CN101583371B - 用于刺激有粘附连接的细胞进行增殖的RNAi方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了通过下调某些细胞-细胞连接刺激细胞增殖的方法和组合物，所述细胞表达粘附连接并停止增殖，例如人角膜内皮细胞。在一种实施方式中，下调通过使用RNA干扰，并使所述细胞与促有丝分裂生长因子和提高胞浆内cAMP的试剂接触完成。而且，本文描述了从角膜细胞中分离人角膜内皮细胞的方法，和保存并维持人角膜内皮细胞聚集体活力的方法。也描述了包含人角膜内皮细胞和生物相容性支持物的手术移植物，所述人角膜内皮细胞已经被分离，任选地储存，并与下调p120表达的试剂短暂接触。本文所述的方法和组合物可以被用于新疗法，以帮助在体外组织工程化期间扩增人角膜内皮细胞，并用于角膜内皮功能障碍的体内治疗。

Description

用于刺激有粘附连接的细胞进行增殖的RNAi方法和组合物
政府支持
本发明，全部或部分地，得到国家眼科研究所(National Eye Institute)给予Scheffer C.G.Tseng的基金号RO1 EY06819和基金号RO1 EY015735支持。政府享有本发明的某些权利。
发明背景
角膜是眼睛最重要的折射元件，其是眼球中多层、透明、无血管的最外层部分。人要想看得清楚，角膜所有的层都必须保持透明。在角膜某一层上的任何模糊或不透明区域都会干扰光的正常折射。从眼表面向内，构成角膜的连续层包括上皮层、鲍曼氏层(Bowman’s Layer)、间质层、后弹性膜层(Descemet’s membrance)和内皮层。
人角膜内皮，是覆盖角膜的后表面并朝向前室的单层细胞，其在调控角膜间质组织水合并由此透明的方面发挥关键的作用。人角膜内皮具有关键的液体提取或泵出的功能，其是维持角膜透明所需要的。在健康的眼中，眼液缓慢地从内部流向间质组织；过量的水通过角膜内皮从间质组织泵到眼的前室。而且，关键的是液体流进和流出角膜的速率保持平衡。如果内皮细胞的泵功能减弱，间质组织将膨大，并且间质组织的胶原基质的常规样式将被过量的水破坏。这会导致间质组织变得浑浊，并最终不透明。
发明简述
本文描述了用于刺激具有粘附连接(Ajs，adherent junction)的细胞增殖的方法，包括将细胞与下调至少一种细胞-细胞连接组分表达的试剂接触。在一种实施方式中，所述细胞-细胞连接组分是AJ蛋白或p190。在另一实施方式中，所述AJ蛋白是钙粘着蛋白。而在另一实施方式中，所述钙粘着蛋白选自N-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、p120联蛋白(以下简称为p120)、E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白和P-钙粘着蛋白。
在一种实施方式中，具有AJs的细胞是，例如，内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、角质形成细胞、外胚层细胞或内胚层细胞。在另一实施方式中，内皮细胞是，例如，人角膜内皮细胞(以下简称HCECs；用在这里，HCECs是角膜后表面处的单层细胞，其朝向前室)、管周内皮细胞、脑微血管内皮细胞、血管内皮细胞、内皮祖细胞、阴道上皮细胞或任何其它类型的上皮细胞。而在另一实施方式中，上皮细胞为，例如，视网膜色素上皮细胞、肌上皮细胞、羊膜上皮细胞、尿道上皮细胞、乳腺上皮细胞、支气管上皮细胞、卵巢上皮细胞、肺泡上皮细胞，或任何其它类型的内皮细胞。而在又一种实施方式中，所述具有AJs的细胞为HCECs。
在一种实施方式中，所述试剂短暂地与所述内皮细胞接触。在另一实施方式中，前述组分的下调由RNA干扰所致。而在另一实施方式中，所述RNA干扰下调p120的表达。而在又一实施方式中，所述试剂为双链RNA。而在又一实施方式中，所述RNA干扰以脉冲式使用。
在一种实施方式中，所述细胞与试剂在体内接触，如在哺乳动物体内，例如，人、猴、狗、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫或兔。优选地，所述哺乳动物为人。在另一实施方式中，所述接触发生在哺乳动物眼中。而在另一实施方式中，所述哺乳动物的眼患有角膜内皮功能障碍，如，例如大疱性角膜病变(包括无晶状体的或人工晶状体的大疱性角膜病变)、角膜内皮细胞营养不良(包括富克斯角膜营养不良、角膜水肿、先天遗传性内皮营养不良，或角膜内皮细胞受损的任意其它病症。而在又一实施方式中，所述试剂被施用到哺乳动物眼的前室。而在又一实施方式中，所述试剂被施用到眼的前室。
在一种实施方式中，所述细胞为HCECs，且所述试剂为下调N-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、p120和/或p190表达的试剂。
本文进一步描述了在培养基中扩增HCECs的方法，包括将所述细胞与下调N-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、p120和/或p190表达的试剂接触；在培养基，如含有生长因子和/或提高胞浆内cAMP的试剂的培养基中接种所述细胞；和培养所述细胞以形成扩增的HCECs。在一种实施方式中，所述试剂短暂地与聚集体或单层形式的HCECs接触。在另一实施方式中，前述组分的下调由RNA干扰所致。而在另一实施方式中，所述RNA干扰下调p120的表达。而在又一实施方式中，所述试剂为双链RNA。而在又一实施方式中，所述RNA干扰以脉冲式应用。而在又一实施方式中，RNA干扰的脉冲持续至少约12小时。而在另一实施方式中，所述HCECs处于聚集状体态或单层形式，在那里AJs形成。
而在另一实施方式中，上述扩增HCECs的方法进一步包括将所述细胞与促有丝分裂生长因子接触。促有丝分裂生长因子包括，例如，表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、其它家族的FGF成员、肝细胞生长因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)或白细胞介素-1(IL-1)。而在又一种实施方式中，扩增HCECs的方法，其中增殖可以被抑制并且AJ形成可以通过将细胞与提高胞浆内cAMP的试剂接触而促进。提高胞浆内cAMP的试剂的实例包括8-溴-cAMP、联丁酰基cAMP、异丁基-甲基黄嘌呤、己酮可可碱(Pentoxifylline)、毛喉素、霍乱毒素、前列腺素E2(PGE2)、丁酸苯酯、布他前列素(Butaprost)、伊洛前列素(Iloprost)或任意其它提高胞浆内cAMP的试剂。在一种特定的实施方式中，所述提高胞浆内cAMP的试剂为霍乱毒素。
本文进一步描述了从角膜细胞分离HCECs的方法，包括将后弹性膜与含有胶原酶的溶液接触，和消化后从溶液中分离HCECs的聚集体。在一种实施方式中，所述胶原酶为胶原酶A、胶原酶B、胶原酶D，或任何分解胶原中三螺旋肽键的酶。在另一实施方式中，所述后弹性膜与含有胶原酶的溶液接触约1到约18小时用于分离至少一个HCEC聚集体，例如，约1.5到约17小时、约5到约17小时、约7到约17小时、约10到约16小时、约12到约16小时，或从约1小时到约18小时的任意其它时间段。在一种实施方式中，HCECs的聚集体可以在消化后通过移液从溶液中分离。在一种实施方式中，HCECs的聚集体可以在消化后通过离心从溶液中分离。而在另一种实施方式中，HCECs的聚集体可以在消化后基于尺寸通过细胞分选仪或网孔筛选从溶液中分离。
