CN110927192B - 一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，涉及制备扫描电镜用草本植物样品领域，解决了现有技术中聚合树脂难以从泥炭藓剥离的难题，包括取材、固定、漂洗及脱水、置换及干燥、树脂铸型、软化、腐蚀及清洗、镀金及观察，即完成扫描电镜用泥炭藓铸型样品的制备。本发明的优点在于：1)解决了聚合树脂难以从泥炭藓剥离的难题；2)结合扫描电镜的使用，能够更加立体的了解泥炭藓内部腔体，透明细胞及绿色细胞的细微结构，达到进一步了解其水分及物质运输，更有益于后续对泥炭藓的开发与应用；3)本发明简单容易操作，技术成本低，适用于多孔的苔藓植物及所取材料可以吸收并向上运输树脂的植物。
Description
技术领域
本发明涉及制备扫描电镜用草本植物样品领域，尤其涉及一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法。
背景技术
泥炭藓生长在沼泽地区或森林洼地，它的植物细胞有非常出色的储水功能，在干燥状态下呈灰白色丛生状态。对比脱脂棉的吸水能力，它的吸水性还要更强大一些，由于泥炭藓的消毒作用，在其经过消毒加工之后，可代替脱脂棉成为制作急救包和敷料的材料。另外，泥炭藓在现实生活中的应用相当广泛，包括医药卫生方面、包装运输、环境保护、能源开发和农学生物学方面等，近年来泥炭藓被开发出新的应用领域就是能源开发领域，由于泥炭藓属苔藓纲泥炭藓科植物，是重要的造炭植物之一，其固定造炭总量在北半球泥炭沼泽固定造炭总量中足足占了一半，所以是泥炭开发地重建的首选植物。由此可见泥炭藓的开发与应用是很重要的，通过对泥炭藓织物内部结构的探索和研究，达到对泥炭藓更进一步的认识的目的，更有益于后续对泥炭藓的开发与应用。
对植物内部结构的研究,最常用的是整体观察、切片等方法，但这些方法有一定的局限性。整体观察时由于外围细胞的遮挡，不利于对内部结构的观察；切片法一般只看到细胞的某个切面，对完整的细胞性状无法判断。连续切片结合三维重构在近些年得到了很好的应用，但此方法对材料及技术的要求比较高。树脂铸型法(resincastingmethod)最早是在医学方面研究动物血管的三维结构，近年来研究者们用树脂注入一些植物的内部组织结构中，就比如植物纤维的内腔和细胞间的腔隙，样本经过软化试剂和浓硫酸的浸泡把细胞壁处理后，可以得到清晰明显的植物木质部内部结构和其完整的三维结构的模型，并以此技术研究植物方向的外表结构、内部结构和细胞间的缝隙空间等三维结构。现有的国内外关于树脂铸型法应用的研究现状较多倾向于人体器官如人体管道或者是木本植物的结构铸型研究，很少有比较广泛的关于草本植物的结构铸型研究，由于草本植物，尤其是苔藓植物的生物量较小，在铸型过程中形成的聚合树脂难以剥离，严重影响了对苔藓植物的内部结构的进一步认识。
发明内容
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：
选取泥炭藓作为样品放入试管中；
步骤二、固定：
向试管中加入2.5v％戊二醛固定液固定样品；
步骤三、漂洗及脱水：
向固定后的样品试管中加入pH为6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液，并反复更换磷酸缓冲液进行漂洗，然后向试管中加入不同体积浓度的乙醇逐级梯度脱水；
步骤四、置换及干燥：
向盛有脱水后的样品试管中加入不同体积浓度的叔丁醇来脱乙醇，然后进行冷冻干燥，直至将叔丁醇全部除去；
步骤五、树脂铸型：
向盛有冷冻干燥后的样品试管中加入含1％-2％wt的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液，并置于60℃下聚合3-4d；
步骤六，软化：
向盛有聚合完成后的样品试管中加入冰乙酸与双氧水体积配比为1:1的混合液，于50℃下软化1-2d；
步骤七，腐蚀及清洗：
将盛有软化后的样品试管置于冷水浴中，并向其中加入98％浓硫酸，然后静置1-2d后，用蒸馏水反复清洗；
步骤八、干燥：
取出试管中的样品，置于60℃下干燥4-6h；
步骤九、镀金及观察：
用碳导电胶带将步骤八干燥后的样品粘贴在扫描电镜的样品台上，保证观察面朝上，用离子溅射仪在样品表面镀金，然后在扫描电镜下进行观察。
优选的，步骤一中，所述试管的长度与所述样品的高度接近。
