CN1753696B - 再生角膜内皮细胞片、制造方法及其使用方法 - Google Patents

再生角膜内皮细胞片、制造方法及其使用方法 Download PDF

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Abstract

再生角膜内皮细胞片的制造方法，其特征是，在用0～80℃的温度范围内水合力变化的聚合物覆盖表面而成的细胞培养支持体上培养从组织采取的角膜内皮细胞，培养后，(1)将培养液温度调节成基材表面的聚合物水合的温度，(2)将所培养的角膜内皮细胞片紧密贴合在载体上，(3)将其连同载体一起剥离。利用上述方法得到的再生角膜内皮细胞片对活体组织的附着性极其良好。

Description

再生角膜内皮细胞片、制造方法及其使用方法
技术领域
本发明涉及生物学、医学等领域中的再生角膜内皮细胞片、制造方法及使用它们的治疗方法。
背景技术
角膜组织由5层构成：从外侧表面开始，依次为角膜上皮层、前弹力层(Bowman′s membrane)、角膜基质层、后弹力层(Descemet′s membrane)、角膜内皮层。最里侧的角膜内皮层对角膜组织成为内衬的形状，后弹力层相当于由角膜内皮层的粘着蛋白形成的基底膜。角膜内皮细胞的功能在于逆着角膜基质的膨润压力从基质一侧向前房一侧吸出水，这是由于使用Na-KATP酶的泵作用而产生的。人的角膜内皮细胞通常在活体内不会发生细胞分裂，变性、脱落的内皮细胞的部分通过残存的细胞发生肥大化、或者移动而被代偿。此时，若残存的角膜内皮细胞数量过少，则角膜内皮组织的泵功能已经变得不充分，角膜组织发生膨胀，引发角膜内皮损伤、大泡性角膜病变等疾病。作为对于这类疾病的治疗方法，可以举出使用治疗眼睛疼痛的软性隐形眼镜，或使用高渗食盐水的眼软膏或眼药水以从肿胀的角膜组织去除水分的方法等，但是这种方法只不过是对症疗法，还是期望能有根本性的治疗方法。
随着医疗技术的显著发展，近年来，用他人的器官替换难以治疗的器官的器官移植得到了普遍化。对上述的角膜内皮损伤、大泡性角膜病变等疾病，也已尝试利用全层角膜移植来根本性地治疗。但是，角膜捐献者人数远远少于患者人数，相对于仅国内每年需要角膜移植的患者就有约2万人，实际上能够进行移植治疗的患者只有其1/10，约2000人左右。现状是尽管已经有角膜移植这样的已被大致确立的技术，但由于角膜捐献不足的问题，所以寻求另一种医疗技术。
作为解决上述问题的手段，最近，在活体外人工培养得到必要的组织的再生医疗技术急速地发展。一直以来，这样的细胞培养是在玻璃表面上或在经过种种处理的合成聚合物的表面上进行的。例如，进行了如γ射线照射、硅酮涂布等表面处理的各种聚苯乙烯材质容器等作为细胞培养用容器得到普及。但是，上述角膜内皮细胞是一种难以在此类容器表面上高密度地增殖的细胞，所以希望有更好的培养方法。
另外，使用细胞培养用容器培养、增殖的细胞，通常用胰岛素之类的蛋白分解酶或用化学药品进行处理而从容器表面剥离、回收。但是，实施如上所述的化学药品处理来回收增殖的细胞时存在如下缺点：混入杂质的可能性大，以及增殖的细胞经过化学处理而转化或损伤、细胞原有的功能受损等。为了克服上述缺点，到目前为止已提出了若干技术方案。
日本专利特公平2-23191号公报中记载了可移植角蛋白组织的膜的制造方法，其特征为，在角蛋白组织的膜能够在容器表面上形成的条件下，在培养容器中培养源自人新生儿的角化表皮细胞，使用酶剥离角蛋白组织的膜。具体而言，公开了这样的技术：将3T 3细胞作为饲养层使其增殖、多层化，使用作为蛋白质分解酶的分散剂回收细胞片。但是，该公报中所记载的方法具有如下缺点：
(1)分散剂源自菌，所回收的细胞片必须充分地洗净。
(2)所培养的每种细胞其分散剂处理条件都不同，而且对该处理必须熟练。
(3)通过分散剂处理来培养的表皮细胞在病理学上被活化。
(4)胞外基质通过分散剂处理被分解。
(5)因此移植了该细胞片的患处易受感染。
除上述的现有技术的缺点之外，作为本发明对象的角膜内皮细胞，还具有如下缺点：由于细胞与细胞间的结合不如皮肤细胞强，因此即使使用上述分散剂，培养后也无法作为整张细胞片进行剥离、回收。
另外、在日本专利特愿2001-226141号中，在细胞培养支持体上培养前眼部相关细胞，该细胞培养支持体是将相对于水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的温度响应性聚合物覆盖在基材表面上而成的，根据需要按照常规方法将培养细胞层多层化，通过只改变支持体的温度剥离所培养的细胞片，由此，制造具有充分强度的细胞片成为可能。但是，考虑到实际所得到的角膜内皮细胞片的成活性、功能，希望能够进一步改善。