本文进一步描述了保存和维持HCEC聚集体活力(viability)的方法，包括在无血清的培养基中储存HCEC聚集体，所述培养基具有约0.8mM到约1.5mM的钙离子浓度，例如，约0.8到约1.5mM、0.85mM到约1.4mM、约0.9mM到约1.3mM、约0.95mM到约1.2mM、约1.0mM到约1.1mM，或从约0.8mM到约1.5mM之间的任何其它浓度。在一种实施方式中，储存培养基中钙离子浓度为约1.08mM。在另一实施方式中，向无血清培养基提供了补充物。
本文进一步描述了手术移植物(surgical graft)，包括：HCECs，其已经(a)使用含有胶原酶的溶液从角膜细胞中分离，(b)任选地在具有约0.8mM到约1.5mM钙离子浓度的无血清培养基中保存，和(c)短暂地与下调p120联蛋白表达的试剂接触；和生物相容性支持物。在一种实施方式中，HCECs被进一步与促有丝分裂的生长因子接触。在另一实施方式中，HCEC的AJ形成通过与提高胞浆内cAMP的试剂接触而被进一步促进。而在另一实施方式中，HCECs被重接种在生物相容性支持物上。生物相容性支持物促进HCEC的粘附，是透明的，并且可以并入角膜间质组织。在一种实施方式中，所述生物相容性支持物是含胶原的细胞外基质。在另一实施方式中，所述生物相容性支持物是羊膜。在另一实施方式中，所述羊膜的厚度被减小。而在又一实施方式中，厚度的减小已经通过利用激基缔合物激光器烧蚀完成。而在另一实施方式中，所述试剂短暂地与聚集体或单层形式的HCECs接触。在又一实施方式中，所述下调p120表达的试剂为RNA干扰。而在又一实施方式中，所述试剂为双链RNA。而在又一实施方式中，所述RNA干扰以脉冲式应用。
附图简述
图1A-F是作为细胞聚集体的分离的HCECs的示例性显微照片。
图2A和图2E是示例性的显微照片，其显示了从胶原酶A消化物中收集的HCEC聚集体。
图2B和图2G是示例性的显微照片，其显示了在高钙无血清培养基中来自图2A的HCEC聚集体。
图2F和图2G是示例性的显微照片，其显示了在低钙无血清培养基中来自图2E的HCEC聚集体。
图2D是示例性的显微照片，其显示了通过在SHEM中进一步培养图2C显示的HCEC聚集体获得的完整的人角膜内皮细胞单层。
图2H是示例性的显微照片，其显示了通过在低钙无血清培养基中进一步培养图2G显示的HCEC聚集体产生的分散的单细胞。
图3是示例性的显微照片，其显示了使用ARPE-19细胞系，晚期汇合(4周培养)，通过p120mRNA的实时PCR定量测定的RNAi敲除(击倒)效率。
图4是显示对照(scRNA)和p120RNAiI敲除培养物的示例性显微照片，其示出了p120移位到每个细胞的细胞核，其也显示了由BrdU核染色判断的增殖。
发明详述
所附的权利要求书特别指出了本文所述的特征。对本公开特征和优点更好的理解将通过参考以下详细描述获得，所述详细描述叙述了示例性的实施方式，其中使用了本文所述的原理。
角膜内皮细胞密度和内皮细胞功能会由于多种疾病、外伤或老龄化的原因而降低。与其它物种，如兔和牛不同，HCECs因其在体内有限的、不明显的再生能力和增殖能力而出名。受损或被破坏的HCECs不被个体再生。
HCECs的破坏和/或功能障碍可以发展为角膜水肿或大疱性角膜病变，其随后引起视觉丧失。其中HCECs退化发生的疾病的实例是角膜内皮细胞营养不良，也被称为富克斯角膜营养不良。角膜内皮细胞的外伤和损伤也可以源自受伤、白内障手术或角膜放射状切开术。
所有角膜移植中约30％是由于角膜内皮细胞疾病进行的。目前，含有健康角膜内皮的尸体供体角膜的全部或部分厚度的角膜移植对由于角膜内皮损伤或疾病引起的视觉丧失仅是可用的补救措施。然而，由于提高的传染性疾病的风险，和矫正性眼部手术的广泛使用——其使得角膜不适合作为替换组织，存在合适的供体角膜组织短缺的现象。而且，角膜组织长期保存用作供体组织仍是未解决的问题。
补充由于营养不良、外伤和手术介入的发生而引起的体内HCECs丧失的主要方式是补偿性细胞的迁移和扩增。作为角膜内皮功能障碍的替代疗法，本文描述了用于刺激在分化期间形成AJs并因此失去增殖潜能的细胞，如HCECs增殖的方法，这通过将所述细胞与下调E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、p120和/或p190表达的试剂接触进行。
而且，HCEC’s增殖的操控可以帮助扩增HCECs，以治疗具有功能障碍的HCECs的眼，作为用于体内疗法和体外组织工程的策略。体外工程化人角膜内皮的能力是重要的，因为其可以随后避免角膜或HCECs手术移植的必要，并且这些组织也可被用作替代的移植物，以恢复患有角膜内皮功能丧失的眼的视力。因此，本文描述了通过用促有丝分裂刺激物和提高胞浆内cAMP并促进带有AJ再形成的分化的试剂间歇地(用脉冲方式)、散布地或混杂地刺激增殖来分离、保存和扩增HCECs的方法，和用以替代角膜内皮组织的新手术植入物。
理论上，有效的工程方法应该包含三个关键步骤：从供体角膜分离HCECs；分离的HCECs保存一段时间，以便允许移植；和分离的HCECs在适于移植的合适体外环境中的增殖。在每一个步骤中，HCECs也可能被细胞暴露于其中的培养基影响，其可能影响AJ形成和细胞增殖之间的平衡作用。
用于人角膜内皮组织工程化的一个前提条件是保证从少量HCECs进行有效分离、保存和扩增。另一前提条件是保证增殖(扩增)不与正常HCEC表现型的丧失关联，而与具有AJ形成的HCEC表现型的保持(恢复)相关。
分离方法
本文公开了从被相邻间质组织角膜细胞污染中分离HCECs的方法。机械剥离的后弹性膜含有一些间质组织，其中有角膜细胞。以前的方法采用含有或不含胰蛋白酶的EDTA，具有或没有后续胰蛋白酶/EDTA的分散酶，胰蛋白酶或EDTA接着胶原酶，或胶原酶接着胰蛋白酶或EDTA。然而，由于使细胞从基质上脱离所需延长的温育时间，这些方法导致细胞变性、细胞损伤和产率降低，或成纤维细胞(角膜细胞)污染。而且，这些方法要求额外的选择培养基的使用，以防止这种成纤维细胞(角膜细胞)污染的发生。
本文公开的方法包括，例如使后弹性膜与含有胶原酶的溶液接触，和从该溶液中分离HCEC聚集体的步骤。例如，后弹性膜可以在含有一定浓度胶原酶的溶液中消化一段时间，足以使粘附的HCECs从溶解的膜上脱落并形成至少一个悬浮在没有角膜细胞的溶液中的HCECs聚集体，所述角膜细胞被从聚集体排除。在胶原酶溶液中的消化帮助消除来自角膜间质组织的角膜细胞的污染，因为形成的HCEC聚集体可随后被转移到单独的培养皿中以避免角膜细胞的污染。这样的HCEC聚集体应该保持细胞-基质相互作用和细胞-细胞AJs，与体内状态相似。
所用的胶原酶可以是，例如，胶原酶A、胶原酶B、胶原酶D或分解胶原中肽键的任何酶。溶液中胶原酶A的浓度范围可以从约0.5mg/ml到约5mg/ml，如，约0.75mg/ml到约4mg/ml、约1mg/ml到约3mg/ml、约1mg/ml到约2mg/ml、约1.5mg/ml到约2.0mg/ml或约0.5mg/ml到约5mg/ml之间的任意其它范围。
