JPH11501508A - ヒトｖｅｇｆ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＶＥＧＦの発現を低減させるのに有用なＶＥＧＦ−特異的な核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを開示する。かかるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および血管新生や血管形成に付随する種々の疾患を治療するのに有用な方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＶＥＧＦ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド 発明の背景 本発明は、血管新生および血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor）に関する。さらに詳しくは、本発明は血管内皮増殖因子核酸に特異的な オリゴヌクレオチドおよび血管新生や血管形成に関連する疾患の有用な治療に関 する。 糖尿病網膜症、未熟児網膜症および加齢黄斑変性症などの網膜の血管新生疾患 は、米国および世界における失明の主要な原因であり、これらプロセスに関連す る生化学的事象は未だ完全には解明されていない。 糖尿病網膜症は、米国において労働成人（２０〜６４）の失明の原因のトップ である（フォスター（Ｆoster）、Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternal Ｍed icine（イセルバッヒャー（Ｉsselbacher）ら編）マックグロー−ヒル、ニュー ヨーク（１９９４）１９９４〜１９９５頁）。真性糖尿病の経過中に網膜の血管 は、浸出性の血管となるばかりでなく網膜低酸素症をもたらす血管の脱落ともな る。これら合併症の結果は、出血、綿状白斑、網膜梗塞、および出血や網膜剥離 となる網膜の血管新生である。もし処置せずに放置したなら、６０％が視力喪失 する。増殖糖尿病網膜症の古典療法は汎網膜レーザー光凝固（ＰＲＰ）である。 しかしながら、汎網膜レーザー光凝固でも、中心窩熱症、出血、網膜剥離および 脈絡膜血管増殖などの合併症が起こり得る。さらに、この処置の他の都合の悪い 作用としては、周辺視力の低下、夜間視力の低下、および色知覚の変化がある（ Ａm.Ｊ.Ｏphthalmol.（１９７６）８１：３８３〜３９６；Ｏphthalmol.（１９ ９１）９８：７４１〜８４０）。 それゆえ、糖尿病網膜症の一層有効な治療法に対する必要性が存在する。 未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、米国における子供の失明の共通の原因である（ピ アス（Ｐierce）ら（１９９４）Ｉnt.Ｏphth.Ｃlinics ３４：１２１〜１４８） 。未熟児は誕生後、補助酸素がなくとも酸素過剰状態に晒される。なぜなら、子 宮 内の酸素分圧は通常の室内空気を呼吸する場合に比べてはるかに低いからである 。このような相対的な酸素過剰症は、ＲＯＰになることがあるとしても生存に必 要なものである。網膜の血管は周辺網膜中への成長を止め、その結果、成長中の 網膜の代謝要求が増大するにつれて虚血および局限的な低酸素状態となる。こう した低酸素症は、その後の網膜の血管新生を刺激する。この血管新生は通常、寛 解するが、不可逆的な視力喪失となることがある。１年に少なくとも１０,００ ０の新たな症例があり、世界的推計で総計１０００万の症例がある。現在のとこ ろ、ＲＯＰの有効な治療法はない。低温療法およびレーザー療法の２つの治療法 が用いられているが完全に有効なものではなく、これら方法自体が目に障害をも たらし、その結果、視力の低下となる（ピアスら（１９９４）Ｉnt.Ｏphth.Ｃli nics３４：１２１〜１４８）。他の多くの抗脈管形成化合物が試験されているが 、網膜血管新生の抑制は報告されていない（スミス（Ｓmith）ら（１９９４）Ｉ nvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：１４４２；フォリー（Ｆoley）ら（１９９ ４）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：１４４２）。それゆえ、ＲＯＰの有 効な治療法に対する必要性が存在する。 加齢黄斑変性症は米国における老齢成人の失明の原因のトップであり、カフカ スアメリカ人（Ｃaucasian Ａmericans）のすべての両眼失明の３０％までを占 める（作者不明（１９９４）Ｐrevent Ｂlindness Ａmerica）。この疾患は、網 膜の光感受性光受容細胞に生理的支持を付与する網膜色素上皮細胞への障害によ る中心視力の喪失（通常、両眼性）を特徴とする。ほとんどの症例において、現 在のところ有効な治療法はない。早期に診断した滲出性の症例の約２０％におい てレーザー療法が視力のさらなる喪失を防ぐことはできる。しかしながら、この 作用は一過性のものである（ブレスラー（Ｂressler）ら、Ｐrinciples and Ｐr actices of Ｏphthalmology（アルバート（Ａlbert）およびジャコビアック（Ｊ akobiac）編）、ソーンダース（Ｗ.Ｂ.Ｓaunders Ｃo.）、フィラデルフィア、 ペンシルベニア（１９９４）Ｖol.２、８３４〜８５２頁）。 それゆえ、加齢黄斑変性症の一層有効で恒久的な治療法に対する必要性が存在 する。 黄斑血管新生はまた、鎌状赤血球網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、 その他の低酸素症の基礎をなす病理でもある。これら眼科疾患並びに血管新生に 付随する他の病理学的状態（すなわち、腫瘍の増殖、損傷の治癒）は、共通因子 として低酸素症を有すると思われる（ナイトン（Ｋnighton）ら（１９８３）Ｓc ience２２１：１２８３〜１２８５；フォークマン（Ｆolkman）ら（１９８７） Ｓcience２３５：４４２〜４４６；クラグスブルン（Ｋlagsbrun）ら（１９９１ ）Ａnn.Ｒev.Ｐhysiol.５３：２１７〜２３９；ミラー（Ｍiller）ら（１９９３ ）Ｐrinciples and Ｐractice of Ｏphthalmology、ソーンダース、フィラデル フィア、７６０頁；アイエロ（Ａiello）ら（１９９４）Ｎew Ｅng.Ｊ.Ｍed.３ ３１：１４８０〜１４８７）。さらに、網膜血管新生は、低酸素症に応答して網 膜により放出される「血管形成因子（vasoformative factor）」の結果であると の仮説が立てられている（マイケルソン（Ｍichaelson）（１９４８）Ｔrans.Ｏ phthalmol.Ｓoc.Ｕ.Ｋ.６８：１３７〜１８０；およびアシュトン（Ａshton）ら （１９５４）Ｂr.Ｊ.Ｏphthalmol.３８：３９７〜４３２）。近年の実験データ は、血管内皮増殖因子の発現と網膜血管新生との間に高度の相関がみられること を示している（アイエロら（１９９４）Ｎew Ｅng.Ｊ.Ｍed.３３１：１４８０〜 １４８７）。さらに、糖尿病患者の硝子体液で上昇レベルの血管内皮増殖因子が 認められている（アイエロら、上掲）。それゆえ、このサイトカイン／増殖因子 は血管新生関連疾患において重要な役割を果たしていると思われる。 血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）は、内皮細胞特異的 なマイトジェンであり、最近、低酸素症によって刺激され腫瘍の血管形成に必要 であることが示された（センガー（Ｓenger）ら（１９８６）Ｃancer Ｒes.４６ ：５６２９〜５６３２；キム（Ｋim）ら（１９９３）Ｎature３６２：８４１〜 ８４４；シュウェイキ（Ｓchweiki）ら（１９９２）Ｎature３５９：８４３〜８ ４５；プレート（Ｐlate）ら（１９９２）Ｎature３５９：８４５〜８４８）。 ＶＥＧＦ／ＶＰＦは、３４〜４３ｋＤａの（優勢な種は約４５ｋＤａにある）二 量体のジスルフィド様結合した糖タンパク質であり、種々の腫瘍細胞および正常 細胞により合成および分泌される。さらに、色素内皮細胞や血管周囲細胞などの 培養ヒト網膜細胞はＶＥＧＦを分泌し、低酸素症に応答してＶＥＧＦ遺伝子発現 を増加させることが示されている（アダミス（Ａdamis）ら（１９９３）Ｂioche m.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.１９３：６３１〜６３８；プルート（Ｐlouet）ら（ １９９２）Invest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３４：９００；アダミスら（１９９ ３）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３４：１４４０；アイエロら（１９９４） Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：１８６８；シモレ−ピナテル（Ｓimorre −Ｐinatel）ら（１９９４）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：３３９３〜 ３４００）。対照的に、正常組織中ではＶＥＧＦは比較的低レベルである。それ ゆえ、ＶＥＧＦは血管新生に関連する多くの病理学的状態およびプロセスにおい て主要な役割を果たしていると思われる。それゆえ、上記種々の状態により引き 起こされる組織中のＶＥＧＦ発現を制御することは、低酸素症に付随する治療ま たは予防療法の鍵となるであろう。 細胞遺伝子あるいは外来遺伝子の発現を調節することのできる「アンチセンス オリゴヌクレオチド」と呼ばれる新たな化学療法剤が開発されている（ザメクニ ク（Ｚamecnik）ら（１９７８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）７５：２８ ０〜２８４参照）。いかなる理論や機構にも拘束されるものではないが、アンチ センスオリゴヌクレオチドの活性は該オリゴヌクレオチドが標的核酸（たとえば 、ゲノム領域、遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部）へ結合し、かく してハイブリダイゼーション阻止によるかまたはＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡ の破壊（ＲＮＡにハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨを活性化する能力）に より該標的の機能を破壊することに依存している。 ＶＥＧＦ−特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが開発されているが（ウ チダ（Ｕchida）ら（１９９５）Ａntisense Ｒes.＆Ｄev.５（１）：８７（アブ ストラクトＯＰ−１０）；ノムラ（Ｎomura）ら（１９９５）Ａntisense Ｒes. ＆Ｄev.５（１）：９１（アブストラクトＯＰ−１８））、血管新生または血管 形成を逆行させることを示すものはない。それゆえ、ＶＥＧＦ発現を低減させる ことができ、最終的にＶＥＧＦ発現に関連する疾患および異常の発症を抑制しう るオリゴヌクレオチドの開発に対する必要性が依然として存在する。発明の要約 低酸素症の作用を受けた細胞はＶＥＧＦを発現することが知られている。ＶＥ ＧＦのｍＲＮＡに特異的な合成オリゴヌクレオチドが低酸素症関連血管新生を抑 制しうることが今やわかった。ＶＥＧＦ遺伝子のヌクレオチド５８〜９０に特異 的なオリゴヌクレオチドがＶＥＧＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の低酸素症によ り誘発された発現を低減させうることもまたわかった。この知見を用いて本発明 を開発したが、本発明はＶＥＧＦ−特異的なオリゴヌクレオチド、医薬組成物、 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低減させる方法、および血管新生 を低減させる方法および血管新生に関連する異常および疾患の治療方法を包含す るものである。本明細書において「血管新生」なる語は、血管および毛細血管の 増殖をいう。 一つの側面において、本発明は、血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮 増殖因子の発現を抑制するのに有効な合成オリゴヌクレオチドを所定量、血管新 生した組織に投与する。この組織は培養液であってもよいし、またはヒトその他 の哺乳動物などの動物の体の一部もしくは全体であってもよい。一つの態様にお いて、本発明はヒトＶＥＧＦ−特異的な核酸に相補的で配列表の配列番号：２〜 １６に示す核酸配列を有する合成オリゴヌクレオチドを提供する。 本明細書において「合成オリゴヌクレオチド」なる語は、少なくとも一つの５ ’から３’へのインターヌクレオチド結合を介して共有結合により連結したヌク レオチドからなる化学的に合成したポリマーをいう。幾つかの態様において、こ れらオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド、リボ ヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両者を 含む。他の態様において、本発明の方法に用いる合成オリゴヌクレオチドは長さ が約１４〜約２８、または約１５〜約３０ヌクレオチドである。幾つかの好まし い態様において、これらオリゴヌクレオチドは約１５〜約２５のヌクレオチドを 含み、他の態様において約１６〜２９ヌクレオチドを含む。 幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはまた、ＶＥＧＦのｍＲＮＡ内に 含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を損なうことなく、多くの 仕方で修飾することができる。本明細書において「修飾オリゴヌクレオチド」な る語は、少なくとも２つのヌクレオチドが一方のヌクレオチドの５’末端と他方 のヌクレオチドの３’末端との間で合成結合、すなわちホスホジエステル以外の 結合により共有結合で連結されており、その際、該５’ヌクレオチドのリン酸基 がいずれかの化学基で置換されているようなオリゴヌクレオチドをいう。 