优选的，步骤二中，所述固定时间为4-6h。
优选的，步骤三中，先逐级使用体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇进行脱水，然后使用体积浓度为100％的乙醇进行三次脱水。
优选的，步骤五中，加入的含1％-2％wt的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液的重量为样品所吸水分重量的1-2倍，所述样品所吸水分重量为泥炭藓干重与吸水比重(倍)的乘积，其中，吸水比重(倍)＝(泥炭藓的湿重-泥炭藓的干重)/泥炭藓的干重，泥炭藓的干重为将选取与所用泥炭藓相同组的泥炭藓烘干，称重得到，泥炭藓的湿重为将所用泥炭藓样品装入滤网后，放入装有纯水的容器中，在不滴水时，称重得到。
优选的，步骤六中，加入的体积配比为1:1的冰乙酸与双氧水的混合液应完全浸泡试管中的样品。
优选的，步骤七中，在冷水浴中，加入98％浓硫酸腐蚀1-2d，重复2-3次，用蒸馏水反复清洗，清洗干净后放在无水酒精中浸泡，捞出。
优选的，作为样品的所述泥炭藓为新鲜泥炭藓叶片或者茎，进一步优选新鲜泥炭藓叶片。
优选的，作为样品的所述泥炭藓为干燥过的泥炭藓叶片或者干燥过的泥炭藓茎，当干燥过的泥炭藓叶片或者干燥过的泥炭藓茎作为样品时，步骤二至步骤四省略，其他步骤条件保持不变。
本发明的有益效果为：
本发明通过控制加入树脂的用量及泥炭藓样品的高度，使得在泥炭藓体中形成树脂栓样的结构，在腐蚀掉后收集得到泥炭藓内部结构的复制品，解决了铸型过程中形成的聚合树脂难以从泥炭藓的表面剥离的难题，突破了树脂铸型法在苔藓植物上利用的局限性，再结合扫描电镜的使用，能够将泥炭藓内部腔体，透明细胞及绿色细胞的细微结构更加立体的呈现出来，达到进一步了解其水分及物质运输，更有益于后续对泥炭藓的开发与应用。而且，本发明简单容易操作，制备得到的泥炭藓的内部结构(叶子、茎)得到了很好的呈现，变形小，成功率高，技术成本低，适用于多孔的苔藓植物及所取材料可以吸收并向上运输树脂的植物。
附图说明
图1为本发明方法制备的新鲜泥炭藓叶片的扫描电镜图像；
图2为本发明方法制备的干燥过的泥炭藓叶片的扫描电镜图像；
图3为本发明方法制备的干燥过的泥炭藓茎的扫描电镜图像；
图4为本发明方法制备的干燥过的泥炭藓茎的扫描电镜图像；
图5为本发明方法制备的干燥过的泥炭藓茎的扫描电镜图像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：
选取新鲜泥炭藓叶片作为样品，放入与其高度接近的带盖试管中；
步骤二、固定：
向盛有样品的试管中加入由pH为6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液配制的2.5v％戊二醛固定液，固定样品4h；
步骤三、漂洗及脱水：
向盛有固定后的样品试管中加入pH为6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液，反复更换磷酸缓冲液，本实施例中，更换磷酸缓冲液3次，每次漂洗1.5h；然后依次使用体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇脱水剂，在室温下进行脱水，每个浓度下脱水20min，然后使用体积浓度为100％的乙醇脱水剂，在室温下进行三次脱水，每次脱水20min；
步骤四、置换乙醇及干燥：
按照乙醇与叔丁醇的体积浓度比为1:1，向盛有脱水后的样品试管中加入不同体积浓度的叔丁醇及纯叔丁醇进行置换乙醇，本实施例中，每个浓度置换10min，加入纯叔丁醇3次，每次置换10min，然后于4℃下凝固后，置于叔丁醇专用的冷冻干燥机上进行冷冻干燥直至将叔丁醇全部除去；
步骤五、树脂铸型：
用干净的吸管吸取样品所吸水分重量的2倍的含2wt％的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液，沿试管壁加入到放有样品的试管中，加入时不能接触液面以上的样品，封盖，垂直放入60℃的干燥箱中，聚合4d；其中，样品所吸水分重量为泥炭藓干重与吸水比重(倍)的乘积，吸水比重(倍)＝(泥炭藓的湿重-泥炭藓的干重)/泥炭藓的干重，泥炭藓的干重为选取与所用泥炭藓相同组的泥炭藓5份，50℃下烘干称重，得到，泥炭藓的湿重为将所用泥炭藓样品装入滤网后，放入装有纯水的容器中，在不滴水时，称重得到；
