WO2007055224A1 - 角膜疾患治療剤 - Google Patents

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Tetsuro Takamatsu
Ping Dai
Shigeru Kinoshita
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to proliferation of corneal endothelial cells or regeneration of corneal endothelium, and in particular, a therapeutic agent for treatment of a disease or disorder caused by a decrease in corneal endothelium, use for the treatment, treatment
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treatment, a method for treating the disease or disorder, a therapeutic agent and a treatment method that enable intraocular surgery in a patient with reduced corneal endothelial cells, and siRNA against human connexin 43 (Cx43).
  • the cornea is a transparent tissue that functions as an optical lens, and has a corneal endothelial tissue in its innermost layer.
  • Corneal endothelial cells are essential for maintaining the transparency of the cornea. Human corneal endothelial cells do not regenerate once they are damaged, and the damaged part moves and compensates for the damaged part.When the corneal endothelium is damaged more than a certain amount and the thickness of the corneal endothelium decreases, It becomes impossible to maintain the transparency of the skin, resulting in bullous keratopathy. Treatment of this disease requires a corneal transplant.
  • Non-Patent Document 1 shows that an antisense oligonucleotide (AS ODN) sequence of connexin 43 (connex in 43, Cx43) consisting of a specific 30 nucleotides is effective for skin wound repair. Reported.
  • AS ODN antisense oligonucleotide
  • Non-Patent Document 2 reports that Cx43 has an effect on tumor suppression.
  • Patent Document 1 discloses various RNAi of connexin, but suggests its relevance to corneal endothelial cells.
  • Patent Document 2 suppression of connexin protein expression by antisense polynucleotides reduces neuronal cell death, wound healing, inflammation, reduced scar formation, and skin rejuvenation and thickness. It is disclosed that it is useful in the process.
  • Non-patent or 1 Qiu et al., Pargeting connexm expression accelerates the rate of wo und repair, Current Biology 13, 1697-1703, 2003
  • Non-Patent Document 2 You- Wei Zhang et al. J. Biol. Chem. Vol.278 No.45, p. 44852-44856 (2003)
  • Patent Document 1 US2005 / 0119211
  • Patent Document 2 WO00 / 44409
  • the present invention aims to provide a technique for proliferating or regenerating corneal endothelial cells.
  • the present invention provides the following items 1 to 31.
  • a therapeutic agent for a disease or disorder caused by a decrease in corneal endothelial cells comprising as an active ingredient at least one nucleic acid molecule that suppresses connexin 43 gene expression.
  • nucleic acid molecule is siRNA comprising a continuous 15-30 polynucleotide sequence having a sequence complementary to the gene of connexin 43.
  • siRNA against human connexin 43 wherein the nucleic acid molecule has the following sequence:
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • nucleic acid molecule is an siRNA comprising a contiguous 15-30 polynucleotide sequence having a sequence complementary to the gene of connexin 43.
  • siRNA against human connexin 43 wherein the nucleic acid molecule has the following sequence:
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • a disease caused by a decrease in corneal endothelial cells characterized by administering at least one nucleic acid molecule that suppresses connexin 43 gene expression to a patient with a disease or disorder caused by a decrease in corneal endothelial cells Or how to treat the disorder.
  • nucleic acid molecule is an siRNA comprising a contiguous 15-30 polynucleotide sequence having a sequence complementary to the gene of connexin 43.
  • siRNA against human connexin 43 wherein the nucleic acid molecule has the following sequence:
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • a disease or disorder caused by a decrease in corneal endothelial cells comprising an effective amount of at least one nucleic acid molecule that suppresses gene expression of connexin 43 and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • a pharmaceutical composition for treating comprising an effective amount of at least one nucleic acid molecule that suppresses gene expression of connexin 43 and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • composition according to item 16 which is in the form of a preparation for anterior chamber administration.
  • nucleic acid molecule is siRNA comprising a contiguous 15-30 polynucleotide sequence having a sequence complementary to the gene of connexin 43.
  • siRNA against human connexin 43 wherein the nucleic acid molecule has the following sequence:
  • At least one nucleic acid molecule that suppresses connexin 43 gene expression a therapeutic agent for enabling intraocular surgery in patients who cannot undergo intraocular surgery due to a decrease in corneal endothelial cells
  • the treatment agent which uses as an active ingredient.
  • nucleic acid molecule is siRNA comprising 15 to 30 consecutive polynucleotide sequences having a sequence complementary to the gene of connexin 43.
  • siRNA against human connexin 43 wherein said nucleic acid molecule has the following sequence:
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • a treatment method for enabling intraocular surgery comprising administering at least one nucleic acid molecule that suppresses expression.
  • nucleic acid molecule is an siRNA comprising a contiguous 15-30 polynucleotide sequence having a sequence complementary to the gene of connexin 43.
  • siRNA against human connexin 43 wherein the nucleic acid molecule has the following sequence:
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • Item 27 The method according to Item 26.
  • siRNA against human connexin 43 having the following sequence: Sense: 5 '-CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3'
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • a corneal endothelial cell is a single cell layer on the back side of the cornea that plays an important role in maintaining the transparency of the cornea by keeping the water content in the cornea constant by a pump function and a barrier function. .
  • corneal endothelial cells are damaged or dropped due to injuries such as trauma, dystrophy, or intraocular surgery, corneal endothelial cells of primates such as human monkeys have very poor proliferative capacity in vivo, and thus dysfunction of the corneal endothelium. This results in strong edema and turbidity in the cornea. Such a condition is called bullous keratopathy, and the patient develops severe visual impairment.
  • the present invention it is possible to proliferate corneal endothelial cells, and to effectively treat a disease or disorder caused by a decrease in corneal endothelial cells.
  • the corneal endothelium proliferates by corneal endothelium. Tissue can be repaired or regenerated to cure bullous keratopathy.
  • intraocular surgery includes surgery requiring intraocular manipulation (inner eye surgery) and laser therapy.
  • Internal eye surgery includes cataract, glaucoma, strabismus surgery, retinal detachment surgery, Vitreous surgery and the like are exemplified, but not limited thereto.
  • the “disease or disorder caused by a decrease in corneal endothelial cells” refers to bullous cornea by intraocular surgery or laser treatment due to a decrease in corneal endothelial cells not only by bullous keratopathy. This includes a situation in which the risk of developing complications increases and patients who cannot undergo internal eye surgery or laser treatment.
