CN108106910A - 一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法 - Google Patents

一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108106910A
CN108106910A CN201711367415.2A CN201711367415A CN108106910A CN 108106910 A CN108106910 A CN 108106910A CN 201711367415 A CN201711367415 A CN 201711367415A CN 108106910 A CN108106910 A CN 108106910A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue
room temperature
human body
animal
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711367415.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李宁
杨凤英
周雷
车彤彤
李殿香
胡杨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Jinan
Original Assignee
University of Jinan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Jinan filed Critical University of Jinan
Priority to CN201711367415.2A priority Critical patent/CN108106910A/zh
Publication of CN108106910A publication Critical patent/CN108106910A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法，包括以下步骤：(1)人体和动物组织标本的固定和包埋；(2)人体和动物组织芯片的制备；(3)人体和动物组织标本的切片与排布；(4)抗体类药物的标记；(5)采用免疫组织化学方法检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应。该方法首先利用组织芯片进行初筛，然后在人体和不同动物种属组织中进行高通量的免疫组化试验，并提高对结果判读的准确性，有效地提高了组织交叉反应试验的效率，加快实验流程，适合产业化。

Description

一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法
技术领域
本发明涉及一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法，特别是涉及一种高通量地、更准确地进行结果判读的用于冰冻组织切片和石蜡组织切片的方法，所涉及的动物组织来源于大鼠、小鼠、犬、狨猴、食蟹猴或恒河猴。
背景技术
作为一种特殊的生物技术药物，单克隆抗体(以下简称单抗)具有其特定的免疫化学性质，即对抗原结合的特异性，表现为单抗可作用于表达其抗原表位的靶组织。但如果正常组织中存在相同或相似的抗原表位，单抗则可能会与靶组织以外的其他组织发生结合，从而可能导致不良反应的发生。因此，单抗的免疫化学性质评价还应包括对这种可能的“脱靶”结合的考察。组织交叉反应检测是区分“在靶”结合的靶器官和“脱靶”结合的非靶器官的重要手段，同时通过对单抗在人体和动物组织中组织交叉反应类型的比较，可以为用于毒性评价的动物种属选择提供参考。此外，对于含有人免疫球蛋白IgG的Fc片段的融合蛋白，由于其具有与分布于正常组织上的Fc受体结合的可能性，因此在某些情况下，进行这一类药物的组织交叉反应检测也是有意义的。
尽管组织交叉反应试验是基于常规的免疫组织化学技术而实施的，但是系统的将30余种组织(每种组织来自3个个体)在同一个系统中进行高通量地检测、比对和评价，需要进行精心的设计和对现有方法的改进，以便高通量地进行试验的实施和对结果进行准确地判读。基于此，需要开发一种高通量、更准确地检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法。该方法首先利用组织芯片进行初筛，然后在人体和不同动物种属组织中进行高通量的免疫组化试验，并提高对结果判读的准确性，有效地提高了组织交叉反应试验的效率，加快实验流程，适合产业化。
本发明的一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法技术方案为，包括以下步骤：
(1)人体和动物组织标本的固定和包埋；
(2)人体和动物组织芯片的制备；
(3)人体和动物组织标本的切片与排布；
(4)抗体类药物的标记；
(5)采用免疫组织化学方法检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应。
所述步骤(1)中，采集的步骤为：动物麻醉后摘取新鲜组织，剔除结缔组织和多余脂肪，用生理盐水冲掉残留的血液并用吸水纸吸净水分；人体组织采用活检组织或手术标本；
动物组织来源于以下种属：大鼠、小鼠、犬、狨猴、食蟹猴和恒河猴，每个种属单独取材并建立组织库。
所述新鲜组织包括以下33种：