本発明の目的のためには、「ゲノム領域またはそれから転写されたＲＮＡヌク レオチドに相補的なオリゴヌクレオチド配列」なる語は、生理的条件下、たとえ ば、ワトソン−クリック塩基対形成（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間の 相互作用）により、またはフーグスチーン塩基対形成（オリゴヌクレオチドと二 本鎖核酸との間の相互作用）により、またはオリゴヌクレオチドがＲＮＡへ結合 してシュードノット（pseudoknot）形成を起こす場合を含む他の手段により、該 核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを意味する。生理的条件下でのワトソン −クリックまたはフーグスチーンの塩基対形成による結合は、実際には該核酸配 列の機能の妨害を観察することにより測定する。 幾つかの態様において、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦのｍＲ ＮＡ内に含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を損なうことなく 幾つかの仕方で修飾される。本明細書において「修飾オリゴヌクレオチド」とは 、そのヌクレオチドの少なくとも二つが、合成結合、すなわち一方のヌクレオチ ドの５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端との間のホスホジエステル結合以外 の結合（５'ヌクレオチドリン酸はいずれかの化学基により置換されている）に より連結しているオリゴヌクレオチドをいう。 幾つかの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのイ ンターヌクレオチド結合は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホス ホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルア ミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデー ト、および／またはカルボキシメチルエステルである。 「修飾オリゴヌクレオチド」なる語はまた、２'−Ｏ−置換リボヌクレオチド などの修飾塩基および／または糖を有する少なくとも一つのヌクレオチドを有す るオリゴヌクレオチドをも包含する。本発明の目的のためには、「２'−Ｏ−置 換」とは、ペントース残基の２'位での１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含 む−Ｏ−低級アルキル基による、または２〜６炭素原子を有する−Ｏ−アリール またはアリル基（その際、かかるアルキル、アリールまたはアリル基は置換され ていなくてもよいし、または、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメ チル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カル ブアルコキシで置換されていてもよい）による、またはヒドロキシ、アミノまた はハロ基による（しかしながら、２'−Ｈ基による置換は含まない）置換を意味 する。幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、５'末端で２'− Ｏ−アルキル化された４または５のリボヌクレオチド（すなわち、５’２−Ｏ− アルキル化リボヌクレオチド）、および／または３'末端で２'−Ｏ−アルキル化 された４または５のリボヌクレオチド（すなわち、３’２−Ｏ−アルキル化リボ ヌクレオチド）を含む。好ましい態様において、合成オリゴヌクレオチドのヌク レオチドは、一つまたは少なくとも一つのホスホロチオエートインターヌクレオ チド結合により連結されている。ホスホロチオエート結合はＲ_PおよびＳ_Pの混合 エナンシオマーであるか、またはＲ_PかＳ_Pのいずれかの形態で立体規則的または 実質的に立体規則的であってよい（アイアー（Ｉyer）ら（１９９５）Ｔetrahed ron Ａsymmetry ６：１０５１〜１０５４）。 本発明の他の側面において、未熟児網膜症（ＲＯＰ）の治療方法が提供される 。この方法は、血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子の網膜中で の発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドの治療学的量を、ＲＯＰを患う患者に投 与する工程を含む。本発明の他の側面において、糖尿病網膜症の治療方法が提供 される。この方法は、血管内皮増殖因子の核酸に特異的でＶＥＧＦの網膜中での 発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドの治療学的量を、糖尿病網膜症を患う患者 に投与する工程を含む。 本発明のさらに他の側面において、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）の治療方法が 提供される。この方法は、血管内皮増殖因子の核酸に特異的でＶＥＧＦの網膜中 での発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドの治療学的量を、ＡＲＭＤを患う患者 に投与する工程を含む。 本発明の他の側面は、疾患状態に関連する血管新生および血管形成におけるＶ ＥＧＦの役割を評価することである。 他の側面において、本発明はＶＥＧＦの発現を抑制する方法を提供する。この 方法においては、ＶＥＧＦに特異的な核酸を本発明のオリゴヌクレオチドと接触 させる。本明細書において「核酸」とは、ゲノム領域またはそれから転写された ＲＮＡ分子を包含する。幾つかの態様において核酸はｍＲＮＡである。 いかなる理論や機構にも拘束されるものではないが、本発明に従って用いられ るオリゴヌクレオチドの活性は、該オリゴヌクレオチドが標的核酸（たとえば、 ゲノム領域、遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部）へ結合し、かくし て該標的の機能を破壊することに依存している。生理的条件下で起こるかかるハ イブリダイゼーションは、実際は該核酸配列の機能の妨害を観察することによっ て測定する。それゆえ、本発明に従って用いられる好ましいオリゴヌクレオチド は、標的核酸と安定な二本鎖（あるいはフーグスチーン塩基対形成機構の場合に は三本鎖）を形成することができ、ＲＮアーゼＨを活性化することによって標的 ＲＮＡ分子を有効に破壊することができ、さらにインビボでのヌクレアーゼ分解 （たとえば、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼ活性）に対して耐性 を示しうる。オリゴヌクレオチドの上述した幾つかの修飾および当該技術分野で 知られた他の修飾は、これらそれぞれの好ましい特性に特異的かつ首尾よく取り 組むものである。生理学的に許容しうる担体中に請求項１に記載の少なくとも一 つの合成オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物もまた本発明により提供される。 上記本発明の方法の幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドを局 所（たとえば、眼内または病変間（interlesionally））および／または全身投 与する。「局所投与」なる語は生体の定められた領域または部位への送達をいい 、一方、「全身投与」なる語は経口摂取により、または筋肉内、静脈内、皮下も しくは腹腔内注射による生体全体への送達を包含することを意味する。 本発明の他の側面は、血管新生を抑制することができ、それゆえ本発明の方法 に有用な医薬組成物を含む。これら組成物は、血管内皮増殖因子の発現を特異的 に抑制する本発明の合成オリゴヌクレオチドおよび生理学的および／または薬理 学的に許容しうる担体を含む。 「薬理学的に許容しうる」なる語は、活性成分の生物学的作用の有効性を妨害 することのない非毒性物質を意味する。「生理学的に許容しうる」なる語は、生 物系、たとえば、細胞、細胞培養液、組織、または生物体などと両立しうる非毒 性物質をいう。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、本発明の種々の特徴、並びに本発明それ自体は 、下記の記載を添付の図面とともに読んだときに一層完全に理解される。添付図 面において、 図１は、網膜血管新生のマウスモデルの模式図である； 図２は、未熟児網膜症における血管新生を抑制する本発明のオリゴヌクレオチ ドの能力を示すグラフである； 図３は、ＶＥＧＦの発現を抑制するヒトＶＥＧＦ−特異的オリゴヌクレオチド の能力を試験するのに用いたＥＬＩＳＡの模式図である； 図４は、ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであり、本発明のヒトＶＥＧＦ−特異 的オリゴヌクレオチドの存在下でのヒト細胞中でのＶＥＧＦの発現の低下を示す ； 図５は、ノーザンブロットの結果を示すグラフであり、種々の濃度の本発明の ヒトＶＥＧＦ−特異的オリゴヌクレオチドの存在下でのヒト細胞によるＶＥＧＦ の発現の低下を示す； 図６は、本発明のオリゴヌクレオチドによりターゲティングされるＶＥＧＦ ｃＤＮＡ配列の領域を示す模式図である； 図７は、ＥＬＳＡの結果を示すグラフであり、塩化コバルトにより誘発された ＶＥＧＦ発現を抑制するオリゴヌクレオチドＨ３−ＩおよびＨ３−Ｊの能力を示 す； 図８は、ＥＬＳＡの結果を示すグラフであり、塩化コバルトにより誘発された ＶＥＧＦ発現を抑制するオリゴヌクレオチドＨ３−Ｄ、Ｈ３−ＥおよびＨ３−Ｆ の能力を示す； 図９は、ＥＬＳＡの結果を示すグラフであり、塩化コバルトにより誘発された ＶＥＧＦ発現を抑制するオリゴヌクレオチドＨ３−ＧおよびＨ３−Ｈの能力を示 す； 図１０は、ＥＬＳＡの結果を示すグラフであり、インビトロにおいてＭ２１ヒ ト黒色腫細胞中で塩化コバルトにより誘発されたＶＥＧＦ発現を抑制するオリゴ ヌクレオチドＨ３およびＨ３−Ｉの能力を示す；および 図１１は、ＥＬＳＡの結果を示すグラフであり、塩化コバルトにより誘発され たＶＥＧＦ発現を抑制する修飾Ｈ３オリゴヌクレオチドの能力を示す（Ｈ３−Ｋ ：すべて２'−Ｏ−メチル化されたホスホロチオエートリボヌクレオチド；Ｈ３ −Ｌ：５つの５’２'−Ｏ−アルキル化されたホスホロチオエートリボヌクレオ チド、残りはホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；Ｈ３−Ｍ：５つの ３’２'−Ｏ−アルキル化されたホスホロチオエートリボヌクレオチド、残りは ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；およびＨ３−Ｎ：５つの３’２ '−Ｏ−アルキル化されたホスホロチオエートリボヌクレオチド、５つの５’２' −Ｏ−アルキル化されたホスホロチオエートリボヌクレオチド、残りはホスホロ チオエートデオキシリボヌクレオチド）。好ましい態様の詳細な説明 本明細書において言及する特許および科学文献は、当業者に利用できる知見を 確立するものである。本明細書中に引用する発行された米国特許、許された出願 、および引用文献は、参照のため本明細書中に引用する。 本発明は、網膜血管新生を含む血管新生および血管形成に関連する疾患および 異常を治療するのに有用な、ＶＥＧＦの核酸に特異的な合成アンチセンスオリゴ ヌクレオチドを提供する。 アンチセンスオリゴヌクレオチド法は、遺伝子発現の抑制に新たなアプローチ を提供するものである（一般に、アグラワル（Ａgrawal）（１９９２）Ｔrends in Ｂiotech.１０：１５２；ワグナー（Ｗagner）（１９９４）Ｎature ３７２ ：３３３〜３３５；およびスタイン（Ｓtein）ら（１９９３）Ｓcience ２６１ ：１００４〜１０１２参照）。相補的な核酸配列（センス鎖）に結合することに より、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を 抑制することができる。このようにしてアンチセンスオリゴヌクレオチドはタン パク質の発現を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた ゲノムＤＮＡに結合して三本鎖を形成し、転写を抑制することも示されている。 さらに、１７ｍｅｒの塩基配列は統計的にヒトゲノム中で１回しか起こらず、そ れゆえ、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより特定配列の 極めて正確なターゲティングが可能である。 ＶＥＧＦをコードする領域は８つのエキソンからなることが決定されている（ ティッシャー（Ｔischer）ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６６：１１９４７ 〜１１９５４）。１２１、１６５、および１８９アミノ酸長の３つのＶＥＧＦ転 写物が観察されており、別のスプライシング機構が存在することを示唆している （レング（Ｌeung）ら（１９８９）Ｓcience ２４６：１３０６〜１３０９；テ ィッシャーら（１９９１）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６６：１１９４７〜１１９５４） 。さらに最近では、２０６アミノ酸をコードする長さの第四のＶＥＧＦ転写物が 発見された（フック（Ｈouck）ら（１９９１）Ｍol.Ｅndocrinol.５：１８０６ 〜１８１４）。１２１および１６５アミノ酸ポリペプチドに相同な転写物がウシ の系で同定されており（レングら（１９８９）Ｓcience ２４６：１３０６〜１ ３０９）、１６５アミノ酸転写物に対応する転写物もまたマウスの系で同定され ている（コン（Ｃonn）ら（１９９０）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８７ ：１３２３〜１３２７；センガーら（１９９０）Ｃancer Ｒes.