从角膜细胞中分离至少一个HCECs聚集体的溶液可以包含适合培养该细胞的任何培养基，如补充的激素上皮培养基(SHEM)。所述培养基可以补充以其它物质，如，例如血清、抗生素、生长因子，或提高胞浆内cAMP的试剂。可被用于提高胞浆内cAMP的试剂包括，例如，可透过膜的cAMP类似物，如8-溴-cAMP和联丁酰基cAMP，和其它细胞内cAMP提高试剂，如磷酸二酯酶抑制剂，例如，异丁基-甲基黄嘌呤和己酮可可碱；腺苷酸环化酶激活剂，如毛喉素或霍乱毒素；或外源试剂，如前列腺素E2(PGE2)、丁酸苯酯、布他前列素或伊洛前列素；或提高胞浆内cAMP的任何其它试剂。在一种实施方式中，所述培养基含有等体积的HEPES缓冲的DMEM和HAM氏F12；5％胎牛血清；0.5％二甲基亚砜；2ng/ml小鼠表皮生长因子；5μg/mL胰岛素；5μg/ml转铁蛋白；5ng/ml硒；0.5μg/ml氢化可的松；1nM霍乱毒素；50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素B。
后弹性膜可以在约37℃的温度下温育约1到约18小时，以从角膜细胞中分离至少一个HCEC聚集体，例如，约1.5到约17小时、约5到约17小时、约7到约17小时、约10到约16小时、约12到约16小时，或约1小时到约18小时中任意其它时间段。在胶原酶溶液中分离HCECs所必须的温育时间可以取决于，例如，期望的消化的量、期望的HCEC聚集体的数量、胶原酶溶液的浓度和/或待消化的后弹性膜的尺寸，并且基于这里提供的公开，可以由本领域普通技术人员容易地确定。
后弹性膜消化和HCEC聚集体从角膜细胞分离之后，聚集体可以通过移液被从溶液中收集并移取。可选地，HCEC聚集体可以通过其它方法收集，包括离心或通过细胞分选仪或网筛基于尺寸进行筛选。不管怎样，收集应该在不扰乱聚集体的情况下发生。
保存/维持的方法
分离的HCEC聚集体，包括按照上文所述分离的那些，可以进一步被组织为圆形，如果在无血清高钙浓度培养基中连续培养达约3周或更长时间，并且这样保存的球形可以产生带有六边形表现型的HCECs单层(图2D)。本文公开了通过在具有高钙离子浓度的无血清培养基中储存聚集体而保存和维持HCEC聚集体活力的方法。
用在这里，在储存培养基中高钙离子浓度为约0.8mM到约1.5mM钙浓度，例如，约0.8到约1.5mM、0.85mM到约1.4mM、约0.9mM到约1.3mM、约0.95mM到约1.2mM、约1.0mM到约1.1mM，或从0.8mM到约1.5mM之间的任意其它浓度。在一种实施方式中，储存培养基中钙离子浓度为约1.08mM。
所述储存培养基可以是适合储存HCECs的任何无血清培养基，如Dulbecco氏修改的Eagle培养基(DMEM)、Ham氏F12、或如SHEM中所用的DMEM和F12的混合物，只要钙浓度达到上述标准。在培养基中，额外的生长补充物可以被加入，如促有丝分裂生长因子、抗生素、提高胞浆内cAMP的试剂、KSFM补充物或SHEM补充物，只要胎牛血清(FBS)或其它血清因子包括纤维粘连蛋白被除去。
一旦HCEC聚集体被置于无血清、高钙浓度的储存培养基中，它们可以在如组织培养温育箱中，在例如约37摄氏度的温度下培养达约3周或更长的时间。聚集体可以在储存培养基中保持为漂浮的聚集体，并可以被用于在例如含血清的培养基中进行后续培养，如下文所述。而且，HCEC聚集体的增殖可按下文所述进行刺激。
扩增方法
本文公开了刺激在分化期间形成AJs并停止增殖的细胞增殖的方法，包括将所述细胞与下调E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、p120和p190表达的试剂接触。例如，按上文所述分离和保存的HCEC聚集体或从HCEC聚集体衍生的HCEC单层的增殖可以使用所述方法刺激。
不希望被理论限制，提出：HCECs的细胞-细胞连接的分解可能会帮助它们分散为单层而扩增。细胞-细胞接触包括AJs、紧密连接(TJ)和细胞桥粒。在这些接触中，AJs对控制细胞增殖、连接、特异性、细胞间粘附的形成和维持特别重要。AJs是由钙粘着蛋白和联蛋白介导的肌动蛋白基的细胞间连接，并代表单跨膜结构域糖蛋白的一个独特家族，其介导钙依赖的细胞增殖和细胞-细胞粘附。AJs的关键成员包括钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白和p120。在钙粘着蛋白家族中，有E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白和P-钙粘着蛋白，其表达取决于细胞类型。一般地，联蛋白是80到102-千道尔顿蛋白的家族，其被认为在细胞与细胞粘附的调控中具有主要的作用，与它们和E-钙粘着蛋白、其它钙粘着蛋白和肌动蛋白细胞骨架的相互作用有关。P190是RhoA家族GTP酶激活蛋白，其调控肌动蛋白应力纤维动力，并通过抑制F-肌动蛋白纤维的焦点粘附和肌球蛋白介导的收缩而在调控细胞骨架动力中发挥作用。
对于HCECs，关键的钙粘着蛋白是N-钙粘着蛋白而非E-钙粘着蛋白或VE-钙粘着蛋白(其以非常小的量产生)；如本文所述，α-联蛋白、β-联蛋白、p120和p190也存在于HCECs中。典型地，细胞-细胞连接已经被认为是已分化细胞的结构元素。然而，不希望被理论限制，通过这些细胞-细胞连接组分短暂下调解开HCECs的有丝分裂阻抑可以促进HCECs的扩增。N-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、p120和p190因此是解开HCECs中有丝分裂阻抑的合适目标。
以前用于刺激带有Ajs的细胞增殖的方法采用诸如胰蛋白酶的酶和/或如EDTA的二价阳离子螯合剂。然而，使用胰蛋白酶/EDTA的方法不能在体内应用中被有效地使用，因为其具有潜在的有害性。而且，胰蛋白酶/EDTA可能解离周围的细胞-基质相互作用，并且额外地靶向一个以上的AJs组分。此外，胰蛋白酶/EDTA将无差别地解离HCECs和相邻的角膜细胞。细胞-细胞连接和细胞-基质相互作用这样非特异且宽泛的解离之后，HCECs将增殖但也转化为成纤维细胞，模拟被称作角膜后膜的病理状态，特别是在由诸如IL-1和bFGF的生长因子的刺激下。
在一种实施方式中，短暂的EDTA处理通过释放由细胞-细胞接触介导的促有丝分裂阻抑而促进HCEC聚集体的增殖(实施例3)。然而，如上文所述，这样的处理产生不适于人移植的HCEC细胞，并且导致细胞-细胞连接和细胞-基质相互作用的非特异且宽泛的解离。
在另一实施方式中，含有AJs细胞的增殖可以通过靶向特异的细胞-细胞连接组分而被刺激。细胞-细胞连接组分可被敲除，以帮助解开在分化期间表达Ajs同时失去增殖潜能的细胞的促有丝分裂阻抑。钙粘着蛋白的实例包括E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白和P-钙粘着蛋白。联蛋白的实例包括α-、β-、γ-联蛋白和p120。如果待敲除的RNAi为p120，例如，p120RNAi 1或p120RNAi 3可以被使用(表5)。p120的下调导致细胞-细胞连接的分解，以及对ARPE-19细胞而言E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白和β-联蛋白明显下调(实施例5)，以及对HCECs而言N-钙粘着蛋白、E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白和β-联蛋白明显下调(实施例6)。此外，p120被从细胞-细胞连接转运到HCECs的细胞核，如通过BrdU(表示DNA合成的标记)的核染色判断，其证明增殖(图4)。钙粘着蛋白(即，对HCECs为N-钙粘着蛋白)、α-联蛋白和β-联蛋白被发现在细胞-细胞连接被破坏时代谢不稳定，而p120则稳定(实施例4，表3)，这表明靶向p120是特异且更有效的。
