CN108486034A - 耐高温温敏型细胞培养介质材料及其制备方法 - Google Patents

耐高温温敏型细胞培养介质材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明耐高温温敏型细胞培养介质材料，其组分及浓度范围为：温敏性聚合物单体N‑异丙基丙烯酰胺10～20w/v%；生物相容性单体甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕0.9～2.7w/v%；交联剂八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷1～3w/v%；光引发剂0.4 w/v%；溶剂为1，4‑二氧六环。本发明的制备方法含有以下步骤：⑴称取组分制备预聚液；⑵注入模具、紫外灯下形成凝胶；⑶凝胶在溶剂中溶胀，去除未反应的单体和交联剂；（4）凝胶在磷酸盐缓冲溶液中溶胀以置换溶剂，获得目标材料。本发明制备的温敏型水凝胶材料具有较好的稳定性、生物相容性、机械强度和韧性，可经受高温灭菌，支持贴壁细胞贴附和扩增，通过改变温度能实现细胞的智能收获。

Description

耐高温温敏型细胞培养介质材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及功能高分子材料技术领域，涉及温敏水凝胶材料的制备方法，具体的涉及耐高温温敏型细胞培养介质材料——八甲基丙烯酸酯基倍半硅氧烷-N-异丙基丙烯酰胺（POSS-PNIPAM）水凝胶材料及其制备方法。
背景技术
传统的贴壁细胞培养时，当细胞进行传代或收获时，通常需要用胰酶对细胞进行消化，而酶消化会在一定程度上破坏细胞膜蛋白，影响细胞的活性。特别是当细胞作为产品时，胰酶消化的影响将会影响细胞最终的质量，所以，采用细胞贴附性能可控的智能材料培养细胞成为一种趋势。
目前，可调控细胞贴附性能的智能型响应材料主要有pH响应材料、光响应材料、电势响应材料以及温度响应材料。所述pH响应材料（聚合物）的主要特征是：当pH发生变化时，聚合物材料的相分离、溶解性和溶胀行为会发生改变，从而影响细胞在材料表面的贴附；因为在细胞培养过程中，细胞生长在材料表面，pH的大幅度变化会对细胞产生不可逆转的损伤。所述光响应材料的主要特征是：材料经紫外光照射后会迅速发生降解，使细胞与材料分离，可在几分钟内收获细胞。但是，紫外光照射会降低细胞活性、甚至导致细胞变异，因此，所述光响应材料难以用于细胞产品的制备。所述电势响应材料不仅制备方法非常复杂、成本高以及操作难度大，而且电压与细胞膜收缩之间的关系尚未明确。因此，电势响应材料目前还处在研究阶段，离实际应用还比较遥远。所述温度响应材料是指材料的某些特性会随温度的变化而改变，使得细胞在材料表面的贴附性能发生变化，从而使贴附在材料表面的细胞自动脱落。由于在一定的范围内，温度的变化对细胞的影响较小，因此，温度响应材料是一种有应用潜力的细胞培养介质。目前研究最多的温度响应材料是基于N-异丙基丙烯酰胺的水凝胶。但是，由于该材料生物相容性和力学性能欠佳，而材料的力学性能对贴壁细胞的生长有很大的影响，如对贴壁细胞在材料上的贴壁、生长和分化的影响。此外，细胞培养需要严格的无菌环境，很多水凝胶类材料无法耐受高温灭菌，使得其应用价值降低。可见，现有的温度响应材料离实际应用尚有不小的差距。
有研究表明：N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）是温敏性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的单体，具有温度响应性。甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA）是乙二醇的寡聚体，其具有良好的生物相容性、亲水性以及一定的温敏性。八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS）是一类具有独特笼形结构并具有八臂甲基丙烯酸甲酯基的有机-无机纳米化合物，能提高材料的热稳定性、力学性能以及疏水性，提高材料的刚性和表面粗糙度。我们在现有研究的基础上能否开发更好的智能型响应材料呢。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足并在现有研究成果的基础上，提供耐高温温敏型细胞培养介质材料，它以N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA）为单体、八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS）为交联剂制备温敏型水凝胶材料，使材料的力学性能得以增强，提高细胞在材料表面的贴附力。由于该温敏型水凝胶材料在高温下疏水，使得其在高温条件下具有类似硬塑料的状态，在高温灭菌后该温敏型水凝胶材料不会发生降解且形态保持稳定；降温后又可恢复到水凝胶状态，可作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。本发明的再一目的是，提供所述细胞培养介质材料的制备方法，使之能有效地制取所述的细胞培养介质材料。本发明制备的细胞培养介质材料具有良好力学性能、生物相容性以及温度响应性，可用于间充质干细胞等贴壁类细胞的培养。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
耐高温温敏型细胞培养介质材料，其特征在于，其组分及组分的浓度范围为：
温敏性聚合物单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）：浓度范围为10w/v%～20w/v%；
生物相容性单体甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA）：浓度范围为0.9w/v%～2.7w/v%；
