FR2880631A1 - Genes impliques dans la regularisation de l'angiogenese, preparations pharmaceutiques les contenant et leurs applications - Google Patents
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Abstract
L'invention appartient au domaine des compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de pathologies résultant d'une dérégulation du mécanisme de l'angiogenèse.Elle concerne en particulier de nouveaux gènes dont la fonction n'était pas identifiée à ce jour ainsi que des gènes connus mais dont l'implication dans le mécanisme de l'angiogenèse a été mise en évidence pour la première fois.
Description
GENES IMPLIQUES DANS LA REGULATION DE L'ANGIOGENÈSE, PREPARATIONS
PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention appartient au domaine des compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de pathologies résultant d'une dérégulation du mécanisme de l'angiogenèse.
Elle concerne en particulier de nouveaux gènes dont la fonction n'était pas identifiée à ce jour ainsi que des gènes connus mais dont l'implication dans le mécanisme de l'angiogenèse a été mis en évidence pour la première fois par la Demanderesse.
Ces gènes sont identifiés par leurs séquences nucléotidiques dans le listage de séquences en annexe.
La présente invention concerne également les séquences polypeptidiques des facteurs codés par lesdits gènes qui trouvent leur application dans l'étude clinique du processus de l'angiogenèse, le pronostic, le diagnostic et le traitement de pathologies liées à ce processus ainsi que dans la mise en oeuvre des essais pharmacologiques, pharmacogénomiques, ou pharmacosignalitiques.
L'angiogenèse est un processus fondamental par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins se forment. Ce processus est essentiel dans plusieurs phénomènes physiologiques normaux tels que la reproduction, le développement ou encore la cicatrisation. Dans ces phénomènes biologiques normaux, l'angiogenèse est sous contrôle strict, c'est-à-dire qu'elle est déclenchée pendant une période courte, quelques jours, puis complètement inhibée. Cependant, plusieurs pathologies sont liées à une angiogenèse invasive et incontrôlée.
L'arthrite, par exemple, est une pathologie due à l'endommagement des cartilages par les néovaisseaux invasifs. Dans la rétinopathie diabétique, l'invasion de la 2880631 2 rétine par les néovaisseaux conduit à l'aveuglement des malades; la néovascularisation de l'appareil oculaire présente la cause majeure de l'aveuglement et cette néovascularisation domine une vingtaine de maladies de l'oeil. Enfin, la croissance et la métastase des tumeurs sont directement liées à la néovascularisation et sont dépendantes de l'angiogenèse. La tumeur stimule la croissance des néovaisseaux pour sa croissance elle-même. De plus, ces néovaisseaux présentent les voies d'échappement des tumeurs pour joindre la circulation sanguine et provoquer les métastases dans des sites à distance comme le foie, le poumon ou l'os.
Dans d'autres pathologies telles que les maladies cardio- vasculaires, les maladies d'artères périphériques, les lésions vasculaires ou cérébrales, l'angiogenèse peut présenter une base thérapeutique importante. En effet, la promotion de l'angiogenèse dans les endroits endommagés peut conduire à la formation de néovaisseaux sanguins latéraux et alternatifs aux vaisseaux endommagés fournissant ainsi le sang et par conséquent l'oxygène et d'autres facteurs nutritifs et biologiques, nécessaires à la survie des tissus concernés.
La formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales implique la migration, la croissance, et la différentiation des cellules endothéliales. La régulation de ces phénomènes biologiques est directement liée à l'expression génétique. En matière d'angiogenèse, un nombre sans cesse grandissant d'études montre que la régulation de l'angiogenèse se fait à travers un équilibre entre des facteurs agissant directement sur la cellule endothéliale.
Ces facteurs peuvent être stimulants, d'une part, tels que, entre autres, le VEGF, le FGFs, l'IL-8, le HGF/SF, le PDGF.