  • Intraocular surgery is the most common cause of bullous keratopathy, but hereditary corneal endothelium disease (decreased corneal endothelial cells with age), corneal endotheliitis caused by herpes virus infection (corneal endothelium) Cell loss), trauma, dystrophy and the like.
  • Connexin 43 (Cx43) is known to be involved in cell-to-cell communication through gap junctions, channel formation in the myocardium, and the like.
  • the gene sequence and amino acid sequence of connexin 43 are known in humans, monkeys and rats as shown in Table 1 below.
  • Cx43 which is a target for suppressing gene expression in the present invention, is a protein responsible for gap junctions.
  • the human gene sequence is described in SEQ ID NO: 1
  • the rat gene sequence is described in SEQ ID NO: 2, respectively.
  • a preferred subject gene is human Cx43.
  • Connexins are classified into Cx43, Cx26, Cx32, etc. according to molecular weight.
  • the protein involved in the proliferation of corneal endothelial cells is Cx43.
  • Cx43 is specifically suppressed.
  • Examples of the nucleic acid molecule of the present invention include connexin 43 antisense DNA, antisense RNA, siRNA (small interfering RNA; RNAi) and the like, and siRNA is preferably exemplified.
  • the siRNA has a polynucleotide sequence consisting of a contiguous complementary 15 to 30 polynucleotides IJ, preferably 18 to 25 polynucleotides IJ, more preferably 19 to 21 in length. Only one siRNA may be used, or two or more siRNAs may be used in combination.
  • the siRNAf has a length of 15 to 30, preferably about 18 to 25, and more preferably about 19 to 21 on the strand.
  • the siRNA may be composed of two complementary RNAs.
  • RNAs may have a structure in which one or both ends are linked with a nucleic acid sequence of an appropriate length.
  • the siRNA is a single-stranded or circular RNA having a complementary portion and a non-complementary portion.
  • the nucleic acid molecules of the present invention may be made as single strands after each complementary strand is made independently and then joined.
  • the nucleic acid molecule may be chemically synthesized or made using genetic engineering techniques. Specifically, the nucleic acid molecule is preferably chemically synthesized using, for example, a protected ribonucleotide / phosphoramidite method or a suitable DNA / RNA synthesizer.
  • the polynucleotide may be synthesized by itself according to a commercially available DNA / RNA synthesizer and the instruction manual attached to the device, or by commissioning the synthesis of this kind of polynucleotide. It is also easy in the industry to outsource the composition to a company or department.
  • the nucleic acid molecule is preferably selected from exon sites of the Cx43 gene. Further, it is more preferable that the sequence specificity of the complementary site of the target gene is high.
  • the region selected is AA (or CA) (N15-30 bases) TT that contains about 50% G or C in the region. The region can be exemplified as a complementary region. In the case where the sequence is not found, the terminal site can be substituted with AA (N15-30) or CA (N15-30).
  • the gene sequence corresponding to rat Cx43 siRNA is shown below. caattcctcg tgccgcaatt (SEQ ID NO: 4)
  • the gene sequence corresponding to the siRNA of monkey Cx43 is the same as that of human Cx43.
  • nucleic acid molecules (particularly siRNA) of the present invention are preferably exemplified as follows:
  • nucleic acid molecule having a sequence can be designed according to a conventional method.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be a derivative having a low degradability by a nuclease such as phosphorothioate.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can effectively promote the proliferation of corneal endothelial cells by being administered to the anterior chamber.
  • the dose is, for example, 10 to about 100 ⁇ M, preferably about 40 ⁇ siRNA or antisense DNA / RNA is about 1 to 50 ⁇ 1, preferably about 20 ⁇ 1, and can be administered once. A sufficient effect is recognized.
  • Administration is preferably by injection through the cornea.
  • the needle should be as thin as possible, so as not to damage the corneal endothelial cells.
  • the nucleic acid molecule can be administered by dissolving it in water for injection or an appropriate buffer.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be administered alone, and the introduction efficiency can be improved by using various reagents such as a polycation lipid ribosome-based transfusion reagent and a nucleic acid introduction reagent composed of virus particles. Is possible.
  • Wistar rat (8 weeks old, male) was used. After deep anesthesia with pentobarbital, insert a 30 G needle (Nibro Doctor) from the corneal limbus into the anterior chamber and aspirate 20 ⁇ ⁇ of the anterior chamber fluid. With the needle, the corneal endothelium was gently abraded from the anterior chamber side to create a wound.
  • 40 ⁇ of AS ODN siRNA 20 ⁇ 1 was used with the same wound.
  • the eyeball was removed and a cornea slice (6-7 mm in diameter) was prepared.
  • oligonucleotides used are as follows.
  • siRNA sequences used are as follows.
  • Wistar rat (8 weeks old, male) was used. After deep anesthesia with pentobarbital, a 30 G needle was inserted into the anterior chamber from the corneal limbus, and 20 ⁇ 1 of the anterior aqueous humor was aspirated. In this case, the needle was removed without creating a wound. 40 ⁇ of AS ODN or RNAi 20 ⁇ 1 was placed in the same wound using another needle and injected into the anterior chamber. After 6, 12 hours, 1, 2 and 3 days, the eyeball was removed and a cornea slice was prepared.
  • the cornea slice by immersing it in 1% paraformaldehyde / phosphate buffered saline (PBS) for 5 minutes at room temperature. Treated with acetone at 20 ° C for 10 minutes. Nonspecific adsorption was blocked by placing in 5% skim milk / PBS for 20 minutes at room temperature. 5% dextran / 1% dimethylsulfoxide (DMSO) / PBS for 10 minutes at room temperature to stabilize the structure of the cornea The treatment by was performed 3 times. Using a force razor, the cornea slices were trimmed into 4 mm x 4 mm cornea slices.
  • PBS paraformaldehyde / phosphate buffered saline
  • the immunohistochemical staining was carried out by using a rabbit anti-Cx43 antibody (400-fold diluted, Chemicon), mouse anti-Cx43 antibody (400-fold diluted, Zymed), and a rabbit anti-ZO-1 antibody (400-fold) as primary antibodies. Dilution, Zymed) and mouse anti-Ki-67 antibody (20-fold dilution, Dako) were used.
  • the corneal sections were incubated at 4 ° C for 48 hours with anti-Ki-67 antibody, and with the rest for one day. The plate was washed 3 times with PBS at room temperature for 5 minutes each. Secondary antibodies include Alexa488-conjugated rabbit anti-rabbit immunoglobulin G antibody, Alexa488-conjugated rabbit anti-mouse immunoglobulin G antibody, Alexa594-conjugated rabbit anti-rabbit immunoglobulin G antibody, Alexa594-conjugated rabbit anti-mouse immunoglobulin G antibody. The corneal slices were treated at 37 ° C for 90 minutes using (400-fold dilution, Invitrogen).