肾上腺Adrenal(1)、胱Bladder(2)、血细胞Blood cells(3)、髓Bone marrow(4)、乳腺Breast(5)、小脑Cerebellum(6)、大脑Cerebral Cortex(7)、直肠Colon(8)、内皮Endothelium(9)、眼球Eye(10)、输卵管Fallopian tube(11)、胃肠道Gastrointestinaltract(12)、心脏Heart(13)、肾脏Kidney(glomerulus,tubule)(14)、肝脏Liver(15)、肺脏Lung(16)、淋巴结Lymph node(17)、卵巢Ovary(18)、胰腺Pancreas(19)、甲状旁腺Parathyroid(20)、垂体Pituitary(20)、胎盘Placenta(22)、前列腺Prostate(23)、横纹肌Striated muscle(24)、皮肤Skin(25)、脊髓Spinal cord(26)、脾脏Spleen(27)、睾丸Testis(28)、胸腺Thymus(29)、甲状腺Thyroid(30)、输尿管Ureter(31)、子宫内膜Uterus(endometrium)(32)、子宫颈Uterus(cervix)(33)；由以上组织构建组织库用于组织交叉反应试验。
所述步骤(1)中，组织标本的固定方法至少为以下方法中的一种：
①石蜡组织
眼球和睾丸采用Dividson’s固定液，其余组织采用10％中性福尔马林。在室温下固定2周以上，按常规方法将组织进行石蜡包埋；
②冰冻组织
采用冰冻组织包埋剂OCT制备的步骤具体如下：
在金属包埋模具底部涂抹冰冻组织包埋剂，将组织的取材面朝向模具底面，将标注有脏器识别信息的包埋盒置于组织上，注入冰冻组织包埋剂OCT，将包埋模具放入液氮干冰中，静止1～3min，形成新鲜冰冻组织标本，保存于-60～-80℃冰箱。
所述步骤(2)中，在载玻片1上制备组织芯片，其中，32种组织芯片以4*8的队列整齐排布，质控组织芯片位于其余32种组织芯片的队列以外的位置(如说明书附图图2所示)，所述的32种组织芯片不包括血细胞；用于制备组织芯片的组织包括石蜡组织或冰冻组织；切片厚度为3～7μm，冰冻组织芯片保存于-80℃超低温冰箱中，石蜡组织芯片保存于室温。
所述步骤(3)中，将不同个体的同一种组织进行切片，并按照顺序依次呈线性排布在同一张载玻片1上，组织的数量为1～4个，优选的数量为3个。
所述步骤(4)中，用于单克隆抗体和同型对照标记的方法包括生物素、FITC或辣根过氧化物酶。
所述步骤(5)中，检测抗体类药物的组织交叉反应的步骤如下：①石蜡组织及芯片
a.从徕卡切片机上取出切好的玻片；
b.将切片放入恒温箱内烘烤65℃约2小时；
c.切片常规脱蜡至水20-40min；
d.0.01M PBS浸洗3-5min，共3次，可将切片放置于PBS中直到下一步；
e.将切片置于3％过氧化氢溶液，室温封闭10-15min；
f.重复步骤d；
g.将组织切片放入高压锅，加入约2000ml左右的EDTA抗原修复液或柠檬酸修复液，沸腾后高温高压修复3min；
h.将高压锅移至冷水中冷却至室温；组织切片蒸馏水中浸泡3-5min；
i.取出切片，擦干组织周围的水，用迈新画圈笔在组织块周围画一圆圈；
j.重复步骤d；
k.在组织切片上滴加免疫组化封闭液，湿盒内室温孵育20-30min；
l.甩掉切片上的免疫组化封闭液，滴加一抗(鼠抗CD31(JC/70A)抗体)，置于湿盒内4℃放置过夜；
m.恢复至室温；
n.重复步骤d；
o.滴加相应二抗(快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室温下孵育20-40min；
p.重复步骤d；
q.DAB显色2-8min，在显微镜下控制染色的强度，显色结束用蒸馏水终止反应；
r.将切片放入流水中冲洗3-5min，苏木素轻度复染，1％盐酸酒精分化约3s，流水冲洗3-5min；
s.梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，备阅；
②冰冻组织及芯片
1)将组织切片放于室温干燥15～30min后，放于冷丙酮中固定15～30min，然后置于室温干燥30～60min；
2)将干燥后的组织切片浸入0.01M PBS洗涤2～3次，每次1～2min；3)向组织切片上滴加50～100μL商品化内源性生物素阻断试剂盒中的卵白素试剂，置于湿盒内中，于室温下孵育10～20min；
4)重复步骤2)；
5)滴加50～100μL内源性生物素阻断试剂盒中的生物素试剂，置于湿盒内在室温下孵育10～20min；
6)重复步骤2)；
7)在浸入过0.01M PBS的新鲜冰冻组织切片上，滴加50～100μL过氧化酶阻断剂，置于湿盒内在室温下孵育5～15min；
8)将组织切片浸入去离子水中1～2次，每次1～2min，然后浸入0.01M PBS中1～2次，每次1～2min；
9)滴加50～100μL动物非免疫血清，置于湿盒内在室温下孵育10～20min后，拭去切片周围的试剂，滴加50～100μL的待检测的抗体类药物或同型对照于切片组织上，置于湿盒内在室温下孵育60～90min；
其中，抗体类药物包括：单克隆抗体、含有免疫球蛋白IgGFc片段的融合蛋白；
10)重复步骤2)；
11)滴加50～100μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，置于湿盒内在室温下孵育10～20min；
12)重复步骤2)；
13)滴加50～100μL显色剂DAB，置于湿盒内在室温下孵育2～10min后，用水冲洗2～3min后用苏木素复染切片2～4min，冲洗8～10min，使用封片胶进行封片；
14)显微镜下观察反应结果。
所述步骤(5)中，待检测的抗体类药物的使用浓度为0.1～50μg/mL，同型对照的浓度为0.1～50μg/mL，所使用的组织完整性验证抗体包括抗-CD31抗体或抗转铁蛋白受体抗体。
