RU2484446C1 - Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе - Google Patents
Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2484446C1 RU2484446C1 RU2011154287/05A RU2011154287A RU2484446C1 RU 2484446 C1 RU2484446 C1 RU 2484446C1 RU 2011154287/05 A RU2011154287/05 A RU 2011154287/05A RU 2011154287 A RU2011154287 A RU 2011154287A RU 2484446 C1 RU2484446 C1 RU 2484446C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- microorganisms
- camphene
- sample
- cell
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе. Способ включает фиксацию, промывку и обезвоживание, пропитку в камфене и высушивание при комнатной температуре. Перед фиксацией образца микроорганизмы культивировали на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду. Образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С, а затем промывали в фосфатном буфере 20 минут и в дистиллированной воде 6 мин. После образец поэтапно обезвоживали в 70% 15 минут и по 10 минут в 80%, 96% и 100% этиловом спирте, пропитывали в камфене при t=60°C в течение 20 минут. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Достигаемый при этом технический результат заключается в предотвращении деформации клеток и микрорельефа клеточной поверхности бактерий, а также пространственной структуры микропленок микроорганизмов и внеклеточного полимерного матрикса в процессе высушивания. 3 ил.
Description
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при проведении научно-исследовательских работ, связанных с изучением пространственной структуры биопленок микроорганизмов и ее внеклеточного полимерного матрикса.
Известны способы подготовки образцов биологических тканей к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии путем высушивания с помощью метода перехода критической точки, методом замораживания-высушивания, высушивания в вакууме и путем высушивания на воздухе (Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. - М.: Медицина, 1996. - с.247-250).
Однако для осуществления данных методов необходимы специальное дорогостоящее оборудование и реактивы, в противном случае это приводит к грубой деформации структуры образца.
Известен способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание. После обезвоживания, не высушивая, образцы переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60ºС, после пропитывания камфеном образец высушивают на воздухе (RU 2397472 С1).
Однако известный способ не позволяет исследовать структуру биопленок, образованных прокариотными организмами.
Задачей изобретения является предотвращение деформации клеток и микрорельефа клеточной поверхности бактерий, а также пространственной структуры биопленок микроорганизмов и внеклеточного полимерного матрикса в процессе высушивания для получения изображений методом сканирующей электронной микроскопии.
Указанный технический результат достигается тем, что перед фиксацией образца микроорганизмы культивировали на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4ºС, промывали в фосфатном буфере 20 минут, в дистиллированной воде 6 мин, поэтапно обезвоживали в 70% 15 минут и по 10 минут в 80%, 96% и 100% этиловом спирте, пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C в течение 20 минут, далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примером его практического использования и электронными сканограммами (см. фиг.1), на которых микроорганизмы расположены в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ - биопленок; а - пространственная структура биопленки микроорганизмов, увеличение ×650; б - внеклеточный полимерный матрикс биопленки микроорганизмов, увеличение ×5000; в - форма клеток и клеточной поверхности, увеличение ×8000.
Способ осуществляется следующим образом.
Для подготовки образцов биопленок микроорганизмов перед исследованием методом сканирующей электронной микроскопии микроорганизмы культивируют на поверхности ячейки диаметром 3 мм ячейковой упаковки с перфорациями (проколы сверху вниз) по всему диаметру ячейки. Ячейку погружают в суспензию микроорганизмов в питательной среде. После культивирования бактерий в условиях, соответствующих поставленной задаче, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С. Затем их промывали в фосфатном буфере 20 минут (4 раза по 5 мин), в дистиллированной воде 6 минут (3 раза по 2 мин). Затем обезвоживали поэтапно в 70% 15 минут (3 раза по 5 мин) и по 10 минут в 80% (2 раза по 5 мин), 96% (2 раза по 5 мин), 100% (2 раза по 5 мин) этиловом спирте. Пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C в течение 20 минут (2 раза по 10 мин). Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Затем осуществляли монтаж ячейки на держатель образца для сканирующего электронного микроскопа.
Подготовленные образцы исследуют в сканирующем электронном микроскопе.
Практическое использование способа иллюстрируется следующим примером. Для исследования взяли стерилизованные ячейки ячейковой упаковки, перфорировали по всему диаметру ячейки и погрузили в суспензию микроорганизмов в питательной среде (питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)). После культивирования бактерий в условиях, соответствующих поставленной задаче, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С. Затем их промывали в фосфатном буфере 4 раза по 5 мин, в дистиллированной воде 3 раза по 2 мин. Затем поэтапно обезвоживали в 70% - 3 раза по 5 мин, в 80% - 2 раза по 5 мин, 96% - 2 раза по 5 мин, 100% - 2 раза по 5 мин этиловом спирте. Пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C - 2 раза по 10 мин. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. После чего осуществляли монтаж ячейки на держатель образца для сканирующего электронного микроскопа.
После напыления серебром в ионном напылителе IB-6 препараты исследовали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Япония). В подготовленном образце сохранены: форма клеток, микрорельеф клеточной поверхности, пространственная структура сформировавшейся биопленки и внеклеточного полимерного матрикса (Фиг.1 а, б, в).
Предложенный способ используется в ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А.Илизарова» Минздравсоцразвития России в научно-клинической лаборатории микробиологии и иммунологии. Способ позволил получить изображения как отдельных клеток в процессе развития биопленки, так и пространственной структуры биопленки микроорганизмов без деформации размеров, формы клеток, клеточной поверхности и нарушения связей между клетками.