步骤六、软化：
待干燥箱中的试管无液体试剂之后，打开试管，将覆盖在样品的外层树脂销掉，向试管中加入体积配比为1:1的冰乙酸和双氧水的混合液至完全浸泡样品，重新封盖，软化24h；
步骤七、腐蚀及清洗：
打开试管盖，把试管中的剩余液体用吸管吸干净，晾干后，在冷水浴中，加入98％浓硫酸进行腐蚀1d后开盖，重复2次；用蒸馏水反复清洗残渣，清洗干净后在无水酒精中浸泡2min后捞出；
步骤八、干燥：
将样品置于干燥箱于60℃干燥4h；
步骤九、镀金及观察：
用碳导电胶带将步骤八干燥后的样品粘贴在扫描电镜的样品台上，保证观察面朝上，用离子溅射仪在样品表面镀金，然后在扫描电镜下进行观察。
参照图1，从图1可以观察到通过本发明方法制成的新鲜泥炭藓叶片的透明细胞(宽)和绿色细胞(细)。
本实施方案制备所得泥炭藓扫描电镜样品，用JSM-6510LV扫描电镜观察，参数为：信号模式为二次电子；加速电压为20KV；工作距离为16mm；放大倍数为400倍。
实施例2
一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：
选取干燥过的泥炭藓叶片作为样品，放于与其高度接近的带盖试管中；
步骤二、树脂铸型：
用干净的吸管吸取样品所吸水分重量的2倍的含1wt％的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液，沿试管壁加入到放有样品的试管中，加入时不能接触液面以上的样品，封盖，垂直放入60℃的干燥箱中，聚合4d；其中，样品所吸水分重量为泥炭藓干重与吸水比重(倍)的乘积，吸水比重(倍)＝(泥炭藓的湿重-泥炭藓的干重)/泥炭藓的干重，泥炭藓的干重为选取与所用泥炭藓相同组的泥炭藓5份，50℃下烘干称重，得到，泥炭藓的湿重为将所用泥炭藓样品装入滤网后，放入装有纯水的容器中，在不滴水时，称重得到；
步骤三、软化：
待干燥箱中的试管无液体试剂之后，打开试管，将覆盖在样品的外层树脂销掉，向试管中加入体积配比为1:1的冰乙酸和双氧水的混合液至完全浸泡样品，重新封盖，软化32h；
步骤四、腐蚀及清洗：
打开试管盖，把试管中的剩余液体用吸管吸干净，晾干后，在冷水浴中，加入98％浓硫酸进行腐蚀1d后开盖，重复2次；用蒸馏水反复清洗残渣，清洗干净后在无水酒精中浸泡2min后捞出；
步骤五、干燥：
将样品置于干燥箱于60℃干燥4h；
步骤六、镀金及观察：
将样品的需要观察的面朝上，用碳导电胶带粘贴在扫描电镜样品台后，在离子溅射仪下镀金，最后在扫描电镜下观察。
参照图2，从图2可以观察到通过本发明方法制成的干燥过的泥炭藓叶片的透明细胞(宽)和绿色细胞(细)。
本实施方案制备所得泥炭藓扫描电镜样品，用JSM-6510LV扫描电镜观察，参数为：信号模式为二次电子；加速电压为20KV；工作距离为19mm；放大倍数为700倍。
实施例3
一种制备扫描电镜用泥炭藓的铸型方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：
选取干燥过的泥炭藓茎作为样品，放入与其高度接近的带盖试管中；
步骤二、树脂铸型：
用干净的吸管吸取样品所吸水分重量的1倍的含1wt％的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液，沿试管壁加入到放有样品的试管中，加入时不能接触液面以上的样品，封盖，垂直放入60℃的干燥箱中，聚合4d；其中，样品所吸水分重量为泥炭藓干重与吸水比重(倍)的乘积，吸水比重(倍)＝(泥炭藓的湿重-泥炭藓的干重)/泥炭藓的干重，泥炭藓的干重为选取与所用泥炭藓相同组的泥炭藓5份，50℃下烘干称重，得到，泥炭藓的湿重为将所用泥炭藓样品装入滤网后，放入装有纯水的容器中，在不滴水时，称重得到；
步骤三、软化：
待干燥箱中的试管无液体试剂之后，打开试管，将覆盖在样品的外层树脂销掉，向试管中加入体积配比为1:1的冰乙酸和双氧水的混合液至完全浸泡样品，重新封盖，软化24h；
步骤四、腐蚀及清洗：
打开试管盖，把试管中的剩余液体用吸管吸干净，晾干后，在冷水浴中，加入98％浓硫酸进行腐蚀1d后开盖，重复2次；用蒸馏水反复清洗残渣，清洗干净后在无水酒精中浸泡2min后捞出；
步骤五、干燥：
将样品置于干燥箱于60℃干燥5h；
步骤六、镀金及观察：