５０：１７７４ 〜１７７８；クラフィー（Ｃlaffey）ら（１９９２）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６７： １６３１７〜１６３２２）。３つの形態のＶＥＧＦをコードする核酸配列もまた ヒトで報告されており（ティッシャーら（１９９１）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６６： １１９４７〜１１９５４）、ヒトＶＥＧＦとマウスＶＥＧＦとの比較により８５ ％以上の種間保存が明らかとなっている（クラフィーら（１９９２）Ｊ.Ｂiol. Ｃhem.２６７：１６３１７〜１６３２２）。 本発明のオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦ発現を抑制するための標的として有 効に働くのであればＶＥＧＦ核酸配列のいずれの部分に向けられたものであって もよい。ＶＥＧＦをコードする遺伝子の配列はマウス（クラフィーら、上掲）お よびヒト（ティッシャーら、上掲）で報告されている。ＶＥＧＦ遺伝子のこれら ターゲティング領域には既知のエキソンのいずれの部分も含まれる。さらに、エ キソン−イントロン境界領域は、ＶＥＧＦ発現のアンチセンス抑制の潜在的に有 用な標的である。ヒトＶＥＧＦに特異的な幾つかの代表的だが限定されないオリ ゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を下記表１に列挙する。 刊行されている核酸配列および本明細書の開示に基づき、当業者であれば不当 な実験をすることなくＶＥＧＦ発現を抑制する他のアンチセンス核酸配列を同定 できるであろう。たとえば、ヒトＶＥＧＦ核酸に特異的にターゲティングされる 他の配列は、ＲＮアーゼＨにより開裂される能力に基づいて選択することができ る。一つの有用なターゲティング領域は塩基５８〜９０あたりにある。ヒトＶＥ ＧＦに特異的な幾つかの代表的な限定されないオリゴヌクレオチドは、配列番号 ：５４〜６８を有する。 本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチ ド、または両者の組み合わせからなり、一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌ クレオチドの３'末端とが共有結合により連結している。これらオリゴヌクレオ チドは長さが少なくとも１４ヌクレオチドであるが、１５〜３０ヌクレオチドの 長さであるのが好ましく、１５〜２９ｍｅｒが最も一般的である。 これらオリゴヌクレオチドの調製は、ホスホルアミデート化学またはＨ−ホス ホネート化学などの当該技術分野で認識された方法により行うことができ、これ らは手動または自動合成機により行うことができる（ウールマン（Ｕhlmann）ら 、Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３；およびアグラワル（Ｔrends Ｂiotechnol.（１９９２）１０：１５２〜１５８））。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにハイブリダイズす る能力を損なうことなく多くの仕方で修飾することができる。たとえば、オリゴ ヌクレオチドには一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌクレオチドの３'末端と の間のホスホジエステル以外のインターヌクレオチド結合が少なくとも一つ含ま れていてよく、その際、５'ヌクレオチドホスホジエステル結合はいずれかの化 学基で置換されていてよい。そのような化学基の例としては、アルキルホスホネ ート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエー ト、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、 カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルが挙げら れる。 たとえば、米国特許第５,１４９,７９７号は、ホスホロチオエートコア領域が メチルホスホネートまたはホスホルアミデートフランキング領域の間に挟まれて いる伝統的なキメラオリゴヌクレオチドを記載している。１９９５年８月９日に 出願された米国特許出願第４７５０８−５５９号は、オリゴヌクレオチドホスホ ロチオエートの１またはそれ以上の領域によりフランキングされた１またはそれ 以上の非イオン性オリゴヌクレオチド領域（たとえば、アルキルホスホネートお よび／またはホスホルアミデートおよび／またはリン酸トリエステルインターヌ クレオシド結合）を含む「逆（inverted）」キメラオリゴヌクレオチドを開示し ている。修飾インターヌクレオシド結合を有する種々のオリゴヌクレオチドの調 製は、公知の方法（たとえば、グッドチャイルド（Ｇoodchild）（１９９０）Ｂ ioconjugate Ｃhem.２：１６５〜１６７；アグラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎat l.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８５：７０７９〜７０８３；ウールマンら（１９９０ ）Ｃhem.Ｒev.９０：５３４〜５８３；およびアグラワルら（１９９２）Ｔrends Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８を参照）に従って行うことができる。 ホスホロチオエート結合はＲ_PおよびＳ_Pの混合エナンシオマーであってもよい し、またはＲ_PまたはＳ_Pのいずれかの形態で立体規則的または実質的に立体規則 的であってよい（アイヤーら（１９９５）Ｔetrahedron Ａsymmetry ６：１０５ １〜１０５４）。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、ホス ホルアミダイト（たとえば、アグラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci .（ＵＳＡ）８５：７０７９〜７０８３を参照）化学やＨ−ホスホネート（たと えば、フレーラー（Ｆroehler）（１９８６）Ｔetrahedron Ｌett.２７：５５７ ５〜５５７８を参照）化学などの当該技術分野でよく知られた方法を用いて調製 できる。バーゴット（Ｂergot）らにより記載された方法（Ｊ.Ｃhromatog.（１ ９９２）５５９：３５〜４２）を用いることもできる。 自己安定化したオリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法に有用な修飾オリゴ ヌクレオチドであると思われる（タング（Ｔang）ら（１９９３）Ｎucleic Ａci ds Ｒes.２０：２７２９〜２７３５）。これらオリゴヌクレオチドは、標的ハイ ブリダイズ領域；および該自己安定化オリゴヌクレオチド内の核酸配列に相補的 なオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補的領域の２つの領域を含む。 他の修飾としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端にあるものが挙 げられ、インターヌクレオシドリン酸結合の該分子への付加、たとえばアミノ基 と末端リボース、デオキシリボースとの間に種々の数の炭素残基を有するコレス テリルまたはジアミン化合物、および開裂させ、または反対鎖または結合酵素も しくはゲノムに結合する他のタンパク質に架橋させるリン酸修飾が含まれる。そ のような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、リボースの代わりのアラビノー スなどの修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチド、または３'位 および５'位の両方でヒドロキシル基以外の化学基（その３'位にて）およびリン 酸基以外の化学基（その５'位にて）に結合した糖を有する３',５'−置換オリゴ ヌクレオチドが挙げられる。 糖の修飾の他の例としては、リボース残基の２'位の修飾が挙げられ、これに は１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基による、また は２〜６の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基による（その際、か かる−Ｏ−アルキル、アリールまたはアリル基は置換されていなくてもよいし、 または置換されていてもよい（たとえば、ハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロ メチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カ ルブアルコキシ、またはアミノ基により））、またはアミノまたはハロゲン基に よる、２'−Ｏ−置換が挙げられるが、これらに限られるものではない。これら 置換基はいずれも、リボースの場合の天然の２'−ヒドロキシル基、またはデオ キシリボースの場合の２'−Ｈ−を排除することを意図するものではない。ＰＣ Ｔ公開第ＷＯ９４／０２４９８号は、ＤＮＡコア領域をフランキングする２'− Ｏ−置換されたリボヌクレオチドの領域を有する伝統的なハイブリッドオリゴヌ クレオチドを開示している。１９９５年８月９日に出願された米国特許出願第４ ７５０８−５５９号は、２'−Ｏ−置換された（または２'ＯＨ、非置換）ＲＮＡ 領域が２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域の間に存在する（「伝統的な 」ハイブリッドオリゴヌクレオチドに比べて「逆」の構造）オリゴヌクレオチド を含む、「逆」ハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示している。本発明の特に 有用なオリゴヌクレオチドの限定されない例は、３'末端、５'末端、または３' お よび５'の両末端で２'−Ｏ−アルキル化されたリボヌクレオチドを有し、少なく とも４または５の隣接するヌクレオチドがそのように修飾されたものである。２ '−Ｏ−アルキル化基の限定されない例示としては、２'−Ｏ−メチル、２'−Ｏ −エチル、２'−Ｏ−プロピル、および２'−Ｏ−ブチルが挙げられる。 他の修飾オリゴヌクレオチドは、その３'末端および／または５'末端にてヌク レアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基でキャッピングされており、またはヌク レオチド当たり一つの非架橋性酸素に置換基を有する。そのような修飾はインタ ーヌクレオシド結合のいずれかまたはすべてでなされてよく、オリゴヌクレオチ ドのいずれかまたは両方の末端および／または該分子の内部でなされていてよい 。 本発明の有用な非修飾および修飾オリゴヌクレオチドの限定されない例示を下 記表２に掲げる。 上記表２に示したオリゴヌクレオチド中の太字で表示したヌクレオチドは２' −Ｏ−アルキル化されており、すべてのヌクレオチドがホスホロチオエートなど の非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合により連結されているのが好ま しい。 これら修飾オリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野でよく知られている（ア グラワルら（１９９２）Ｔrends Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８；アグラワ ルら（１９９５）Ｃurr.Ｏpin.Ｂiotechnol.６：１２〜１９に概説されている） 。たとえば、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホスホ ルアミデート化学などの当該技術分野で認識された技術を用いてヌクレオチドを 共有結合により連結することができる（たとえば、ウールマンら（１９９０）Ｃ hem.Ｒev.９０：５４３〜５８４；アグラワルら（１９８７）Ｔetrahedron Ｌet t.２８：（３１）：３５３９〜３５４２；カルサーズ（Ｃaruthers）ら（１９８ ７）Ｍeth.Ｅnzymol.１５４：２８７〜３１３；米国特許第５,１４９,７９８号 を参照）。オリゴマー性のホスホロチオエートアナログの調製は、メトキシホス ホルアミダイト（たとえば、アグラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci .（ＵＳＡ）８５：７０７９〜７０８３を参照）またはＨ−ホスホネート（たと えば、フレーラー（１９８６）Ｔetrahedron Ｌett.２７：５５７５〜５５７ ８を参照）化学などの当該技術分野でよく知られた方法を用いて行うことができ る。バーゴットらによって記載された合成法（Ｊ.Ｃhromatog.（１９９２）５５ ９：３５〜４２）を用いることもできる。 治療組成物の形態の本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管新 生に付随する疾患、異常および状態、たとえば、これらに限られるものではない が、網膜血管新生、腫瘍増殖および創傷治癒を治療するのに有用である。かかる 方法において、血管内皮増殖因子の発現を抑制するのに有効な治療学的量の本発 明の合成オリゴヌクレオチドを細胞に投与する。この細胞は、細胞培養、血管新 生した組織培養の一部であってもよいし、またはヒトや他の哺乳動物などの動物 の体の一部または全体であってよい。投与は、当業者によって決定されるように 状態および応答に応じてボーラス（bolus）、間欠的または連続的であってよい 。本発明の上記方法の幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドを局 所（たとえば、眼内または病変間）および／または全身投与する。「局所投与」 は生体の定められた領域または部位に送達することをいうのに対し、「全身投与 」は経口摂取により、または筋肉内、静脈内、皮下または腹腔内注射により生物 体全体に送達することを包含する。 