交联剂八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS）：浓度范围为1w/v%～3w/v%
光引发剂Irgacure 2959：浓度为0.4w/v%；
溶剂为1，4–二氧六环。
为实现上述第二个目的，本发明采取了以下技术方案。
所述耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入100～200 mg的N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为10w/v%～20w/v%；加入9～27mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为0.9w/v%～2.7w/v%；加入10～30mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为1w/v%～3w/v%；加入4mg的Irgacure 2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；
（2）将步骤（1）获得的预聚液注入聚四氟乙烯模具中，用表面洁净的盖玻片进行液封，在功率为8mW/cm2的紫外灯（365nm）下照射30分钟使其形成凝胶；
（3）将步骤（2）获得的凝胶从模具中取出，转移到1，4–二氧六环中溶胀2～3天，期间多次更换溶剂1，4–二氧六环，去除未反应的单体和交联剂；
（4）将去除了未反应单体和交联剂的凝胶转移至磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，用水替换凝胶网络中的1，4–二氧六环，获得温敏型水凝胶材料；所述温敏水凝胶材料经过酒精灭菌和高温灭菌（121℃、30分钟）都不发生降解，能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
进一步，步骤（1）所述的N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）的浓度为10w/v%～20w/v%。
进一步，步骤（1）所述的甲基丙烯酸〔寡（乙二醇）〕（OEGMA）的浓度为0.9w/v%～2.7w/v%。
进一步，步骤（1）所述的八甲基丙烯酸酯基倍半硅氧烷（OMAPOSS）的浓度为1w/v%～3w/v%。
进一步，步骤（1）所述的Irgacure 2959的浓度为0.4w/v%。
本发明的积极效果是：
（1）将八甲基丙烯酸酯基倍半硅氧烷（OMAPOSS）以交联剂的形式引入了PNIPAM型温敏水凝胶中，而OMAPOSS是一种八官能度的有机-无机杂化分子，在很大程度上提高了温敏水凝胶材料的力学性能。
（2）采用紫外光交联制取水凝胶，制备方法简单。
（3）制取的温敏型水凝胶材料具有较好的稳定性、生物相容性、机械强度和韧性，能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料，支持贴壁细胞的贴附和扩增，通过改变温度能实现细胞的智能收获。
附图说明
图1为实施例1制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图2为不同温度下，贴附在用实施例1制取的温敏型水凝胶材料上的海拉细胞形态的荧光染色图（a：37℃；b：4℃）。
图3为用实施例1制取的温敏型水凝胶材料培养海拉细胞时的细胞贴附率、扩增倍数、细胞收获率和细胞活性显示图。
图4为实施例2制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图5为不同温度下，贴附在用实施例2制取的温敏型水凝胶材料上的海拉细胞形态的荧光染色图（a：37℃；b：4℃）。
图6为用实施例2制取的温敏型水凝胶材料培养海拉细胞时的细胞贴附率、扩增倍数、细胞收获率和细胞活性显示图。
图7为实施例3制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图8为不同温度下，贴附在用实施例3制取的温敏型水凝胶材料上的海拉细胞形态的荧光染色图（a：37℃；b：20℃）。
图9为用实施例3制取的温敏型水凝胶材料培养海拉细胞时的细胞贴附率、扩增倍数、细胞收获率和细胞活性显示图。
图10为实施例4制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图11为不同温度下，贴附在用实施例4制取的温敏型水凝胶材料上的海拉细胞形态的荧光染色图（a：37℃；b：20℃）。
图12为用实施例4制取的温敏型水凝胶材料培养海拉细胞时的细胞贴附率、扩增倍数、细胞收获率和细胞活性显示图。
图13为实施例5制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图14为不同温度下，贴附在用实施例5制取的温敏型水凝胶材料上的人羊膜间充质干细胞形态的荧光染色图（a：37℃；b：20℃）。
图15为用实施例5制取的温敏型水凝胶材料培养人羊膜间充质干细胞时的细胞贴附率、扩增倍数、细胞收获率和细胞活性显示图。
图16为实施例6制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图17为不同温度下，贴附在用实施例6制取的温敏型水凝胶材料上的人羊膜间充质干细胞形态的荧光染色图（a：37℃；b：20℃）。
图18为用实施例6制取的温敏型水凝胶材料培养人羊膜间充质干细胞时的细胞贴附率、扩增倍数、细胞收获率和细胞活性显示图。
图19为实施例7制取的温敏型水凝胶材料在不同温度下的实物图（a：37℃；b：20℃）。
图20为实施例7制取的温敏型水凝胶材料在酒精灭菌或高压蒸汽灭菌后的实物图（a：酒精灭菌；b：一次高温灭菌；c：三次高温灭菌）。
图21为用实施例7制取的温敏型水凝胶材料培养海拉细胞时的细胞贴附率示意图。
图22为用实施例7制取的温敏型水凝胶材料培养海拉细胞时的细胞扩增倍数示意图。