在另一实施方式中，含有AJs细胞的增殖可以通过RNAi敲除靶向p120而被刺激。RNAi指的是引入双链RNA(dsRNA)到细胞中，在细胞中其诱导互补mRNA的降解并由此抑制基因表达。公开的RNAi序列可被用于下调p120，或者特异的RNAi序列可以被设计，如，基于Invitrogen BlockitTM RNAiDesigner，通过考虑，例如，(a)期望mRNA开放阅读框的不同靶向区域；(b)如Mittal V，Nature(2004)5：355-365中发表的RNAi设计原理；和(c)BLAST搜索以保证期望的RNAi是特异的。
对于体内应用，RNAi可以脉冲式应用，如，RNAi应用一段时间后接着退出，在退出的这段时间中含有促有丝分裂刺激物的培养基与提高胞浆内cAMP的试剂一起被施用一段时间，随后下一次应用RNAi；或施用含有促有丝分裂刺激物的培养基接着施用提高胞浆内cAMP的试剂一段时间，随后下一次应用RNAi。例如，RNAi可以被应用约12到约72小时，如，约12小时、16小时、约20小时、约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时、约52小时、约56小时、约60小时、约64小时、约68小时、约72小时，或约12到约72小时之间的任意其它时间，并且退出或休整时间可以为约12到约48小时中的任意时间段，如，约12小时、16小时、约20小时、约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时、约52小时、约56小时、约60小时、约64小时、约68小时、约72小时，或约12到约72小时之间的任意其它时间。在一种实施方式中，RNAi被应用24小时的时间，并随后在下一个RNAi脉冲施用进行之前退出或休整24小时。
在一种实施方式中，所述细胞与试剂体内接触，如在哺乳动物体内，例如，马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、兔、猴或人。优选地，所述哺乳动物为人。在另一实施方式中，所述接触发生在哺乳动物眼中。而在另一实施方式中，所述哺乳动物的眼患有角膜内皮功能障碍，如，例如大疱性角膜病变(包括无晶状体的或人工晶状体的大疱性角膜病变)、角膜内皮细胞营养不良(富克斯角膜营养不良)、角膜水肿、先天遗传性内皮细胞营养不良，或角膜内皮细胞受损的任意病症。而在又一实施方式中，所述试剂被施用到哺乳动物眼的前室。
对于体外应用，RNAi可以以脉冲方式应用于聚集体或单层形式的HCECs，并间插或混以含有促有丝分裂刺激物的培养基的替代，与提高胞浆内cAMP的试剂一起施用或在之后施用提高胞浆内cAMP的试剂，例如，RNAi被应用一段时间，并然后接着在下一个RNAi脉冲应用之前是退出或休整时间，退出或休整期间使用含有促有丝分裂刺激物的新鲜培养基，同时使用提高胞浆内cAMP的试剂，或在之后使用提高胞浆内cAMP的试剂。例如，RNAi可以被应用约12到约72小时，如，约12小时、16小时、约20小时、约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时、约52小时、约56小时、约60小时、约64小时、约68小时、约72小时，或约12到约72小时之间的任意其它时间，并且退出或休整时间可以为约12到约48小时中的任意时间段，如，约12小时、16小时、约20小时、约24小时、约28小时、约32小时、约36小时、约40小时、约44小时、约48小时、约52小时、约56小时、约60小时、约64小时、约68小时、约72小时，或约12到约72小时之间的任意其它时间。在退出或休整期间使用的新鲜培养基可以是适合培养这样的细胞的任何培养基，如补充的激素上皮培养基(SHEM)。在一种实施方式中，在被含有促有丝分裂刺激物的培养基替代之前，RNAi被应用上述的时间，如在RNAi的下一个脉冲应用实施之前，使用肽生长因子如EGF和bFGF以及提高胞浆内cAMP的试剂如霍乱毒素，或在使用肽生长因子如EGF和bFGF之后使用提高胞浆内cAMP的试剂如霍乱毒素，以促进AJ形成24小时或上述任意的时间段。
待应用RNAi的HCEC培养物可以是聚集体或单层形式。HCEC单层可以是早期汇合(如，汇合约1、约2、约3、约4、约5、约6或约7天)或晚期汇合(如，约2周、约3周、约4周或约5周汇合)。RNAi短暂转染HCEC细胞后，转染试剂可以被除去，并且细胞可以被传代并按照上文所述的细胞培养技术扩增，以维持特有的六边形嵌合表现型。
在另一实施方式中，应用于HCECs的培养基补充有可以提高胞浆内cAMP的试剂。不希望被理论限制，胞浆内cAMP的提高抵消了由延长和持续的增殖引起的副作用，所述延长和持续的增殖由促有丝分裂生长因子，如EGF和bFGF，特别是IL-1和bFGF引起的，副作用如转化进成纤维细胞和特征性HCEC表现型的丧失。可被用于提高胞浆内cAMP的试剂包括，例如，可透过膜的cAMP类似物，如8-溴-cAMP和联丁酰基cAMP，和其它细胞内cAMP提高试剂，如磷酸二酯酶抑制剂，例如，异丁基-甲基黄嘌呤和己酮可可碱；腺苷酸环化酶激活剂，如毛喉素或霍乱毒素；或外源试剂，如前列腺素E2(PGE2)、丁基苯酯、布他前列素或伊洛前列素；或提高胞浆内cAMP的任何其它试剂。产生的细胞适合人类移植。
手术移植物/治疗方法
按上文所述制备的HCECs可以在具有或没有适当载体或支持物的条件下被作为组织输送，即，作为手术移植物。这里公开的是手术移植物，所述手术移植物含有HCECs，其已经(a)使用含有胶原酶的溶液从角膜细胞中分离，(b)任选地在具有约0.8mM到约1.5mM钙离子浓度的无血清培养基中保存，和(c)短暂地与下调p120表达的试剂接触；和生物相容性支持物。在一种实施方式中，HCECs被进一步与促有丝分裂的生长因子接触。在另一实施方式中，HCEC的AJ形成进一步通过与提高胞浆内cAMP的试剂接触而促进。而在另一实施方式中，HCECs被重接种在生物相容性支持物上。生物相容性支持物促进HCEC的粘附，是透明的，并且可以整合入角膜间质组织。在一种实施方式中，所述生物相容性支持物是含胶原的细胞外基质。在另一实施方式中，所述生物相容性支持物是羊膜。在另一实施方式中，所述羊膜的厚度已被减小。而在又一实施方式中，厚度的减小已经通过利用激基缔合物激光器烧蚀完成。而在另一实施方式中，所述试剂短暂地与聚集体或单层形式的HCECs接触。在又一实施方式中，所述下调p120表达的试剂为RNA干扰。而在又一实施方式中，所述试剂为双链RNA。而在又一实施方式中，所述RNA干扰以脉冲式应用。
用于这种移植物的HCEC来源可以从自体的(来自同一个体)或异体的(来自不同的个体)来源获得，并被用作手术移植物以治疗患有角膜内皮疾病的患者。自体移植物是由接受者的自身组织，例如从接受者健康的眼制备的移植物。异体移植物是遗传上不相同的个体之间的组织的移植物。异体移植物可以由从例如，尸体的眼或活的亲属个体获得的组织制备。自体移植物显出了避免异体移植物排斥的优点，这在传统的角膜移植中不可避免。
