JP5761827B2 - 角膜内皮細胞の調製方法 - Google Patents
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Description
以下、本発明にかかる用語について説明する。
(1)角膜内皮細胞
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の3層構造をしている。「角膜内皮細胞」は、この角膜の一番内側の層を構成する細胞群で、障害を受けるとin vivoでは再生しない。「角膜内皮細胞」は神経堤に由来する細胞で、敷石状の形態を有し、角膜内皮細胞の分化マーカーであるタイプVIIIコラーゲン、ZO−1、Na+/K+ ATPase等の発現によって特徴づけられる。
本発明にかかる「角膜内皮前駆細胞」とは、角膜内皮に分化可能な未分化細胞を意味する。「角膜内皮前駆細胞」は、樹状形態を有する細胞で、高い増殖能を有する。また、培養(増殖)初期段階では、分化マーカーを発現しておらず、神経堤幹細胞等の未分化細胞特異的なマーカーであるp75の発現によって特徴づけられる。本発明で得られる「角膜内皮前駆細胞」は、幹細胞としての性質(多分化能と自己複製能)も有する可能性がある。その意味では、「角膜内皮前駆細胞」は「「角膜内皮幹細胞・前駆細胞」と記載することもできる。
本発明で用いられる「無血清培地」とは、他種血清成分を含まない培地を意味する。無血清培地は、動物血清に由来する病原体による感染の恐れがなく、得られた細胞や培養物は安全に、臨床応用に適用することができる。それゆえ、本発明で得られる角膜内皮細胞の再生医療等への利用を考慮した場合、培地としては無血清培地を用いることが好ましい。なお、無血清培地は、後述する工血清代替物を含んでいてもよい。
本発明で用いられる「血清代替物」とは、血清に代替して使用可能な人工血清代替物を意味し、例えば、前述したKSR(knockout serum replacement:invitrogen社(GIBCO)製)、脂質リッチアルブミン等のアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノールや3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物を挙げられる。
「サイトカイン」とは、細胞から放出され、種々の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子の総称である。本発明においては、細胞の増殖と分化誘導を促進させる目的で、培地にサイトカインを添加する。
本発明では、角膜内皮前駆細胞、及び、分化誘導された角膜内皮細胞を同定するために、各細胞種に特異的に発現しているタンパク質(細胞マーカー)を利用する。具体的には、本発明にかかる角膜内皮前駆細胞群は、培養初期段階においては、p75、FOXC2、SOX9、N−cadherin陽性によって特定される。これらのマーカーは、本発明の培養系において一定期間維持することが可能であるが、増殖が進むにつれて少しずつ消失する。一方で、角膜内皮前駆細胞は培養初期にはki−67を発現していないが、増殖時にはki−67を高発現するようになる。一方分化誘導された角膜内皮細胞を含む細胞群はタイプVIIIコラーゲン陽性によって特定される。
2.1 細胞の単離
まず、常法にしたがい、単離された角膜内皮組織をトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素で処理して、細胞を単離させる。単離させた細胞は、DMEM等の基本培地に懸濁させ、遠心して組織断片を除去する。こうして調製した角膜内皮組織由来の細胞群を以下の手順で培養を行う。
本発明の方法は、(1)無血清培地、(2)低密度培養、(3)接着培養の3つを主たる特徴とする。
本発明の方法では、血清を含まない無血清培地を用いて細胞を培養する。基本培地としては、DMEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、α MEM培地、Dulbecco MEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、McCoy’s培地、ウイリアムスE培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
一般に角膜内皮細胞の培養は、10,000〜100,000cells/cm2の高密度で細胞を播種、またはデスメ膜ごと外植片培養を行う。しかし、本発明の方法では少なくとも10000cells/cm2未満、好ましくは5000cells/cm2以下、より好ましくは20〜2000cells/cm2、さらに好ましくは50−1000cells/cm2、もっとも好ましくは100〜500cells/cm2程度の低密度で細胞を播種して培養を行う。
本発明の方法では、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルTM、ポリ−L−オルニチン/ラミニン(PLO/LM)又はポリ−D−リジン(PDL)等でコーティングした培養皿(器)を用いて、接着培養を行う。