所述步骤(5)中，用于组织交叉反应结果判断的标准如下：
染色强度：
染色范围：
本发明的有益效果为：
(1)建立组织芯片用于组织交叉反应试验的初筛，初步了解拟检测药物与人体和动物组织交叉反应的基本情况和背景着色等信息，筛选合适的试验浓度，为大样本量的正式试验提供方法学基础。
(2)将来自不同个体的同种组织的切片排布在同一张载玻片上，然后采用相同的方法和试验条件进行检测，这一方面降低了组织之间的检测误差(多次检测)，提高了阅片准确度和阅片质量；另一方面提高了3倍的工作效率(以每张玻片上放置3个个体的组织计算)。
附图说明：
图1所示为组织交叉反应试验中同一种组织的排布；
图2所示为组织芯片中组织的排布图。
图中，1-载玻片，2-组织切片，3-质控组织芯片，4-组织芯片。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
本发明的一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法，包括以下步骤：
(1)人体和动物组织标本的固定和包埋；
采集的步骤为：动物麻醉后摘取新鲜组织，剔除结缔组织和多余脂肪，用生理盐水冲掉残留的血液并用吸水纸吸净水分；人体组织采用活检组织或手术标本；
动物组织来源于以下种属：大鼠、小鼠、犬、狨猴、食蟹猴和恒河猴，每个种属单独取材并建立组织库。
所述新鲜组织包括以下33种：
肾上腺Adrenal(1)、胱Bladder(2)、血细胞Blood cells(3)、髓Bone marrow(4)、乳腺Breast(5)、小脑Cerebellum(6)、大脑Cerebral Cortex(7)、直肠Colon(8)、内皮Endothelium(9)、眼球Eye(10)、输卵管Fallopian tube(11)、胃肠道Gastrointestinaltract(12)、心脏Heart(13)、肾脏Kidney(glomerulus,tubule)(14)、肝脏Liver(15)、肺脏Lung(16)、淋巴结Lymph node(17)、卵巢Ovary(18)、胰腺Pancreas(19)、甲状旁腺Parathyroid(20)、垂体Pituitary(20)、胎盘Placenta(22)、前列腺Prostate(23)、横纹肌Striated muscle(24)、皮肤Skin(25)、脊髓Spinal cord(26)、脾脏Spleen(27)、睾丸Testis(28)、胸腺Thymus(29)、甲状腺Thyroid(30)、输尿管Ureter(31)、子宫内膜Uterus(endometrium)(32)、子宫颈Uterus(cervix)(33)；由以上组织构建组织库用于组织交叉反应试验。
组织标本的固定方法至少为以下方法中的一种：
①石蜡组织
眼球和睾丸采用Dividson’s固定液，其余组织采用10％中性福尔马林。在室温下固定2周以上，按常规方法将组织进行石蜡包埋；
②冰冻组织
采用冰冻组织包埋剂OCT制备的步骤具体如下：
在金属包埋模具底部涂抹冰冻组织包埋剂，将组织的取材面朝向模具底面，将标注有脏器识别信息的包埋盒置于组织上，注入冰冻组织包埋剂OCT，将包埋模具放入液氮干冰中，静止1～3min，形成新鲜冰冻组织标本，保存于-60～-80℃冰箱。
(2)人体和动物组织芯片4的制备；
在载玻片1上制备组织芯片4，其中，32种组织芯片4以4*8的队列整齐排布，质控组织芯片2位于其余32种组织芯片4的队列以外的位置(如说明书附图图2所示)，所述的32种组织芯片4不包括血细胞；用于制备组织芯片4的组织包括石蜡组织或冰冻组织；切片厚度为3～7μm，冰冻组织芯片4保存于-80℃超低温冰箱中，石蜡组织芯片4保存于室温。
(3)人体和动物组织标本的切片与排布；
将不同个体的同一种组织进行切片，并按照顺序依次呈线性排布在同一张载玻片1上，组织的数量为1～4个，优选的数量为3个。
(4)抗体类药物的标记；
用于单克隆抗体和同型对照标记的方法包括生物素、FITC或辣根过氧化物酶。
(5)采用免疫组织化学方法检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应；
待检测的抗体类药物的使用浓度为0.1～50μg/mL，同型对照的浓度为0.1～50μg/mL，所使用的组织完整性验证抗体包括抗-CD31抗体或抗转铁蛋白受体抗体。
用于组织交叉反应结果判断的标准如下：
染色强度：
染色范围：
采用本法用于抗PD-1或PD-L1等靶点的单克隆抗体与人体和动物正常组织的交叉反应试验，与传统方法相比具有如下优势：
(1)采用组织芯片4进行初筛可快速评初步价供试品与不同组织的反应情况
通过组织芯片4可快速评价供试品与32种组织的交叉反应情况，包括特异性着色、非特异性着色和背景着色等，以便于对后续正式试验所用方法进行确认或优化调整。
(2)大大缩短正式试验所用工时
在人体和一个种属动物的33种组织上进行完整的组织交叉反应试验时，一般需要设置阴性对照组、质控对照组、IgG同型对照组和不同浓度的供试品组(一般为高、低两个浓度)，如按照常规免疫组化方法进行试验，共计划进行约1000张切片的操作，工作量较大。采用本发明所述方法，通过将来自不同个体的相同组织放在同一张切片上，可有效地提高免疫组化检测的效率，假定一张玻片上排布3个个体的组织，则工作量仅为常规方法的1/3。
(3)提高正式试验染色质量和结果判读的准确性
根据(2)中所述，采用常规免疫组化方法完成1000张切片的免疫组化试验大约需要连续1个月的时间，如果还需要进行另外一个种属动物的组织交叉反应试验，完成时间会延长至连续1.5个月。在这么长的时间跨度内完成一项试验，可能会造成日间差异较大，进而导致结果判读的准确性受到影响。本发明所述方法保证了不同个体的相同组织在同一切片上，染色过程完全相同，可同时进行阅片等同质化操作，且由于工时的缩短，可大大降低日间差异造成的染色效果的影响，从而提高染色质量和结果判读的准确性。