Ils peuvent aussi être inhibants, comme, entre autres, l'IL- 10, l'IL-12, le gro-a et t, le facteur plaquettaire 4, 2880631 3 l'angiostatine, l'inhibiteur dérivé de chondrocyte humaine, la thrombospondine, le facteur inhibiteur de la leucémie.(Jensen, Surg. Neural., 1998, 49, 189-195; Tamatani et al., Carcinogenesis, 1999, 20, 957-962; Tanaka et al., Cancer Res., 1998, 58, 3362-3369; Ghe et al., Cancer Res., 1997, 57, 3733--3740; Kawahara et al., Hepatology, 1998, 28, 1512-1517; Chandhuni et al., Cancer Res., 1997, 57, 1814-1819; Jendraschak et Sage, Semin. Cancer Biol., 1996, 7, 139-146; Majewski et al., J. Invest.
Dermatol., 1996, 106, 1114-1119).
Le contrôle de l'angiogenèse représente donc un axe stratégique, à la fois de recherche fondamentale, afin d'améliorer notre compréhension des nombreux phénomènes pathologiques liés à l'angiogenèse, mais aussi une base pour l'élaboration des nouvelles thérapies destinées à traiter les pathologies liées à l'angiogenèse.
Afin de contrôler l'angiogenèse, plusieurs groupes pharmaceutiques ont développé des stratégies thérapeutiques basées directement sur l'utilisation de signaux paracrines, les facteurs stimulateurs et inhibiteurs, comme agents pour promouvoir ou inhiber l'angiogenèse. Ces stratégies sont basées essentiellement sur l'utilisation de ces facteurs sous leur forme polypeptidique comme agents stimulateurs ou inhibiteurs de l'angiogenèse, ou encore plus récemment sous la forme de vecteurs d'expression codant pour les facteurs choisis.
Un procédé permettant l'identification de nouveaux gènes impliqués dans la régulation de l'angiogenèse a été mis au point. Il a fait l'objet d'une demande de brevet français publiée sous le n FR 2798674 et d'une demande de brevet internationale PCT publiée sous le n WO 01/218312.
Cette méthode a la particularité de traduire fidèlement le mécanisme intime régulant l'angiogenèse en prenant en compte tous les facteurs extracellulaires décrits comme agents régulateurs de l'angiogenèse, c'est-à-dire les facteurs angiogéniques, les facteurs angiostatiques, ainsi que les différents composants de la matrice extracellulaire. Cette méthodologie consiste à mettre en uvre ces différents facteurs extracellulaires à travers quatre conditions expérimentales bien définies. Les cellules endothéliales sont cultivées sur une composante et/ou un mélange bien défini de plusieurs composantes de la matrice extracellulaire et placées sous les quatre conditions expérimentales à savoir: une condition contrôle où les cellules endothéliales ne sont pas stimulées; une condition angiogénique où les cellules endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs facteurs angiogéniques; - une condition d'inhibition de l'angiogenèse où les cellules endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs facteurs angiogéniques et mises en présence d'un ou plusieurs facteurs angiostatiques; et une autre condition de contrôle où les cellules endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs facteurs angiostatiques.
Ces quatre conditions permettent d'obtenir des préparations d'ARNm spécifiques de l'angiogenèse à savoir de l'état angiogénique et/ou l'inhibition de l'angiogenèse et permettent de déceler les gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse, incluant des régulateurs positifs et des régulateurs négatifs.
Donc, le procédé ci-dessus décrit permet le criblage systématique de tous les facteurs angiogéniques et angiostatiques ainsi que des différentes composantes de la matrice extracellulaire dans le but de mettre en évidence et 2880631 5 identifier les gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse.De plus, étant donné que l'expression génique peut être analysée tout au long de la cinétique de la formation des néovaisseaux par les cellules endothéliales, cette approche constitue une méthodologie in vitro permettant de relier l'expression génique aux paramètres fonctionnels biologiques de l'angiogenèse.
L'identification des 34 gènes rapportés ci-dessous a été effectuée selon la méthodologie décrite ci-dessus, en utilisant les facteurs angiogéniques et angiostatiques, ainsi que le collagène type I comme composant de la matrice extracellulaire pour reproduire les quatre conditions expérimentales.
La Demanderesse a par ailleurs prouvé l'implication de ces 34 nouveaux gènes identifiés par les séquences SEQ ID No. : 1 à SEQ ID No. : 34 dans la liste de séquences en annexe, dans le mécanisme de régulation de l'angiogenèse.
