CN104865115A - 使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法，包括：1）新鲜冰冻组织采集；2）制备新鲜冰冻组织标本；3）将新鲜冰冻组织标本制作成新鲜冰冻组织切片；4）利用新鲜冰冻组织切片检测单克隆抗体类药物的组织交叉反应。本发明提高了冰冻组织制片技术、切片质量，降低免疫反应评价的困难度，便于操作，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法，特别是涉及一种使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法。
背景技术
单克隆抗体有特异性识别靶点的能力，具有药效精确可控、副作用小的优点，单克隆抗体类药物作为一种新型的生物技术药物具有特定的免疫性，如果除去本身特定的靶器官外，正常组织细胞中存在相同或相似的抗原决定簇，单克隆抗体类药物则可能与非靶器官外的其他组织或细胞结合，从而产生严重的副作用。因此，单克隆抗体类药物的组织交叉反应在药物临床前的安全性评价中非常重要，现被广泛的应用于生物学及医学研究等领域。
然而在组织交叉反应试验中，组织标本的处理是保证良好组织交叉结果的前提，必须保证要检测的组织取材新鲜，形态保存良好，抗原物质的抗原不丢失，不扩散或被破坏。
免疫组织交叉反应的组织标本主要包括石蜡切片和冰冻切片，然而在试验中，要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时需高温烘片，可能会破坏组织的抗原性，且石蜡切片包括取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、染色、封固一系列环节，操作步骤不仅繁琐，且若有某一环节的时间延长都会影响组织抗原的检出强度，同时存在着组织抗原免疫活性弱，切片质量不高，脱片严重等现象。
因此，需开发出一种有效保存组织抗原免疫活性，提高切片质量，防止脱片现象的单克隆抗体类药物组织交叉反应检测关键技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法。该方法能够较好地保存组织的抗原免疫活性，提高切片质量，防止脱片，以及有效地简化了组织交叉反应的操作步骤，加快实验流程。
为解决上述技术问题，本发明的使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法，包括步骤：
（1）新鲜冰冻组织采集；
（2）制备新鲜冰冻组织标本；
（3）将新鲜冰冻组织标本制作成新鲜冰冻组织切片；
（4）利用新鲜冰冻组织切片检测单克隆抗体类药物的组织交叉反应。
所述步骤（1）中，采集的步骤为：使用解剖技术摘取新鲜组织，并剔除组织中多余的脂肪及纤维，确保组织的完整及干净。其中，组织包括：人和动物的组织，如可包括：食蟹猴的大脑皮质，小脑淋巴结、脾脏、肝脏、胰腺、小肠、肺脏、心脏、乳房、子宫、输卵管、胎盘、睾丸、前列腺、肾脏、皮肤、骨骼肌、甲状腺、肾上腺、扁桃体、膀胱、结肠、主动脉上皮、卵巢、垂体、脊髓、输尿管、眼和胸腺等。
所述步骤（2）中，制备的步骤具体如下：
将液氮罐中注满液氮，在不锈钢烧杯内加注4～7厘米高度的异戊烷，将该烧杯放入液氮罐中，在金属包埋模具（常规）底部涂抹少量冰冻组织包埋剂（O.C.T:Optimal CuttingTemperature），组织的欲取材面应朝向模具底端进行包埋，将标注有脏器识别信息的包埋盒置于组织上，注入冰冻组织包埋剂，将包埋模具放入异戊烷中，静止1～3分钟，确保整个组织被充分冻结，形成新鲜冰冻组织标本。
另外，制备后的新鲜冰冻组织标本可保存在-80℃超低温冰箱中。
所述步骤（3）中，将新鲜冰冻组织标本制作成新鲜冰冻组织切片的方法可参照冰冻切片机说明书进行，其中，所述冰冻切片机的切片条件包括：冰冻切片机仓内温度为-10℃～-30℃，调整切片厚度至3～7μm。
新鲜冰冻组织切片可保存在-80℃超低温冰箱中。
所述步骤（4）中，检测单克隆抗体类药物的组织交叉反应的步骤如下：
1）将新鲜冰冻组织切片放于室温干燥15～30分钟后，放于冰水混合物冷却的丙酮中固定15～30分钟，然后，置于室温干燥30～60分钟；
