1 (ru) * 2011-12-28 2013-06-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе
US20130252240A1 (en) * 2012-03-21 2013-09-26 Ventana Medical Systems, Inc. Cryoembedded cell concentrates, methods for making, and methods for using
CN104865115A (zh) * 2014-02-24 2015-08-26 百奇生物科技（苏州）有限公司 使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法
CN104749010A (zh) * 2015-03-31 2015-07-01 东华大学 一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法
US20200041389A1 (en) * 2015-11-13 2020-02-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Fixatives and methods of use
CN109152863A (zh) * 2016-02-12 2019-01-04 渥太华大学 植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作为支架材料的用途
CN106008718A (zh) * 2016-03-31 2016-10-12 西北民族大学 重组人源性抗菌肽c16ll-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法
CN106018050A (zh) * 2016-05-20 2016-10-12 北京九州柏林生物科技有限公司 冷冻切片包埋剂
CN106501043A (zh) * 2016-10-26 2017-03-15 中国热带农业科学院椰子研究所 一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法
CN107132097A (zh) * 2017-06-29 2017-09-05 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法
CN107319304A (zh) * 2017-08-08 2017-11-07 山东省农业科学院农产品研究所 一种食用菌酶解工艺及其用于制备食用菌面粉的应用
CN111372450A (zh) * 2017-08-28 2020-07-03 福姆62有限责任公司 用于组织保存的方法和组合物
CN108572105A (zh) * 2018-04-13 2018-09-25 山东中医药大学 一种脑组织冰冻切片的制备方法
CN108956253A (zh) * 2018-09-10 2018-12-07 生工生物工程（上海）股份有限公司 冰冻切片包埋剂及其制备方法和应用
CN110441084A (zh) * 2019-09-04 2019-11-12 海南省农业科学院热带果树研究所 一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法
CN110618018A (zh) * 2019-09-19 2019-12-27 华南农业大学 一种获取植物木质部的方法
CN110616148A (zh) * 2019-10-08 2019-12-27 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所 海藻糖作为保护剂在食用菌菌种液氮冷冻保存中的应用
CN111238892A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 宁夏大学 一种地衣子实体显微结构的永久制片方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨慧;金良韵;姬曼;孙竹林;陈大兴;赵君朋;: "透射电镜生物样品冷冻保存方法的探讨", 电子显微学报, no. 02 *
章静;杨成伟;王云;汤文建;: "香菇多糖对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用", 中华医院感染学杂志, no. 10 *
胡春辉;徐青;孙璇;于浩;袁玉清;: "几种典型扫描电镜生物样本制备" *
胡春辉;徐青;孙璇;于浩;袁玉清;: "几种典型扫描电镜生物样本制备", 湖北农业科学, no. 20 *
高增贵, 庄敬华, 陈捷, 刘限, 刘军华: "应用免疫胶体金银染色技术定位玉米内生细菌", 植物病理学报, no. 03 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114563432A (zh) * 2022-01-14 2022-05-31 浙江大学 一种用于扫描电子显微镜三维结构重建实验的冷冻样品处理方法
CN114563432B (zh) * 2022-01-14 2022-12-23 浙江大学 一种用于扫描电子显微镜三维结构重建实验的冷冻样品处理方法

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