图23为本发明耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法的流程框图。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明耐高温温敏型细胞培养介质材料及其制备方法的具体实施方式，提供7个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤（参见图23）：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入100mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为10w/v%；加入18mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为1.8w/v%；加入20mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为2w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）用移液枪吸取步骤（1）获得的预聚液注入聚四氟乙烯模具中，用表面洁净的盖玻片液封；将聚四氟乙烯模具转移到紫外灯下，用功率为8mW/cm2的紫外光照射30分钟以形成凝胶。
（3）将步骤（2）获得的凝胶从模具中取出，在1，4-二氧六环中浸泡数次，期间多次更换溶剂1，4 –二氧六环，去除未反应的单体和交联剂；之后，将去除了未反应单体和交联剂的凝胶转移到磷酸盐缓冲溶液中（PBS）中，用水替换凝胶网络中的1，4 –二氧六环，获得温敏水凝胶材料（参见图1）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例1制取的温敏型水凝胶材料用于培养和收获海拉细胞
（1）将温敏型水凝胶材料用75%的医用酒精浸泡6小时充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）润洗3次；然后将温敏型水凝胶材料转移到37℃的基础培养基（RPMI1640）中溶胀12小时，将溶胀后的温敏型水凝胶材料置于48孔细胞培养板的培养孔底部。
（2）将海拉细胞（Hela）以1.25×104个细胞/厘米2的密度接种到所述铺有温敏型水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔RPMI1640+10%胎牛血清（v/v）〕,置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养三天，在培养的第二天更换培养基。细胞帖附在所述温敏型水凝胶材料上的细胞形态荧光染色图参见图2（a）（标尺=200μm）。
（3）海拉细胞贴附在温敏型水凝胶上于培养基中培养到第三天时，将48孔细胞培养板中的温敏型水凝胶材料转移到温度为4℃的新鲜RPMI1640培养基中进行降温收获；持续降温处理40分钟后，在所述温敏水凝胶材料上残留的海拉细胞形态的荧光染色图参见图2（b）（标尺=200μm）。
（4）收集上述处理后上清液中的细胞，收获细胞的活性通过台盼蓝染色进行评价，并计算收获率。
（5）接种12小时后海拉细胞在所述温敏型水凝胶材料上的贴附率、培养第三天时收获细胞的活性、收获率、细胞扩增倍数如图3所示。
实施例2
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入100mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为10w/v%；加入27mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为2.7w/v%；加入30mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为3w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）（同实施例1）。
（3）（同实施例1），获得温敏水凝胶材料（参见图4）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例2制取的温敏型水凝胶材料用于培养和收获海拉细胞
（1）（同实施例1），将实施例2制取的温敏水凝胶材料灭菌后，铺在48孔细胞培养板中的培养孔底部。（以下同实施例1）
（2）（同实施例1），海拉细胞帖附在所述温敏型水凝胶材料上的细胞形态荧光染色图参见图5（a）（标尺=200μm）。
（3）（同实施例1），培养到第三天时进行降温收获后，所述温敏型水凝胶材料上残留的海拉细胞形态的荧光染色图参见图5（b）（标尺=200μm）。
（4）（同实施例1），接种12小时后海拉细胞在所述温敏型水凝胶材料上的贴附率、培养第三天时收获细胞的活性、收获率、细胞扩增倍数如图6所示。
实施例3
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入135mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为13.5w/v%；加入18mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为1.8w/v%；加入10mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为1w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）（同实施例1）。
（3）（同实施例1），获得温敏型水凝胶材料（参见图7）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例3制取的温敏水凝胶材料用于培养和收获海拉细胞