かかる方法は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症、鎌 状赤血球網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、および他の低酸素症疾患を 治療するのに有用である。 本発明の合成オリゴヌクレオチドは、生理学的および／または薬理学的に許容 しうる担体とともに用いたときに医薬組成物の一部として用いることができる。 担体の特性は投与経路に依存するであろう。かかる組成物は、合成オリゴヌクレ オチドおよび担体に加えて、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤 、および当該技術分野でよく知られた他の物質を含んでいてよい。本発明の医薬 組成物はまた、ＶＥＧＦ発現の抑制を促進し、または血管新生を低減させるであ ろう他の活性因子および／または薬剤をも含んでいてよい。たとえば、それぞれ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた合成オリゴヌクレオチドの組み合 わせを本発明の医薬組成物中に用いることができる。本発明の医薬組成物はさら に、 アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどのヌクレオチド アナログを含んでいてよい。かかる付加的な因子および／または薬剤は、本発明 の合成オリゴヌクレオチドとともに相乗作用が得られるように、または本発明の 合成オリゴヌクレオチドによって引き起こされる副作用を最小限に抑えるために 医薬組成物中に配合する。逆に、特定の抗ＶＥＧＦまたは抗血管新生因子および ／または薬剤の副作用を最小限に抑えるために、これら抗ＶＥＧＦまたは抗血管 新生因子および／または薬剤の組成物中に本発明の合成オリゴヌクレオチドを配 合することができる。 本発明の医薬組成物は、他の薬理学的に許容しうる担体に加えて本発明の合成 オリゴヌクレオチドを脂質などの両親媒性薬剤とともに配合したリポソームの形 態であってよく、該脂質などの両親媒性薬剤は水溶液中にミセル、不溶性の単層 、液晶、またはラメラ層として凝集形態で存在する。リポソーム組成物のために 適した脂質としては、これらに限られるものではないが、モノグリセリド、ジグ リセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙 げられる。一つの特に有用な脂質担体はリポフェクチンである。かかるリポソー ム組成物の調製は、たとえば、米国特許第４,２３５,８７１号、米国特許第４, ５０１,７２８号、米国特許第４,８３７,０２８号、および米国特許第４,７３７ ,３２３号に開示されているように、当業者の範囲内である。本発明の医薬組成 物はまた、ザオ（Ｚhao）ら（印刷中）により記載されているように、オリゴヌ クレオチドの細胞中への送達を促進するシクロデキストリンなどの化合物、また は遅放性ポリマーをさらに含んでいてよい。 本明細書において「治療学的有効量」とは、意味のある患者の利益、すなわち 血管新生を特徴とする慢性状態の治癒または血管新生それ自体の低減またはかか る状態の治癒速度の上昇、を示すに充分な医薬組成物または方法の各活性成分の 合計量を意味する。単独で投与した個々の活性成分についていう場合は、この語 は該成分のみをさす。組み合わせたものについていう場合は、この語は、活性成 分を組み合わせて、順番に、または一度に投与したかにかかわらず、治療学的効 果を示す活性成分の合計量をいう。 本発明の治療または使用法を行うに際しては、１、２またはそれ以上の本発明 の合成オリゴヌクレオチドの治療学的有効量を、血管新生に関連する疾患または 異常を患う患者、または血管新生している組織に投与する。本発明の合成オリゴ ヌクレオチドは、本発明の方法に従い、単独か、または他の公知の血管新生療法 剤と組み合わせて投与することができる。１またはそれ以上の他の療法剤ととも に投与する場合には、本発明の合成オリゴヌクレオチドは他の治療剤と同時かま たは順番に投与することができる。順番に投与する場合には、担当医師は他の治 療剤と組み合わせて本発明の合成オリゴヌクレオチドを投与する適当な順番を決 定するであろう。 本発明の医薬組成物中に用いたまたは本発明の方法を行うための本発明の合成 オリゴヌクレオチドの投与は、眼内、経口摂取、吸入、または経皮、皮下、筋肉 内、もしくは静脈内注射などの種々の通常の経路で行うことができる。 本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療学的有効量を経口投与する場合には、 合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤またはエリキシル剤 の形態であろう。錠剤の形態で投与する場合には、本発明の医薬組成物はさらに ゼラチンなどの固形担体やアジュバントを含有していてよい。錠剤、カプセル剤 および散剤は、約５〜９５％の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約２ ５〜９０％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体の形態で投与する場合には、 液体担体、たとえば、水、石油エーテル、動物または植物由来の油、たとえばピ ーナッツ油、鉱油、ダイズ油、ゴマ油、または合成油を加えることができる。液 体形態の医薬組成物はさらに、生理食塩水、デキストロースその他の糖溶液、ま たはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポ リエチレングリコールを含んでいてよい。液体形態で投与する場合には、医薬組 成物は約０.５〜９０重量％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約１〜５０ 重量％の合成オリゴヌクレオチドを含む。 本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療学的有効量を静脈内、皮下、筋肉内、 眼内、または腹腔内注射により投与する場合には、合成オリゴヌクレオチドは発 熱物質不含の非経口的に許容しうる水溶液の形態にあるであろう。ｐＨ、等張性 、 安定性などに妥当な注意を払ったそのような非経口的に許容しうる溶液の調製は 当該技術の範囲内である。静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または眼内注射のた めの好ましい組成物は、合成オリゴヌクレオチドに加えて等張ビヒクル、たとえ ば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロ ースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液、または当該技術分野で 知られた他のビヒクルを含有していなければならない。本発明の医薬組成物はま た、安定化剤、保存剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に知られた他の添加 剤を含んでいてよい。 本発明の医薬組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、処置しようとする状 態の性質および重篤度、および患者が以前に受けた処置の性質に依存するであろ う。最終的には担当医師が、個々の患者を処置するに必要な合成オリゴヌクレオ チドの量を決定するであろう。最初は担当医師は低投与量の合成オリゴヌクレオ チドを投与し、患者の応答を観察するであろう。最適の治療効果が患者で得られ るまで投与する合成オリゴヌクレオチドの投与量を大きくしていき、その時点で 投与量をそれ以上は増加させない。本発明の方法を行うのに使用する種々の医薬 組成物は、体重または器官重量１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約２０ｍｇの合成オリ ゴヌクレオチドを含有していなければならない。 本発明の医薬組成物を用いた静脈内療法の期間は、処置しようとする疾患の重 篤度および各個々の患者の状態および潜在的な特異体質的応答に応じて変わるで あろう。最終的には担当医師が、本発明の医薬組成物を用いて静脈内療法を行う 適当な期間を決定するであろう。 幾つかの疾患は急性の処置に付されるが、他の疾患は長期にわたる療法を必要 とする。増殖網膜症は、ＲＯＰ、糖尿病網膜症の幾つかの症例、および血管新生 緑内障において認められるように数日のうちに閾値に達しうる。未熟児はまた、 妊娠３５週頃、誕生後数週間は血管新生のリスクにあり、網膜が血管形成する（ vascularized）までしばらくの間はリスクにあり続けるであろう。糖尿病網膜症 は急性ではありうるが、増殖相ではかなり長期にわたって燻り続けることもある 。糖尿病網膜症は、血管増殖シグナルが血管新生または網膜の破壊とともに減 少するにつれて最終的に静止される。 網膜疾患への急性および長期間の両介入は、目的とするに足る。ＶＥＧＦに対 するオリゴヌクレオチドの硝子体内注射は、急性の状況における網膜血管新生の 有効な抑制手段である。しかしながら、何年にもわたる長期間の治療の場合には 、食塩水、遅放性ポリマーまたはリポソームなどの担体を用いた全身送達（腹腔 内、筋肉内、皮下、静脈内）も考慮すべきである。 慢性血管新生疾患の幾つかの症例においては、オリゴヌクレオチドの全身投与 が好ましい。該疾患プロセスは異常で漏れやすい血管が関与するので、血液脳関 門の通過は問題とはならない。それゆえ、全身送達が有効であることがわかる。 注射の頻度は、疾患プロセスおよびオリゴヌクレオチドの生物学的半減期に応じ て連続的な注入から１カ月に１回である。 ＶＥＧＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで血管新生 を抑制することに加えて、血管新生が関与するプロセスにおける該サイトカイン の役割を決定するうえでも有用である。たとえば、この技術は、血管の形成およ び透過性を模倣するインビトロ系において、および下記マウスモデルなどの血管 新生のインビボ系モデルにおいて有用である。 酸素誘発による（oxygen-induced）網膜血管新生のマウスモデルは確立されて おり、この血管新生は処置動物の１００％で起こり、しかも定量的である（スミ スら（１９９４）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：１０１〜１１１）。こ のモデルを用い、ＶＥＧＦメッセージの発現の増大と内顆粒層および神経節細胞 層（すなわち、ミュラー細胞）中での網膜血管新生の開始との間の相関関係を決 定した（ピアスら（１９９５）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（印刷中） ）。この結果を、血管新生の進展の間の種々の時点での全網膜のノーザンブロッ ティングおよびインシチュハイブリダイゼーション分析により確認した（ピアス ら、上掲）。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＶＥＧＦの発現を低減させる方法におい ても有用である。標的ＶＥＧＦ発現は、インビトロであってもよいし、またはＶ ＥＧＦを発現する細胞におけるものであってもよい。この方法において、ＶＥＧ Ｆに特異的な核酸を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させて、該核酸のｍＲＮ Ａおよび／またはタンパク質への転写が低減または抑制されるようにする。 本発明のオリゴヌクレオチドがタンパク質レベルでＶＥＧＦ発現を抑制しうる ことは、ヒトＶＥＧＦおよびヒト神経膠芽細胞腫（たとえば、Ｕ３７３ ＡＴＣ Ｃ受託番号第ＨＴＢ１７、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロ ックビル、メリーランド）やヒト黒色腫（たとえば、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＡＴＣ Ｃ受託番号第ＨＴＢ６８、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロ ックビル、メリーランド；またはＭ２１）などのＶＥＧＦ発現細胞株を特異的に 検出するＥＬＩＳＡを用いて示すことができる。簡単に説明すると、ヒト神経膠 芽細胞腫細胞株Ｕ３７３およびヒト黒色腫細胞株Ｍ２１を本発明のＶＥＧＦ−特 異的オリゴヌクレオチドで処理すると、これら細胞は、それぞれ図７、８、９お よび１０に示すように配列特異的な仕方でＶＥＧＦの発現を停止する。図１１は 、これらオリゴヌクレオチドの修飾がその抑制活性を低減しないことを示してい る。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、下記実施例４に記載のノーザン分析に より示されるようにＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現をも低減させた。 インビボでの腫瘍形成におけるＶＥＧＦの役割は、動物モデルとして注射した 無胸腺マウスを用いて示すことができる。Ｍ２１細胞は、約１〜１.５週で触診 しうる腫瘍をマウスに生じることが知られている。別のやり方として、エンゲル ブレス・ホルム・スウォーム（Ｅngelbreth Ｈolm Ｓwarm）（ＥＭＳ）腫瘍マト リックス（マトリゲル（Ｍatrigel）^TM、コラボラティブ・リサーチ（Ｃollabor ative Ｒesearch）、ウォルサム、マサチューセッツ）の存在下で無胸腺マウス を通過させたＵ３７３細胞株を用いることができる。本発明のＶＥＧＦ−特異的 オリゴヌクレオチドをマウスに注射した場合、ＶＥＧＦ発現が本発明のオリゴヌ クレオチドまたは医薬組成物によって低減されるならば腫瘍の重量および容量が 低減されるであろう。 ＶＥＧＦが網膜血管新生において役割を果たしていることが、上記血管新生の マウスモデルを用いて示された。ＶＥＧＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレ オチド（ＪＧ−３（配列番号：４７）、ＪＧ−４（配列番号：４８）、およびＶ ｍ（配列番号：４６））および対応センスオリゴヌクレオチド（Ｖ２（配列番号 ：４９））を用い、３つの独立した実験を行った。