  • the plate was washed 3 times with PBS for 5 minutes at room temperature.
  • a few sections were treated with propidiu m iodide (PI, 1 mg / ml) for 30 minutes at room temperature to stain the nuclei.
  • the corneal slice was placed on a slide glass with the corneal endothelium facing up, and sealed with Vectorshield (Vector), a fluorescent fading inhibitor.
  • Vectorshield Vectorshield
  • FIGS. 1A and 1B Corneal sections 3 days after wounding with oligonucleotides are shown in FIGS. 1A and 1B. They perform ZO-1 staining (green) indicating the boundary of endothelial cells and PI (red) staining indicating the nucleus. Compared with the Cx43 sense ODN treatment group (B) in which wound healing hardly occurs, the Cx43 AS ODN treatment group (A) shows that the endothelial cells proliferate and the wound is completely healed. Effect of siRNA
  • FIGS. 2A and 2B A corneal section 3 days after wounding with siRNA is shown in FIGS. 2A and 2B. These are stained with ZO-1 staining (green) indicating the boundary of endothelial cells and PI (red) staining indicating the nucleus. Compared to the non-functional siRNA treatment group (Fig. 2B), where wound healing hardly occurs, the Cx43 siRNA treatment group (Fig. 2A) shows that the endothelial cells proliferate and the wound is completely healed. .
  • Fig. 3 The experimental conditions in Fig. 3 are shown below.
  • Cx43 AS-OD N or siRNA is administered to normal rat corneal endothelial cells without wounds in the anterior chamber and collected over time. Asked. This experiment shows that Cx43 knockdown directly affects and increases the proliferation of corneal endothelial cells, which is not related to the release of contact inhibition by wounds.
  • the results of Fig. 3 show that siRNA treatment is more effective than SAS-ODN treatment.
  • Example 2 Effect of hCx43-siRNA on regeneration of monkey corneal endothelium
  • hCx43_siRNA was applied to cultured endothelial cell sheets obtained from the cornea of Riki quinzanol, and the effect on endothelial cell proliferation was observed by measuring the number of cells in the DNA synthesis phase.
  • Example 3 Effect of hCx43_siRNA on the regeneration of monkey corneal endothelium in vivo
  • Intra-anterior administration of siRNA that selectively suppresses the expression of human connexin 43 in corneal endothelium injury model of a power quiz monkey with poor ability to proliferate corneal endothelium in vivo as in humans is effective for corneal endothelial wound healing The impact can be evaluated.
  • siRNA hCx43-siRNA
  • Antisense 5 '-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3'
  • connexin 43 inhibitor Collect 50 ⁇ of anterior aqueous humor of the force quizanole that created corneal endothelial dysfunction.
  • 50 ⁇ l of hCx43_siRNA adjusted to a concentration of lOO z g / ml in the anterior chamber
  • Administer 1 As a control, 50 ⁇ l of contro ⁇ siRNA adjusted to the same concentration in the left eye 1 dose.
  • Antibacterial drug (Talivid Eye Ointment (Registered Trademark)) is given to prevent infection and the operation is completed.
  • a model of corneal endothelial dysfunction caused by transcorneal freezing and coagulation has been widely used in corneal endothelium research since the 1970s.
  • the corneal endothelial cells in the coagulation area are removed by transcorneal freezing and coagulation in the central part of the cornea, but normal corneal endothelial cells remaining in the peripheral part expand and migrate, resulting in wound healing, resulting in bullous keratopathy. It has been reported that the cornea restores transparency in about a week.
  • corneal edema was observed up to 24 hours after injury, but the cornea returned to transparency between days 4 and 9 (van Horn DL et al.
  • the corneal endothelial cell density is higher than that of the control eye, and the corneal endothelial cell pumping function is good, so that the corneal thickness is reduced.
  • corneal edema may be strongest immediately after treatment to the next day.
  • monkeys are observed three times a day for general condition, appetite, and behavior. If it is determined that they are not adequately fed or consumed, they are promptly taken orally (Enrich (registered trademark)). Appropriate measures such as supplementation of nutrition and water by infusion.
  • the slit lamp is a biological microscope that is widely used in ophthalmic practice, and it allows detailed observation and photography with a microscope by placing a face on the chin table and shining it with thin light.
  • the time required for the above observation is about 10 minutes, and since it is a non-invasive examination, there is no pain or pain, but it is necessary to rest for several tens of seconds, so ketamine hydrochloride and xylazine hydrochloride are administered intramuscularly. Under general anesthesia.
  • the siRNA of the present invention (hCx43_siRNA) was confirmed to be effective in a model of corneal endothelial dysfunction caused by transcorneal freezing and coagulation in the power cynomolgus monkey. It also proves that it promotes the proliferation of corneal endothelial cells and is effective in the treatment of diseases or disorders caused by a decrease in corneal endothelial cells such as bullous keratopathy.
  • the suppression of gene expression of connexin 43 of the present invention can promote the proliferation of human corneal endothelial cells, and is effective in the prevention and treatment of bullous keratopathy.
  • the decrease in corneal endothelial cells caused by intraocular surgery or laser treatment can be recovered, and for example, treatment of cataracts in the elderly can be facilitated.
  • FIG. 1 shows the results of antisense oligonucleotides.
  • A Cx43 AS ODN treatment group;
  • B Cx43 sense ODN treatment group.
  • FIG. 2 shows the results of siRNA.
  • A Cx43 siRNA treatment group
  • B non-functional siRNA treatment group
  • FIG. 3 shows the results of comparing the proportion of Cx43-negative cells (Cx43 (_)) and Ki67-positive cells (Ki67 (+)) with antisense oligodeoxyribonucleotide (AS-ODN) treatment and siRNA treatment.