（1）将实施例3制取的温敏水凝胶材料灭菌后，铺在48孔细胞培养板中的培养孔底部，（以下同实施例1）。
（2）（同实施例1），海拉细胞帖附在所述温敏型水凝胶材料上的细胞形态荧光染色图参见图8（a）（标尺=200μm）。
（3）（同实施例1），培养到第三天时进行降温收获后，所述温敏型水凝胶材料上残留的海拉细胞形态的荧光染色图参见图8（b）（标尺=200μm）。
（4）（同实施例1），接种12小时后海拉细胞在所述温敏型水凝胶材料上的贴附率、培养第三天时收获细胞的活性、收获率、细胞扩增倍数如图9所示。
实施例4
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入200mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为20w/v%；加入27mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为2.7w/v%；加入10mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为1w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）（同实施例1）。
（3）（同实施例1），获得温敏型水凝胶材料（参见图10）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例4制取的温敏型水凝胶材料用于培养和收获海拉细胞
（1）将实施例4制取的温敏水凝胶材料灭菌后，铺在48孔细胞培养板中的培养孔底部，（以下同实施例1）。
（2）（同实施例1），海拉细胞帖附在所述温敏型水凝胶材料上的细胞形态荧光染色参见图11（a）（标尺=200μm）。
（3）（同实施例1），细胞在材料上培养到第三天时进行降温收获，述温敏型水凝胶材料上残留的海拉细胞形态的荧光染色图参见图11（b）（标尺=200μm）。
（4）（同实施例1），接种12小时后海拉细胞在所述温敏型水凝胶材料上的贴附率、培养第三天时收获细胞的活性、收获率、细胞扩增倍数如图12所示
实施例5
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入200mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为20w/v%；加入18mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为1.8w/v%；加入20mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为2w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）（同实施例1）。
（3）（同实施例1），获得温敏水凝胶材料（参见图13）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例5制取的温敏型水凝胶材料用于培养和收获人羊膜间充质干细胞
（1）（同实施例1），将实施例4制取的温敏型水凝胶材料灭菌后，铺在48孔细胞培养板中的培养孔底部。
（2）将人羊膜间充质干细胞以2.5×104个细胞/厘米2的密度接种到所述铺有温敏型水凝胶材料的48孔细胞培养板中，加入500μL含血清的基础培养基〔α-MEM+10%胎牛血清（v/v）〕，置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养四天，在培养的第二天应更换培养基。
（3）培养到第四天时，在所述温敏型水凝胶材料上贴附的人羊膜间充质干细胞形态的荧光染色图如图14（a）所示（标尺=100μm）。
（4）人羊膜间充质干细胞贴附在温敏型水凝胶上于培养基中培养到第四天时，将48孔细胞培养板中的温敏型水凝胶材料转移到4℃的新鲜的α-MEM培养基中进行降温收获，持续降温处理40分钟后，在所述温敏型水凝胶材料上残留的人羊膜间充质干细胞形态的荧光染色图参见图14（b）（标尺=100μm）。
（5）收集上清液中的细胞，收获细胞的活性通过台盼蓝染色进行评价，并计算收获率。接种12小时后人羊膜间充质干细胞在所述温敏型水凝胶材料上的贴附率、培养第四天时收获细胞的活性、收获率、细胞扩增倍数如图15所示。
实施例6
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入135mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为13.5w/v%；加入9mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为0.9w/v%；加入30mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为3w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）（同实施例1）。
（3）（同实施例1），获得温敏型水凝胶材料（参见图16）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例6制取的温敏型水凝胶材料用于培养和收获人羊膜间充质干细胞
（1）将实施例4制取的温敏水凝胶材料灭菌后，铺在48孔细胞培养板中的培养孔底部，（以下同实施例5）。
（2）（同实施例5），在所述温敏型水凝胶材料上贴附的人羊膜间充质干细胞细胞形态的荧光染色图如图17(a)所示（标尺=100μm）。
（3）（同实施例5），细胞在材料上培养到第四天时进行降温收获，在所述温敏型水凝胶材料上残留的人羊膜间充质干细胞细胞形态的荧光染色参见图17（b）（标尺=100μm）。
（4）（同实施例5），接种12小时后人羊膜间充质干细胞在所述温敏型水凝胶材料上的贴附率、培养第四天时收获细胞的活性、收获率、细胞扩增倍数如图18所示。