发明内容
本发明以解决上述现有技术的问题为目标。即，本发明的目的在于提供对眼部组织的附着性良好的再生角膜内皮细胞片。另外，本发明的目的在于提供其制造方法及使用方法。
本发明人们为了解决上述课题，从各种角度加以探讨，进行了研究开发。其结果发现，在用温度响应性聚合物覆盖基材表面的特定条件的细胞培养支持体上，在特定条件下培养角膜内皮细胞，之后，将培养液温度调节成基材表面的聚合物进行水合的温度，将所培养的再生角膜内皮细胞片紧密贴合在特定的载体上，一边抑制细胞片的收缩，一边将其连同载体一起剥离，由此可以得到对活体组织附着性极其优良的再生角膜内皮细胞片。本发明基于上述认识得以完成。
即，本发明提供一种对前眼部组织的附着性良好、在功能方面具有充分程度的细胞密度的、紧密贴合在载体上的再生角膜内皮细胞片。
另外，本发明提供再生角膜内皮细胞片的制造方法，其特征为，在用0～80℃的温度范围内脱水合的温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养细胞，之后，
(1)将培养液温度调节成基材表面的聚合物水合的温度，
(2)将所培养的角膜内皮细胞片紧密贴合在载体上，
(3)将其连同载体一起剥离。
本发明还提供治疗方法，其特征为，移植上述再生角膜内皮细胞片。
本发明还进一步提供用于治疗创伤组织的上述再生角膜内皮细胞片。
附图说明
图1表示实施例4中从细胞培养支持体材料剥离的再生角膜细胞片。
图2表示实施例4中，分别在培养1天后(A)、3天后(B)、7天后(C)、14天后(D)取出培养中的人再生角膜细胞片，对所生成的胶原蛋白IV(上图)及纤粘连蛋白(下图)按照常规方法进行染色的结果。
图3表示实施例4中，对培养4天后的再生角膜细胞片中存在的Z O-1蛋白质进行免疫荧光染色的结果。
图4表示实施例4中，对得到的剥离途中的人再生角膜细胞片中存在的胶原蛋白IV(左图)及纤粘连蛋白(右图)，按照常规方法进行染色的结果。图中的箭头表示剥离方向。
图5表示实施例4中，对剥离后的人再生角膜细胞片进行H/E(Hematoxylin and Eosin)染色的结果(左图)、对细胞片中存在的胶原蛋白IV(中图)及纤粘连蛋白(右图)按照常规方法进行染色的结果。
图6表示实施例4中得到的人再生角膜细胞片的透射电子显微镜(TEM)图像。图中的标记分别表示ECM：胞外基质，N：核，GC：高尔基复合体(Golgi Complex)，M：线粒体，EM：内质网(Endoplasmic Reticulum)，箭头部分表示细胞-细胞间结合。
图7表示用SDS-PAGE法(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)确认实施例5、比较例3、4中所示的角膜内皮细胞片表层中存在的蛋白质及参与细胞-细胞间的结合的ZO-1蛋白质的结果。上图的A表示用考马斯亮兰(Coomassie brilliantblue)染色、测定存在于细胞片表层的蛋白质的结果，而下图的B表示使用抗人ZO-1多克隆抗体染色的结果。图中的T表示用低温处理从本发明的细胞培养支持体材料剥离的细胞片的结果，D表示进行分散剂处理而从市售的未被温度响应性聚合物覆盖的基材得到的细胞，S表示用刮削法从该市售基材剥离的细胞的分析结果。
图8表示，对实施例7中得到的剥离前的再生角膜内皮细胞片，用抗兔Na-K ATP酶单克隆抗体进行染色，使Na-K ATP酶泵位点部分染色成绿色，用亚丙基(propidium iodide)使细胞核染色成红色，使用共焦显微镜得到的结果。此时，上图的A表示从培养细胞片的上方观察的结果，B是观察厚度方向的结果。
图9中的A表示每1个细胞的钠泵数对于人角膜内皮细胞片内的细胞密度的相关性，图中的B表示每单位面积的钠泵数对于细胞密度的相关性。
具体实施方式
本发明中所使用的代表性的内皮细胞是位于角膜组织内的角膜内皮细胞，但其种类不受任何限制。本发明中，再生角膜内皮细胞片是指，上述各种细胞在培养支持体上被培养成单层状，之后，从支持体剥离的细胞片。