  • AS-ODN antisense oligodeoxyribonucleotide

Abstract

　本発明は、コネキシン43の遺伝子発現を抑制する少なくとも1種の核酸分子を有効成分とする、角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害の処置剤等に関する。

Description

明 細 書
角膜疾患治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、角膜内皮細胞の増殖もしくは角膜内皮の再生に関し、詳しくは角膜内 皮細胞の減少に起因する疾患または障害の処置のための処置剤、該処置のための 使用、該処置のための医薬組成物、該疾患または障害の処置方法、角膜内皮細胞 が減少した患者における眼内手術を可能にする処置剤及び処置方法、ヒトコネキシ ン 43(Cx43)に対する siRNAに関する。
背景技術
[0002] 角膜は、光学レンズの役目をもつ透明な組織であり、その最内層に角膜内皮組織 を有する。
[0003] 角膜内皮細胞は角膜の透明度を維持するために不可欠である。ヒトの角膜内皮細 胞は一度障害されると再生せず、障害された部分は周りの内皮細胞が移動して補う 力 角膜内皮が一定以上に損傷を受けて角膜内皮の厚みが少なくなると、角膜の透 明性が維持できなくなり、水疱性角膜症になる。この疾患の治療には、角膜移植が必 要になる。
[0004] Qiuらは、非特許文献 1で、特定の 30個のヌクレオチドから成るコネキシン 43 (connex in 43、 Cx43)のアンチセンスオリゴヌクレオチド (AS ODN)配列が皮膚創傷修復に有 効であることを報告した。
[0005] 非特許文献 2は、 Cx43が腫瘍の抑制に効果を有することを報告している。
[0006] 特許文献 1は、コネキシンの種々の RNAiを開示しているが、角膜内皮細胞との関連 性にっレ、ては示唆してレヽなレ、。
[0007] 特許文献 2は、アンチセンスポリヌクレオチドによりコネキシンタンパク質の発現を抑 制することが、ニューロン細胞の死の低下、傷の治癒、炎症の低下、傷痕形成の低下 、ならびに皮膚の若返りおよび厚化において有用であることを開示する。
非特許又 1： Qiu et al.， Pargeting connexm expression accelerates the rate of wo und repair , Current Biology 13, 1697-1703, 2003 非特許文献 2 : You- Wei Zhang et al. J. Biol. Chem. Vol.278 No.45, p. 44852-44856 (2003)
特許文献 1： US2005/0119211
特許文献 2 : WO00/44409
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、角膜内皮細胞の増殖ないし再生を行う技術を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、 Cx43遺伝子発現を抑制する ことにより、角膜内皮細胞が増殖することを見出し、本発明を完成した。
[0010] 本発明は、以下の項 1〜項 31を提供するものである。
1. コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を有効成分とす る、角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害の処置剤。
2. 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、項 1 に記載の処置剤。
3. 前眼房投与用製剤の形態である項 1に記載の処置剤。
4. 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜 30のポリヌクレオチド配列を含む siRNAである項 1に記載の処置剤。
5. 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である項 1に記載の処置剤。
6. コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子の角膜内皮細 胞の減少に起因する疾患または障害の処置のための使用。
7. 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、項 6 に記載の使用。
8. 前記核酸分子を前眼房に投与するための項 6に記載の使用。 9. 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜 30のポリヌクレオチド配列を含む siRNAである項 6に記載の使用。
10. 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA:
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である項 6に記載の使用。
11. 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害を有する患者にコネキシン 43 の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を投与することを特徴とする、角 膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害を治療する方法。
12. 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、項 11に記載の方法。
13. 前記核酸分子を前眼房に投与する項 11に記載の方法。
14. 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜 30のポリヌクレオチド配列を含む siRNAである項 11に記載の方法。
15. 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA:
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
である項 11に記載の方法。
16. コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子の有効量と、 薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、角膜内皮細胞の減少に起 因する疾患または障害を処置するための医薬組成物。
17. 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、項 16に記載の医薬組成物。
18. 前眼房投与用製剤の形態である項 16に記載の医薬組成物。
19. 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜 30のポリヌクレオチド配列を含む siRNAである項 16に記載の医薬組成物。
20. 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA:
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 ' アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である項 16に記載の医薬組成物。
21. 角膜内皮細胞の減少が原因で眼内手術を受けることができない患者において 、眼内手術を可能にするための処置剤であって、コネキシン 43の遺伝子発現を抑制 する少なくとも 1種の核酸分子を有効成分とする処置剤。
22. 前記患者が、眼内手術により水疱性角膜症の発症が疑われる患者である、項 2 1に記載の処置剤。
23. 前眼房投与用製剤の形態である項 21に記載の処置剤。
24. 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜 30のポリヌクレオチド配列を含む siRNAである項 21に記載の処置剤。
