CN111965206A

CN111965206A - 一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法

Info

Publication number: CN111965206A
Application number: CN202010808901.9A
Authority: CN
Inventors: 李春霞; 常圣鑫; 李春泽; 胡美姣; 李敏; 高兆银; 弓德强; 母军霞
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2040-08-12
Also published as: CN111965206B

Abstract

本发明公开了一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，包括以下步骤：(1)不锈钢编织网片的制备与灭菌；(2)接种和插片：在超净工作台中进行真菌的接种,将菌饼接种于固体培养基的中心点,平贴于培养基表面放入己灭菌的2‑5片不锈钢编织网片,所述不锈钢编织网片距离培养基的中心点位置3‑4cm；然后用无菌膜密封,置于适宜条件的培养箱中培养,当露出的不锈钢编织网片已经被菌丝覆盖时,停止培养。(4)不锈钢编织网片样品固定、脱水、置换、干燥。

Description

一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法

技术领域

本发明属于的技术领域，具体涉及一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法。

背景技术

真菌作为一种重要实验材料，在微生物实验中的应用是相当普遍的，正确的培养观察方法，可以如实地反映其本质特征，为真菌的分类和鉴定提供坚实基础。插片培养法是实验室观察真菌形态的一种基本方法。该方法简单易懂，应用范围广，在对真菌形态方面的显微观察中可以保证真菌的基本形态不被破坏，结构完整等特点。其基本步骤是：将固体培养基倒入干净的培养皿中，厚度约0.3～0.5mm，待平皿凝固后将接种块接种于凝固的培养皿中央；用干净的镊子，将无菌的盖玻片以45度角的角度斜插入培养基中，插片位置与接种块之间距离一般为1.0～1.5cm；待菌丝铺展开来，长过插片的位置后，取出爬有菌丝的玻片，用软纸擦去玻片背面的菌丝及培养基，进行显微镜观察。

扫描电镜(SEM)对观察研究真菌表面超微形态是一种重要的手段，但过去的SEM常规制备方法观察真菌，由于真菌样品本身属单层细胞，其主要成分为真菌的孢子和菌丝，在制样过程中，极易变形，造成人工假象，很难达到满意的观察效果。另外，插片法使用的玻璃插片易碎且导电性差，极大影响了试验进度和效果，专利一种丝状真菌环境扫描电镜样品制备方法(CN104928343A)通过使用食用铝箔片代替玻璃插片成功解决了插片破碎的问题且增强了插片的导电性。但是本发明作者发现部分真菌在插片培养过程中产生的有机酸极易将铝箔片腐蚀，导致试验失败。另外，铝箔片质软易变形不利于扫描电镜观察真菌。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，采取不锈钢编织网片，同时优化了样品制备的过程，为真菌的表型分类和菌种鉴定等方面提供有效支撑。

一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，包括以下步骤：

(1)不锈钢编织网片的制备与灭菌；

(2)接种和插片：在超净工作台中进行真菌的接种,将菌饼接种于培养基的中心点,平贴于培养基上放入己灭菌的2-5片不锈钢编织网片,所述不锈钢编织网片距离培养基的中心点位置3-4cm；然后用保鲜膜密封,置于适宜条件的培养箱中培养,当露出不锈钢编织网片的已经被菌丝覆盖时,停止培养。

(3)不锈钢编织网片样品固定、脱水、干燥：将步骤(4)制备的被菌丝覆盖的不锈钢编织网片置于体积分数为2.5％的戊二醛溶液中浸泡3h-6h；接着用0.1M的磷酸缓冲液浸泡冲洗，使缓冲液没过样品，每次冲洗持续20min，连续进行四次，洗净戊二醛溶液后，用不同体积分数为30％，50％，70％，90％，100％的酒精溶液逐级进行脱水，从低浓度到高浓度依次进行，每个浓度分别浸泡1-2次，每次10min，接着用100％叔丁醇浸泡两次，每次15min，浸泡结束后吸掉多余叔丁醇，置于4℃低温或液氮罐口处，使样品冷却固化；最后置于低温冻干机真空冻干1h-3h。

进一步的，步骤(2)所述不锈钢编织网片向离心方向水平插入或平贴于培养基中。

进一步的，步骤(3)中所述不锈钢编织网片置于体积分数为30％的酒精溶液2次，体积分数为50％的酒精溶液2次，体积分数为70％的酒精溶液1次，体积分数为90％的酒精溶液1次，体积分数为100％的酒精溶液2次。

进一步的，所述步骤(1)不锈钢编织网片为使用直径0.08mm的304不锈钢丝、采用平纹编织法编制成孔径为100目、厚度约1mm、圆片直径约0.8mm的不锈钢网片。