Ainsi l'invention concerne une molécule d'acide nucléique isolée, naturelle ou recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle consiste en i) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19, 27 à 29 et 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; ii) une séquence antisens de l'une des séquences de i), identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID 62, 63, 65, 67, 69, 73, 74, 81, 82 et 85 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; iii) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente.
Au sens de la présente invention, doivent être considérées comme des séquences équivalentes aux séquences ci-dessus décrites, des séquences nucléotidiques présentant une ou des modification(s) structurelle(s), mineure(s), ne modifiant pas leur fonction, telle(s) que délétion, mutation ou addition de bases, dont l'identité est d'au moins de 90% avec les séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No. : 1 à 34 dans la liste de séquences en annexe.
L'intérêt de toutes les séquences décrites dans le présent texte, réside dans le fait qu'un antisens de ces séquences, lorsque qu'il est introduit dans une cellule,influence les phénomènes de l'angiogenèse, c'est-à-dire que son introduction dans la cellule conduit à une activation ou une inhibition de l'angiogenèse.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide ou fragment dudit polypeptide, naturel ou recombinant, isolé, caractérisé en ce qu'il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29.
Sous une forme de mise en oeuvre particulière de l'invention, ledit polypeptide comprend ou consiste en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 37, 38, 43, 47, 48, 49 ou 57.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet 30 un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend i) une molécule d'acide nucléique telle que décrite précédemment; ii) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle consiste en 2880631 7 a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ! ID n 3, 6, 7, 8, 12, 14 à 16, 20 à 26 et 30 à 33 ou son complémentaire ou 5 un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; b) une séquence antisens de l'une des séquences de a), identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 64, 66, 67, 68, 70 à 72, 75 à 81 et 84 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; c) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente.
Plus particulièrement ledit vecteur est choisi parmi le groupe de vecteurs GS-V1 à GS-V23, identifiés par leur séquence, portant les numéros SEQ ID N 87 à SEQ ID N 109 dans la liste de séquences en annexe.
Lesdits vecteurs peuvent être construits par toute méthode connue de l'homme du métier. Particulièrement on citera la méthode décrite dans la demande de brevet WO 03/074073 avec les séquences amorces, décrites dans ce brevet, GS-PGS-F et GS-PGM-R pour des fragments clonés en orientation sens dans le plasmide bactérien, soit les amorces GS-PGS-F et GS-PGM-R pour des fragments clonés en orientation sens dans le plasmide bactérien.
Ces constructions sont utiles d'une part pour préparer des compositions thérapeutiques destinées au traitement, par thérapie cellulaire, de désordres angiogéniques et d'autre part pour vérifier l'efficacité d'un traitement d'un désordre angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, ou encore pour vérifier la fonctionnalité des 2880631 8 gènes éventuellement impliquées dans le mécanisme de l'angiogenèse, dans ledit mammifère.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34, ou un fragment desdites séquences, particulièrement codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29 ou un fragment desdites séquences, ou ayant une affinité pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 35 à 61, ou un fragment desdites séquences, particulièrement pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 37, 38, 43, 47, 48, 49 ou 57 ou un fragment desdites séquences.
Lesdits anticorps peuvent être obtenus par toute méthode d'immunisation in vivo ou in vitro, d'un animal, notamment d'un vertébré et de préférence d'un mammifère avec l'une quelconque des séquences polypeptidiques selon l'invention, ou l'un de leurs fragments conservant l'immunogénicité de la protéine totale.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. (Kohler G. and Milstein C. Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495- 7.) L'introduction desdites séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 34 et SEQ ID No. 62 à 86 (sens et antisens) ou desdits vecteurs identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N 87 à SEQ ID 2880631 9 N 109 ou de l'un de leurs homologues, et l'insertion ultérieure desdits vecteurs dans des cellules de mammifère permet l'obtention de lignées cellulaires sur-exprimant ou sous-exprimant les gènes intervenant dans le mécanisme de l'angiogenèse.
Ainsi, selon encore un autre aspect, l'invention concerne une cellule génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène impliqué dans l'angiogenèse choisi parmi les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 34, particulièrement les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. n 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19, 27 à 29 et 34.