25. 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
である項 21に記載の処置剤。
26. 角膜内皮細胞が減少し、手術により角膜内皮細胞の減少に起因する疾患また は障害を発症する可能性がある、眼内手術が必要な患者において、眼内手術の前 にコネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を投与することを 特徴とする、眼内手術を可能にするための処置方法。
27. 前記患者が、眼内手術により水疱性角膜症を発症する可能性がある患者であ る、項 26に記載の方法。
28. 前記核酸分子を前眼房に投与する項 26に記載の方法。
29. 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜 30のポリヌクレオチド配列を含む siRNAである項 26に記載の方法。
30. 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である項 26に記載の方法。
31. 以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA : センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
発明の効果
[0011] 角膜内皮細胞は角膜の裏側に存在する一層の細胞層であり、ポンプ機能とバリア 機能により角膜内の含水率を一定に保つことによって角膜の透明性維持に重要な役 割を果たしている。外傷やジストロフィ、眼内手術などの侵襲によって角膜内皮細胞 が障害、脱落すると、ヒトゃサルなどの霊長類の角膜内皮細胞は生体内では非常に 増殖能が乏しいために、角膜内皮の機能不全を生じて角膜に強い浮腫と混濁をきた す。このような病態を水疱性角膜症とよび、患者は重篤な視力障害を生じる。
進行した水疱性角膜症に対しては現在では全層角膜移植が行われている力 その 長期成績は他の角膜疾患と比較すると不良であり、より有効な治療法の開発が望ま れている。また、わが国においては角膜移植に必要なアイバンクの提供角膜が常に 不足しており、手術が必要な水疱性角膜症患者は長い移植待機期間を強いられて レ、るのが現状である。このような社会的、医学的な背景のもと、本発明者らは角膜内 皮疾患に対する新しい治療法の開発を行った。
[0012] 本発明によれば、角膜内皮細胞を増殖させることができ、角膜内皮細胞の減少に 起因する疾患または障害の処置を有効に行うことができる。
[0013] たとえば、角膜の透明度が低下した水疱性角膜症患者の前眼房にコネキシン 43の 遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を投与することで、角膜内皮細胞を 増殖して角膜内皮組織を修復ないし再生し、水疱性角膜症を治癒することができる。
[0014] 眼の外傷、眼内感染症、緑内障による急激な眼圧上昇、コンタ外レンズによる酸素 不足などの種々の原因により角膜内皮組織が薄くなり、眼内の操作を要する手術（内 眼手術)や、レーザー治療が受けられなくなった場合でも、コネキシン 43の遺伝子発 現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を投与して角膜内皮細胞を増殖して角膜内 皮組織を厚くすることで、内眼手術を行うことを可能にし得る。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本明細書において、眼内手術は眼内の操作を要する手術（内眼手術）、レーザー 治療を包含する。内眼手術としては、白内障、緑内障、斜視の手術、網膜剥離手術、 硝子体手術などが挙げられるがこれらに限定されない。
[0016] 本発明において、「角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害」としては、水 疱性角膜症だけでな 角膜内皮細胞が減少したことで内眼手術やレーザー治療に より水疱性角膜症を発症するリスクが高まり、内眼手術やレーザー治療が受けられな い状態を包含する。
[0017] 水疱性角膜症の原因としては、眼内手術が最も多いが、遺伝性の角膜内皮の疾患 (年齢とともに角膜内皮細胞が減少)、ヘルぺスウィルス感染などによる角膜内皮炎（ 角膜内皮細胞の脱落）、外傷、ジストロフィなどが挙げられる。
[0018] コネキシン 43(Cx43)は、ギャップ結合による細胞間の伝達、心筋におけるチャンネ ル形成などに関与することが知られている。コネキシン 43の遺伝子配列およびアミノ 酸配列は、以下の表 1に示すようにヒト、サルおよびラットで公知である。
[0019] [表 1]
Figure imgf000008_0001
[0020] 本発明で遺伝子発現の抑制対象となる Cx43は、ギャップ結合を担うタンパク質であ り、ヒトの遺伝子配列は配列番号 1に、ラットの遺伝子配列は配列番号 2に各々記載 されている。好ましい対象遺伝子はヒト Cx43である。
[0021] コネキシンは分子量により Cx43， Cx26, Cx32などに分類される力 角膜内皮細胞の 増殖に関与するタンパクは、 Cx43である。 Cx43に加えて Cx26， Cx32などの遺伝子発 現を同時に抑制することも可能であるが、好ましい実施形態では、 Cx43を特異的に 抑制する。
[0022] Qiu et al. (Current Biology 13, 1697-1703， 2003)は、アンチセンス'オリゴデォキシ ヌクレオチドによる Cx43ノックダウンが好中球の数を減少して炎症を軽減し、創傷治 癒を促進することが記載されているが、角膜では炎症がほとんど起こらないため、炎 症を抑制しても角膜に対する影響はほとんどない。また、角膜内皮細胞は本件出願 以前には増殖しない細胞として認識されていた。本発明者は、 Cx43を抑制することに より角膜内皮細胞の増殖を促進できることを驚くべきことに発見した。
[0023] 本発明の核酸分子は、コネキシン 43のアンチセンス DNA、アンチセンス RNA、 siRN A (small interfering RNA; RNAi)などが挙げられ、 siRNAが好ましく例示される。 siRNA は、連続する相補的な 15から 30のポリヌクレオチド配歹 IJ、好ましくは 18から 25のポリ ヌクレオチド配歹 IJ、より好ましくは、 19から 21の長さからなるポリヌクレオチド配列を有 する。 siRNAは、 1種のみを用いてもよく 2種以上の siRNAを組み合わせて使用しても よレヽ。 siRNAfまネ目ネ甫鎖の咅 B分力 15〜30、好ましく ίま 18〜25、より好ましく ίま 19〜21 の長さを有していればよい。また、 siRNAは相補的な 2本の RNAから構成されていて もよぐこれら 2本の RNAを片側あるいは両末端で適当な長さの核酸配列で連結した 構造を取っていてもよい。後者の場合、 siRNAは相補部分と非相補部分を有する 1本 鎖または環状 RNAとなる。
[0024] 本発明の核酸分子は、各相補鎖が独立して作られた後、接合されるか、あるいは一 本鎖として作られてもよい。該核酸分子は、化学的に合成されるか、または遺伝子組 換え技術を用いて作られてもよい。具体的には、核酸分子は例えば被保護リボヌタレ ォチド 'ホスホルアミダイト法、好適な DNA/RNA合成機を用いて、好ましくは、化学 合成される。前記ポリヌクレオチドの合成は、市販の DNA/RNA合成機と該機器に付 属の使用説明書に準じて自身で合成してもよぐ或いは、この種のポリヌクレオチドの 合成を受託してレ、る会社、または部門に合成を委託することも当業界では容易であ る。
[0025] 核酸分子は、 Cx43遺伝子のェキソン部位から好ましく選択される。また標的遺伝子 の相補部位の配列の特異性が高いことがより好ましい。核酸分子が siRNAの場合、選 択される領域としては該領域中にぉレ、て、 50%程度の Gまたは Cを含んでレ、る AA ( もしくは CA) (N15〜30塩基) TTという配列領域が相補する領域として例示できる。 前記のような配列が見つからないケースにおいては、末端部位を AA (N15〜30)もし くは CA (N15〜30)として代用することもできる。