これらオリゴヌクレオチドは 、マウスＶＥＧＦの既知の核酸配列（クラフィー（Ｃlaffee）ら（１９９２）Ｊ .Ｂiol.Ｃhem.２６７：１６３１７〜１６３２２）を用いて設計した。Ｖｍオリ ゴヌクレオチドの配列（配列番号：４６）は、翻訳ＴＧＡ停止部位（ＴＧＡ）の 周辺の配列をターゲティングするものである。ＪＧ−４の配列（配列番号：４８ ）は、マウスＶＥＧＦ分子の翻訳開始部位のＡＴＧを含み、該ＡＴＧの５'側の 配列をターゲティングするものである。ＪＧ−３の配列（配列番号：４７）は、 ５'非翻訳領域をターゲティングするものであり、Ｖ２センス配列は翻訳開始部 位（ＡＴＧ）の周辺の配列をターゲティングするものである。これら実験結果の 集積を図２に示す。これら結果は、Ｖｍ（配列番号：４６）アンチセンスオリゴ ヌクレオチドが未処理の対照およびセンスオリゴヌクレオチドＶ２（配列番号： ４９）対照の両者と比べたときに網膜血管新生を有意に低減させることを示して いる。ＪＧ−３（配列番号：４７）およびＪＧ−４（配列番号：４７）は未処理 の眼と比べたときに有意の活性を示す。センス対照オリゴヌクレオチドＶ２（配 列番号：４９）は未処理の眼と比べたときに有意の活性を示さない。 上記試験において、マウスＪＧ−３に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンスオリ ゴヌクレオチドはＨ−１（配列番号：１）であり、５'非翻訳領域をターゲティ ングするものであり、マウスＪＧ−４に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンスオリ ゴヌクレオチドはＨ−１７（配列番号：３０）であり、ヒトＶＥＧＦ分子の翻訳 開始部位のＡＴＧを含み該ＡＴＧの５'側の配列をターゲティングするものであ り、マウスＶｍ遺伝子に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチド はＶＨ（配列番号：４６）であり、ヒトＶＥＧＦ分子の翻訳停止部位（ＴＧＡ） の周辺の配列をターゲティングするものである。これら本発明のアンチセンスオ リゴヌクレオチドは、マウスのアンチセンスオリゴヌクレオチドがマウス細胞に おいてＶＥＧＦの発現を抑制するのと全く同様の仕方でヒト細胞においてＶＥＧ Ｆの発現を抑制することが期待される。 他のマウス配列に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンス配列もまたわかっている 。たとえば、ヒトオリゴヌクレオチドＨ−６（配列番号：１２）はマウス配列Ｊ Ｇ−６（配列番号：５２）とＪＧ−７（配列番号：５３）とに跨がる領域に対応 し、ヒトオリゴヌクレオチドＨ−２（配列番号：５）はマウス配列ＪＧ−５（配 列番号：５１）と同じ領域にある。これら配列は、ＶＥＧＦ発現の抑制、それゆ え血管新生の制御に対して同様の効果を有すると思われる。 ＶＥＧＦ発現および血管新生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果 をモニターする幾つかの方法が存在する。一つの方法は、細胞によって発現され たヒトＶＥＧＦタンパク質を定量するために発色させる捕捉ＥＬＩＳＡである。 このアッセイを用い、翻訳開始部位の直ぐ３'側の配列をターゲティングするア ンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＨ−３（配列番号：６）が、 図４に示すようにランダム（Ｒ）およびセンス（Ｈ−１６、配列番号：２９）対 照に比べて配列特異的な仕方でＶＥＧＦ発現の低酸素誘発を抑制しうることが決 定された。この抑制は再現性があり、また、このインビトロ系ではリポフェクチ ン（脂質担体）の存在下でのアンチセンスオリゴヌクレオチドＨ−３（配列番号 ：６）のみがＶＥＧＦタンパク質の発現を抑制する結果となったが、リポフェク タミン（他の脂質担体）の存在下では抑制されなかったので、脂質担体特異的で アンチセンス特異的であると思われる。 ＲＮＡレベルではノーザンブロッティング（サンブルック（Ｓambrook）ら（ １９８９）Ｍolecular Ｃloning：a Ｌaboratory Ｍanual、コールドスプリング ハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、Ｖol.１、７.３８頁；アーセラナ −パンリリオ（Ａrcellana−Ｐanlilio）（１９９３）Ｍeth.Ｅnz.２２５：３０ ３〜３２８）を行って本発明のオリゴヌクレオチドがＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現 を抑制する程度を決定することができる。たとえば、図５に示すように、ノーザ ンブロッティング分析を示すヒストグラムは、アンチセンスオリゴヌクレオチド Ｈ−３（配列番号：６）で処理した培養ヒト細胞でのＶＥＧＦ ＲＮＡレベルの 減少を示しており、一方、センス対照Ｈ−１６（配列番号：２９）で処理した試 料ではＶＥＧＦ ＲＮＡレベルに最小の変化しか認められない。 さらに、幾つかの方法により生物活性を測定することができ、たとえば、血管 の透過性を測定するマイルズの血管透過性アッセイ（マイルズ（Ｍiles）および マイルズ（１９５２）Ｊ.Ｐhysiol.（ロンドン）１１８：２２８）、細胞の増殖 を測定する内皮細胞マイトジェン活性、および内皮細胞上の受容体へのＶＥＧＦ 結合に応答して放出されるカルシウムを測定する内皮細胞における細胞内カルシ ウム放出（たとえば、ブロック（Ｂrock）およびカパソ（Ｃapasso）（１９８８ ）Ｊ.Ｃell.Ｐhysiol.１３６：５４を参照）が挙げられる。 下記実施例は本発明を製造および実施する好ましい態様を示すものであるが、 別の方法を利用して同様の結果を得ることができるので本発明の範囲を限定する ことを意図するものではない。 実施例１ ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドの調製 ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡをインビトロ真核細胞転写キット（ストラタジーン、 ラジョラ、カリフォルニア）を用いてインビトロで転写する。このＲＮＡを、サ ンブルックら（１９８９）Ｍolecular Ｃloning：ａ Ｌaboratory Ｍanual、コ ールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、Ｖol.１、５.７ １頁に記載されているように、Ｔ−４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐで 標識する。標識したＲＮＡをランダマー２０ｍｅｒライブラリーおよびＲＮＡ− ＤＮＡ二本鎖を開裂する酵素であるＲＮアーゼＨ（ベーリンガー・マンハイム、 インディアナポリス、インディアナ）の存在下でインキュベートする。開裂パタ ーンを６％ポリアクリルアミド尿素ゲル上で分析する。ヒトＶＥＧＦ配列ラダー を用い、開裂断片の特定の位置を決定する（シークエナーゼキット、ユナイテッ ド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical）、クリーブラ ンド、オハイオ）。 実施例２ 網膜血管新生の動物モデル Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 下記オリゴヌクレオチド：ＪＧ−３（配列番号：４７）、ＪＧ−４（配列番号 ：４８）、Ｖｍ（配列番号：４６）、およびＶ２（配列番号：４９）の合成を、 ホスホルアミダイト法（たとえば、ウールマンら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９ ０：５３４〜５８３）を参照）を用い、ファルマシアジーンアセンブラー系列の 合成機で行った。組み立ておよび脱保護の後、オリゴヌクレオチドを２回エタノ ール沈殿し、乾燥させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度で懸濁した 。 これらオリゴヌクレオチドの純度をキャピラリーゲル電気泳動およびイオン交 換ＨＰＬＣにより試験した。オリゴヌクレオチド調製物中の内毒素レベルを発光 変形細胞アッセイ（バング（Ｂang）（１９５３）Ｂiol.Ｂull.（ウッズ・ホー ル、マサチューセッツ）１０５：３６１〜３６２）を用いて決定した。 Ｂ．動物モデルの調製 生後７日のマウス（Ｐ７、Ｃ５７ｂ１／６Ｊ、チルドレンズ・ホスピタル・ブ リーディング・ファシリティーズ（Ｃhildren's Ｈospital Ｂreeding Ｆacilit ies）、ボストン、マサチューセッツ）を、バード（Ｂird）３−Ｍ酸素ブレンダ ー（流速：１.５リットル／分；バード、パームスプリングス、カリフォルニア ）に連結した密封インキュベーター中で５日間の酸素過剰状態（７５±２％）酸 素に暴露した。酸素濃度を酸素アナライザー（ベックマン（Ｂeckman）、モデル Ｄ２、アービン、カリフォルニア）によりモニターした。５日後（Ｐ１２）、マ ウスを室内の空気に戻した。室内の空気に戻してから５日後（Ｐ１７）に最大網 膜血管新生を観察した。Ｐ１２後、網膜血管新生のレベルは、まさに寛解を開始 するところであった。 Ｃ．処置 マウスを酸素から取り出した後、ハミルトン注射器および３３ゲージの注射針 （ハミルトン・カンパニー（Ｈamilton Ｃompany）、レノ、ネバダ）を用いてア ンチセンスオリゴヌクレオチドを硝子体中に注射した。動物を処置のためにアベ ルチン腹腔内投与により麻酔した。マウスにＰ１２にてアンチセンスオリゴヌク レオチド（またはセンスもしくはナンセンス（non-sense）対照）を１回注射し て最終濃度約３０μＭとした。動物をＰ１７にてトリブロモエタノールの腹腔内 投与（０.１ｍｌ／ｇ体重）および頸部脱臼により屠殺した。 Ｄ．顕微鏡観察 眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に埋設した 。全眼の連続切片を、角膜を通り、視神経に平行に矢尻状に切断した。これら切 片をヘマトキシリンおよび過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色で染色した。処置 眼における血管新生の程度を、内境界膜を過ぎて硝子体中に延びている内皮細胞 核をカウントすることにより決定した。新たな血管からの核および血管プロフィ ールは網膜中の他の構造から識別でき、光学顕微鏡を用いて断面中でカウントし た。別の眼の切片も作製し、ＶＥＧＦプローブへのインシチュハイブリダイゼー ションにより調べた。 フルオレセイン−デキストランを用いて網膜血管網を調べるため、マウスを４ ％パラホルムアルデヒド中の高分子量フルオレセイン−デキストラン（シグマ・ ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）の５０ｍｇ／ｍｌ溶液で灌流 した。眼を摘出し、パラホルムアルデヒド中に固定し、グリセロール−ゼラチン で平板スライドを作製した（flat-mounted）。この平板スライドをオリンパスＢ Ｘ６０蛍光顕微鏡（オリンパス・アメリカ（Ｏlympus Ａmerica Ｃorp.）、ベリ ンガム、マサチューセッツ）を用いた蛍光顕微鏡観察により観察および写真撮影 した。 実施例３ 未熟児網膜症 Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを上記実施例２Ａと同様にして合成する。 滅菌および内毒素不含のオリゴヌクレオチドを、眼の眼房水または硝子体と同じ ｐＨおよび電解質濃度となるように平衡塩溶液（Ｂalanced Ｓalt Ｓolution） （ＢＳＳ、アルコン、フォートワース、テキサス）中に希釈する。エマルフォア （Ｅmalphor）ＥＣ６２０（２.５％、ＧＡＦ Ｃorp.）（バーセル（Ｂursell） ら（１９９３）Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.９２：２８７２〜２８７６；石油製品）を、 粘度を変え、送達特性を促進するために加える。０.１μＭ〜１００μＭの範囲 の硝子体内濃度を達成する投与量を、網膜／眼血管新生の重篤度に応して投与す る。送達容量は眼の容量に応じて１μｌから１ｍｌの間である。 Ｂ．ＲＯＰ患者のプロフィール 処置した患者は、出生時に体重が１,０００ｇ未満の受胎後３４週、カフカス 女児の未熟児であり、人工呼吸器に依存している。この患者は両眼性３＋期の疾 患を有し、各眼に１１クロックアワーの（１１ clock hours）血管新生を有する 。片方の眼に出血がみられ、両眼とも国際分類（すなわち、各眼とも＞５０％の 確率で網膜剥離に進行する）によれば「閾値」に達している。両眼において網膜 外線維血管（fibrovascular）増殖が認められる。 Ｃ．処置 挿管した患者にフルオランで麻酔する。顔面および眼をベタジン洗浄（scrub ）で準備し、通常の滅菌手法で拭く。滅菌薬剤およびビヒクルを、滅菌注射器上 の３３ゲージの注射針を用い、後部縁（posterior limbus）（毛様体偏平部）に て完全厚の強膜を通して硝子体中へ注射する。漏出がみられない限り縫合する必 要はない。傷口が完全に縫合されるまで、ゲンタマイシンまたはエリスロマイシ ン軟膏を含有する抗生物質点眼を眼瞼裂中の眼球表面に１日数回適用する。注射 の頻度は、疾患プロセスの重篤度、眼内炎症の程度、ビヒクルの特性（すなわち 、低放出特性）、血管新生の抑制の程度および注射に対する眼の耐性に依存して 、隔日から６カ月に１回またはそれ以下の範囲である。血管新生疾患および注射 により起こる可能性のある網膜剥離について短期および長期にわたる追跡健康調 査が必要である。 Ｄ．進展のモニター 拡張後の眼を、炎症、感染、および血管新生の消散の兆候について直像および 倒像検眼鏡で網膜および眼底を観察することによりモニターする。前眼部疾患の 幾つかの症例では細隙灯検査を用いる。処置の陽性応答としては、一層少ない血 管新生ふさ状分岐（neovascular tufts）、進行における一層少ないクロックア ワー（fewer clock hours of involvement）および一層少ない大血管の蛇行が挙 げられる。