本发明的再生角膜内皮细胞片在培养时没有受到以分散剂、胰岛素等为代表的蛋白质分解酶的损伤。因此，从基材上剥离的再生角膜内皮细胞片，保持着细胞-细胞间的桥粒结构，结构缺陷少，强度也高。另外，本发明的细胞片在培养时形成的细胞-基材间的基底膜类蛋白质也不会受到酶的破坏。因此，移植时能够与患处组织良好地粘合，能够实施效率优良的治疗。对以上事实进行具体说明的话，使用胰岛素等通常的蛋白质分解酶的情况下，细胞-细胞间的桥粒结构以及细胞与基材间的基底膜类蛋白质等几乎无法保持，因而，细胞以各个分开的状态被剥离。其中，关于作为蛋白质分解酶的分散剂，已知能够以保持10～60％细胞-细胞间的桥粒结构的状态剥离细胞片，但由于基本上全部破坏掉细胞-基材间的基底膜类蛋白质等，所以得到的细胞片强度弱。相对于此，本发明的细胞片，其桥粒结构、基底膜类蛋白质皆残留80％以上，可以得到前述的种种效果。
本发明的再生角膜内皮细胞片在作为活体组织的前眼部组织上能极其良好地成活。我们发现，通过抑制从支持体表面剥离的再生角膜内皮细胞片的收缩能够实现该性质。此时，再生角膜内皮细胞片的收缩率在细胞片内的任意方向的长度上都希望达到20％以下，优选10％以下，更优选5％以下。若收缩率在细胞片的任意方向的长度上达到20％以上，剥离的细胞片成为松弛的状态，该状态下附着到活体组织上，也无法紧密贴合在组织上，不能指望本发明所显示的高成活性。
不使再生角膜内皮细胞片收缩的方法，只要是不让细胞片收缩的方法就不受任何制约，例如可以举出，从支持体剥离再生角膜内皮细胞片时，在这些细胞片上紧密贴合切掉了中心部分的环状载体等，将该载体与细胞片一起剥离的方法等。
使再生角膜内皮细胞片紧密贴合时所使用的载体，是用以保持本发明的细胞片不收缩的结构物，可以使用例如聚合物膜或由聚合物膜成型的结构物、金属性夹具等。例如，载体的材质使用聚合物时，其具体的材质可以列举聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纤维素及其衍生物、纸类、几丁质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、胶原蛋白、乌拉坦(urethane)等。
本发明中所谓紧密贴合的情况是指，在细胞片与载体的边界面上，细胞片在载体上不会错离也不会移动，以使细胞片不收缩的状态，可以由物理性的结合而紧密贴合，也可以通过两者之间存在的液体(例如培养液、其他等渗液)紧密贴合。
载体的形状不受特别的限制，例如，在移植所得到的再生角膜内皮细胞片时，若使用这样的载体，即在该载体上切掉了与移植部位同等大小或者比移植部位大的一部分，则细胞片仅仅固定在被切掉部分的周围，只需将位于切掉部分的细胞片接触到移植部位就可以，是比较合适的。另外，由于角膜内皮组织位于角膜组织的最内层，也可以使用这样的移植方法：即，将上述的细胞片用细胞片曾与支持体接触的面的反面固定在夹具上，就那样地将其插入角膜组织内，设置细胞片。此时夹具的形状不受特别的限定，例如，具有与活体内的角膜内皮组织的形态同等的曲率的曲面的夹具，在该夹具上设有吸引口以固定细胞片的夹具等，操作简便、比较合适。
另外，本发明的再生角膜内皮细胞片的特征：对活体组织的高成活性，是在特定的培养条件下实现的。即，本发明的细胞片是在支持体表面上接种再生角膜内皮细胞后经过培养而得到的，而我们明确了在支持体表面上细胞达到铺满(充满的状态)后起10天以后，优选12天以后，更优选20天以后是令人满意的。若少于10天，则剥离的再生角膜内皮细胞片的基底膜不充分，因此附着性也降低，无法达到本发明的特征之一的高成活性。
本发明的再生角膜内皮细胞片是具有角膜内皮组织原有功能的高密度的细胞片。此时的细胞密度为2500个/mm2以上，优选为2700个/mm2以上，更优选为2900个/mm2以上。若细胞密度在2500个/mm2以下，就不能体现充分的钠泵功能，无法希求本发明的特征之一的高功能性。
本发明的再生角膜内皮细胞片是具有充分的钠泵功能的细胞片。我们判明此时的钠泵位点(Na-K ATP酶泵位点)数在3.4×109个/mm2以上，优选在3.8×109个/mm2以上，更优选在4.2×109个/mm2以上是令人满意的。若钠泵位点数在3.4×109个/mm2以下，就不能体现充分的泵功能，无法达到本发明的特征之一的高功能性。
本发明的再生角膜内皮细胞片，如上所示，是能够极其良好地附着在活体组织上，并且能够作为角膜内皮组织充分发挥作用的高密度细胞片，是从现有技术完全无法得到的细胞片。
关于本发明的细胞培养支持体，覆盖在基材上的温度响应性聚合物是随着温度的变化而发生水合、脱水合的聚合物，其温度范围在0～80℃，优选在10℃～50℃，更优选在20℃～45℃。若超过80℃，细胞就有死亡的可能性，因此不优选。另外，若低于0℃，细胞增殖速度通常极度低下，或细胞会死亡，因此也不优选。