Lesdites cellules génétiquement modifiées peuvent être construites par toute méthode connue de l'Homme du Métier. Particulièrement, elles peuvent être construites par la méthode décrite dans la demande de brevet WO 03/074073 et qui comprend: (a) l'introduction d'un gène de résistance à au moins un antibiotique dans ladite cellule génétiquement modifiée, (b) la culture des cellules obtenues à l'étape (a) en présence dudit antibiotique, (c) la sélection des cellules viables.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation à titre de médicament d'une molécule d'acide nucléique, d'un polypeptide, d'un vecteur d'expression, d'un anticorps, ou d'une cellule génétiquement modifiée tels que décrits précédemment.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent actif au moins une substance choisie parmi: i) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce 2880631 10 qu'elle comprend ou qu'elle correspond à a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; b) une séquence antisens de l'une des séquences de a), identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 64, 66, 67, 68, 70 à 72, 75 à 81 et 84, ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; c) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente.
ii) un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34 ou qu'il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35 à 61 ou un fragment desdits polypeptides; iii) un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de la présente revendication; iv) un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35 à 61 ou pour l'une des séquences codées par les séquence en acide nucléiques identifiées dans la liste de séquence fournie en annexe sous les n SEQ ID N 2, 9 à 11, 10 15 20 2880631 11 27, 28 et 34; une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 34.
Particulièrement, la composition pharmaceutique selon l'invention, peut être destinée au diagnostic, au pronostic et/ou au traitement de pathologies liées à l'angiogenèse.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la composition pharmaceutique peut être destinée au traitement des pathologies liées à l'angiogenèse choisie parmi: les cancers, particulièrement au travers de la vascularisation et/ou de la proliférations des tumeurs, les rétinopathies, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, l'athérosclérose, l'hyperstimulation de l'ovaire, le psoriasis, l'endométrie associée à la néovascularisation, la resténose due à l'angioplastie du ballon, la superproduction tissulaire due à la cicatrisation, la maladie vasculaire périphérique, l'hypertension, l'inflammation vasculaire, la maladie et les phénomènes de Raynaud, l'anévrisme, la resténose artérielle, la thrombophlébite, la lymphagyte, le lymphodème, la cicatrisation et la réparation tissulaire, l'ischémie, l'angine, l'infarctus de myocarde, la maladie chronique du coeur, les insuffisances cardiaques telles que l'insuffisance cardiaque congestive, la dégénération maculaire liée à l'âge et l'ostéoporose.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation dans la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber l'angiogenèse, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif inhibiteur de l'angiogenèse choisi parmi: i. une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle correspond à v) 5 2880631 12 a. une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 4 ou 5 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; b. une séquence antisens des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 1 à 3, 6 à :34, séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 62 à 64 ou 66 à 85 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; c. ou la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le n SEQ ID N 86 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; ii. un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéros SEQ ID n 4 ou 5 ou qu'il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides; un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de la présente revendication; iv. un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour l'une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides; v. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle surexprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID 2880631 1:3 No. 4 ou 5 ou qu'elle sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 6 à 34.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation dans la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à activer l'angiogenèse, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif activateur de l'angiogenèse choisi parmi: i) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle correspond à a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 3 ou 6 à 34 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; b) la séquence antisens de l'une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 4 ou 5, séquence identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 65, ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; ii) au moins un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéros SEQ ID n 1 à 3 ou 6 à 34 ou qu'il comprend ou consiste en un des polypeptides identifiés dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéro SEQ ID n 35, 36, 39 à 61 ou un fragment desdits polypeptides; iii) un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de la présente revendication; 2880631 14 iv) un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour la séquence polypeptidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 36, 39 à 61 ou un fragment desdits polypeptides; v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 6 à 34 ou qu'elle sous-exprime un gène ou sous-exprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4 ou 5.
Selon un aspect particulier, un autre objet de l'invention concerne toute séquence d'acides nucléiques (sous forme d'ADN ou d'ARN), comprenant ou consistant en au moins 10 mers d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences identifiées par les numéros SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 34 dans la liste de séquences en annexe, ou complémentaire ou antisens d'une telle séquence.