Claims (1)
- Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание, пропитку в камфене, высушивание при комнатной температуре, отличающийся тем, что перед фиксацией образца микроорганизмы культивируют на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки, с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду, образец с микроорганизмами фиксируют в течение 24 ч в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С, промывают в фосфатном буфере 20 мин, в дистиллированной воде 6 мин, поэтапно обезвоживают в 70% 15 мин и по 10 мин в 80%, 96% и 100%-ном этиловом спирте, пропитывают в камфене при t=60°C в течение 20 мин, далее образцы высушивают на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011154287/05A RU2484446C1 (ru) | 2011-12-28 | 2011-12-28 | Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011154287/05A RU2484446C1 (ru) | 2011-12-28 | 2011-12-28 | Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2484446C1 true RU2484446C1 (ru) | 2013-06-10 |
Family
ID=48785800
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011154287/05A RU2484446C1 (ru) | 2011-12-28 | 2011-12-28 | Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2484446C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111965206A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-20 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法 |
CN111982629A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-11-24 | 北京市农林科学院 | 一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法 |
RU2769574C1 (ru) * | 2020-04-01 | 2022-04-04 | Частное Учреждение Лаборатория Биотехнологических Исследований "3Д Биопринтинг Солюшенс" | Способ фабрикации трехмерных биопленок микроорганизмов |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1690691A1 (ru) * | 1987-02-19 | 1991-11-15 | Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии Им.Почетного Акад.Н.Ф.Гамалеи | Способ диагностики хронической инфекции |
JPH07280714A (ja) * | 1994-04-13 | 1995-10-27 | Jeol Ltd | 走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法並びに走査電子顕微鏡用生物試料作製装置 |
CN1587959A (zh) * | 2004-09-23 | 2005-03-02 | 上海交通大学 | 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法 |
RU2385942C2 (ru) * | 2003-11-06 | 2010-04-10 | Кемира Ойй | Способ определения наличия микроорганизмов, образующих биопленку, в бумажной промышленности |
RU2397472C1 (ru) * | 2008-12-22 | 2010-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе |
-
2011
- 2011-12-28 RU RU2011154287/05A patent/RU2484446C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1690691A1 (ru) * | 1987-02-19 | 1991-11-15 | Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии Им.Почетного Акад.Н.Ф.Гамалеи | Способ диагностики хронической инфекции |
JPH07280714A (ja) * | 1994-04-13 | 1995-10-27 | Jeol Ltd | 走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法並びに走査電子顕微鏡用生物試料作製装置 |
RU2385942C2 (ru) * | 2003-11-06 | 2010-04-10 | Кемира Ойй | Способ определения наличия микроорганизмов, образующих биопленку, в бумажной промышленности |
CN1587959A (zh) * | 2004-09-23 | 2005-03-02 | 上海交通大学 | 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法 |
RU2397472C1 (ru) * | 2008-12-22 | 2010-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2769574C1 (ru) * | 2020-04-01 | 2022-04-04 | Частное Учреждение Лаборатория Биотехнологических Исследований "3Д Биопринтинг Солюшенс" | Способ фабрикации трехмерных биопленок микроорганизмов |
CN111965206A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-20 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法 |
CN111965206B (zh) * | 2020-08-12 | 2024-01-02 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法 |
CN111982629A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-11-24 | 北京市农林科学院 | 一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法 |
CN111982629B (zh) * | 2020-08-25 | 2023-11-17 | 北京市农林科学院 | 一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105349487A (zh) | 一种基于外泌体的促人骨髓间充质干细胞增殖的方法 | |
Kaláb et al. | Conventional scanning electron microscopy of bacteria | |
Jung et al. | Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy | |
RU2484446C1 (ru) | Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе | |
CN105154343B (zh) | 一种简易的稻曲菌分离和保存方法 | |
Korhonen et al. | Simple isolation and inoculation methods for fungal cultures | |
Hrubanova et al. | The innovation of cryo-SEM freeze-fracturing methodology demonstrated on high pressure frozen biofilm | |
Robinow | The preparation of yeasts for light microscopy | |
Prakash et al. | A modified micro chamber agar spot slide culture technique for microscopic examination of filamentous fungi | |
de los Ríos et al. | Preparative techniques for transmission electron microscopy and confocal laser scanning microscopy of lichens | |
RU2397472C1 (ru) | Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе | |
CN107129962B (zh) | 一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法 | |
CN107002034A (zh) | 体外纤维化模型、该模型的制造方法以及用途 | |
CN103525801A (zh) | 一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法 | |
WO2023029909A1 (zh) | 一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法 | |
JP2007309872A (ja) | 透過型電子顕微鏡用試料の調製方法 | |
CN204177654U (zh) | 用于生物原位印片法取样和微量染色的实验装置 | |
Pozzobon et al. | Alveolar rhabdomyosarcoma decellularization | |
Naik et al. | Use of environmental scanning electron microscope for taxonomy of fungi | |
Pérez-López et al. | Simple method for preparing delicate dinoflagellate of the genus Amphidinium for scanning electron microscopy | |
Gibbons et al. | Processing embryo, eggshell, and fungal culture for scanning electron microscopy | |
CN2271927Y (zh) | 人羊膜基底膜侵袭模型 | |
RU206813U1 (ru) | Устройство для культивирования биопленок микроорганизмов | |
CN111965206B (zh) | 一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法 | |
CN114752542B (zh) | 鸡滑液囊支原体生物被膜的培育方法及其应用、筛选方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141229 |