[0026] ヒト Cx43の siRNAに対応する遺伝子配列を以下に示す。
[0027] caattcttct tgccgcaatt (配歹 lj番号 3)
ラット Cx43の siRNAに対応する遺伝子配列を以下に示す。 caattcctcg tgccgcaatt (配列番号 4) なお、サル Cx43の siRNAに対応する遺伝子配列 は、ヒト Cx43の場合と同一である。
[0028] 本発明の核酸分子 (特に siRNA)は、以下のものが好ましく例示される：
ラットに対する好ましレ、 siRNA
センス： 5， -CAA UUC CUC GUG CCG CAA TT-3 ' (配列番号 5) アンチセンス： 5' -UUG CGG CAC GAG GAA UUG TT-3' (配列番号 6) ヒト、サルに対する好ましレ、 siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 ' (配列番号 7) アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 ' (配列番号 8) 上記以外にも Cx43に特異的な配列を有する核酸分子を常法に従い設計すること ができる。
[0029] 本発明の核酸分子は、ホスホロチォエートなどのヌクレアーゼによる分解性の低い 誘導体とすることもできる。
[0030] 本発明の核酸分子は、前眼房に投与することにより、角膜内皮細胞の増殖を効果 的に促進することができる。投与量は、例えば 10〜： 100 μ M程度、好ましくは 40 μ Μ 程度の siRNAないしはアンチセンス DNA/RNAを 1〜50 μ 1程度、好ましくは 20 μ 1程度 投与すればよぐ 1回の投与で十分な効果が認められる。
[0031] 投与は、角膜を通して注射により投与するのが好ましい。角膜内皮細胞を傷つけな レ、ように注射針はできるだけ細いものを用いる。核酸分子は、注射用水又は適当な 緩衝液に溶解して投与することができる。
[0032] 本発明の核酸分子は、単独で投与してもよ ポリカチオン脂質リボソーム系のトラ ンスフエクシヨン試薬、ウィルス粒子からなる核酸導入試薬などの各種の試薬を使用 して導入効率を向上させることが可能である。
実施例
[0033] 以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に 限定されなレ、ことはレ、うまでもなレ、。
実施例 1 1)ラットを用いた角膜創傷治癒のモデル作成
Wistar rat (8週齢、雄）を用いた。ペントバルビタールで深麻酔後、角膜輪部より 30 G針 (ニブロ医ェ）を前房内に刺入し、前房水を 20 μ ΐ吸い取る。その針で前房側から 角膜内皮を軽く擦過し創を作成した。次に、コネキシン 43 (Cx43)に対するアンチセン スオリゴヌクレオチド及び、 RNAiの角膜創傷治癒に対する影響を調べるため、 40 μ Μ の AS ODNあるレ、は siRNA 20 μ 1を、別の針を用いて同じ創口に入れて、前房内に注 入した（前房内液の全量を 40 μ ΐと仮定すると、前房内液での AS ODN及び siRNAの 最終濃度は、 20 μ Μとなる）。 1、 3日後、眼球を摘出し，強角膜切片 (直径 6〜7 mm)を 作成した。
使用したオリゴヌクレオチドは、次の通りである。
Cx43 AS ODN: 5，- GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC-3，(¾3 番号 9)
Cx43 Sense ODN: 5，- GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC- 3，（ 配列番号 10)
また、使用した siRNA配列は、次の通りである。
sense: 5，- CAA UUC CUC GUG CCG CAA TT-3' (配列番号 5)
antisense: 5，- UUG CGG CAC GAG GAA UUG TT-3' (配列番号 6)
2)無処理ラット角膜に対する Cx43 AS ODN及び、 siRNAの処理
Wistar rat (8週齢、雄）を用いた。ペントバルビタールで深麻酔後、角膜輪部より 30 G針を前房内に刺入し前房水を 20 μ 1を吸い取り、この場合は、創を作成せず、針を 抜いた。 40 μ Μの AS ODNあるいは RNAi 20 μ 1を、別の針を用いて同じ創口に入れ て、前房内に注入した。 6、 12時間、 1、 2、 3日後に眼球を摘出し、強角膜切片を作成 した。
3)免疫組織化学的解析法
強角膜切片を 1%パラフオルムアルデヒド/リン酸緩衝液 (PBS)に室温で 5分間浸漬し 固定を行い、つづいて？ 20°Cのアセトンで 10分間処理した。 5%スキムミルク/ PBSに室 温で 20分間入れ、非特異的吸着をブロッキングした。強角膜組織の構造を安定化す るため、室温で 10分間の 5%デキストラン/ 1%ジメチルスルフオキサイド（DMSO)/PBS による処理を、 3回行った。力ミソリを用いて、強角膜切片を 4mm X 4mmの角膜切片 にトリミングした。
[0035] 免疫組織化学的染色は、一次抗体として、ゥサギ抗 Cx43抗体 (400倍希釈、 Chemic on社）、マウス抗 Cx43抗体（400倍希釈、 Zymed社）、ゥサギ抗 ZO-1抗体（400倍希釈 、 Zymed社）、マウス抗 Ki- 67抗体（20倍希釈、 Dako社）を用いた。
[0036] 4°Cで抗 Ki-67抗体は 48時間、それ以外は 1昼夜、角膜切片をインキュベートした。 P BSで室温 5分間ずつ、 3回洗浄を行った。 2次抗体として、 Alexa488結合ャギ抗ゥサ ギ免疫グロブリン G抗体、 Alexa488結合ャギ抗マウス免疫グロブリン G抗体、 Alexa594 結合ャギ抗ゥサギ免疫グロブリン G抗体、 Alexa594結合ャギ抗マウス免疫グロブリン G 抗体（いずれも 400倍希釈、 Invitrogen社）を用いて、角膜切片を 37°Cで 90分間処理 した。その後、 PBSで室温 5分間ずつ、 3回洗浄を行った。レ、くつかの切片は propidiu m iodide (PI, 1 mg/ml)で、室温で 30分間処理し、核を染色した。角膜内皮面を上に して角膜切片をスライドガラスに載せ、蛍光退色防止剤である Vectorshield (Vector社 )で封入した。
[0037] 60倍の油浸対物レンズ (Plan Apo 60, NA = 1.4)を備えた共焦点レーザ顕微鏡（ォ リンパス Fluoview)で切片の観察を行った。
[0038] アンチセンス処理、 RNAi処理に創傷治癒実験は、それぞれ適切な対照群と平行し て実施し、免疫組織化学的染色も同時に行い、共焦点レーザ顕微鏡による撮像も同 一の条件で行った。
4)創の閉鎖の評価
創作成 3日後の角膜切片の ZO-1/PI染色像を用いて、細胞の連続性を判断し、創 の閉鎖の評価を行った。
. オリゴヌクレオチドの効果
オリゴヌクレオチドを投与した創傷後 3日目の角膜切片を図 1Aおよび 1Bに示す。こ れらは内皮細胞の境界を示す ZO-1染色（緑）と核を示す PI (赤)染色を行っている。 創傷治癒がほとんど起きていない Cx43 sense ODN処理群（B)に比較して、 Cx43 AS ODN処理群 (A)では内皮細胞が増殖して創傷が完全に治癒してレ、るのが分かる。 . siRNAの効果
siRNAを投与した創傷後 3日目の角膜切片を図 2Aおよび 2Bに示す。これらは内皮 細胞の境界を示す ZO-1染色（緑）と核を示す PI (赤)染色を行ってレ、る。創傷治癒が ほとんど起きていない non- functional siRNA処理群（図 2B)に比較して、 Cx43 siRNA 処理群（図 2A)では内皮細胞が増殖して創傷が完全に治癒してレ、るのが分かる。