本发明中使用的温度响应性聚合物可以是均聚物、共聚物的任意种。作为这样的聚合物可以列举例如日本专利特开平2-211865号公报中记载的聚合物。具体而言，例如，由以下的单体单独聚合或者共聚得到。可以使用的单体，例如可以列举(甲基)丙烯酰胺化合物((甲基)丙烯酰胺是指丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺。以下也同样)、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或者乙烯基醚衍生物，对于共聚物，可以使用其中任意两种以上。另外，也可以使用与上述单体以外的单体类的共聚，聚合物之间的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不损害聚合物原有性质的范围内进行交联。
被实施覆盖的基材，从通常用于培养细胞的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有机玻璃等化合物开始，到通常能够赋予形态的物质，例如上述之外的聚合物、陶瓷类等全都可以使用。
温度响应性聚合物向支持体上覆盖的方法不受特别的限制，例如，可以按照日本专利特开平2-211865号公报中记载的方法进行。即，可以对基材和上述单体或聚合物，利用电子束照射(EB)、γ射线照射、紫外线照射、等离子处理、电晕处理、有机聚合反应的任意种，或者利用涂布、混炼等物理吸附等进行所述覆盖。
温度响应性聚合物的覆盖量最好是0.4～3.0μg/cm2的范围，优选0.7～2.8μg/cm2，更优选0.9～2.5μg/cm2。覆盖量少于0.4μg/cm2时，即使给与刺激，该聚合物上的细胞也难以剥离，操作效率非常差，不优选。反之，覆盖量在3.0μg/cm2以上时，细胞难以在该区域附着，难以充分附着细胞。
本发明中对支持体的形态没有特别的限制，例如可以列举皿、multiplate微孔板、烧瓶、细胞培养小室(Cell Insert)等。
本发明中，细胞的培养是在如上所述制造的细胞培养支持体上进行的。培养基的温度只要是在覆盖在基材表面的前述聚合物脱水合的温度下进行就没有特别的限制。但是，在导致培养细胞无法增殖的低温区域、或导致培养细胞死亡的高温区域中的培养显然是不合适的。温度以外的培养条件只要按照常规方法就可以，不受特别的限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培养基，还可以是不添加这类血清的无血清培养基。本发明的方法中，从支持体材料剥离回收所培养的细胞时，将培养的再生角膜内皮细胞片紧密贴合在载体上，通过将附着有细胞的支持体材料的温度调节成支持体基材的覆盖聚合物水合的温度，就那样地将细胞连同载体一起剥离。此时，也可以在细胞片与支持体之间加上水流，使剥离顺利进行。另外，细胞片的剥离可以在培养细胞的培养液中进行，也可以在其它等渗液中进行，可以根据目的进行选择。
作为温度响应性聚合物以聚(N-异丙基丙烯酰胺)为例对以上事实进行说明。已知，聚(N-异丙基丙烯酰胺)是在31℃具有下限临界溶解温度的聚合物，处于游离状态时，在水中31℃以上的温度下发生脱水合，聚合物链凝集、产生白色混浊。反之，在31℃以下的温度下聚合物链进行水合，成为溶解于水的状态。本发明中，该聚合物是覆盖、固定于培养皿之类的基材表面上的。因此，如果温度在31℃以上，基材表面的聚合物也同样发生脱水合，但由于聚合物链覆盖、固定于基材表面，因此基材表面呈疏水性。反之，在31℃以下的温度下，基材表面的聚合物进行水合，由于聚合物链覆盖、固定于基材表面，因此基材表面呈亲水性。此时的疏水性表面是细胞能够附着、增殖的适当的表面，而亲水性表面是细胞无法附着的程度的表面，培养中的细胞或者细胞片也可以仅通过冷却就能被剥离。
本发明的细胞片中细胞以高密度存在。该制造方法不受特别限定，但由于角膜内皮细胞并不能快速地增殖到高密度，因此例如可以举出这样的方法：预先进行几次传代培养，在达到规定的总细胞数的阶段，将所有的细胞接种于规定的面积。此时，为了提高细胞分散液中的细胞浓度可以进行离心分离来浓缩，也可以减少基材的培养面积来增加每单位面积的细胞数。在细胞进行传代培养时使用的基材不受特别的限定，在例如胶原蛋白IV、胶原蛋白I、胶原蛋白III、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、人工基膜(Matrigel)等的粘着蛋白上培养的话，角膜内皮细胞的形态不会被破坏，比较合适。