实施例7
（一）一种耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入135mg N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为13.5w/v%；加入18mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为1.8w/v%；加入30mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为3w/v%；加入4mg的Irgacure2959，使其浓度为0.4w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液。
（2）（同实施例1）。
（3）（同实施例1），获得温敏型水凝胶材料（参见图19）。所述温敏型水凝胶材料能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
（二）将实施例7制取的温敏型水凝胶材料用于培养和收获海拉细胞
（1）将温敏型水凝胶材料分别用75%医用酒精灭菌（浸泡6小时）、一次高温灭菌（121℃，持续30分钟）或连续三次高温灭菌后用无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）润洗3次（图20所示的a、b、c分别是酒精灭菌、一次高温灭菌及连续三次高温灭菌并经PBS润洗3次后的温敏型水凝胶材料的实物图）；然后将所述温敏型水凝胶材料转移到37℃的基础培养基（a-MEM）中溶胀12小时，将溶胀后的温敏水凝胶材料转移到48孔细胞培养板中的培养孔底部。
（2）将海拉细胞以1.25×104细胞/厘米2的密度接种到所述酒精灭菌或高温灭菌后的温敏型水凝胶材料上，加入500μL含血清的基础培养基〔RPMI1640+10%胎牛血清（v/v）〕，置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养三天，在培养的第二天更换培养基。海拉细胞接种12小时后的细胞贴附率和培养三天后的细胞扩增倍数如图21、22所示。
以上只是本发明的较佳实施例，它们并非是对本发明实施方式的限制。对于本领域的普通研究人员而言，在上述发明内容和实施例的基础上还可以做出相关的变化或变动，但是，这些相关的变化或变动应仍属于本发明的保护范围之中。

Claims (6)

1.一类耐高温温敏型细胞培养介质材料，其特征在于，其组分及组分的浓度范围为：
温敏性聚合物单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）：浓度范围为10w/v%～20w/v%；
生物相容性单体甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA）：浓度范围为0.9w/v%～2.7w/v%；
交联剂八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS）：浓度范围为1w/v%～3w/v%；
光引发剂Irgacure 2959：浓度为0.4w/v%；
溶剂为1，4–二氧六环。
2.如权利要求1所述的耐高温温敏型细胞培养介质材料的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）在1mL的1，4–二氧六环溶剂中，加入100～200mg的N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM），使其浓度为10w/v%～20w/v%；加入9～27mg的甲基丙烯酸〔寡聚（乙二醇）〕（OEGMA），使其浓度为0.9w/v%～2.7w/v%；加入10～30mg的八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷（OMAPOSS），使其浓度为1 w/v%～3 w/v%；加入4mg的Irgacure 2959，使其浓度为0.4 w/v%，于 25℃的环境温度下搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；
（2）将步骤（1）获得的预聚液注入聚四氟乙烯模具中，用表面洁净的盖玻片进行液封，在功率为8mW/cm2的365nm的紫外灯下照射30分钟使其形成凝胶；
（3）将步骤（2）获得的凝胶从模具中取出，转移到1，4 –二氧六环中溶胀2～3天，期间多次更换溶剂1，4 –二氧六环，去除未反应的单体和交联剂；
（4）将去除了未反应单体和交联剂的凝胶转移至磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，用水替换凝胶网络中的1，4–二氧六环，获得温敏型水凝胶材料；所述温敏水凝胶材料经酒精灭菌和121℃、30分钟高温灭菌不发生降解，能作为耐高温温敏型细胞培养介质材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）的浓度为10 w/v%～20 w/v%。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的甲基丙烯酸〔寡（乙二醇）〕（OEGMA）的浓度为0.9 w/v%～2.7 w/v%。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的八甲基丙烯酸酯基倍半硅氧烷（OMAPOSS）的浓度为1 w/v%～3 w/v%。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的Irgacure 2959的浓度为0.4 w/v%。
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