此外，按上文所述制备的HCECs也可以被包括在工程化或再生的组织中，如角膜间质组织或整个角膜组织。这种工程化的组织可以被用作手术移植物，和用于测试疗法的目的或并入基因疗法中，以提高组织的功能。本文所述的方法和组合物也可被扩展到其它物种中以实施相同的应用。
实施例
以下特定的实施例被解释为仅仅是示例性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。在没有进一步详述的情况下，有理由相信本领域普通技术人员基于本说明书可以使用本发明到其最完全的程度。本文引用的所有出版物在此被完整引入作为参考。其它参考文献证明这些信息的可用性和公开传播。
实施例1：HCFCs的分离
材料：Dulbecco修改的Eagle氏培养基(DMEM)、Ham氏/F12培养基、角质形成细胞无血清培养基(KSFM)、OptiMEM-1培养基、HEPES缓冲液、Hank氏平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、两性霉素B、庆大霉素、胎牛血清(FBS)、牛脑垂体提取物、人重组表皮生长因子(h-EGF)、0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA(胰蛋白酶/EDTA)和存活/死亡(LIVE/DEAD)测试试剂从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买。分散酶II和胶原酶A从Roche(Indianapolis，IN)获得。氢化可的松、二甲基亚砜、霍乱毒素、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂、L-抗坏血酸、硫酸软骨素、碘化丙锭、Hoechst-33342染料、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、人碱性成纤维细胞生长因子(h-bFGF)、仲甲醛和FITC偶联的抗小鼠IgG从Sigma(St.Louis，MO)购买。小鼠抗-ZO-1抗体和I型胶原从BD Biosciences(Bedford，MA)购买。小鼠抗层粘连蛋白5、IV型胶原α2链、基底膜蛋白多糖和连接蛋白43抗体从Chemicon(Temecula，CA)购买。小鼠抗IV型胶原α1抗体从KamiyaBiomedical(Seattle，WA)购买。抗褪色装片(mounting)溶液来自VectorLaboratories(Burlingame，CA)。小鼠抗Ki67抗体来自DakoCytomation(Carpinteria，CA)。DeadEndTM荧光TUNEL系统来自Promega(Madison，WI)。
人组织根据赫尔辛基声明(Declaration of Helsinki)操作。十八份来自人捐献者眼的角膜巩膜组织从Florida Lions Eye Bank(Miami，FL)获得，它们中一些中央角膜片已经被用于角膜移植。捐献者的年龄在18到68岁之间(41.4±15.8岁)。所有的组织在研究前都在4℃下保存于
Figure G2007800437469D00141
(Bausch&Lommb，New York)培养基中小于10天。所述组织用含有50mg/mL庆大霉素和1.25mg/mL两性霉素B的DMEM培养基冲洗三次。
中央角膜通过8mm直径的环钻除去。接着，后弹性膜以及角膜内皮细胞在解剖显微镜下被从外周角膜巩膜组织的后表面上剥离，并在37。℃用在SHEM培养基中的2mg/mL胶原酶A消化1.5到16小时，所述SHEM培养基由等体积的HEPES缓冲的DMEM和用5％FBS、0.5％二甲基亚砜、2ng/mL小鼠EGF、5μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白、5ng/mL硒、0.5μg/mL氢化可的松、1nM霍乱毒素、50μg/mL庆大霉素和1.25μg/mL两性霉素B补充的Ham氏F12制备。消化后，HCECs形成聚集体，其通过在2,000rpm离心3分钟除去消化溶液而收集。作为对照，后弹性膜条也在于SHEM培养基和胰蛋白酶/EDTA中的10mg/ml分散酶II中消化达3小时。
胶原酶消化1.5小时足以从后弹性膜分离内皮细胞并形成松散的聚集体，留下被剥离的后弹性膜。消化3小时后，从胶原酶消化物获得的内皮细胞聚集体变得更紧密；但是，后弹性膜还没有溶解。12小时消化后，后弹性膜被完全消化，并且HCEC聚集体的大部分变得非常紧密。如通过存活/死亡测试和TUNEL测试所证实，在这些HCEC聚集体中，内皮细胞保持高度的活力。那些保持松散的少数HCEC聚集体被证实含有更多的死细胞。基于这些结果，我们得出这样的结论：12小时的消化产生具有高细胞活力的紧密HCEC聚集体。这些紧密的HCEC聚集体可帮助内皮细胞的长期保存，因为它们维持了细胞-细胞连接。
结果.在后弹性膜被从角膜巩膜环组织的外周角膜上经手术剥离下来之后，大部分HCECs仍粘附在后弹性膜上，而一些细胞脱落(由虚线和星号标记)，产生没有细胞的区域(图1A)。在SHEM中37℃分散酶II消化1.5小时后，HCECs开始聚集但仍没有从后弹性膜上脱落(图1B)。
相反，在剥离的后弹性膜在胶原酶A中消化1.5小时后，HCECs聚集成明显地簇并完全从后弹性膜脱落(图1C)，留下完整的后弹性膜。3小时后，这些从胶原酶A消化物获得的聚集体变得更紧密。然而，分散酶II消化后，细胞仍没有从后弹性膜上脱落并开始分解(数据未显示)。值得注意的是，胶原酶A消化16小时后，后弹性膜被溶解并且大部分HCEC聚集体紧密并显示出不同的尺寸和形状(图1D)，而非常少的几个显示出松散性(图1D、1E，箭头)。
存活/死亡测试(LIVE/DEAD assay)显示紧密的聚集体包含存活的细胞，其显示出强烈的绿色荧光(图1F)。相反，松散的聚集体包含死细胞(图1F，由箭头标记)。图1E是图1F的相差显微照片。比例尺代表100微米(μm)。我们推测这些细胞可能在捐献者角膜储存期间已经死亡，并因此不能在胶原酶A消化过程中形成聚集体。
为了研究细胞-细胞连接和基膜组分在胶原酶A消化后是否仍被保持，HCEC聚集体被嵌入OCT，制备冷冻切片，并进行免疫染色。结果显示紧密连接ZO-1间隙连接连接蛋白-43，和诸如IV型胶原α1和α2链、层粘连蛋白5和基底膜蛋白多糖这样的基膜组分都在HCEC聚集体中存在。
核复染色进一步显示聚集体中的HCECs是紧密的。TUNEL测试证实仅少数凋亡细胞存在于聚集体的中心。
为了进一步研究这些基膜组分是否帮助维持HCECs的活力，胶原酶分离的聚集体随后用分散酶II(10mg/mL，在SHEM中)在4℃处理16小时，我们已经报告该处理可以除去胶原IV和层粘连蛋白5。结果显示额外的分散酶II消化不分解HCEC聚集体，并且其中的细胞仍存活，如通过存活和死亡测试判断。然而，分散酶处理的HCEC聚集体不能容易地附着在SHEM中的塑料上，而未经分散酶处理的聚集体则可以。这些结果表明：细胞-细胞连接可能在形成聚集体和维持HCECs的细胞活力方面比细胞-基质相互作用发挥更重要的作用，以及聚集体中残余的基膜基质组分可能在亚培养期间促进HCECs在塑料上的细胞粘附中发挥重要的作用。
实施例2：分离的HCEC聚集体的保存