2）将干燥过的新鲜冰冻组织切片浸入0.01mol/L PBS（磷酸缓冲液）中2～3次，每次1～2分钟，或将新鲜冰冻组织切片放在0.01mol/L PBS中直至滴加试剂；
3）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升的商品化内源性生物素阻断试剂盒中的卵白素试剂（购自福州迈新生物技术开发有限公司），置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟；
4）重复步骤2）；
5）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升内源性生物素阻断试剂盒中的生物素试剂，置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟；
6）重复步骤2）；
7）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升过氧化酶阻断剂，置于湿盒内在室温下孵育5～15分钟；
8）将新鲜冰冻组织切片浸入去离子水中1～2次，每次1～2分钟，然后浸入0.01mol/LPBS中1～2次，每次1～2分钟，或将新鲜冰冻组织切片放在0.01mol/L PBS中，直至滴加试剂；
9）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升动物非免疫血清（羊），置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟后，将新鲜冰冻组织切片上的试剂沥除并拭去新鲜冰冻组织切片周围的试剂，滴加50～100微升的待检测的单克隆抗体类药物于切片组织上，置于湿盒内在室温下孵育60～90分钟；
其中，单克隆抗体类药物包括：人猿化单克隆抗体类药物；待检测的单克隆抗体类药物中的单克隆抗体的使用浓度一般为2～4μg/mL；
10）重复步骤2）；
11）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟；
12）重复步骤2）；
13）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升DAB显色剂（即1×DAB试剂，由辣根过氧化氢酶DAB显色试剂盒配制而成），置于湿盒内在室温下孵育2～10分钟后，用水冲洗2～3分钟，并用苏木素复染切片2～4分钟，用水冲洗8～10分钟，使用封片胶进行封片。
14）显微镜下观察反应结果。
上述步骤1）-13）中所涉及的试剂，可均为商业化产品。
本发明的使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法，提高了冰冻组织制片技术、切片质量，降低免疫反应评价的困难度，便于操作具有广泛的应用价值。
具体实施方式
本发明的使用新鲜冰冻正常食蟹猴组织检测制药公司制造的单克隆抗体类药物——生物素化鼠抗人CD34单克隆[QBEND/10]抗体（ab30375）的组织交叉反应的方法，包括步骤：
1）新鲜冰冻食蟹猴组织采集
使用解剖技术一一摘取正常健康食蟹猴的组织，并剔除组织中多余的脂肪及纤维，确保组织的完整及干净。解剖前，将食蟹猴进行放血处理，以避免组织切片时出现的冰晶现象，便于切片的制备。其中，采用的放血方式可使用颈静脉放血方式。
2）制备新鲜冰冻组织标本
将液氮罐中注满液氮，在不锈钢烧杯内加注约5厘米高度的异戊烷，使用铁架台和台夹架起装异戊烷的烧杯，放低烧杯使其深入液氮罐中，在常规的金属包埋模具底部涂抹少量冰冻组织包埋剂（O.C.T:Optimal Cutting Temperature），组织的欲取材面应朝向模具底端进行包埋，将标注有脏器识别信息的包埋盒置于食蟹猴组织上，注入冰冻组织包埋剂，使用可以充分张开并牢固夹持包埋模具的长柄镊将包埋模具放入异戊烷中，静止1-2分钟，确保整个组织被充分冻结，形成新鲜冰冻组织标本。该冻结组织可先转移至干冰容器中保存。另外，按照上述操作，完成其他组织的冻结操作。其中，注入冰冻组织包埋剂时，注意在注入过程中不要移动组织，且使用镊子将组织周围的气泡排除，避免切片出现裂痕或空泡现象。该冰冻组织包埋剂将会凝固成白色固态。通过肉眼观察，组织应被包埋剂完全包裹。