Tout préférentiellement l'invention a pour objet les séquences antisens ayant une identité d'au moins 85%, de préférence de 95% avec une séquence choisie parmi les séquences identifiées sous les numéros SEQ ID N 62 à SEQ ID N 86 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention concerne en particulier les ARN inhibiteurs de l'expression d'un ARN (ARNi) comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sous forme d'ARN, d'au moins 10 mers, complémentaire d'un ARNm correspondant à l'une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34.
Lorsque ces séquences (ARNi) s'hybrident avec une portion de la séquence de l'ARNm correspondant, elles peuvent inhiber son expression, c'est-à-dire sa traduction en une protéine.
2880631 15 Ainsi l'invention a pour objet l'utilisation d'un ARN d'au moins 10 mers, comprenant ou consistant en un ARN complémentaire d'une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe comme ARN inhibiteur.
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d'une pathologie angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, consistant à détecter dans les cellules dudit mammifère la surexpression ou la sous- expression d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées par les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34 dans la liste de séquences en annexe.
Une telle méthode de diagnostic comprend les étapes suivantes: -la détection de l'expression d'une ou plusieurs desdites séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34, par une population cellulaire d'un mammifère, - la détection de l'expression de celle(s) même(s) séquence(s) par une population cellulaire de référence dont 20 l'état angiogénique est connu, - l'identification des différences éventuelles du niveau d'expression de celle(s) même(s) séquence(s) par les deux populations cellulaires.
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic et de pronostic d'une pathologie angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, consistant à détecter dans les cellules dudit mammifère la surexpression ou la sous-expression d'une ou plusieurs séquences polypeptidiques identifiées par les numéros SEQ ID No. : 35 à SEQ ID No. : 61 dans la liste de séquences en annexe.
Selon un mode de mise en ouvre préféré, ladite méthode comporte les étapes suivantes: a) la détection de l'expression d'une ou plusieurs 2880631 16 desdites séquences polypeptidiques SEQ ID No. : 35 à SEQ ID No. : 61 par une population cellulaire d'un mammifère, b) la détection de l'expression de celle(s) même(s) séquence(s) polypeptidique(s) par une population cellulaire de référence dont l'état angiogénique est connu, c) l'identification des différences éventuelles du niveau d'expression de celle(s) même(s) séquence(s) polypeptidique(s) par les deux populations cellulaires.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la méthode de diagnostic de l'invention la détection de l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules endothéliales en présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
La présente invention concerne également une méthode de vérification de l'efficacité thérapeutique d'un traitement angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, caractérisée en ce qu'elle comporte l'identification in vitro dans une population cellulaire dudit mammifère, de la surexpression ou de la sous-expression d'au moins un gène impliqué dans un désordre angiogénique identifié par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34.
une telle méthode de vérification de l'efficacité 25 thérapeutique comprend les étapes suivantes: - la détection de l'expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère auquel est administrée une composition thérapeutique destinée à traiter un désordre angiogénique, d'au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34; la détection de l'expression ladite séquence nucléotidique par unepopulation cellulaire de 2880631 17 référence dont l'état angiogénique est connu, - l'identification d'une éventuelle différence du niveau d'expression de ladite séquence par les deux populations cellulaires.
Selon des modes de réalisation préférés, la méthode de vérification est effectuée sur une population cellulaire d'un mammifère in vivo, ex-vivo, ou bien sur une population cellulaire isolée dudit mammifère in vitro Selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la méthode de vérification de l'invention la détection de l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules, particulièrement les cellules endothéliales, en présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
La présente invention concerne également une méthode de 15 criblage de composés utiles pour le traitement angiogénique d'un mammifère, notamment d'un être humain.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, une telle méthode de criblage comprend les étapes suivantes: a) la détection de l'expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère mise en présence d'un composé susceptible d'avoir un effet thérapeutique sur un désordre angiogénique, d'au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ I:D N 34, b) la détection de l'expression de la même séquence nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l'état angiogénique est connu, c) l'identification des différences éventuelles du niveau d'expression de(s) celle(s) même(s) séquences nucléotidiques par les deux populations cellulaires.