所得的HCEC聚集体被保存在含有不同补充物的无血清低钙或高钙培养基中(表1)。储存培养基1——KSFM基培养基——的钙浓度为0.08毫摩尔(mM)，我们定义为“低钙”培养基。基于DMEM.F12的基本培养基和FBS中的钙，储存培养基2、3和所有培养基的钙浓度为约1.08mM。我们定义这些具有约1.08毫摩尔(mM)钙浓度的培养基为“高钙”培养基。
HCEC聚集体被保存在约37℃的组织培养箱中达3周。细胞活力通过存活和死亡测试确定，并且也通过在含血清的培养基中亚培养它们来评估(表2)。
表1.用于HCEC聚集体的不同储存培养基
  培养基类型   基本培养基   补充剂
  1   KSFM   KSFM补充剂
  2   DMEM/F12   KSFM补充剂
  3   DMEM/F12   SHEM培养基补充剂，无FBS
表2.用于HCEC聚集体的不同培养基
  培养基类型   基本培养基   补充剂
  1   DMEM/F12   SHEM培养基补充剂
  2   DMEM/F12   SHEM培养基补充剂+0.1mg/ml BPE
  3   DMEM/F12   SHEM培养基补充剂+20ng/ml NGF
  4   DMEM/F12   SHEM培养基补充剂+40ng/ml bFGF
结果.当在含血清的培养基中温育时，HCEC聚集体在12小时内快速附着在塑料培养皿上。相反，当在无血清培养基中温育时，它们保持为漂浮的聚集体(图2C，2G)。在后一种情况下，漂浮的聚集体于1周后逐渐在低钙无血清培养基(培养基1)中分解(图2F，2G)。
相反，HCECs在一周后在高钙无血清培养基中(培养基2和3)组成圆球形(图2B)，并在3周时组成紧密的圆球形(图2C)。在第三周最后，当接种于SHEM中的塑料上时，这些聚集体在12小时内附着并在四天内扩展为完整的人角膜内皮层(图2D)。然而，保存在低钙无血清培养基中的那些仅能够产生非常少的单细胞(图2H)。比例尺代表100μm。
这些结果表明胶原酶分离的HCEC聚集体可以在高钙无血清培养基中保存至少三周，并且这些保存的聚集体仍保持高HCEC活力，用于后续在含血清的培养基中培养。
实施例3：使用胰蛋白酶/EDTA扩增分离的HCEC聚集体
产生的HCEC聚集体，在消化后即刻或在储存培养基中保存一段时间后，接着在约37℃的温度和百分之五(5％)二氧化碳(CO2)条件下，在不同的培养基中的塑料培养皿上培养。培养基每2到3天更换。一些HCEC聚集体用胰蛋白酶/EDTA在37℃预处理10分钟，以在上述培养前解离内皮细胞。
HCEC聚集体被嵌入OCT并进行冷冻切片。4微米(μm)的冷冻切片在室温下风干30分钟，并在-20℃的冰冻丙酮中固定10分钟。用于免疫染色的切片在PBS中再水化，并在0.2％Triton X-100中温育10分钟。用PBS润洗三次，每次5分钟并用2％BSA预温育以阻断非特异性染色后，切片用抗-层粘连蛋白5、IV型胶原α1和α2链、基底膜蛋白多糖、ZO-1和连接蛋白43(所有均为1∶100)抗体温育1小时。用PBS润洗三次15分钟后，切片用FITC-偶联的二抗(山羊抗兔或抗小鼠IgG，1∶100)温育45分钟。
三次额外的PBS润洗，每次10分钟之后，它们用碘化丙锭(1∶1000)或Hoechst-33342(10μg/mL)复染色，随后用抗退色溶液装片并用荧光显微镜分析。在24孔板或腔室载玻片中培养的HCECs在4％仲甲醛中在室温下固定15分钟，并使用上述方法用抗ZO-1和连接蛋白43抗体染色。
对于Ki67的免疫组织化学染色，内源过氧化物酶活性由0.6％的过氧化氢抑制10分钟。非特异性染色由1％正常山羊血清抑制30分钟。细胞随后用抗Ki67抗体(1∶100)温育1小时。用PBS润洗三次15分钟后，细胞与生物素化的兔抗小鼠IgG(1∶100)温育30分钟，接着用ABC试剂温育30分钟。反应产物用DAB显影5分钟并在光学显微镜下观察。
存活/死亡测试和末端脱氧核糖核苷酸基转移酶介导的FITC-连接的dUTP缺口末端DNA标记(TUNEL)测试分别被用于测定细胞活力和细胞凋亡。HCEC聚集体用存活/死亡测试试剂在室温下温育15分钟。活细胞通过细胞细胞质的绿色荧光染色分辨，而死细胞在核内有红色荧光染色。TUNEL测试根据生产商的说明进行。简单地说，HCEC聚集体的横切面用4％甲醛在室温下固定20分钟并用1％的Triton X-100渗透。样品随后用外源TdT和荧光素偶联的dUTP在37℃温育60分钟，以修复缺口的3’-羟基DNA末端。细胞用DNA酶I处理作为阳性对照，而阴性对照与缺少rTdT酶的缓冲液温育。凋亡的细胞核用绿色荧光标记。
结果.在37℃胰蛋白酶/EDTA短暂处理10分钟后，HCEC聚集体被分解成更小的簇和单细胞。大多数细胞在24小时内附着并扩展(图5B)，并在四天后长成片和层。一周后，这些细胞达到汇合并保持表现型的六边形形状。
免疫染色显示汇合的细胞表达维持体内形态的标记物：紧密连接ZO-1标记蛋白和间隙连接连接蛋白-43标记蛋白。这些结果表明：通过EDTA/胰蛋白酶额外的短暂消化确实导致HCECs成功地扩展为单层。
为了进一步证实前述胰蛋白酶/EDTA的短暂处理对刺激HCEC增殖是必须的，我们进行了Ki67的免疫组化染色，Ki67在除G0以外的细胞周期所有阶段都表达。直接接种在没有胰蛋白酶/EDTA处理的塑料上的HCEC聚集体在SHEM中培养一周后也产生层状生长。然而，Ki67阳性细胞核仅在生长物外周偶尔被观察到。相反，简短的胰蛋白酶/EDTA处理后，如果接种在SHEM中的塑料上，尽管HCEC聚集体也产生汇合的细胞层，但是更多的细胞显示出随机分布的Ki67阳性细胞核。该结果表明：短暂的胰蛋白酶/EDTA处理确实促进细胞增殖。
为了确定SHEM中生长因子的额外补充是否有益，有或无简短的胰蛋白酶/EDTA处理的HCEC聚集体在含有或不含100μg/mL BPE、20ng/mLNGF或40ng/mL bFGF的SHEM中培养一周。结果显示：额外的BPE刺激细胞更分散，导致完整层的丧失，并且如果用胰蛋白酶/EDTA预处理，这一现象变得更明显并且大多数细胞变为成纤维细胞的形状。相反，额外的NGF不引起前述显著的细胞形状变化，并且在没有或有胰蛋白酶/EDTA处理的情况下细胞仍保持完整的层状。Ki67染色揭示了SHEM中加入BPE或NGF在有或没有胰蛋白酶/EDTA短暂处理的情况下产生较少的Ki67阳性细胞核。与BPE相比，当bFGF被加入SHEM时获得相似的结果。
这些结果表明：短暂的胰蛋白酶/EDTA处理在所有这四种培养中都产生较多的Ki67阳性，并且细胞增殖未通过在SHEM中加入任何这三种生长因子补充物而被促进。在SHEM中加入BPE或bFGF导致六边形表现型和细胞-细胞连接形成的丧失，表明这些生长补充剂的每一种都增加细胞迁移和分化。总之，但是，胰蛋白酶/EDTA处理引起不可逆的HCEC损伤。
实施例4：HCECs中细胞-细胞连接及其调控分子的mRNA表达在体内 和体外的确定
HCEC中AJs和TJs及其调控分子在体内和体外的表达，以及与细胞的细胞骨架激动蛋白纤维和增殖的相关性被确定。HCEC中Ajs/TJs及其调控分子体内和体外在塑料上达14天的mRNA表达通过传统的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)确定。HCECs中AJs的阳性表达组分体内和体外的mRNA表达也通过实时PCR确定。
