CN107805625A - 一种石墨烯培养基底及其制备方法和在多能干细胞培育、分化及移植方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石墨烯培养基底及其制备方法和在多能干细胞培育、分化及移植方面的应用，基底由下至上依次为支持层、石墨烯层和PMMA层，支持层为柔性膜材料或生物贴膜。石墨烯培养基底是生物医学工程应用于再生医学领域的产物。该石墨烯培养基底的大小可根据实际需要进行调整。通过其培养分化获得的成熟心肌，可以用于药物检测开发，疾病模型研究，还可用于临床心脏疾病治疗，例如将带有成熟心肌的石墨烯补片应用于心衰患者的移植治疗以及心律失常的再同步化治疗。该发明开拓了石墨烯在生物材料方面的应用前景，对于细胞培养和疾病治疗方面具有重要意义。

Description

一种石墨烯培养基底及其制备方法和在多能干细胞培育、分 化及移植方面的应用
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种新材料的培养基地，该系统可以用于人类多能干细胞的培养及分化，促进再生心肌细胞的传导及成熟，提供成熟的心肌用于药筛或研究，也可将其用作移植用的再生心脏创可贴补片(Regenerative CardiacPatch)。
背景技术
人类多能干细胞由于其自我更新与不断增殖的能力，加之在特定的因素下分化为特定细胞系的潜能，备受世人瞩目。干细胞分化的心肌组织是再生医学的热点，但目前体外分化的心肌细胞存在肌丝结构紊乱、钙瞬变不成熟、缺乏T小梁结构、心肌细胞之间传导缓慢等问题，动物体内移植试验显示出了潜在的致心律失常作用。心脏肌肉是电活性组织，能够传递电信号，使心脏同步跳动。基于这方面的知识，亟需开发新型的生物电学材料，以此作为培养支撑物进行干细胞的培养和分化，来提高再生心肌细胞的传导性和成熟度。
发明内容
本发明的目的是结合材料学最新进展，应用具有高载流子迁移率，同时结构稳定且具有良好生物兼容性的石墨烯材料，开发一种新的生物培养基底，用于提高再生心脏的传导和成熟度，并提供上述基底的制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于多能干细胞培育、分化及移植的石墨烯培养基底，所述基底由下至上依次为支持层、石墨烯层和PMMA层。
进一步的，支持层为柔性膜材料或生物贴膜。
进一步的，柔性膜材料为聚酰亚胺膜、聚酰胺医用柔性膜、聚乳酸柔性膜、聚乳酸和聚乙二酸共聚膜。
一种石墨烯培养基底的制备方法，包括以下步骤：
(1)在石英管内先通氢气，对铜基底进行热处理，然后通甲烷，在铜基底上利用化学气相沉积法制备石墨烯薄膜，生长结束后关闭甲烷，自然冷却至室温，关闭氢气，放气，待石英管内外气压相等，取出石墨烯/Cu；
(2)利用匀胶机在石墨烯/Cu表面旋涂浓度为2％～10％的PMMA，并将样品放置于过硫酸铵溶液中腐蚀去除Cu；
(3)将PMMA/石墨烯转移至干净的支持层上，用低流量氮气枪缓慢吹干去除表面水分，之后自然晾0.5～10h将水分全部除去，得到石墨烯培养基底。
一种石墨烯培养基底在诱导多能干细胞培育、分化方面的应用。
进一步的，石墨烯培养基底用75％酒精消毒/或紫外线消毒5～30分钟，PBS冲洗后，涂上Matrigel/Vitronectin/Gelatin涂层，然后进行多能干细胞培育及分化。
一种石墨烯培养基底在诱导多能干细胞再生的心脏细胞在种植及移植治疗方面的应用。
进一步的，石墨烯培养基底用75％酒精消毒/或紫外线消毒5～30分钟，PBS冲洗后，涂上Matrigel/Vitronectin/Gelatin涂层，然后进行心脏细胞的移植。
石墨烯培养基底作为基底，支撑促进多能干细胞培养、分化及移植；具体是将石墨烯培养基底浸没于陈放在器皿里的心肌营养液中。
成熟再生心肌采用以下步骤获得：在石墨烯培养支撑物上添加Matrigel涂层，接种多能干细胞，每日更换溶液。进而利用小分子化合物CHIR-99021和IWR-1诱导心肌分化，分化完成后使用心肌培养液，在石墨烯基底上持续培养。
石墨烯衬底用于与细胞直接接触，其中人类多能干细胞诱导分化心肌细胞时，细胞自身的电活动，引起材料中电子分布的变化，电信号在极短时间内会扩散到周围的细胞，从而导致周围细胞膜电位到达阈值，引发动作电位并引起跳动，最终实现所有细胞协同跳动并提高心肌成熟度。
支持物的材质包括柔性膜材料或生物贴膜等，用于石墨烯衬底的固定，以及再生心肌细胞的支持，该支持物无色透明，有利于培养过程中的观察和染色，带有生物贴膜材质的基底还可直接用于移植治疗。
器皿用于承载再生心肌细胞，其内可以承载可以浸没再生心肌细胞的心肌营养液，即器皿的外周壁高于再生人工心肌细胞的水平面。
石墨烯培养基底是生物医学工程应用于再生医学领域的产物。该石墨烯培养基底的大小可根据实际需要进行调整。通过其培养分化获得的成熟心肌，可以用于药物检测开发，疾病模型研究，还可用于临床科研，例如将带有成熟心肌的石墨烯补片应用于心衰患者的移植治疗。该发明开拓了石墨烯在生物材料方面的应用前景，对于细胞培养和疾病治疗方面具有重要意义。
附图说明
图1是石墨烯基底制作及使用的示意图。
图2是石墨烯培养基底的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图3是石墨烯培养基底上的多能干细胞分化获得的心肌细胞的实物图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
如图1是石墨烯基底制作及使用的示意图：
1.在石英管内先通氢气，对铜基底进行热处理，然后通甲烷，在铜基底上利用化学气相沉积法制备石墨烯薄膜。
2.生长结束后关闭甲烷，自然冷却至室温，关闭氢气，放气，待石英管内外气压相等，取出样品石墨烯/Cu。
3.利用匀胶机在石墨烯/Cu表面旋涂浓度为4％的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)。并将样品放置于过硫酸铵溶液中腐蚀去除Cu。
4.将PMMA/石墨烯转移至干净的聚酰亚胺膜上，用低流量氮气枪缓慢吹干去除表面水分，之后自然晾两个小时左右以将水分全部除去得到石墨烯培养基底。
5.将石墨烯培养基底用75％酒精消毒，PBS冲洗后，涂上Matrigel涂层，接种多能干细胞，每日更换溶液。
6.细胞分化：利用小分子化合物CHIR-99021和IWR-1诱导心肌分化，分化完成后更换心肌培养液，持续在培养支持物上培养，获得成熟的心肌。
图2是制得石墨烯培养基底的扫描电子显微镜(SEM)图像，图3是石墨烯培养基底上的多能干细胞分化获得的心肌细胞的实物图。
以上所述，仅是本发明基于玻片支持物较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式的限制。凡是依据本发明的技术和方法实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术和方法方案的范围内。