2880631 18 Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré, une telle méthode de criblage comprend également les étapes suivantes: - la détection de l'expression d'une ou plusieurs desdites séquences polypeptidiques identifiées par les numéros SEQ ID No. : 35 à SEQ ID No. : 61 dans la liste de séquences en annexe par une population cellulaire mise en présence d'un composé susceptible d'avoir un effet thérapeutique sur un désordre angiogénique, - la détection de l'expression de celle ou celles mêmes séquences polypeptidiques par une population cellulaire de référence dont l'état angiogénique est connu, - l'identification des différences éventuelles du niveau d'expression de celle(s) même(s) séquence(s) polypeptidique(s) par les deux populations cellulaires.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la méthode de criblage de l'invention la détection de l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules, particulièrement les cellules endothéliales en présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
Parmi les désordres angiogéniques, susceptibles d'être diagnostiqués ou traités avec les compositions pharmaceutiques de l'invention on peut citer: les cancers, particuliérement au travers de la vascularisation et/ou de la proliférations des tumeurs, les rétinopathies, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, l'athérosclérose, l'hyperstimulation de l'ovaire, le psoriasis, l'endométrie associée à la néovascularisation, la resténose due à l'angioplastie du ballon, la superproduction tissulaire due à la cicatrisation, la maladie vasculaire périphérique, l'hypertension, l'inflammation vasculaire, la maladie et les phénomènes de Raynaud, l'anévrisme, la resténose artérielle, la thrombophlébite, la lymphagyte, le lymphodème, la cicatrisation et la réparation tissulaire, l'ischémie, 1'9 l'angine, l'infarctus de myocarde, la maladie chronique du coeur, les insuffisances cardiaques telles que l'insuffisance cardiaque congestive, la dégénération maculaire liée à l'âge et l'ostéoporose.
L'invention a également pour objet un dispositif comprenant un support comprenant une ou plusieurs sondes spécifiques d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe pour la mise en oeuvre de la méthode de criblage de l'invention, particulièrement d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29,ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences.
Dans le cadre de la présente invention on entend par sonde tout fragment d'ADN simple brin dont la séquence est complémentaire à une séquence recherchée: celle-ci pourra par exemple ainsi être décelée par hybridation avec une sonde marquée (par exemple par incorporation d'atomes radioactifs ou de groupements fluorescents), qui joue le rôle d'un "hameçon" moléculaire,.
Selon des modes de mise en oeuvre préférés, le support dudit dispositif est choisi parmi une membrane de verre, une membrane métallique, une membrane polymère, une membrane de silice.
De tels dispositifs sont par exemple des puces à ADN comprenant une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention a aussi pour objet une trousse destinée à la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant un dispositif tel que précédemment décrit, des amorces spécifiques et les accessoires nécessaires à l'amplification des séquences 2880631 2 0 extraites d'un échantillon, leur hybridation avec les sondes du dispositif et la réalisation des mesures de l'affichage différentiel.
L'invention a aussi pour objet une trousse destinée à la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant une lignée de cellules génétiquement modifiées exprimant de manière stable le vecteur exprimant au moins une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe, ou un de leurs fragments en tant que population cellulaire de référence et les moyens nécessaires pour la mesure dudit affichage différentiel.
L'invention a aussi pour objet une trousse destinée à la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant une lignée de cellules génétiquement modifiées exprimant de manière stable le vecteur exprimant au moins une séquence antisens d'une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe, ou un de leurs fragments, en tant que population cellulaire de référence et les moyens nécessaires pour la mesure dudit affichage différentiel.
La vérification de l'implication des 34 gènes identifiés et de leurs homologues dans le mécanisme de l'angiogenèse a été effectuée selon la méthodologie décrite dans la section Matériel et méthodes.