所有的PCR片段都是预期的大小。HCECs在体内表达高水平的N-钙粘着蛋白(II型)、E-钙粘着蛋白(II型)、VE-钙粘着蛋白、p-钙粘着蛋白、p120、p190、Racl和RhoA的mRNA，并在mRNA水平表达E-钙粘着蛋白(I型)、N-钙粘着蛋白(I型)、α-联蛋白、β-联蛋白、γ-联蛋白和ZO-1。14天培养后，HCEC体外表达相似水平的细胞-细胞连接相关分子mRNA，除了E-(I和II型)和P-钙粘着蛋白。HCECs中体外N-钙粘着蛋白(II型)的早期恢复表明：N-钙粘着蛋白可能参与由p120募集并稳定的AJs形成的早期阶段。在这一阶段，p120可能分散于细胞溶胶和核中，并发挥转录因子的作用。N-钙粘着蛋白可能从连接扩散进细胞溶胶，作为未成熟的标志。在第21天，N-钙粘着蛋白在细胞-细胞连接处形成环状条带，并且p120在内细胞膜处形成环状条带，而N-钙粘着蛋白和VE-钙粘着蛋白在HCECs的细胞溶胶中。这一模式代表了与体内发现相似的成熟模式。
短暂的胰蛋白酶/EDTA处理显著地解离AJ和TJ组分，如通过VE-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白(II型)、β-联蛋白和ZO-1明显的下调证明(表3)。在这种情况下，AJs和TJs在2天培养中没有形成或形成很差。
制备人内皮后弹性膜的平面装片的切片，在室温下风干，并立即在室温下4％甲醛中固定。用于免疫染色的切片在PBS中水合，并在0.2％TritonX-100中温育15分钟。用PBS润洗三次，每次5分钟并用2％BSA预温育30分钟以阻断非特异染色后，切片用抗N-钙粘着蛋白、E-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白和p120(所有均为1∶50)抗体在4℃温育16小时。用PBS润洗三次15分钟后，切片用德州红(Texas-red)偶联的二抗(驴抗兔或抗小鼠IgG，1∶100)温育60分钟。三次额外的PBS洗涤，每次10分钟之后，用Hoechst-33342(10μg/mL)复染色，随后用抗退色溶液装片并用荧光显微镜分析。
结果.体外培养的HCEC在培养14天后具有提高的p120、p190和α-联蛋白的水平。HCEC体外的p120水平比HCEC体内的高四倍，其可能在体外抑制HCEC增殖。实时PCR结果与RT-PCR的那些结果相当。
表3.AJ相关分子mRNA表达的概要
表4.体外HCEC与体内样品实时PCR结果的比较
Figure G2007800437469D00202
通过免疫染色，N-钙粘着蛋白和p120水平与第7、14和21天培养的HCEC中的细胞骨架的成熟(肌动蛋白网络形成)关联，表明它们的表达与AJs的体外成熟和AJs在晚期汇合的稳定相关。
首先，N-、E-、VE-钙粘着蛋白、p120和肌动蛋白细胞骨架网络在体内HCEC中通过带有内皮细胞的后弹性膜的水平装片制备物被识别。体内HCEC显示出主要在细胞-细胞交界的环状N-钙粘着蛋白条带，主要在细胞溶胶中的连续环状E-钙粘着蛋白条带，和在细胞溶胶中微弱的、不连续的环状VE-钙粘着蛋白条带。P120被安排在体内HCEC中接近细胞-细胞边界的细胞溶胶中，形成环状条带。F-肌动蛋白在与相邻细胞分开的单个细胞中被安排为紧密的外周条带(DPB)。
接着，N-钙粘着蛋白、p120和肌动蛋白细胞骨架网络的染色模式在体外HCEC中被识别，并且通过Brd U标记N-钙粘着蛋白的染色与增殖相关，以确定何时HCECs中的环状N-钙粘着蛋白可以被体外确定以及N-钙粘着蛋白是否与细胞有丝分裂阻抑相关。没有一抗的体外HCEC被用作阴性对照。
结果.体外HCEC在第21天显示出主要在细胞-细胞交界的环状N-钙粘着蛋白条带，与体内HCEC的位置和染色模式相似，这表明了体外HCEC的成熟。在第7天，体外HCEC已经形成破碎的环状条带，并且在第14天体外HCEC仍在细胞-细胞连接处显示出不完整的环状N-钙粘着蛋白条带，这表明在这一培养时期的HCEC不成熟。P120在第21天被排列在体外HCEC的内细胞膜中，具有环状条带，这表明HCEC成熟。在第7和14天，p120主要在体外HCEC的细胞溶胶中，表明那些细胞仍未成熟。BrdU标记表明HCEC在培养第7天的增殖率比第21天高40倍。
实施例5：ARPF-19细胞系中通过RNAi敲除p120的短暂下调
材料：Dulbecco修改的Eagle氏培养基(DMEM)、Ham氏/F12培养基、人表皮生长因子(hEGF)、HEPES缓冲液、Hank氏平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、两性霉素B、庆大霉素、胎牛血清(FBS)、和0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA(胰蛋白酶/EDTA)从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买。胶原酶A从Roche(Indianapolis，IN)获得。氢化可的松、二甲基亚砜、霍乱毒素和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)购买。ARPE-19细胞系从ATCC(Manassas，VA)购买。GeneEraserTM siRNA转染试剂从Stratagene(La Jolla，CA)购买。RNAeasyMini试剂盒从Qiagen(Valencia，CA)获得。高容量反转录试剂盒(HighCapacity Reverse Transcription Kits)和实时PCR引物及探针从Appl iedBiosystems(Foster City，CA)订购。单克隆抗VE-钙粘着蛋白和多克隆抗E-钙粘着蛋白、抗N-钙粘着蛋白和p120抗体从Santa Cruz(Santa Cruz，CA)获得。德州红偶联的驴抗兔或小鼠抗体从Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)获得。FITC偶联的山羊抗兔抗体从Sigma-Al drich获得。
ARPE-19细胞在DMEM/F12(1∶1)加10％FBS中培养。细胞被培养到早期(4天)和晚期(4周，图3)汇合。
RNAi根据Mittal V，Nature(2004)5：355-365中公开的RNAi设计原则选择。Invitrogen BlockitTM RNAi Designer被用于设计除Davis MA，Ireton RC，Reynolds AB，J Cell Biol.(2003)Nov 10；163(3)：525-34中公开的两个RNAi序列以外的另外两个p120特异的RNAi序列。进行BLAST搜索以确保所选的RNAi序列为p120特异的。RNAi靶向序列被列于表5。
表5.靶向的RNAi序列
  RNAi 1  P120RNAi1，公开的，有义链5’GCCAGAGGTGGTTCGGATA3’P120RNAi1，公开的，反义链5’TATCCGAACCACCTCTGGC3’
  RNAi 2  P120RNAi2，公开的，有义链5’AACGAGGTTATCGCTGAGAAC3’P120RNAi2，公开的，反义链5’GTTCTCAGCGATAACCTCGTT3’
  RNAi 3  P120RNAi3，有义链5’CAGAGGTGATCGCCATGCTTGGATT3’P120RNAi3，反义链5’AATCCAAGCATGGCGATCACCTCTG3’