接种时，基材的每单位面积的细胞数在2000个/mm2以上为宜，优选在2300个/mm2以上，更优选2500个/mm2以上。在小于2000个/mm2的情况下，很难使得到的再生角膜内皮细胞片的细胞密度达到2500个/mm2以上。
在本发明中，将细胞片贴于患处之后，将细胞片从载体剥离就可以。该剥离方法不受任何限制，例如，可以是浸湿载体，使载体与细胞片的紧贴性减弱而剥离的方法；或者也可以是使用手术刀、剪刀、激光、等离子波等的工具切断的方法。例如使用上述紧密贴合在被切掉了一部分的载体上的细胞片的情况下，若使用激光等沿着患处的边界线切断，则可避免细胞片附着到患处之外不需要的部分上，是比较合适的。
本发明所示的再生角膜内皮细胞片与活体组织间的固定方法不受特别的限定，可以缝合细胞片与活体组织，或者由于本发明所示的再生角膜内皮细胞片迅速地在活体组织上成活，因此附着于患处的细胞片不与活体一侧缝合也可以。
为达到高回收率地剥离、回收再生角膜内皮细胞片的目的，可以单独使用或者同时使用下述方法：或者轻敲或者晃动细胞培养支持体的方法，或用移液器搅拌培养基的方法，在细胞片与基材之间加上水流的方法等。另外，也可以根据需要用等渗液等冲洗培养细胞进行剥离回收。
本发明所示的再生角膜内皮细胞片的用途不受任何限制，例如对角膜内皮损伤、大泡性角膜病变有效。
根据上述方法得到的再生角膜内皮细胞片，与以往的方法得到的细胞片相比，由于在剥离时的非侵袭性方面、并且在高功能方面极为优良，因此强烈期待其作为移植用角膜内皮细胞片的临床应用。特别是，本发明的再生角膜内皮细胞片与以往的移植细胞片不同，具有与活体组织的高成活性，能极为迅速地在活体组织上成活。可以认为，这是可以提高患处的治疗效率、进一步可以减轻患者负担的极其有效的技术。另外，本发明的方法中所使用的细胞培养支持体可以重复使用。
实施例
以下基于实施例进行进一步详细说明本发明，但这些实施例对本发明没有任何限定。
实施例1、2
在市售的直径3.5cm细胞培养用培养皿(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、フアルコン(FALCON)3001)上，涂布0.10ml 40wt％(实施例1)、45wt％(实施例2)N-异丙基丙烯酰胺单体的异丙醇溶液。照射0.25MGy强度的电子束，在培养皿表面上使N-异丙基丙烯酰胺聚合物(PIPAAm)固定化。照射后，用离子交换水洗净培养皿，除去残余的单体和未与培养皿结合的PIPAAm，在净化台内干燥，用环氧乙烷气体灭菌，得到细胞培养支持体材料。PIPAAm的覆盖量分别为1.6μg/cm2(实施例1)、1.8μg/cm2(实施例2)。
另一方面，根据常规方法在深度麻醉下从白色家兔角膜周边部分采取角膜内皮组织，使用涂覆了胶原蛋白IV的烧瓶，按照常规方法对该角膜内皮细胞进行5次传代培养(使用培养基：DMEM、10％FCS、37℃、10％CO2下)。其结果，最终能够回收4×106个角膜内皮细胞。
然后，在上述培养皿表面上固定化PIPAAm而成的培养支持体材料上接种全部上述细胞，就那样地继续培养4周。培养后，在所培养的细胞上盖上载体，所述载体由切除1.8cm直径圆形的直径2.3cm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟进行冷却，两种细胞培养支持体材料上的细胞皆连同覆盖在其上的载体一起剥离。得到的细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。得到的细胞片内的细胞密度为3000个/mm2。
另外，上述各实施例中，“低温处理”是在20℃下培养30分钟的条件下进行，本发明中的“低温处理”不限于这一温度和时间。本发明中的“低温处理”优选的温度条件在0℃～30℃，优选的处理时间为2分钟～1小时。
将实施例1、2中得到的再生角膜内皮细胞片移植给角膜内皮组织部分缺损的白色家兔。此时，用再生角膜内皮细胞片的曾与支持体接触的面的反面吸引、固定在夹具上，用手术刀切除载体，所述夹具具有与活体内的角膜内皮组织同等曲率的吸引面。用夹具将再生角膜内皮细胞片推碰到创伤部位，停止夹具的吸引，就那样地附着15分钟。此时，并未进行再生角膜内皮细胞片与活体的缝合。最后，按照常规方法，将切开的角膜组织缝合到眼球上。3周后，观察患处，实施例1、2的再生角膜内皮细胞片都在眼球上良好地成活，并且也没有观察到角膜的膨润。