进一步的，所述步骤(2)的具体步骤为将不锈钢编织网片用报纸密封包装后120℃高压灭菌20分钟，烘干备用。

进一步的，所述真菌为丝状真菌。

本发明的有益效果：

1.本发明的适用于真菌扫描电镜样品制备方法，采用不锈钢编织网片代替铝箔片或者玻璃片，可为丝状真菌菌丝提供缠绕生长的孔隙，防止菌丝脱落，同时也解决了玻璃片易碎不导电，铝箔片柔软易变形以及菌群产酸腐蚀爬片的问题。

2.未经固定和干燥处理的菌丝因其含水量高、质地柔软、导电性差、容易变形等特点，容易影响试验结果，因此本发明方法增加了样品固定、脱水、干燥等处理步骤，经过这些处理后，不仅能够有效除去样品细胞中的水分还能固定细胞，使样品保持原貌。

3.以不锈钢编织网片代替玻璃片来作为爬片,(1)避免因玻璃爬片破碎而影响样品制备和观察；(2)避免玻璃破碎划伤皮肤、眼睛等，可有效排除安全隐患；(2)避免因玻璃爬片破碎而污染电镜环境；(3)增加了观察样品和样品台之间的导电性,减少了样品的放电现象,使样品在相同的放大倍率下更加清晰逼真，样品可以被放大更大的倍率。

4.以不锈钢丝编织的网片代替铝箔片，(1)平纹编织的网片不仅平整而且能为丝状真菌菌丝提供缠绕生长的孔隙，具有固定支撑真菌的作用，避免样品固定脱水等处理过程滑落变形甚至丢失；(2)增加了爬片的硬度，可以有效避免样品制备过程由于爬片弯曲变形等原因造成样品损毁或丢失，影响试验结果；(3)增加了爬片的耐腐蚀性，避免因菌群产酸量大而腐蚀爬片；(4)增加了爬片的密度，使爬片更易于浸没在溶液中，样品固定效果更好。

5.增加样品固定、漂洗、脱水、置换、干燥等处理步骤，(1)避免未经脱水处理样品的表面水分影响喷金；(2)避免因未固定脱水的生物样品含水量高、质地柔软、导电性差、容易变形等影响试验；(3)避免浪费稀有、昂贵试剂，避免使用剧毒试剂。

附图说明

图1为实施例1观察的真菌；

图2为实施例2观察的真菌。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

一、固体培养基的制备与灭菌

使用去离子水熬制普通的马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基(PDA),每100ml加入琼脂粉1.5g，放入高压锅内灭菌,灭菌温度为121℃，灭菌时间20min，灭菌后的固体培养基于超净台中分装倒入直径9cm的玻璃培养皿中,培养基的厚度4-6mm。

二、不锈钢网片的制备与灭菌

选择直径为0.08mm的304不锈钢丝采用平纹编织法编制成孔径为100目、厚度约1mm、直径约0.8mm的不锈钢网片，使用报纸密封包装后120℃高压灭菌20分钟，烘干备用。

三、接种和插片

在超净工作台中进行真菌接种,将菌饼(φ＝5mm)接种于培养基的中心点,平贴培养基上放入己灭菌的不锈钢网片,不锈钢网片距离圆心位置3-4cm处平贴于PDA培养基上,同样在其对面和两侧以相同的方式在放上三片不锈钢网片。然后用保鲜膜密封,置于28℃的培养箱中黑暗培养,当露出不锈钢网片的已经被菌丝覆盖时,停止培养。

四、不锈钢网片样品固定、漂洗、脱水、置换、干燥

固定：2.5％的戊二醛溶液中浸泡3h以上；漂洗：用0.1M的磷酸缓冲液(PBS)浸泡冲洗，使缓冲液没过样品，每次冲洗持续20min，连续进行四次，洗净固定液；

脱水：配制浓度分别为30％，50％，70％，90％，100％的酒精,将样品用不同浓度的酒精溶液浸泡逐级进行脱水，从低浓度到高浓度依次进行，浸泡1-2次(30％2次，50％2次，70％1次，90％1次，100％2次)，每次10min；

置换：100％乙醇脱水后用100％叔丁醇浸泡两次，每次15min，第二次没过样品即可，浸泡结束后吸掉多余叔丁醇，置于4℃低温或液氮罐口处，使样品冷却固化；

干燥：置于低温冻干机真空冻干1h左右。

五、喷金

小心取出干燥后不锈钢网片,把没有菌丝体和孢子的一面粘到贴有导电双面胶的上样台上，然后将上样台放在真空蒸发器中，采用离子溅射镀膜机喷镀一层50～300埃厚的金属膜。