[0039] 使用した nonfunctional control siRNAの配列は以下の通りである。
sense: 5，_AAU UCU CCG AAC GUG UCA CGT_3， (配列番号 11)
antisense: 5'- GUG ACA CGU UCG GAG AAU UTT- 3' (配列番号 12)
なお、 siRNAはオリゴヌクレオチドに比較して Cx43の発現を抑制する効果が強いこと 、さらに増殖している細胞数が多いことは確認している。この結果を図 3に示す。図 3 の実験条件を、以下に示す。創傷のない正常のラット角膜内皮細胞に Cx43 AS-OD Nないしは siRNAを前房内に投与後、経時的に採取し、 Cx43と Ki67に対する免疫染 色を行うことによってそれぞれの陰性率'陽性率を求めた。この実験によって、 Cx43 のノックダウンが創傷による接触阻止の解除とは関係なぐ角膜内皮細胞の増殖に直 接影響しこれを高める作用があることが分かる。また、図 3の結果から、 siRNA処理の 方力 SAS-ODN処理よりも有効であることが分かる。
[0040] 実施例 2 :サル角膜内皮の再生に対する hCx43-siRNAの影響
力二クイザノレの角膜から得られた培養内皮細胞シートに下記の hCx43_siRNAを投 与し、 DNA合成期にある細胞数を測定することによって内皮細胞増殖に対する影響 をみた。
hCx43-siRNA:
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 ' (配列番号 7) アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 ' (配列番号 8) その結果、 hCx43_siRNA非投与のコントロール群 (#1)に比較して hCx43-siRNA投与 群 (#2-4)では、明らかに BrdU陽性細胞数が増加しており、 hCx43_siRNA (ヒトとサルの Cx43_siRNAは同一の配歹 IJ)がサルの角膜内皮細胞の再生を促すことが実証された。
[0041] [表 2] hCx43-siRNA投与 BrdU陽性細胞
#1 一 19
#2 + 29
#3 + 40
#4 + 30
[0042] 実施例 1， 2の結果から、ヒトの角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害 (特 に、水疱性角膜症)の処置にヒトコネキシン 43の遺伝子発現を抑制する核酸分子 (ァ ンチセンスオリゴヌクレオチト、 siRNAなど)が有効であることが明らかになった。
[0043] 実施例 3 :サル角膜内皮の再生に対する hCx43_siRNAの in vivoにおける影響
ヒトと同様に生体内での角膜内皮増殖能が乏しい力二クイザルの角膜内皮障害モ デルを用いて、ヒトコネキシン 43の発現を選択的に抑制する siRNAの前房内投与が 角膜内皮創傷治癒に与える影響を評価することができる。
1. コネキシン 43抑制薬の作成
以下の siRNA (hCx43-siRNA)を使用する。
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
2. 力二クイザル角膜内皮障害モデルの作成とコネキシン 43抑制薬の投与
1) 全身麻酔:塩酸ケタミンと塩酸キシラジンによる筋肉注射による全身麻酔を行った 後、ケージから処置台へ運ぶ。処置台にてマスクを用いた吸入麻酔を開始したのち、 血圧、心電図および酸素飽和度モニターを装着し、全身状態の安定を確認した後に 以下の手術操作を行う。
2) ドレービングと消毒:皮膚および体毛からの眼内組織の感染を予防するために、 顔部および上半身を眼科手術用ドレープで覆レ、、イソジンによる消毒を行う。
3) 経角膜冷凍凝固による角膜内皮細胞障害の作成:力二クイザノレの両眼に、液体 窒素で冷却した直径 5mmのチップの先端を角膜中央部に接着させ、前房内に ice bal 1が確認できるまで約 15秒間の冷凍凝固を行う。
4) コネキシン 43抑制薬の投与：角膜内皮障害を作成した力二クイザノレの前房水を 50 μ ΐ採取する。右眼には、前房内に lOO z g/mlの濃度に調整した hCx43_siRNAを 50 μ
1を投与する。コントロールとして左眼に contro卜 siRNAを同濃度に調整したものを 50 μ 1投与する。
5) 感染予防のために抗菌薬 (タリビッド眼軟膏 (登録商標)）の点入を行い、手術を終 了する。
6) 吸入麻酔を終了し、回復室のケージ内で保温マットを敷いた状態で覚醒を待つ。 サルが覚醒し、異常がないことを確認した後に飼育室ケージに戻す。
[0044] 経角膜冷凍凝固による角膜内皮障害モデルは、 1970年代から角膜内皮研究にお レ、て広く用レ、られてきた方法である。角膜中央部の経角膜冷凍凝固によって凝固部 位の角膜内皮細胞は脱落するが、周辺部に残存する正常角膜内皮細胞が拡大、遊 走することによって創傷治癒が得られるため、水疱性角膜症には至らず、約 1週間で 角膜は透明性を回復することが報告されている。 van Hornらのべニガオザルを用い た研究では、受傷後 24時間までは角膜浮腫が認められるものの 4日- 9日で角膜は透 明性を回復したことが報告されている (van Horn DL et al. Exp Eye Res, 1975)。また Matsubaraらのカ二クイザルを用いた研究では、直径 2.5mmの角膜冷凍凝固後には 3 日間で角膜内皮の拡大伸展による修復が行われることが報告されている（Matsubara M et al. Jpn J Ophthalmology, 1982) 0これらの報告は、ヒトと同様にサルの角膜内皮 細胞は生体内では増殖せず、残存する細胞の拡大、伸展によって創傷治癒が起こる ことを証明したものである。このようにして治癒した角膜内皮細胞は、正常の角膜内 皮細胞に比べて密度が低く年余を経ても回復しない。ヒトにおける水疱性角膜症の 初期にも同様の現象が生じており、角膜内皮障害の初期段階では残存細胞の拡大 、伸展によって機能を代償できているものが、時間経過によって代償がきかなくなり、 重症の水疱性角膜症となる。
[0045] 本発明者の研究により、このような初期の角膜内皮障害に対して、残存する角膜内 皮細胞の増殖能を高めることにより、より密度が高ぐ形態的にも健常な角膜内皮細 胞による創傷治癒を得ることが可能になる。
[0046] 力二クイザルの生体内で角膜内皮細胞の障害を作成した場合は、残存する周辺部 の角膜内皮細胞が移植後 1週間程度で角膜は拡大、伸展した内皮細胞で被覆され 、ある程度の透明性を回復する。角膜が透明性を回復した際の角膜内皮細胞の形 態や密度、角膜内皮細胞の機能の指標となる角膜厚について左右眼を比較すること により、投与薬剤の角膜内皮細胞修復に与える影響を評価できる。すなわち薬剤投 与によって角膜内皮細胞の増殖促進効果が認められる場合には、コントロール眼より も角膜内皮細胞密度が高くなり、角膜内皮細胞のポンプ機能が良好であるために角 膜厚が薄くなる。
[0047] 経角膜冷凍凝固による角膜内皮障害モデルでは、処置の直後から翌日にかけて 最も角膜浮腫が強くなる可能性がある。術後早期には 1日 3回サルの全身状態、食欲 や行動について観察を行い、摂餌、摂水が十分行われていないと判断された場合に は速やかに経口（エンリッチ (登録商標)）や点滴による栄養および水分の補給などの 適切な処置を行う。
3. 前眼部の観察
1) 全身状態の観察:サルの食欲、排泄、毛並み、行動などを観察し、全身状態に問 題がないことを確認する。
2) スリットランプ (細隙灯顕微鏡）による前眼部の観察
外科的処置前、処置翌日、処置後 3、 7日目および 1、 3、 4週間後にスリットランプ、 角膜厚測定装置、角膜内皮スぺキユラ一観察装置を用いて、前眼部の観察を行う。 スリットランプは眼科診療で広く用いられている生体顕微鏡であり、あご台に顔をのせ て細い光を当てることにより顕微鏡による詳細な観察と写真撮影が可能である。以上 の観察に必要な時間は 10分程度であり、非侵襲的な検查であるため痛みや苦痛は ないが、数十秒間静止することが必要なため、塩酸ケタミンと塩酸キシラジンの筋肉 内投与による全身麻酔下に行う。