血清を含む培地を用いた従来の方法では、継代するにつれて細胞形態が変化し、角膜内皮機能や増殖能を維持することが困難になる。しかしながら、本発明の方法では、継代しても細胞形態は変化せず、高い増殖能を維持したまま、長期間の培養が可能となる。これは、本発明の方法では、角膜内皮組織由来の細胞を、未分化な状態を維持したまま増殖させることができるからである。換言すれば、本発明の方法では、増殖能の高い、より未分化な細胞群が選択的に増殖させることができる。
上記のとおり、本発明の方法によって得られた角膜内皮前駆細胞群は、適当な条件下で培養することにより、成熟した角膜内皮細胞に分化させることができる。
基本培地としては、DMEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、α MEM培地、Dulbecco MEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、McCoy’s培地、ウイリアムスE培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
培養は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルTM、ポリ−L−オルニチン/ラミニン(PLO/LM)又はポリ−D−リジン(PDL)等でコーティングした培養皿(器)を用いて、36℃〜38℃、好ましくは36.5℃〜37.5℃で、1%〜25% O2、1%〜15% CO2の条件下で行われる。培養期間は、2〜3日に1回培地を交換し、少なくとも7日、好ましくは1週間〜8週間程度である。
本発明の方法によって増殖された角膜内皮前駆細胞群は、表面マーカーであるp75等を利用して、簡便に単離(純化)することができる。例えば、p75に特異的な抗体で標識された免疫磁気ビーズ、p75抗体を固相化したカラム、蛍光標識されたp75抗体を用いたセルソーター(FACS)による分離を用いて単離することができる。
5.1 培養物
本発明の方法によって得られた角膜内皮前駆細胞群、及び/又は前記細胞群から分化誘導された角膜内皮細胞群を含む培養物は、研究、再生医療あるいは後述する細胞製剤の原料として利用することができる。
本発明の方法によって、分化誘導され、単離された角膜内皮前駆細胞群、及び/又は前記細胞群から分化誘導された角膜内皮細胞群は、角膜内皮疾患用細胞製剤として利用できる。
(1)キャリア上での培養
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞群を適当な高分子膜(キャリア)上で培養し、角膜内皮細胞に分化誘導させることにより、あるいは、上記3に記載した方法で得られた角膜内皮細胞群を適当な高分子膜(キャリア)上で培養することにより角膜内皮細胞シートを作製することができる。
1.角膜内皮前駆細胞の培養・維持
角膜内皮前駆細胞の樹立・維持培地
・DMEM/F−12(Invitrogen社、基礎培地)
・20% KnockOUT Serum Replacement(Invitrogen社、血清代替物)
・2mM L−グルタミン(Invitrogen社)
・1%非必須アミノ酸(Invitrogen社)
・100μM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen社)
・4ng/ml basic−FGF(Wako社)
・マトリゲルTM hESC−qualified Matrix(BD社)
氷上又は4℃で融解したマトリゲルTMを冷DMEM/F12培地(Invitrogen社)で30倍希釈し、培養皿に添加し、37℃、1時間インキュベートして培養皿をコーティングした。
・ラミニン511(ベリタス社)
ラミニン511をPBSで20μg/mlに希釈し、培養皿に添加し、37℃、2時間インキュベートして培養皿をコーティングした。PBSで2回、使用する培地で2回洗浄した後、培地を加えた。
ヒト角膜内皮組織をデスメ膜ごと剥離し、10μM Y−27632(Wako社,ROCK阻害剤;アポトーシス阻害剤)を含むDMEM(Invitrogen社)の入った3.5cm培養皿に移し、37℃で30分維持した。
サブコンフルエントまで培養した細胞に、Y−27632(Wako社、アポトーシス阻害剤)を終濃度10μMになるように添加し、37℃で60分放置し、PBSで1回洗浄したのち、0.25mlのStem Pro Accutase(Invitrogen社,細胞乖離液)を加え、室温で2〜5分放置した。
角膜内皮前駆細胞から成熟角膜内皮細胞への分化誘導培地
・DMEM low−glucose(日研生物医学研究所)
・10% FBS(日本バイオシーラム社)
・2mM L−グルタミン(Invitrogen社)
・1% Penicillin−Streptomycin(Invitrogen社)
・FNC coating mix(AthenaES社)
FNC coating mix(フィブロネクチンとタイプIコラーゲンを含むコーティング剤)を培養皿に加え、室温、30秒放置した。
上記方法で培養した角膜内皮前駆細胞にY−27632(Wako社)を終濃度10μMになるように添加し、37℃で60分処理し、PBSで1回洗浄したのち、0.25mlのStem Pro Accutase(Invitrogen社,細胞乖離液)を加え、室温で2〜5分間インキュベーションした。
・DMEM low−glucose(日研生物医学研究所,基礎培地)