Claims (8)

1.一种用于多能干细胞培育、分化及移植的石墨烯培养基底，其特征在于：所述基底由下至上依次为支持层、石墨烯层和PMMA层。
2.根据权利要求1所述的石墨烯培养基底，其特征在于：所述支持层为柔性膜材料或生物贴膜。
3.根据权利要求2所述的石墨烯培养基底，其特征在于：所述柔性膜材料为聚酰亚胺膜、聚酰胺医用柔性膜、聚乳酸柔性膜、聚乳酸和聚乙二酸共聚膜。
4.一种根据权利要求1至3任一所述石墨烯培养基底的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在石英管内先通氢气，对铜基底进行热处理，然后通甲烷，在铜基底上利用化学气相沉积法制备石墨烯薄膜，生长结束后关闭甲烷，自然冷却至室温，关闭氢气，放气，待石英管内外气压相等，取出石墨烯/Cu；
(2)利用匀胶机在石墨烯/Cu表面旋涂浓度为2％～10％的PMMA，并将样品放置于过硫酸铵溶液中腐蚀去除Cu；
(3)将PMMA/石墨烯转移至干净的支持层上，用低流量氮气枪缓慢吹干去除表面水分，之后自然晾0.5～10h将水分全部除去，得到石墨烯培养基底。
5.一种根据权利要求1至3任一所述石墨烯培养基底在诱导多能干细胞培育、分化方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述石墨烯培养基底用75％酒精消毒/或紫外线消毒5～30分钟，PBS冲洗后，涂上Matrigel/Vitronectin/Gelatin涂层，然后进行多能干细胞培育及分化。
7.一种根据权利要求1至3任一所述石墨烯培养基底在诱导多能干细胞再生的心脏细胞在种植及移植治疗方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述石墨烯培养基底用75％酒精消毒/或紫外线消毒5～30分钟，PBS冲洗后，涂上Matrigel/Vitronectin/Gelatin涂层，然后进行心脏细胞的移植。
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