モニターは、未熟児が増殖ＲＯＰのために網膜剥離の危険にさらされ ている場合のような症例では毎日くらいの頻繁さで行うことができる。モニター の頻度は、血管新生の消散につれて減少するであろう。 実施例４ 糖尿病網膜症 Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを上記実施例２Ａと同様にして合成し、上 記上記３Ａと同様にして投与用に調製する。０.１〜１００μＭの範囲の硝子体 内濃度を達成する投与量を、網膜／眼血管新生の重篤度に応じて投与する。送達 容量は、眼の容量、および糖尿病性眼疾患のための硝子体切除術を行う間のよう に硝子体を前以て切除したか否かに応じて１μｌから１ｍｌの間である。 Ｂ．糖尿病患者のプロフィール 処置した患者は、若年期に発症した糖尿病を２５年間患う３０歳のアフリカ− アメリカ人男性である。この患者は両眼性の増殖網膜症を有し、網膜下出血、綿 状白斑および浸出物を呈している。フルオレセイン血管造影をしたところ、両眼 にはっきりと定められた血管新生の領域が認められ、毛細血管の脱落した領域も 存在した。 Ｃ．処置 患者を、適当なビヒクル（ＢＳＳ、エマンフォア）中に０.１〜１００μＭの 濃度範囲で再懸濁したオリゴヌクレオチドの眼内注射で１週間毎に処置する。こ の処置に加えて、疾患プロセスおよびオリゴヌクレオチドの生物学的半減期に依 存して１日に２〜５回から１カ月に１回の範囲のオリゴヌクレオチドの全身送達 （すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）を行ってよい。 Ｄ．進展のモニター 患者の眼を上記実施例２Ｄと同様にしてモニターする。拡張後の眼を血管新生 の寛解について直像および倒像の両検眼鏡で網膜および眼底を観察することによ りモニターする。前眼部疾患の症例では細隙灯検査を用いる。必要に応じ、血菅 新生の抑制の程度および注射に対する眼の耐性に基づき繰り返し注射を行う。血 管新生疾患および注射により起こる可能性のある網膜剥離について短期および長 期にわたる追跡健康調査を行う。 実施例５ 加齢黄斑変性症 Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを上記実施例２Ａと同様にして合成し、上 記実施例３Ａと同様にして投与用に調製する。１μｌ〜１ｍｌの範囲の硝子体内 濃度を達成する投与量を、網膜／眼血管新生の重篤度に応じて投与する。送達容 量は、眼の容量および硝子体を前以て切除したか否かに応じて１μｌから１ｍｌ の間である。 Ｂ．ＡＲＭＤ患者のプロフィール 患者は、浸出性の加齢黄斑変性症を患う５０歳のカフカス男性である。この患 者はフルオレセイン血管造影から明らかな脈絡膜の血管新生を有する。疾患は両 眼性であり、患者の視力は各眼で２０／６０から２０／１００へ低下している。 Ｃ．処置 患者を、適当なビヒクル（ＢＳＳ、エマンフォア）中に０.１〜１００μＭの 濃度範囲で再懸濁したオリゴヌクレオチドの眼内注射で１週間毎に処置する。こ の処置に加えて、１日に２〜５回から１カ月に１回の範囲のオリゴヌクレオチド の全身送達（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）を行ってよい。 Ｄ．進展のモニター 拡張後の眼を血管新生の寛解について直像および倒像の両検眼鏡で網膜および 眼底を観察することによりモニターする。血管新生の寛解のチェックはフルオレ セイン血管造影を用いて行う。前眼部疾患の症例では細隙灯検査を用いる。必要 に応じ、血管新生の抑制の程度および注射に対する眼の耐性に基づき繰り返し注 射を行う。血管新生疾患および注射により起こる可能性のある網膜剥離について 短期および長期にわたる追跡健康調査を行う。 実施例６ ヒト細胞の培養 Ｕ３７３ヒト神経芽腫細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ ／ＭＩ／１００ｍｃｇ／ｍｌ、メディアテック（Ｍediatech）、ワシントン、Ｄ Ｃ）を補足したグルコース（４５００ｍｇ／ｍｌ）およびグルタミン酸（２ｍＭ ）を含有するダルベッコ変性アール（Ｄulbecco's modified Ｅarls）（ＤＭＥ ）培地（メディアテック、ワシントン、ＤＣ）中で培養した。細胞を３７℃で１ ０％ＣＯ₂下で培養した。細胞を９６ウエル組織培養皿（コスター（Ｃostar Ｃo rp.）、ケンブリッジ、マサチューセッツ）中にプレーティングし、上記のまま 保持した。細胞を嫌気チャンバ（ＢＢＬ、ガス・パック（Ｇas Ｐak）、コッキ ースビル、メリーランド）を用いて無酸素条件下または２５０μＭ ＣｏＣｌ₂存 在下に１８〜２０時間置いた。 実施例７ ノーザンブロッティング 本発明のオリゴヌクレオチドの存在下でＶＥＧＦ発現の抑制が細胞中で起こる レベルを決定するため、ノーザンブロッティングを行った。上記実施例６に記載 のようにして培養したヒトＵ３７３細胞を１００ｍｍ組織培養皿中にプレーティ ングし、それぞれ０.０５μＭ、０.５μＭおよび２.０μＭのオリゴヌクレオチ ドＨ−３（配列番号：６）（アンチセンスオリゴヌクレオチド）およびＨ−１６ （配列番号：２９）（センスオリゴヌクレオチド）とともに脂質担体としての５ μｇ／ｍｌのリポフェクチン（ギブコ−ＢＲＬ、ゲイサーズバーク、メリーラン ド）の存在下で１２時間処理した。これら細胞を１２〜１５時間後に新たな培地 ＋オリゴヌクレオチド（リポフェクチン不含）を用いて再培養し、５〜７時間回 復させた。細胞を低酸素状態に１８〜２０時間置き、チョムスジンスキー（Ｃho mczynski）およびサッチ（Ｓacchi）により記載された（Ａnal.Ｂiochem.（１９ ８７）１６２：１５６〜１５９）単一工程の酸グアニジニウムチオシアネートー フェノール−クロロホルム抽出法により全ＲＮＡを単離した。ノーザンブロッテ ィングを、サンブルックらの方法（Ｍolecular Ｃloning：a Ｌaboratory Ｍanual、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク（１ ９８９）Ｖol.１、７.３８頁）またはアーセラナーパンリリオの方法（Ｍeth.Ｅ nz.（１９９３）２２５：３０３〜３２８）に従って行った。すべてのＲＮＡシ グナルをホスホルイメージャー（Ｐhosphorimager）（バイオラド（ＢioＲad） 、ヘルキュールズ、カリフォルニア）で定量し、３６Ｂ４ ｃＤＮＡプローブ（ ラボルダ（Ｌaborda）（１９９１）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：３９９８）を 用いて正規化した。ＲＮＡ発現は本発明のＶＥＧＦ−特異的オリゴヌクレオチド の存在下では低減したが、対照のセンスオリゴヌクレオチドの存在によっては有 意の影響を受けなかった。 実施例８ ＥＬＩＳＡ ＶＥＧＦタンパク質試験 上記実施例６に記載したＵ３７３神経芽腫細胞を９６ウエル組織培養皿中にプ レーティングし、５μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、ヒトＶＥＧＦに対す る種々の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで一夜処理した。これら細胞を １２〜１５時間後に新たな培地＋オリゴヌクレオチド（リポフェクチン不含）を 用いて再培養し、５〜７時間回復させた。皿を嫌気チャンバ（ガス・パック、コ ッキースビル、メリーランド）を用いて低酸素条件下に１８〜２０時間置いた。 この培地を上記抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した（処理後約３６時 間）。使用したヒトＶＥＧＦオリゴヌクレオチドは、Ｈ−３（配列番号：６）（ アンチセンス、コーディング）、Ｈ−１６（配列番号：２９）（開始部位／コー ディング、センス対照）およびランダム対照（Ｒ）であった。 実施例５に記載した細胞からの培養液を、ＶＥＧＦタンパク質について以下の ようにして分析した。９６−ウエルプレート（マクシゾーブＥＬＩＳＡヌンクＡ ／Ｓ、カンストラップ、デンマーク）を４℃にて１００μｌ／ウエルの捕捉抗体 、ヒトＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓyst ems）、ミネアポリス、ミネソタ、１×ＰＢＳ中に２.５μｇ／ｍｌ）で一夜処理 した。プレートウォッシャー（ダイナテック、ガーンセイチャネルアイランズ） を用いてウエルを１×ＰＢＳ／０.０５％ツイーン−２０（ユナイテッド・ステ イツ・ バイオケミカル、クリーブランド、オハイオ）で３回洗浄した。ウエル中の非特 異的な結合部位は、２％通常ヒト血清（１００μｌ）を加え、プレートを３７℃ で２時間インキュベートすることによりブロックした。このブロック溶液を除き 、ヒトＶＥＧＦを含有する２００μｌのならし培地を各ウエルに加え、３７℃で ２〜３時間インキュベートした。プレートを上記のようにして洗浄した。１００ μｌの一次抗体（６１８／６１９、通常ヒト血清中に２μｇ／ｍｌ）を各ウエル に加え、３７℃で１〜２時間インキュベートした。二次抗体はアフィニティー精 製したウサギ抗ヒトＶＥＧＦポリクローナル抗体であった。プレートを上記のよ うにして洗浄した。１００μｌの検出抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ標 識ヤギ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（１：１０,０００、ベクター・ラボ ラトリーズ（Ｖector Ｌaboratories）、バーリンゲーム、カリフォルニア）を 各ウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のように して洗浄した。ＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ発色システム（キルケガ ール・アンド・ペリー（Ｋirkegaard and Ｐerry）、ゲイサーズバーク、メリー ランド）を用いてウエルを発色させ、セレス（Ｃeres）９００プレートリーダー （バイオ−テック・インスツルメンツ（Ｂio−Ｔek Ｉnstruments,Ｉnc.）、ウ イノースキー、バーモント）を用いて４５０ｎｍで定量した。このアッセイの線 形範囲は２ｎｇ〜０.０１ｎｇヒトＶＥＧＦである。代表的な結果を図３に示す 。 実施例９ 生物活性アッセイ 生物活性はマイルズの血管透過性アッセイ（マイルズおよびマイルズ（１９５ ２）Ｊ.Ｐhysiol.（ロンドン）１１８：２２８）により決定することができる。 簡単に説明すると、ハートレイモルモット（８００ｇ）を剃り、除毛し、１００ ｍｌ当たり０.５ｇのエバンスブルー染料を含有する通常食塩水（１.０ｍｌ）を 静脈内注射する。未知の量のＶＥＧＦを含有する血清不含培地の皮下注射（２５ ０μｌ）を行う。陽性（精製ＶＥＧＦ）および陰性対照（通常食塩水）も実験中 に含まれる。注射２０分後、動物を屠殺し、試験および対照部位を切り出し、エ バンスブルー染料の管外遊出を定量する。このアッセイの検出限界は５００ｐＭ である。 内皮細胞のマイトジェン活性も生物活性を示し得る。この方法ではヒト臍静脈 内皮（ＨＵＶＥＣ）を、バイオコート内皮細胞増殖環境（コラボラティブ・バイ オメディカル・プロダクツ（Ｃollaborative Ｂiomedical Ｐroducts）、ベッド フォード、マサチューセッツ）を用いて増殖および維持させる。ついで、１×１ ０⁴細胞を、１.４ｍｌ Ｅ−ＳＴＩＭ培地（コラボラティブ・バイオメディカル ・プロダクツ、ベッドフォード、マサチューセッツ）プラス５％熱不活化ウシ胎 仔血清中、３５ｍＭ組織培養皿上で２つずつプレーティングする。細胞付着後（ 約４時間）、２つの皿の細胞をトリプシン処理し、カウントし、開始細胞数とし て用いる。ついで、未知の量のＶＥＧＦを含有する試験試料を２つずつ、残りの 皿に０日目および２日目に加える。精製ＶＥＧＦ（陽性）およびＰＢＳ（陰性） からなる対照も用いる。４日目に皿の細胞をトリプシン処理し、カウントし、開 始細胞数と比較する。このアッセイの検出限界は１０ｐＭである。 細胞内カルシウム放出アッセイも用いて生物活性をモニターする（たとえば、 ブロックおよびカパソ、Ｊ.Ｃell.Ｐhysiol.１３６：５４）。ヒト臍静脈内皮細 胞（ＨＵＶＥＣ）をＥＧＭ−ＵＶ培地中で維持する。細胞をＥＤＴＡおよびコラ ゲナーゼによりプレートから除く。カルシウム感受性の染料であるＦura−２（ モレキュラー・プローブズ（Ｍolecular Ｐrobes）、ユージーン、オレゴン）を 用いて細胞内カルシウムの濃度変化をモニターする。簡単に説明すると、未知濃 度のＶＥＧＦを含有する培地を、Ｆura−２を前以て負荷した懸濁ＨＵＶＥＣの アリコートに加える。細胞内カルシウム放出の変化を示す蛍光変化をヒタチ２０ ００Ｆ蛍光計を用いて測定する。陽性（ヒスタミン、トロンビン）および陰性（ ＥＧＴＡ）対照も分析する。この方法は極めて感度が高く、検出限界は０.２ｐ Ｍである。 実施例１０ ＥＬＩＳＡ ＶＥＧＦタンパク質試験 Ｕ３７３神経芽細胞腫細胞を９６ウエル組織培養皿にプレーティングし、５μ ｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、ヒトＶＥＧＦに対する種々の濃度のアンチ センスオリゴヌクレオチドで一夜処理した。これら細胞を７〜１２時間後に新た な培地で再培養し、５〜７時間回復させた。細胞を嫌気チャンバ（ＢＢＬ、カス ・パック、コッキースビル、メリーランド）を用いて無酸素条件下または２５０ μＭ ＣｏＣｌ₂の存在下に１８〜２０時間置いた。細胞を通常の酸素（normoxic ）条件下に維持して非誘発対照とした。下記抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用い て培地を分析した（処理の約２４時間後）。 実施例２に記載した細胞からの培養液を、以下のようにしてＶＥＧＦタンパク 質について分析した。９６−ウエルプレート（マクシゾーブＥＬＩＳＡヌンクＡ ／Ｓ、カンストラップ、デンマーク）を４℃にて１００μｌ／ウエルの捕捉抗体 であるヒトＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポ リス、ミネソタ、１×ＰＢＳ中に２.