实施例3
将含有N，N-亚甲基双丙烯酰胺(1wt％/丙烯酰胺单体)的丙烯酰胺单体溶于异丙醇以得到5wt％的溶液。对实施例1的细胞培养支持体，在其上继续涂布0.10ml该溶液，覆上直径1.8cm的金属制掩膜，以这样的状态照射0.25MGy强度的电子束，使未覆盖金属掩膜部分的丙烯酰胺聚合物(PAAm)固定化。照射后，用离子交换水洗净培养皿，除去残余的单体和未与培养皿结合的PAAm，在净化台内干燥，用环氧乙烷气体灭菌，得到细胞培养支持体材料。
然后，按照与实施例1同样的方法，在深度麻醉下从白色家兔角膜周边部分采取角膜内皮组织，进行4次传代培养，最终能够回收7.6×105个角膜内皮细胞。然后，在上述细胞培养支持体材料上接种全部上述细胞，就那样地继续培养3周。培养后，与实施例1同样地在所培养的细胞上盖上载体，所述载体由切除1.8cm直径圆形的直径2.3cm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，轻轻地吸去培养基，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟进行冷却，将细胞培养支持体材料上的细胞连同覆盖在其上的载体一起剥离。得到的细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。得到的细胞片内的细胞密度为2800个/mm2。
将得到的再生角膜内皮细胞片与实施例1同样地移植给角膜内皮组织部分缺损的白色家兔。3周后，观察患处，再生角膜内皮细胞片在眼球上良好地成活，并且也没有观察到角膜的膨润。
比较例1
用实施例2制造角膜内皮细胞片，除不使用载体剥离细胞片、产生收缩之外，与实施例2同样地制造角膜内皮细胞片。此时的收缩率为42％。
与实施例2同样地将得到的角膜内皮细胞片移植给角膜内皮组织部分缺损的兔子。移植一天后观察患处，角膜内皮细胞片对眼球的成活性稍差，并且也观察到角膜的膨润。
比较例2
用实施例3培养角膜内皮细胞，除从细胞培养支持体剥离为止的期间为9天后之外，与实施例3同样地尝试制造再生角膜内皮细胞片。尝试与实施例3同样地剥离再生角膜内皮细胞片，但只能剥离一部分，不足以作为细胞片。
实施例4
对实施例3的覆盖直径1.8cm的金属制掩膜而得到的细胞培养支持体材料，与实施例3同样地在上述细胞培养支持体材料上接种用与实施例3同样的方法从人角膜周边部分采取的角膜内皮细胞，就那样地继续培养4周。培养后，使用聚偏二氟乙烯(PVD F)载体，连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟进行冷却，剥离细胞培养支持体材料上的内皮细胞片。得到的内皮细胞片收缩率在5％以下，其作为整张细胞片具有充分的强度。得到的内皮细胞片内的细胞密度为3000个/mm2。图1表示从得到的内皮细胞片上除去了载体后的细胞片。可知人再生角膜内皮细胞片漂浮在培养支持体材料内。
图2表示将培养中的人再生角膜内皮细胞片在培养1天后(A)、3天后(B)、7天后(C)、14天后(D)分别取出，按照常规方法将所生成的胶原蛋白IV(上图)及纤粘连蛋白(下图)染色的结果。可知随着培养天数的增加，胶原蛋白IV及纤粘连蛋白蓄积。
对培养4天后的再生角膜细胞片中存在的ZO-1蛋白质进行免疫荧光染色。结果如图3所示。可知该蛋白质局部存在于细胞-细胞间，从该结果可知本发明中得到的再生角膜内皮细胞片形成了细胞-细胞间的结合，且该形成在剥离后也未被破坏而依然保留。
然后，从培养支持体材料内剥离人再生角膜内皮细胞片。对剥离途中的人再生角膜内皮细胞片中存在的胶原蛋白IV(左图)及纤粘连蛋白(右图)用常规方法染色的结果如图4所示。从该图也可以知道得到的再生角膜内皮细胞片中具有胶原蛋白IV和纤粘连蛋白。
图5表示对剥离后的人再生角膜内皮细胞片进行H/E染色的结果(左图)、对存在于细胞片中的胶原蛋白IV(中图)及纤粘连蛋白(右图)用常规方法进行染色的结果。根据H/E染色照片可知本发明中得到的人再生角膜内皮细胞片与在活体内通常的状态一样是单层的，胶原蛋白IV局部存在于内皮细胞片曾与支持体相接触的一侧，纤粘连蛋白局部存在于细胞-细胞间。
另外，将同样地准备的再生角膜细胞片用2％的戊二醛固定，之后用锇酸染色，用透射电子显微镜观察，结果如图6所示。从图也可以知道得到的再生角膜细胞片是与活体内的组织同样的组织。