4. 組織学的検討：
創傷治癒が終了した段階で、力二クイザノレを安楽死させて角膜組織を採取し、免疫 組織化学的手法を用いた角膜内皮細胞の組織学的検討を行う。
[0048] 以上の実験により、本発明の siRNA (hCx43_siRNA)は、力二クイザルの経角膜冷凍 凝固による角膜内皮障害モデルにおいても有効性が確認され、サルと同様に角膜内 皮増殖能が乏しいヒトにおいても角膜内皮細胞の増殖を促進し、水疱性角膜症など の角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害の処置に有効であることが実証 される。 産業上の利用可能性
[0049] 本発明、コネキシン 43の遺伝子発現の抑制によりヒトの角膜内皮細胞の増殖を促 進することができ、水疱性角膜症の予防と治療に有効である。
[0050] また、本発明によれば、眼内手術やレーザー治療による角膜内皮細胞の減少を回 復させることができ、例えば高齢者における白内障などの治療を、行いやすくすること ができる。
図面の簡単な説明
[0051] [図 1]アンチセンスオリゴヌクレオチドの結果を示す。（A) Cx43 AS ODN処理群; (B) C x43 sense ODN処理群。
[図 2]siRNAの結果を示す。（A) Cx43 siRNA処理群；（B) non-functional siRNA処理 群 (Control)。
[図 3]Cx43陰性細胞（Cx43(_))ならびに Ki67陽性細胞（Ki67(+))の割合を、 antisense oligodeoxyribonucleotide(AS-ODN)処理と siRNA処理について比較した結果を示す。 (A) AS— ODN treatment； (B) siRNA treatment.

Claims

請求の範囲
[I] コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を有効成分とする、 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害の処置剤。
[2] 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、請求項 1 に記載の処置剤。
[3] 前眼房投与用製剤の形態である請求項 1に記載の処置剤。
[4] 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜30の ポリヌクレオチド配列を含む siRNAである請求項 1に記載の処置剤。
[5] 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である請求項 1に記載の処置剤。
[6] コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子の角膜内皮細胞の 減少に起因する疾患または障害の処置のための使用。
[7] 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、請求項 6 に記載の使用。
[8] 前記核酸分子を前眼房に投与するための請求項 6に記載の使用。
[9] 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜30の ポリヌクレオチド配列を含む siRNAである請求項 6に記載の使用。
[10] 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
である請求項 6に記載の使用。
[I I] 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害を有する患者にコネキシン 43の遺 伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を投与することを特徴とする、角膜内 皮細胞の減少に起因する疾患または障害を治療する方法。
[12] 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、請求項 1 1に記載の方法。
[13] 前記核酸分子を前眼房に投与する請求項 11に記載の方法。
[14] 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜30の ポリヌクレオチド配列を含む siRNAである請求項 11に記載の方法。
[15] 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である請求項 11に記載の方法。
[16] コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子の有効量と、薬学的 に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、角膜内皮細胞の減少に起因する 疾患または障害を処置するための医薬組成物。
[17] 角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障害が、水疱性角膜症である、請求項 1
6に記載の医薬組成物。
[18] 前眼房投与用製剤の形態である請求項 16に記載の医薬組成物。
[19] 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜30の ポリヌクレオチド配列を含む siRNAである請求項 16に記載の医薬組成物。
[20] 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
である請求項 16に記載の医薬組成物。
[21] 角膜内皮細胞の減少が原因で眼内手術を受けることができない患者において、眼内 手術を可能にするための処置剤であって、コネキシン 43の遺伝子発現を抑制する少 なくとも 1種の核酸分子を有効成分とする処置剤。
[22] 前記患者が、眼内手術により水疱性角膜症の発症が疑われる患者である、請求項 21 に記載の処置剤。
[23] 前眼房投与用製剤の形態である請求項 21に記載の処置剤。
[24] 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜30の ポリヌクレオチド配列を含む siRNAである請求項 21に記載の処置剤。
[25] 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA : センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
である請求項 21に記載の処置剤。
[26] 角膜内皮細胞が減少し、手術により角膜内皮細胞の減少に起因する疾患または障 害を発症する可能性がある、眼内手術が必要な患者において、眼内手術の前にコネ キシン 43の遺伝子発現を抑制する少なくとも 1種の核酸分子を投与することを特徴と する、眼内手術を可能にするための処置方法。
[27] 前記患者が、眼内手術により水疱性角膜症を発症する可能性がある患者である、請 求項 26に記載の方法。
[28] 前記核酸分子を前眼房に投与する請求項 26に記載の方法。
[29] 前記核酸分子が、コネキシン 43の遺伝子に相補的配列を有する連続する 15〜30の ポリヌクレオチド配列を含む siRNAである請求項 26に記載の方法。
[30] 前記核酸分子が、以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3 '
である請求項 26に記載の方法。
[31] 以下の配列を有するヒトコネキシン 43に対する siRNA :
センス： 5 ' -CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3 '
アンチセンス： 5 ' -UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT- 3 '
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