・10% FBS(日本バイオシーラム社)
・2mM L−グルタミン(Invitrogen社)
・1% Penicillin−Streptomycin(Invitrogen社)
・2ng/ml bFGF(Invitrogen社)
1と同様にして、角膜組織から細胞を単離し、公知の方法にしたがい培養を行った(前掲、Yokooら,IVOS,2005)。すなわち、単離した角膜内皮細胞をDMEM/F12,B27 supplement,40ng/ml bFGF,20ng/ml EGFを含む培地を使用し、非接着性培養皿上に播種した。2日に1回40ng/ml bFGF,20ng/ml EGFを追加し、計10日間培養した。
RNA抽出
RNeasy Micro Plus kit(QIAGEN社)を用いて、細胞からRNAを抽出した。
SuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen社)を用いて、前項で得たRNAからcDNAを調製した。
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems社)と、表1記載のTaqMan probe(Applied Biosystems社)を用いて、7500 FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)によりリアルタイムPCRを行った。データ解析は、GAPDHを内因性コントロールとして、ΔΔCt法により行った。
上記した方法で調製した角膜内皮前駆細胞又は角膜内皮細胞を、4%パラホルムアルデヒド(Wako社)で室温30分又は冷メタノール(Wako社)で−30℃、30分で固定した。トリス緩衝溶液(TBS,TaKaRa社)で2回洗浄し、5% NST(組成は表2参照)で室温1時間処理した。
アリザリンレッドS(Wako社)を0.9%NaCl(pH4.2)に調整した。細胞を染色液で5分間染色したのち、4%パラホルムアルデヒドにより固定し、顕微鏡下で観察した。
ポンプ機能はUssing chamberを用いて測定した。アテロコラーゲン上で培養した誘導角膜内皮細胞シートをKrebs−Ringer溶液(120.7mM NaCl,24mM NaHCO2,4.6mM KCl,0.7mM Na2HPO4,0.5mM MgCl2,10mM glucose,pH7.4)でインキュベートした。Ussing chamberシステムはWPI社製のものを用いた。Na+/K+ −ATPase阻害剤である1mMウワバイン(Sigma社)を加え、短絡電流を算出した。
家兎角膜内皮障害モデルは家兎の片眼をクライオ法によって角膜内皮を脱落させた。その1週間後、誘導角膜内皮シートの角膜内皮移植術(DAESK)によって角膜内皮面に接着させ、空気を注入して密着させた。角膜厚は経時的にパキメーター(SP−100,Tomey社)によって測定し、前眼部像はスリットランプによって観察した(AIP−20、トプコン社)。
(1)本発明の方法で得られた細胞
ヒト角膜内皮組織(内皮細胞数:約1〜4×104細胞)から単離した細胞を50−1000cells/cm2/無血清下で培養することにより、約7〜14日間培養で、コロニーの出現が認められた(出現率:約0.1%:1眼あたりに約10〜40細胞存在)。
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞は公知の方法で培養した内皮細胞や、in vivoの細胞と比較して、角膜内皮の発生に由来する神経堤マーカーp75、SOX9、FOXC2と、角膜内皮マーカーの一つであるN−cadherinの発現が亢進していた(図2)。
角膜内皮組織から公知の方法で得られた細胞や生体から単離しただけの細胞(in vivo)ではp75の発現が認められなかったが、本発明の方法で得られた角膜内皮幹細胞・前駆細胞では、p75の発現が認められた(図3)。p75(CD271/NGFR)は、神経堤幹細胞を含めた、生体内に少数存在する幹細胞にのみ発現するマーカーで、未分化性の指標である。上記の結果は、本発明の方法では、角膜内皮前駆細胞をより未分化な状態で増殖させることが可能であることを示す。
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞では、増殖マーカーの発現が認められた(図4B)。また、継代を繰り返すことによって単一細胞から最大約108個に増幅可能であった(図4C)。このことは、1ドナーから理論上最大、細胞シート8×104枚が作製可能であることを示す。これに対し、公知の方法で得た細胞では、細胞形態が変化し、増殖能が低下するため、継代は困難である(前掲、Yokooら,IVOS,2005)。
本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞から分化した角膜内皮細胞は敷石状の細胞形態を呈し(図5A)、角膜内皮マーカーであるタイプVIIIコラーゲン(COL8A2)の発現の亢進が認められた(図5B)。このことから、本発明の方法で得られた角膜内皮前駆細胞は角膜内皮細胞に分化可能であることが確認された。
アテロコラーゲンシートは安全性の高い医療用のコラーゲンシートで、角膜内皮の移植用キャリア候補の一つである。角膜内皮前駆細胞から誘導された角膜内皮細胞はアテロコラーゲンシート上に播種すると透明な角膜内皮細胞シートが作製でき(図6A)、敷石状の細胞形態を呈した(図6B、C)。