步骤2）中，将装有异戊烷的烧杯，深入液氮罐中时，烧杯底端接触液氮液面即可，放入过深将会导致异戊烷冻结。若异戊烷发生冻结，应抬起烧杯，待异戊烷解冻后，再次将其放入液氮中。
另外，制备后的新鲜冰冻组织标本，可放入-80℃超低温冰箱进行长期保存。
3）将新鲜冰冻食蟹猴组织标本制作成新鲜冰冻食蟹猴组织切片
参照冰冻切片机说明书，完成切片制作程序，其中，包括调整冰冻切片机仓内温度，通常为-10℃～-30℃，用准备好的新鲜冰冻食蟹猴组织标本托架固定冰冻组织标本，调整切片厚度至5μm。如在制备脾脏等实质性组织时，应将仓内温度调至-15℃左右，以避免组织应温度过低，造成切片时组织干裂，影响切片质量的现象，但对于软组织（皮肤、乳房、睾丸、胸腺、垂体、前列腺、甲状腺、扁桃腺和淋巴结等），在切片前没有必要调整仓内温度。
另外，该新鲜冰冻食蟹猴组织切片可保存在-80℃超低温冰箱中。
4）通过免疫组化技术，利用新鲜冰冻食蟹猴组织切片检测单克隆抗体类药物——生物素化鼠抗人CD34单克隆[QBEND/10]抗体（ab30375）的组织交叉反应
其中，步骤4）的具体步骤如表1所示，并且表1中所提及的试剂均可为市售的商品化试剂，如可均购自于福州迈新生物技术开发有限公司。
表1使用新鲜冰冻食蟹猴组织切片检测单克隆抗体类药物的组织交叉反应流程
在表1的操作完成后，采用显微镜观察反应结果，即观察单克隆抗体在阳性细胞的表达情况，并依照表2中的标准对切片进行评价。
表2评价标准
| 结果评价 | 切片观察结果 |
| 无 | 无着色 |
| 极轻 | 极浅着色和/或极少数细胞着色(<20%) |
| 轻 | 浅着色和/或少数细胞着色(20%～40%，但不含40%) |
| 中 | 深着色和/或较多细胞着色(40%～60%，但不含60%) |
| 重 | 显著着色和/或大量细胞着色(60%～80%) |
| 极重 | 极深着色和/或几乎所有细胞着色(>80%) |
本实施例中，在显微镜下观察单克隆抗体类药物——生物素化鼠抗人CD34单克隆[QBEND/10]抗体（ab30375）在新鲜冰冻食蟹猴组织中的交叉反应结果为：2μg/mL的生物素化鼠抗人CD34单克隆[QBEND/10]抗体（ab30375）在食蟹猴的肾、肝、胸腺、小肠、甲状腺、甲状旁腺、子宫、肾上腺、膀胱、乳房、大脑皮质、小脑、结肠、输卵管、肾、胰腺、垂体、脊髓和输尿管组织中，均可见不同程度的免疫组化着色。
另外，本实验采用的同型对照为生物素化正常鼠源抗体（IgG-B：sc-2762），在对照品组中具有免疫组化着色的组织有肾、肝、胸腺、小肠、肾上腺、膀胱、乳房、大脑皮质、小脑、结肠、输卵管、肾、胰腺、垂体、脊髓和输尿管组织，对比相同浓度下的供试品【即生物素化鼠抗人CD34单克隆[QBEND/10]抗体（ab30375）】组和对照品组的免疫组化着色结果，在甲状腺、甲状旁腺、子宫组织中可观察到的供试品特异性的免疫组化着色，即供试品在以上3种组织中存在特异性结合。
因此，本实施例中，能较好地保存组织的抗原免疫活性。同时，本发明通过减少组织中脂肪、纤维的成分，便于提高切片质量和降低切片评价的困难度，解决了以往对于组织中的脂肪、纤维成分较多，常出现切片不全、组织切片脱片、染色不均匀等现象，并能加快实验流程。
Claims (9)
1.一种使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法，其特征在于，包括步骤：
（1）新鲜冰冻组织采集；
（2）制备新鲜冰冻组织标本；
（3）将新鲜冰冻组织标本制作成新鲜冰冻组织切片；
（4）利用新鲜冰冻组织切片检测单克隆抗体类药物的组织交叉反应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，采集的步骤为：使用解剖技术摘取新鲜组织，并剔除组织中多余的脂肪及纤维，确保组织的完整及干净；
其中，所述新鲜组织包括：人和动物的新鲜组织。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述新鲜组织包括：食蟹猴的大脑皮质、小脑淋巴结、脾脏、肝脏、胰腺、小肠、肺脏、心脏、乳房、子宫、输卵管、胎盘、睾丸、前列腺、肾脏、皮肤、骨骼肌、甲状腺、肾上腺、扁桃体、膀胱、结肠、主动脉上皮、卵巢、垂体、脊髓、输尿管、眼和胸腺。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，制备的步骤具体如下：