Claims (10)

1.一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人体和动物组织标本的固定和包埋；
(2)人体和动物组织芯片的制备；
(3)人体和动物组织标本的切片与排布；
(4)抗体类药物的标记；
(5)采用免疫组织化学方法检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采集的步骤为：动物麻醉后摘取新鲜组织，剔除结缔组织和多余脂肪，用生理盐水冲掉残留的血液并用吸水纸吸净水分；人体组织采用活检组织或手术标本；
动物组织来源于以下种属：大鼠、小鼠、犬、狨猴、食蟹猴和恒河猴，每个种属单独取材并建立组织库。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述新鲜组织包括以下33种：
肾上腺Adrenal、胱Bladder、血细胞Blood cells、髓Bone marrow、乳腺Breast、小脑Cerebellum、大脑Cerebral Cortex、直肠Colon、内皮Endothelium、眼球Eye、输卵管Fallopian tube、胃肠道Gastrointestinal tract、心脏Heart、肾脏Kidney、肝脏Liver、肺脏Lung、淋巴结Lymph node、卵巢Ovary、胰腺Pancreas、甲状旁腺Parathyroid、垂体Pituitary、胎盘Placenta、前列腺Prostate、横纹肌Striated muscle、皮肤Skin、脊髓Spinal cord、脾脏Spleen、睾丸Testis、胸腺Thymus、甲状腺Thyroid、输尿管Ureter、子宫内膜Uterus、子宫颈Uterus；由以上组织构建组织库用于组织交叉反应试验。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，组织标本的固定方法至少为以下方法中的一种：
①石蜡组织
眼球和睾丸采用Dividson’s固定液，其余组织采用10％中性福尔马林。在室温下固定2周以上，按常规方法将组织进行石蜡包埋；
②冰冻组织
采用冰冻组织包埋剂OCT制备的步骤具体如下：
在金属包埋模具底部涂抹冰冻组织包埋剂，将组织的取材面朝向模具底面，将标注有脏器识别信息的包埋盒置于组织上，注入冰冻组织包埋剂OCT，将包埋模具放入液氮干冰中，静止1～3min，形成新鲜冰冻组织标本，保存于-60～-80℃冰箱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在载玻片1上制备组织芯片，其中，32种组织芯片以4*8的队列整齐排布，质控组织芯片位于其余32种组织芯片的队列以外的位置，所述的32种组织芯片不包括血细胞；用于制备组织芯片的组织包括石蜡组织或冰冻组织；切片厚度为3～7μm，冰冻组织芯片保存于-80℃超低温冰箱中，石蜡组织芯片保存于室温。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将不同个体的同一种组织进行切片，并按照顺序依次呈线性排布在同一张载玻片1上，组织的数量为1～4个。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，用于单克隆抗体和同型对照标记的方法包括生物素、FITC或辣根过氧化物酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，检测抗体类药物的组织交叉反应的步骤如下：
①石蜡组织及芯片
a.从徕卡切片机上取出切好的玻片；
b.将切片放入恒温箱内烘烤65℃约2小时；
c.切片常规脱蜡至水20-40min；
d.0.01M PBS浸洗3-5min，共3次，可将切片放置于PBS中直到下一步；
e.将切片置于3％过氧化氢溶液，室温封闭10-15min；
f.重复步骤d；
g.将组织切片2放入高压锅，加入约2000ml左右的EDTA抗原修复液或柠檬酸修复液，沸腾后高温高压修复3min；
h.将高压锅移至冷水中冷却至室温；组织切片2蒸馏水中浸泡3-5min；
i.取出切片，擦干组织周围的水，用迈新画圈笔在组织块周围画一圆圈；
j.重复步骤d；
k.在组织切片2上滴加免疫组化封闭液，湿盒内室温孵育20-30min；
l.甩掉切片上的免疫组化封闭液，滴加一抗(鼠抗CD31(JC/70A)抗体)，置于湿盒内4℃放置过夜；
m.恢复至室温；
n.重复步骤d；
o.滴加相应二抗(快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室温下孵育20-40min；
p.重复步骤d；
q.DAB显色2-8min，在显微镜下控制染色的强度，显色结束用蒸馏水终止反应；
r.将切片放入流水中冲洗3-5min，苏木素轻度复染，1％盐酸酒精分化约3s，流水冲洗3-5min；
s.梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，备阅；
②冰冻组织及芯片
1)将组织切片2放于室温干燥15～30min后，放于冷丙酮中固定15～30min，然后置于室温干燥30～60min；
2)将干燥后的组织切片2浸入0.01M PBS洗涤2～3次，每次1～2min；
3)向组织切片2上滴加50～100μL商品化内源性生物素阻断试剂盒中的卵白素试剂，置于湿盒内中，于室温下孵育10～20min；
4)重复步骤2)；
5)滴加50～100μL内源性生物素阻断试剂盒中的生物素试剂，置于湿盒内在室温下孵育10～20min；