５μｇ／ｍｌ）で一夜処理した。プレート ウォッシャー（ダイナテック、ガーンセイチャネルアイランズ）を用いてウエル を１×ＰＢＳ／０.０５％ツイーン−２０（ユナイテッド・ステイツ・バイオケ ミカル、クリーブランド、オハイオ）で３回洗浄した。ウエル中の非特異的な結 合部位は、２％通常ヒト血清（１００μｌ）を加え、プレートを３７℃で２時間 インキュベートすることによりブロックした。このブロック溶液を除き、ヒトＶ ＥＧＦを含有する２００μｌのならし培地を各ウエルに加え、３７℃で２〜３時 間または４℃で一夜インキュベートした。プレートを上記のようにして洗浄した 。１００μｌの一次抗体（６１８／６１９、通常ヒト血清中に２μｇ／ｍｌ）を 各ウエルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートした。一次抗体はアフィニ ティー精製したウサギ抗ヒトＶＥＧＦポリクローナル抗体であった。プレートを 上記のようにして洗浄した。１００μｌの検出抗体である西洋ワサビペルオキシ ダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（１：１０,０００、ベクタ ー・ラボラトリーズ（Ｖector Ｌaboratories）、バーリンゲーム、カリフォル ニア） を各ウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のよう にして洗浄した。ＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ発色システム（キルケ ガール・アンド・ペリー（Ｋirkegaard and Ｐerry）、ゲイサーズバーク、メリ ーランド）を用いてウエルを発色させ、セレス（Ｃeres）９００プレートリーダ ー（バイオ−テック・インスツルメンツ（Ｂio−Ｔek Ｉnstruments,Ｉnc.）、 ウイノースキー、バーモント）を用いて４５０ｎｍで定量した。このアッセイの 線形範囲は２ｎｇ〜０.０１ｎｇヒトＶＥＧＦである。代表的な結果を図２〜６ に示す。 実施例１１ インビボ試験 Ａ．マトリゲル試験 Ｕ３７３神経芽細胞腫細胞を５μｇ／ｍｌのリポフェクチン（ギブコ−ＢＲＬ 、ゲイサーズバーグ、メリーランド）の存在下、０.５μＭのアンチセンスホス ホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｈ−３、配列番号：５４）または 対照（Ｈ３−センスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；配列番号：７４） で７時間処理した。１×１０⁶のオリゴヌクレオチド処理した細胞を２５０μｌ のマトリゲル^TM（コラボラティブ・リサーチ、ウォルサム、マサチューセッツ； １０〜１２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、６〜８週齢の無胸腺マウス（約２０ｇ）（チ ャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃharles Ｒiver Ｌaboratories）、ウイ ルミントン、マサチューセッツ）の右側および左側の両側に皮下注射した。これ ら細胞は低酸素症に応答し、増加レベルのＶＥＧＦを発現した。マウスを無制限 に維持し、注射８日後に屠殺した。皮膚を切開してマトリゲルペレットを暴露し た。周囲血管の大まかな写真撮影をザイス（Ｚeiss）顕微鏡を用いて行った。マ トリゲルプラグを取り、パラフィン埋設および組織学的分析のためにホルマリン 固定した。組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色してマトリゲルプラ グ中への血管増殖を定量した。 マトリゲル単独の注射は透明なプラグとなり、明らかな血管形成は認められな かった。Ｕ３７３神経芽細胞腫細胞と組み合わせたマトリゲルプラグは視覚可能 な出血を含んでいた。さらに、プラグの周囲の毛細血管床は一層濃く染まり、血 管は一層曲がりくねっていた。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞と ともにマトリゲルプラグを注射した無胸腺マウスは、マトリゲルプラグと非処理 の細胞かまたは対照のオリゴヌクレオチドで前処理した細胞とを注射したマウス に比べて血管形成が少なかった。アンチセンス処理した細胞を含むマトリゲルプ ラグはまた、視覚可能な出血も少なかった。これら結果は、アンチセンスオリゴ ヌクレオチド処理がＶＥＧＦ−誘発血管形成を抑制することを示唆している。 Ｂ．腫瘍試験 ６週齢の無胸腺マウス（約２０ｇ）をチャールズ・リバー・ラボラトリーズか ら購入する。マトリゲルの存在下で無胸腺マウスに通して置いたヒト黒色腫Ｍ２ １細胞またはヒト神経芽細胞腫Ｕ３７３細胞を、無胸腺マウスの脇腹に皮下注射 （２〜２０×１０⁶）する。触診しうる腫瘍が１〜２週間で生成する。アンチセ ンスまたはセンス対照オリゴヌクレオチドの皮下注射を腫瘍細胞の注射の１日後 に開始する。オリゴヌクレオチドの濃度を決定すると、５〜５０ｍｇ／ｋｇの範 囲である。ついで、動物に３週間にわたって注射する。ついで、動物を屠殺し、 腫瘍を取り出す。まず、腫瘍を重さおよび容量について分析する。さらに、分析 には、抗ヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネア ポリス、ミネソタ）を用いてＶＥＧＦ／ＶＰＦタンパク質について、またはイン サイチュハイブリダイゼーション法を用いてＶＥＧＦ／ＶＰＦ ＲＮＡについて 切片形成および染色することが含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオ チドを注射したマウスは、ビヒクルまたは対照を注射したマウスに比べて小さな 腫瘍を有することが期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト血管内皮増殖因子に特異的な核酸配列に相補的な合成オリゴヌクレオ チド。 ２．配列番号：１を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３．配列番号：２を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ４．配列番号：３を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．配列番号：４を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ６．配列番号：５を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ７．配列番号：６を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ８．配列番号：７を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ９．配列番号：８を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １０．配列番号：９を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １１．配列番号：１０を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １２．配列番号：１１を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １３．配列番号：１２を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １４．配列番号：１３を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １５．配列番号：１４を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １６．配列番号：１５を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １７．配列番号：１６を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １８．配列番号：１７を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 １９．配列番号：１８を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２０．配列番号：１９を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２１．配列番号：２０を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２２．配列番号：２１を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２３．配列番号：２２を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２４．配列番号：２３を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２５．配列番号：２４を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２６．配列番号：２５を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２７．配列番号：２６を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ２８．配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、 配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６７、配列番号 ：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列６５、配列番号：６７、配列番 号：６８、および配列番号：６９を有するオリゴヌクレオチドよりなる群から選 ばれた、ヒト血管内皮増殖因子に特異的な核酸配列に相補的な合成オリゴヌクレ オチド。 ２９．配列番号：５５を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３０．配列番号：５６を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３１．配列番号：５７を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３２．配列番号：５８を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３３．配列番号：５９を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３４．配列番号：６０を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３５．配列番号：６１を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３６．配列番号：６２を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３７．配列番号：６３を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３８．配列番号：６４を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ３９．配列番号：６５を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４０．配列番号：６６を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４１．配列番号：６７を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４２．配列番号：６８を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４３．配列番号：６９を有する請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４４．アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、 リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメ ート、カーボネート、リン酸トリエステル，アセトアミデート、およびカルボキ シメチルエステルインターヌクレオチド結合、およびその組み合わせよりなる群 から選ばれた修飾を有する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４５．少なくとも一つのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を有す る、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド。 ４６．ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を有する、請求項４５に 記載のオリゴヌクレオチド。 ４７．本質的に２'−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドからなる、請求項２８ に記載のオリゴヌクレオチド。 ４８．４または５の５’２'−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求 項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ４９．４または５の３’２'−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求 項２８に記載のオリゴヌクレオチド。 ５０．４または５の３’２'−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求 項４８に記載のオリゴヌクレオチド。 ５１．４または５の５’２'−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求 項４５に記載のオリゴヌクレオチド。 ５２．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５３．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項３に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５４．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項４に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５５．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項５に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５６．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項６に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５７．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項７に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５８．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項８に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ５９．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項９に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６０．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１０に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６１．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１１に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６２．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１２に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６３．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１３に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６４．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１４に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６５．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１５に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６６．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１６に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６７．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１７に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６８．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１８に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ６９．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１９に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７０．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２０に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７１．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２１に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７２．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２２に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７３．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２３に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７４．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２４に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７５．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２５に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７６．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２６に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７７．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２７に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを投与することを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７８．ＶＥＧＦに特異的な核酸を請求項２８に記載のオリゴヌクレオチドと接 触させることを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ７９．ＶＥＧＦに特異的な核酸を請求項４４に記載のオリゴヌクレオチドと接 触させることを含む、ＶＥＧＦ発現を抑制する方法。 ８０．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８１．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項３に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８２．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項４に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８３．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項５に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８４．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項６に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８５．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項７に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８６．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項８に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８７．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項９に記載の合成オリゴ ヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８８．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１０に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ８９．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１１に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９０．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１２に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９１．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１３に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９２．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１４に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９３．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１５に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９４．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１６に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９５．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１７に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９６．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１８に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９７．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項１９に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９８．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２０に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 ９９．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２１に記載の合成オリ ゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １００．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２２に記載の合成オ リゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０１．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２３に記載の合成オ リゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０２．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２４に記載の合成オ リゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０３．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２５に記載の合成オ リゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０４．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２６に記載の合成オ リゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０５．ＶＥＧＦの発現を抑制するのに有効な量の請求項２７に記載の合成オ リゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０６．生理学的に許容しうる担体中に請求項２８に記載の少なくとも一つの 合成オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。 １０７．生理学的に許容しうる担体中に請求項４４に記載の少なくとも一つの 合成オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。