将液氮罐中注满液氮，在不锈钢烧杯内加注4～7厘米高度的异戊烷，将该烧杯放入液氮罐中，在金属包埋模具底部涂抹冰冻组织包埋剂，组织的欲取材面应朝向模具底端进行包埋，将标注有脏器识别信息的包埋盒置于组织上，注入冰冻组织包埋剂，将包埋模具放入异戊烷中，静止1～3分钟，形成新鲜冰冻组织标本。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述新鲜冰冻组织标本保存在-80℃超低温冰箱中。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，将新鲜冰冻组织标本制作成新鲜冰冻组织切片的方法是参照冰冻切片机说明书进行。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述冰冻切片机的切片条件包括：冰冻切片机仓内温度为-10℃～-30℃，切片厚度至3～7μm；
新鲜冰冻组织切片保存在-80℃超低温冰箱中。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，检测单克隆抗体类药物的组织交叉反应的步骤如下：
1）将新鲜冰冻组织切片放于室温干燥15～30分钟后，放于冰水混合物冷却的丙酮中固定15～30分钟，然后，置于室温干燥30～60分钟；
2）将干燥过的新鲜冰冻组织切片浸入0.01mol/L PBS中2～3次，每次1～2分钟，或将新鲜冰冻组织切片放在0.01mol/L PBS中直至滴加试剂；
3）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升的商品化内源性生物素阻断试剂盒中的卵白素试剂，置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟；
4）重复步骤2）；
5）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升内源性生物素阻断试剂盒中的生物素试剂，置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟；
6）重复步骤2）；
7）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升过氧化酶阻断剂，置于湿盒内在室温下孵育5～15分钟；
8）将新鲜冰冻组织切片浸入去离子水中1～2次，每次1～2分钟，然后浸入0.01mol/LPBS中1～2次，每次1～2分钟，或将新鲜冰冻组织切片放在0.01mol/L PBS中，直至滴加试剂；
9）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升动物非免疫血清，置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟后，将新鲜冰冻组织切片上的试剂沥除并拭去新鲜冰冻组织切片周围的试剂，滴加50～100微升的待检测的单克隆抗体类药物于切片组织上，置于湿盒内在室温下孵育60～90分钟；
其中，单克隆抗体类药物包括：人猿化单克隆抗体类药物；
10）重复步骤2）；
11）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，置于湿盒内在室温下孵育10～20分钟；
12）重复步骤2）；
13）在浸入过0.01mol/L PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100微升DAB显色剂，置于湿盒内在室温下孵育2～10分钟后，用水冲洗2～3分钟，并用苏木素复染切片2～4分钟，用水冲洗8～10分钟，使用封片胶进行封片；
14）显微镜下观察反应结果。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤9）中，待检测的单克隆抗体类药物中的单克隆抗体的使用浓度为2～4μg/mL。
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