实施例5
对实施例1中得到的细胞培养支持体材料，与实施例3同样地在上述细胞培养支持体材料上接种按照与实施例3同样的方法从人角膜周边部分采取的角膜内皮细胞，就那样地继续培养4周。培养后，不使用聚偏二氟乙烯(PVDF)载体而连同细胞培养支持体材料一起在20℃培养30分钟进行冷却，从而剥离细胞培养支持体材料上的内皮细胞片。用常规方法抽提出存在于所得到的内皮细胞片表层的蛋白质及参与细胞-细胞间的结合的ZO-1蛋白质等，并用SDS-PAGE法确认。结果如图7中的T所示。此时，上图的A用考马斯亮兰染色，测定存在于细胞片表层的蛋白质，而下图的B用抗人ZO-1多克隆抗体染色。由图7可知，按照本发明的方法，细胞表层的蛋白质不被破坏，依然保留。
比较例3、4
在实施例5的实验中，除人再生角膜内皮细胞的培养是在未覆盖温度响应性聚合物的市售的培养基材上培养以外，按照同样的操作继续培养4周。培养后，为了剥离培养的细胞，一种方法是按照常规方法，进行分散剂处理来剥离(比较例3)，另一种方法是用橡胶制的刮刀进行物理性剥离的方法(比较例4)。对分别用两种方法得到的细胞与实施例5同样地用常规方法抽提出存在于内皮细胞片表层的蛋白质及参与细胞-细胞间的结合的ZO-1蛋白质等，并用SDS-PAGE法进行确认。结果分别如图7中的D(比较例3)、图7中的S(比较例4)所示。从图7可知，用分散剂处理法，细胞表层的蛋白质被破坏，残余量变少。另外，用刮削法，尽管细胞表层的蛋白质的残余量多，但由于是物理性的剥离，因此得到的角膜内皮细胞片中有多处被切断，不足以作为本发明所示的再生角膜内皮细胞片。另外，比较图7的S和T，两者完全看不出有差别，因此可知由本发明的实施例5得到的再生角膜内皮细胞片的表层蛋白质几乎没有被破坏。
实施例6
用实施例3得到的剥离前的再生角膜内皮细胞片、以及冷却剥离后再次附着到市售的直径3.5cm细胞培养用培养皿(FALCON3001)上的再生角膜内皮细胞片，计算剥离前后每1个细胞的钠泵数。具体而言，使用作为Na-K ATP酶抑制剂的乌本苷，认为1分子的乌本苷与1分子的Na-K泵结合，通过测定乌本苷的总结合量求得每1个细胞的钠泵数。此时，乌本苷使用3H标记物，用液体闪烁计数器测定。根据乌本苷对细胞片的总结合量、以及细胞片的细胞密度，计算出实施例3中剥离前后每1个细胞的钠泵数的结果，剥离前的钠泵数为3.5×106个，剥离后的钠泵数为3.5×106个。使用本发明的细胞培养支持体，剥离时没有看到细胞的损伤。
实施例7
对实施例3的覆上直径1.8cm的金属制掩膜得到的细胞培养支持体材料，与实施例3同样地在上述细胞培养支持体材料上接种按照与实施例3同样的方法从人角膜周边部分采取的角膜内皮细胞，就那样地继续培养4周。对该剥离前的人再生角膜内皮细胞片，用抗兔Na-K ATP酶单克隆抗体进行染色，使Na-K ATP酶泵位点部分染色成绿色。此时，用亚丙基(propidium iodide)将细胞核染色成红色。图8表示用共焦显微镜得到的结果。此时，上图的A表示从培养细胞片的上方观察的结果，B是观察厚度方向的结果。如图所示，可知本发明的再生角膜内皮细胞片中高密度地残留有Na-K ATP酶泵位点部分。
实施例8
除以人角膜内皮细胞作为所使用的细胞，且培养至细胞片内的细胞密度达到575个/mm2～3070个/mm2之外，按照与实施例6同样的方法进行培养操作，与实施例6同样地用液体闪烁计数器测定3H标记化乌本苷结合量，从而测定Na-K ATP酶泵位点数。根据Na-K ATP酶泵位点数和细胞片的细胞密度，算出剥离的再生角膜内皮细胞片的每1个细胞的钠泵数。得到的结果如图9所示。图中的A表示每1个细胞的钠泵数对细胞密度的相关性，图中的B表示每单位面积钠泵数对细胞密度的相关性。从图中的A可知当细胞密度增加时，每1个细胞的钠泵数减少；从图中的B可知当细胞密度增加时，每单位面积的钠泵数增加。我们明确了通过使细胞密度成为2500个/mm2，达到本发明的钠泵位点数。
比较例5
将含有N，N-亚甲基双丙烯酰胺(1wt％/丙烯酰胺单体)的丙烯酰胺单体溶于异丙醇以得到5wt％的溶液。对市售的直径3.5cm的细胞培养用培养皿(FALCON 3001)，按照与实施例3同样的方法在其上涂布0.10ml该溶液，覆上直径1.8cm的金属制掩膜，以这样的状态照射0.25MGy强度的电子束，使未覆盖金属掩膜部分的丙烯酰胺聚合物(PAAm)固定化。照射后，用离子交换水洗净培养皿，除去残余的单体和未与培养皿结合的PAAm，在净化台内干燥，用环氧乙烷气体灭菌，得到实施例3的细胞培养支持体中没有PIPAAm覆盖部分的培养用支持体。