6)重复步骤2)；
7)在浸入过0.01M PBS的新鲜冰冻组织切片2上，滴加50～100μL过氧化酶阻断剂，置于湿盒内在室温下孵育5～15min；
8)将组织切片2浸入去离子水中1～2次，每次1～2min，然后浸入0.01M PBS中1～2次，每次1～2min；
9)滴加50～100μL动物非免疫血清，置于湿盒内在室温下孵育10～20min后，拭去切片周围的试剂，滴加50～100μL的待检测的抗体类药物或同型对照于切片组织上，置于湿盒内在室温下孵育60～90min；
其中，抗体类药物包括：单克隆抗体、含有免疫球蛋白IgGFc片段的融合蛋白；
10)重复步骤2)；
11)滴加50～100μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，置于湿盒内在室温下孵育10～20min；
12)重复步骤2)；
13)滴加50～100μL显色剂DAB，置于湿盒内在室温下孵育2～10min后，用水冲洗2～3min后用苏木素复染切片2～4min，冲洗8～10min，使用封片胶进行封片；
14)显微镜下观察反应结果。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，待检测的抗体类药物的使用浓度为0.1～50μg/mL，同型对照的浓度为0.1～50μg/mL，所使用的组织完整性验证抗体包括抗-CD31抗体或抗转铁蛋白受体抗体。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，用于组织交叉反应结果判断的标准如下：
染色强度：
染色范围：
CN201711367415.2A 2017-12-18 2017-12-18 一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法 Pending CN108106910A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711367415.2A CN108106910A (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711367415.2A CN108106910A (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108106910A true CN108106910A (zh) 2018-06-01

Family

ID=62211010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711367415.2A Pending CN108106910A (zh) 2017-12-18 2017-12-18 一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108106910A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109115543A (zh) * 2018-07-09 2019-01-01 苏州华测生物技术有限公司 一种有效提高实验动物甲状旁腺组织病理制片切出率的方法
CN113720669A (zh) * 2021-08-27 2021-11-30 吴鸿雁 基于动物器官或组织构建的免疫组化质控品

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104991073A (zh) * 2015-06-18 2015-10-21 南通大学附属医院 检测scml2的即用型快速酶免疫组织化学试剂盒
CN104865115B (zh) * 2014-02-24 2018-05-25 百奇生物科技（苏州）有限公司 使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104865115B (zh) * 2014-02-24 2018-05-25 百奇生物科技（苏州）有限公司 使用新鲜冰冻组织检测单克隆抗体类药物组织交叉反应的方法
CN104991073A (zh) * 2015-06-18 2015-10-21 南通大学附属医院 检测scml2的即用型快速酶免疫组织化学试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
祁德波等: "组织交叉试验中多路径体系技术难点的探索和研究", 《药物评价研究》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109115543A (zh) * 2018-07-09 2019-01-01 苏州华测生物技术有限公司 一种有效提高实验动物甲状旁腺组织病理制片切出率的方法
CN109115543B (zh) * 2018-07-09 2021-06-22 苏州华测生物技术有限公司 一种有效提高实验动物甲状旁腺组织病理制片切出率的方法
CN113720669A (zh) * 2021-08-27 2021-11-30 吴鸿雁 基于动物器官或组织构建的免疫组化质控品

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zaqout et al. Immunofluorescence staining of paraffin sections step by step
Hoffman et al. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods
Franke et al. Intermediate-sized filaments of the prekeratin type in myoepithelial cells.
Burns et al. Intracellular immunoglobulins: a comparative study on three standard tissue processing methods using horseradish peroxidase and fluorochrome conjugates
Richards et al. Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human
US20070243560A1 (en) Method for examining kidney diseases
CN108106910A (zh) 一种检测抗体类药物与人体和动物正常组织交叉反应的方法
Fra-Bido et al. Optimized immunofluorescence staining protocol for imaging germinal centers in secondary lymphoid tissues of vaccinated mice
Ahmad et al. Antiangiogenic effect of soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 in placental angiogenesis
JP3259768B2 (ja) 腎疾患の検査方法
CN106198996B (zh) 微小病变型肾病的早期诊断生物标记物、试剂盒及其应用
Bates et al. Insulin receptor-related receptor expression in non-A intercalated cells in the kidney
Robinson Immunofluorescent and immunoperoxidase staining of antibodies to fibrous keratin: improved sensitivity for detecting epidermal cancer cells
Borel et al. Testicular hypoplasia in a bull persistently infected with bovine diarrhoea virus
Al-Refu General methods in preparation of skin biopsies for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry
Kilic et al. Methods to evaluate the formation and stabilization of blood vessels and their role in tumor growth and metastasis
Smart et al. Protocol for tissue processing and paraffin embedding of mouse brains following ex vivo MRI
Pal et al. Immunohistochemistry
Praderio et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in histological endometritis in the bitch: An immunohistochemical study
Qi et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections
Wu et al. A novel triple immunoenzyme staining enables simultaneous identification of all muscle fiber types on a single skeletal muscle cryosection from normal, denervated or reinnervated rats
Smith Evaluation of cross-species reactivity of antibodies to human antigens in animal models using immunoperoxidase techniques
Saitoh et al. Immunolocalization of phospho-Arg-directed protein kinase-substrate in hypoxic kidneys using in vivo cryotechnique
Llewellyn-Smith et al. Immunoperoxidase detection of neuronal antigens in full-thickness whole mount preparations of hollow organs and thick sections of central nervous tissue
Shi et al. Extended application of antigen retrieval technique in immunohistochemistry and in situ hybridization

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180601