用碳导电胶带将步骤八干燥后的样品粘贴在扫描电镜的样品台上，保证观察面朝上，用离子溅射仪在样品表面镀金，然后在扫描电镜下进行观察。
参照图3-5，可以观察到通过本发明方法制成的干燥过的泥炭藓茎的不同层的细胞的形貌。
本实施例制备所得泥炭藓扫描电镜样品，用JSM-6510LV扫描电镜观察，参数为：信号模式为二次电子；加速电压为20KV；工作距离为16mm、14mm和21mm；放大倍数为500倍、500倍和300倍。
本发明方法简单容易操作，制备得到的泥炭藓的内部结构(叶子、茎)均得到了很好的呈现，变形小，成功率高，技术成本低，可应用于苔藓植物及可以向上吸收树脂的植物材料。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于， 包括以下步骤：
步骤一、取材：
选取泥炭藓作为样品放入试管中；
步骤二、固定：
向试管中加入 2.5v%戊二醛固定液固定样品；
步骤三、漂洗及脱水：
向固定后的样品试管中加入pH 为 6.8 的 0.1mol/L 磷酸缓冲液， 并反复更换磷酸缓冲液进行漂洗，然后向试管中加入不同体积浓度的乙醇逐级梯度脱水；
步骤四、置换及干燥：
向盛有脱水后的样品试管中加入不同体积浓度的叔丁醇来脱乙醇，然后进行冷冻干燥，直至将叔丁醇全部除去；
步骤五、树脂铸型：
向盛有冷冻干燥后的样品试管中加入含1%-2%wt的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液，加入的含1%-2%wt的过氧化苯甲酰的苯乙烯溶液的重量为样品所吸水分重量的1-2倍，所述样品所吸水分重量为泥炭藓干重与吸水比重的乘积，其中，吸水比重=（泥炭藓的湿重-泥炭藓的干重)/泥炭藓的干重，泥炭藓的干重为将选取与所用泥炭藓相同组的泥炭藓烘干，称重得到，泥炭藓的湿重为将所用泥炭藓样品装入滤网后， 放入装有纯水的容器中，在不滴水时，称重得到，并置于60℃下聚合3-4d；
步骤六，软化：
向盛有聚合完成后的样品试管中加入体积配比为1:1的冰乙酸与双氧水的混合液，于50℃下软化1-2d；
步骤七，腐蚀及清洗：
将盛有软化后的样品试管置于冷水浴中，并向其中加入98%浓硫酸，然后静置1-2d后，用蒸馏水反复清洗；
步骤八、干燥：
取出试管中的样品，置于 60℃下干燥 4-6h；
步骤九、镀金及观察：
用碳导电胶带将步骤八干燥后的样品粘贴在扫描电镜的样品台上，保证观察面朝上，用离子溅射仪在样品表面镀金，然后在扫描电镜下进行观察。
2.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，步骤一中，所述试管的长度与所述样品的高度接近。
3.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，步骤二中，所述固定时间为 4-6h。
4.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，步骤三中，先逐级使用体积浓度为 50%、70%、80%、90%的乙醇进行脱水，然后使用体积浓度为100%的乙醇进行三次脱水。
5.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，步骤六中，加入的体积配比为 1:1 的冰乙酸与双氧水的混合液应完全浸泡试管中的样品。
6.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，步骤七中，在冷水浴中，加入 98%浓硫酸腐蚀 1-2d， 重复 2-3 次，用蒸馏水反复清洗，清洗干净后放在无水酒精中浸泡， 捞出。
7.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，作为样品的所述泥炭藓为新鲜泥炭藓叶片或者茎。
8.根据权利要求 1 所述的制备扫描电镜用泥炭藓样品的铸型方法，其特征在于，作为样品的所述泥炭藓为干燥过的泥炭藓叶片或者干燥过的泥炭藓茎，当干燥过的泥炭藓叶片或者干燥过的泥炭藓茎作为样品时，步骤二至步骤四省略，其他步骤条件保持不变。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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