使用该培养用支持体，与实施例4同样地用剥离前的再生角膜内皮细胞片、以及用胶原酶处理进行剥离后再附着到市售的直径3.5cm的细胞培养用培养皿(FALCON 3001)上的再生角膜内皮细胞片，算出剥离前后的每1个细胞的钠泵数。计算剥离前后的每1个细胞的钠泵数的结果，剥离前的钠泵数为3.5×106个，剥离后的钠泵数为1.5×106个。剥离时发生的细胞的损伤显著。
产业上的可利用性
本发明得到的再生角膜内皮细胞片对活体组织的成活性极高，并具有高功能，强烈地期待其在例如角膜内皮疾病治疗等的临床应用。因此，本发明是在细胞工学、医用工学等的医学、生物学等领域极为有用的。

Claims (18)

1.再生角膜内皮细胞片的制造方法，其特征是，在用0～80℃的温度范围内水合力变化的聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支持体上培养从组织采取的角膜内皮细胞，培养后，
(1)将培养液温度调节成基材表面的聚合物水合的温度，
(2)将所培养的角膜内皮细胞片紧密贴合在切掉了一部分的载体上，所述一部分为与移植部位同等大小或者比移植部位大的一部分，细胞片固定在被切掉上述部分的载体上，
(3)细胞达到铺满后起10天以后，将其连同载体一起未经蛋白质分解酶处理而从支持体剥离。
2.根据权利要求1记载的再生角膜内皮细胞片的制造方法，其特征是，从组织采取的角膜内皮细胞通过预先进行多次传代培养增加总细胞数，使支持体表面的接种细胞浓度最终成为2000个/mm2以上，以高密度进行培养。
3.根据权利要求1记载的再生角膜内皮细胞片的制造方法，所述传代培养在胶原蛋白IV上进行。
4.根据权利要求1记载的再生角膜内皮细胞片的制造方法，所述聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
5.根据权利要求1～4任一项记载的再生角膜内皮细胞片的制造方法制作的再生角膜内皮细胞片，剥离后的细胞片的收缩率保持在20％以下。
6.根据权利要求5记载的再生角膜内皮细胞片，其残留有80％以上基底膜类蛋白质。
7.根据权利要求5记载的再生角膜内皮细胞片，其残留有80％以上桥粒结构。
8.根据权利要求5记载的再生角膜内皮细胞片，所述细胞片内的细胞密度为2500个/mm2以上。
9.根据权利要求5记载的再生角膜内皮细胞片，所述细胞片内的钠泵位点数为3.4×109个/mm2以上。
10.根据权利要求5记载的再生角膜内皮细胞片，其用于治疗角膜内皮组织的一部分或全部损伤或缺损了的患处。
11.根据权利要求10记载的再生角膜内皮细胞片，其特征是，治疗不是将再生角膜内皮细胞片缝合在患处，而是将再生角膜内皮细胞片覆盖于患处。
12.根据权利要求11记载的再生角膜内皮细胞片，所述细胞片在覆盖于患处时，按照患处的大小、形状被切断。
13.移植用再生角膜内皮细胞片，其为权利要求5～12的任意一项记载的再生角膜内皮细胞片，使用到角膜内皮组织的一部分或全部损伤或缺损的患处。
14.根据权利要求13记载的移植用再生角膜内皮细胞片，其特征为，所述移植是：
(1)将再生角膜内皮细胞片连同载体一起剥离，
(2)将细胞片的曾与支持体接触的面的反面，固定在具有与活体内的角膜内皮组织形态同等的曲率的夹具上进行移植，
(3)用曾与支持体接触的同一面，将再生角膜内皮细胞片覆盖在患处，之后，去除固定着细胞片的夹具及载体。
15.根据权利要求13记载的移植用再生角膜内皮细胞片，其特征为，所述移植是：
(1)将再生角膜内皮细胞片连同载体一起剥离，
(2)将细胞片的曾与支持体接触的面的反面，固定在具有与活体内的角膜内皮组织形态同等的曲率的夹具上，去除载体，
(3)用曾与支持体接触的同一面，将再生角膜内皮细胞片覆盖在患处，之后，去除固定着细胞片的夹具。
16.根据权利要求13～15的任意一项记载的移植用再生角膜内皮细胞片，其特征是，所述移植不是缝合在患处，而是覆盖于患处。
17.根据权利要求16记载的移植用再生角膜内皮细胞片，其特征是，覆盖于患处时，按照患处的大小、形状切断再生角膜内皮细胞片。
18.根据权利要求13～15的任意一项记载的移植用再生角膜内皮细胞片，其特征是，适合治疗的疾病是角膜内皮损伤、大泡性角膜病变。
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