  RNAi 4  P120RNAi4，有义链5’GCGATTGCTTCGAAAGGCTCGTGAT3’P120RNAi4，反义链5’ATCACGAGCCTTTCGAAGCAATCGC3’
50μl无菌、室温、无血清、无抗生素的DMEM/F12培养基被转移到聚苯乙烯管中，并向无血清培养基中加入3μl的GeneEraser siRNA转染试剂。通过振荡充分混合后，接着其在室温下温育15分钟。该混合物随后加入3.0μl的1-μM p120siRNA样品，通过吸取轻柔混合，并在室温下温育15分钟。最终的转染混合物被逐滴加入24孔盘的孔中，其中细胞培养在250μl新鲜的含血清培养基中，并且该培养物在进行RNA提取和实时PCR之前在培养箱中培养48小时。
结果.P120RNAi1和3最有效。RNAi1和3之间没有观察到协同效应。使用早期汇合的ARPE-19细胞，敲除的效率高达90-95％；并且由于所谓的“脱靶效应”，p120RNAi的组合没有提高效率。使用晚期汇合的ARPE-19细胞，敲除效率较低(70-75％)。p120敲除后，E-和VE-钙粘着蛋白丧失，并且p190被下调(表6)。
表6.ARPE-19细胞中P120RNAi敲除后的mRNA表达(实时PCR)
Figure G2007800437469D00231
实施例6：HCEC中通过RNAi敲除p120的短暂下调
人组织根据赫尔辛基声明操作。八份来自人捐献者眼的角膜巩膜组织从Florida Lions Eye Bank(Miami，FL)获得。它们中一些中央角膜片已经被用于角膜移植。捐献者的年龄在3到65岁之间。所有的组织在研究前都被保存在4℃的储存培养基(Optisol；Chiron Vision，Irvine，CA)中小于10天。所述组织用含有50mg/mL庆大霉素和1.25mg/mL两性霉素B的DMEM培养基润洗三次。中央角膜通过8mm直径的环钻除去。接着，后弹性膜以及角膜内皮细胞在解剖显微镜下被从外周角膜巩膜组织的后表面上剥离，并在37℃用1mg/mL在补充的激素上皮培养基(SHEM)中的胶原酶A消化16小时，所述SHEM培养基由等体积的HEPES缓冲的DMEM和用5％FBS、0.5％二甲基亚砜、2ng/mL小鼠EGF、5μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白、5ng/mL硒、0.5μg/mL氢化可的松、1nM霍乱毒素、50μg/mL庆大霉素和1.25μg/mL两性霉素B补充的Ham氏F12制成。消化后，HCECs形成聚集体，其通过在2000rpm离心3分钟除去消化溶液而收集。聚集体在SHEM培养基中培养3到14天。
来自HCECs体内或体外聚集体/片层的RNAs使用RNAeasy Mini kit(Qiagen)裂解并提取。提取的RNA使用高容量反转录试剂盒(Appliedbiosystems)被反转录。AJ组分的扩增通过PCR使用特异引物和DNA聚合酶(Appliedbiosystems)进行。PCR条件包括在95℃初始变性6分钟，接着35个循环的95℃变性30秒、60℃退火1分钟和72℃延伸1分钟。对于实时PCR，其包含在95℃初始变性10分钟，接着40个循环的95℃变性30秒、60℃退火和延伸1分钟。
P120敲除试验在第21天进行，那时E-钙粘着蛋白mRNA出现，表明AJs成熟且细胞没有增殖。50μl无菌、室温、无血清、无抗生素的DMEM/F12培养基被转移到聚苯乙烯管中，并向无血清培养基中加入3μl的GeneErasersiRNA转染试剂。通过振荡充分混合后，接着其在室温下温育15分钟。该混合物随后加入3.0μl的1-μM p120siRNA样品，通过吸取轻柔混合，并在室温下温育15分钟。最终的转染混合物被逐滴加入24孔盘的孔中，其中细胞培养在250μl新鲜的含血清培养基中，并且该培养物在培养箱中培养48小时，然后进行RNA提取和实时PCR以检测p120、p190、E-、VE-、N-钙粘着蛋白和β-联蛋白的mRNA变化。使用Scramble RNAi处理的样品的p120、N-钙粘着蛋白和BrdU抗体的双免疫染色/免疫组化被用作对照。
结果.体外培养3周的HCEC中p120的敲除导致p120、E-和VE-钙粘着蛋白的显著下调，p190的中等程度减少，并且β-联蛋白没有明显变化(表7和8)。此外，p120被转运到细胞的核，这显示了细胞增殖，由BrdU核染色判断(图4)。
表7.HCEC的3周培养中P120RNAi敲除后的mRNA表达(实时PCR)
Figure G2007800437469D00251
表8.p120敲除后的分子变化
  细胞类型   P120   P190   VE-钙粘着蛋白   N-钙粘着蛋白(II)   E-钙粘着蛋白(I)  β-联蛋白  RhoA   Rac1
  有丝分裂阻抑中的细胞   +++   +++   +++   +++   ++   +++  +   +++
  P120敲除   ---   +   ---   ---   ---   +  +++   +
尽管本发明已经针对其公开的实施方式被特别地显示和描述，本领域普通技术人员应理解，各种形式和细节的变化可以在其中做出，而不背离由所附权利要求书所包含的范围。

Claims (16)

1.下调p120联蛋白的表达的试剂在制备用于体内刺激具有粘附连接的人角膜内皮细胞使之增殖的药物中的应用，其中所述试剂与所述细胞短暂地接触。
2.权利要求1所述的应用，其中所述试剂是双链RNA。
3.权利要求1的应用，其中所述试剂以脉冲形式接触所述角膜内皮细胞。
4.权利要求3的应用，其中所述试剂应用12-72小时。
5.权利要求3的应用，其中所述试剂的退出时间是12-72小时。
6.权利要求1所述的应用，其中所述试剂接触患有角膜内皮功能障碍的哺乳动物的眼睛。
7.权利要求1的应用，其中所述试剂应用到哺乳动物眼部的前室。
8.权利要求1所述的应用，其中所述试剂与促有丝分裂生长因子、提高胞浆内cAMP水平的试剂、或它们的组合一起应用，其中所述提高胞浆内cAMP水平的试剂选自：8-溴-cAMP、联丁酰基cAMP、异丁基-甲基黄嘌呤、己酮可可碱、毛喉素、霍乱毒素、前列腺素E2(PGE2)、丁酸苯酯、布他前列素或伊洛前列素。
9.在培养物中扩增人角膜内皮细胞单层的方法，包括：(a)将所述细胞与下调p120联蛋白的表达的试剂短暂地接触；和(b)培养所述细胞，以形成扩增的人角膜内皮细胞。
10.权利要求9所述的方法，其中所述试剂是RNA干扰试剂。
11.权利要求10的方法，其中所述接触以脉冲形式发生，随后撤去所述RNA干扰试剂。
12.权利要求11的方法，其中所述试剂的脉冲应用12-72小时。
13.权利要求11的方法，其中所述试剂的退出时间是12-72小时。
14.权利要求9的方法，其中所述人角膜内皮细胞为早期汇合或晚期汇合。
15.权利要求9所述的方法，进一步包括将所述细胞与促有丝分裂生长因子、提高胞浆内cAMP水平的试剂、或它们的组合接触，其中所述提高胞浆内cAMP水平的试剂选自8-溴-cAMP、联丁酰基cAMP、异丁基-甲基黄嘌呤、己酮可可碱、毛喉素、霍乱毒素、前列腺素E2(PGE2)、丁酸苯酯、布他前列素或伊洛前列素。
16.权利要求9的方法，其中所述扩增的人角膜内皮细胞单层被用于制造手术移植物。
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