アテロコラーゲンシート上に再播種した角膜内皮細胞では、角膜内皮前駆細胞から分化誘導した角膜内皮細胞と同様に、角膜内皮マーカーであるNa+/K+ −ATPase、ZO−1及びN−Cadherinの発現が認められた(図6D、E、F)。このことから、誘導角膜内皮細胞シートは成熟角膜内皮細胞を含み、再生医療用材料として使用可能であることが示された。
本発明で得られた誘導角膜内皮細胞シートをUssing chamberを用いてポンプ機能を解析した(図7A)。その結果、培養角膜内皮細胞と比較して同程度であった(図7B)。
本発明で得られた誘導角膜内皮細胞シートを家兎角膜内皮障害モデルへ移植するとアテロコラーゲンのみを移植したコントロール群と比較して、移植後2週間目より顕著な角膜厚の減少が認められた(図8A、B)。このことから、誘導角膜内皮細胞シートは成熟角膜内皮細胞を含み、再生医療用材料として使用可能であることが示された。
本発明の方法により、角膜内皮組織由来の細胞をより未分化な状態(p75及びFOXC2、SOX9 陽性)で増殖させることが可能なことが確認された。得られる角膜内皮前駆細胞は、高い増殖能を有し、1ドナーから理論上、約330枚の角膜内皮細胞シート作製可能であった。当該細胞は成熟角膜内皮細胞への分化能を有する角膜内皮前駆細胞であることが確認された。
Claims (14)
- 角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、5000 cells/cm 2 以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を得ることを特徴とする、角膜内皮前駆細胞の調製方法。
- 細胞群を20〜2000 cells/cm2の密度で播種して培養することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも7日以上培養することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 得られる角膜内皮前駆細胞がKi-67陽性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 増殖される角膜内皮前駆細胞がp75陽性である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 増殖される角膜内皮前駆細胞が、FOXC2、SOX9、及びN-cadherin陽性の細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 培地がbFGF、EGF、TGF、NGF、及びWnt3aから選ばれる少なくとも1以上のサイトカインを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 培地が血清代替物を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 培地が、さらにレチノイン酸、βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、及びアスコルビン酸から選ばれる1又は2以上を含む、請求項7又は8に記載の方法。
- コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルTM、ポリ−L−オルニチン/ラミニン、又はポリ−D−リジン(PDL)でコーティングした培養容器を用いて接着培養することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、5000 cells/cm 2 以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を取得し、前記角膜内皮前駆細胞を、角膜内皮細胞に分化誘導することを特徴とする、角膜内皮細胞の調製方法。
- 分化誘導がTGF−β2を含む無血清培地、又は血清を含む培地を用いて行われる、請求項11に記載の方法。
- 角膜内皮細胞組織から単離した細胞群を、5000 cells/cm 2 以下の低密度で、無血清培地を用いて接着培養して角膜内皮前駆細胞を取得し、前記角膜内皮前駆細胞をそのまま、あるいは前記角膜内皮前駆細胞を角膜内皮細胞に分化誘導したのち、前記細胞を高分子膜上で培養することを特徴とする、角膜内皮細胞シートの作製方法。
- 高分子膜が、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸などのグリコサミノグリカン;アテロコラーゲン;アルカリ処理コラーゲン;ゼラチン;ケラチン;プロテオグリカン;アルギン酸;キトサン;ヒアルロン酸;ポリアミノ酸;ポリ乳酸;セルロース;(メタ)アクリルアミド化合物、N−(若しくはN,N−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体、及びこれらの共重合体などの温度応答性ポリマー;からなる群より選ばれるいずれか1又は2以上を含むものである、請求項13に記載の方法。
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