六、扫描电镜观察

把喷金后的样品台置于扫描电镜中进行观察,使用扫描电镜在真空模式下,使用电压10.0KV进行观察和照相。

实施例2

一、固体培养基的制备

使用去离子水熬制普通的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),每100ml加入琼脂粉1.5g，放入高压锅内灭菌,灭菌温度为121℃，灭菌时间20min，灭菌后的固体培养基于超净台中分装倒入直径9cm的玻璃培养皿中,培养基的厚度4-6mm。

二、玻璃玻片和铝箔片的准备

取组织观察用玻璃盖玻片、剪成长宽均为8mm的微波用铝箔片以及不锈钢网片,用滤纸包裹并121℃灭菌20min，烘干备用。

三、接种和插片

在超净工作台中进行真菌的接种,将菌饼(φ＝5mm)接种于培养基的中心点,在培养基上插入己灭菌的玻璃玻片/铝箔片,玻璃玻片/铝箔片距离圆心位置3-4cm处,并且平贴于PDA培养基上,同样在其对面和两侧以相同的方式放置三片玻璃玻片/铝箔片/不锈钢网片。然后用保鲜膜密封,置于28℃的培养箱中黑暗培养,当玻璃玻片/铝箔片的已经被菌丝覆盖时,停止培养。

四、喷金

小心取出干燥后玻璃玻片和铝箔片,把没有菌丝体和孢子的一面粘到贴有导电双面胶的上样台上，然后将上样台放在真空蒸发器中，采用离子溅射镀膜机喷镀一层50～300埃厚的金属膜。

五、扫描电镜观察

从图1可以看出实施例1处理后的真菌菌丝粗细均匀，形态饱满，层次分明，立体感强，说明实施例1制备的丝状真菌扫描电镜样品可以真实反映真菌的形态特征，可为真菌的分类和鉴定提供试验基础；图2可以看出实施例2处理后的真菌菌丝、孢囊和孢囊孢子都变形扭曲，严重塌陷，说明实施例2处理的真菌样品不适合用于扫描电镜观察，另外例2操作过程中，玻璃玻片易碎，铝箔片易弯曲变形，不锈钢网片未发生上述情况。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)不锈钢编织网片的制备与灭菌：选择直径为0.08mm的304不锈钢丝采用平纹编织法编制成孔径为100目、厚度约1mm、直径约0.8mm的不锈钢网片，使用报纸密封包装后120℃高压灭菌20分钟，烘干备用；

(2)接种和插片：在超净工作台中进行真菌的接种,将菌饼接种于固体培养基的中心点,平贴于培养基上放入己灭菌的2-5片不锈钢编织网片,所述不锈钢编织网片距离培养基的中心点位置3-4cm；然后用无菌膜密封,置于适宜条件的培养箱中培养,当露出的不锈钢编织网片已经被菌丝覆盖时,停止培养。

(3)不锈钢编织网片样品固定干燥：将步骤(2)制备的被菌丝覆盖的不锈钢编织网片置于体积分数为2.5％的戊二醛溶液中浸泡3h-6h；接着用0.1M的磷酸缓冲液浸泡冲洗，使缓冲液没过样品，每次冲洗持续20min，连续进行四次，洗净戊二醛溶液后，用不同体积分数为30％，50％，70％，90％，100％的酒精溶液逐级进行脱水，从低浓度到高浓度依次进行，每个浓度分别浸泡1-2次，每次10min，接着用100％叔丁醇浸泡两次，每次15min，浸泡结束后吸掉多余叔丁醇，置于4℃低温或液氮罐口处，使样品冷却固化；最后置于低温冻干机真空冻干1h-3h。

2.根据权利要求1所述的一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，其特征在于，步骤(1)所述不锈钢编织网片为使用直径0.08mm的304不锈钢丝、采用平纹编织法编制成孔径为100目、厚度约1mm、圆片直径约0.8mm的不锈钢网片。

3.根据权利要求2所述的一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，其特征在于，步骤(2)所述不锈钢编织网片向离心方向平贴于培养基表面。

4.根据权利要求3所述的一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述不锈钢编织网片置于体积分数为2.5％的戊二醛溶液1次，0.1M的磷酸缓冲液浸泡4次，体积分数为30％的酒精溶液2次，体积分数为50％的酒精溶液2次，体积分数为70％的酒精溶液1次，体积分数为90％的酒精溶液1次，体积分数为100％的酒精溶液2次，用100％叔丁醇浸泡,2次，最后置于低温冻干机真空冻干。

5.根据权利要求4所述的一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，其特征在于：所述不锈钢编织网片使用报纸密封包装后120℃高压灭菌20分钟，烘干备用。

6.根据权利要求5所述的一种适用于真菌扫描电镜样品制备方法，其特征在于：所述真菌为丝状真菌。