Cette implication est illustrée à l'aide des figures 1 à 11 en annexe, dans lesquelles: La figure 1 montre que l'expression de GS-V1, GS- V2, GS-V3 et GS-V5 dans les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires et que l'expression de GS-V4 chez les cellules endothéliales humaines stimule la formation des tubes capillaires: 2880631 21 cellules endothéliales transfectées avec 1A) GSV1 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N1; 1B) GS-V2 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N2; 1C) GS-V3 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N3; 1D) GS-V4 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N4 et son homologue GS-N5; 1E) GS-V5 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N6 et son homologue GSN7, et le transcrit antisens spécifique de GS-N8 et ses homologues GS- N9, GS-N10 et GS-N11; 1F) le vecteur vide (Contrôle).
La figure 2 montre que l'expression de GS-V6, GS-V7, GS-V8, GS-V9 et GS-V10 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires cellules endothéliales transfectées avec 2A) GS-V6 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N12; 2B) GS-V7 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N13; 2C) GS-V8 codant pour le transcrit antisens spécifique de GSN14; 2D) GS-V9 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N15; 2E) GS-V10 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-16; 2F) le vecteur vide (Contrôle).
La figure 3 montre que l'expression de GS-V11, GS-V12, GS-V13, GS- V14, GS-V15, chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires cellules endothéliales transfectées avec 3A) GS-V11 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N17; 3B) GS-V12 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N18 et son homologue GS-N19; 3C) GS-V13 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N20; 3D) GSV14 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N21; 3E) GS-V15 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N22; 3F) le vecteur vide (Contrôle).
La figure 4 montre que l'expression de GS-V16, GS-V17, GS-V18, GS- V19, GS-V20 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires 2880631 22 cellules endothéliales transfectées avec 4A)GS-V16 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N23; 4B)GSV17 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N24; 4C)GS-V18 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N25; 4D)GS-V19 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N26 et ses homologues GS-N27 et GS-N28; 4E)GS-V20 codant pour le transcrit antisens spécifique de GSN29 et 4F) le vecteur vide (Contrôle).
La figure 5 montre que l'expression de GS-V21, GS-V22, GS-V23 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires: cellules endothéliales transfectées avec 5A)GS-V21 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N30; 5B)GS-V22 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N31, et ses homologues GS-N32 et GSN33; 5C)GS-V23 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N34; 5D) le vecteur vide (Contrôle).
MATÉRIEL ET METHODES 1.Culture des cellules et test d'angiogenèse Des cellules endothéliales de veines ombilicales (HUVEC) sous lesdites quatre conditions de culture sont alors utilisées pour identifier les gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse.
Les cellules endothéliales sont maintenues en milieu complet (EGM- 2 de Clonetics).
Pour l'identification des gènes impliqués dans l'angiogenèse dans les test in vitro de l'angiogenèse selon le modèle de Montesano et al. (1986, Proc Natl Acad Sci U S A, 83(19):7297-301). Les cellules sont tout d'abord ensemencées sur un gel de Collagène type I en milieu complet jusqu'à confluence. Puis, les cellules HUVEC de référence sont cultivées en milieu appauvri en sérum et sans facteurs de croissance: EBM-2 + 2% de sérum et différents facteurs 2880631 23 sont ajoutés dans les conditions test.
Le FGF2: à des concentrations comprises entre 5 ng/ml et 60 ng/ml, de préférence entre 10 et 40 ng/ml; du VEGF: à des concentrations comprises entre 10 ng/ml et 60 ng/ml, de préférence comprises entre 30 ng/ml et 50 ng/ml; du PF4: à de concentrations comprises entre 0,1 et 5 pg/ml, de préférence comprises entre 0,5 pg/ml et 1 pg/ml; du TNF-a à des concentrations comprises entre 20 ng/ml et 100 ng/ml, de préférence comprises entre 30 ng/ml et 60 ng/ml; du IFN-y: à des concentrations comprises entre 50 ng/ml et 200 ng/ml, de préférence comprises entre 80 ng/ml et 120 ng/ml; de l'Ang-2: à des concentrations comprises entre 20 ng/ml et 800 ng/ml, de préférence comprises entre 200 ng/ml et 400ng/ml; Les cellules endothéliales humaines placées sous les quatre conditions de culture précitées sont alors utilisées pour identifier des gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse.
2. Facteurs angiogéniques et angiostatiques.
Des facteurs angiogéniques et angiostatiques, ayant un effet sur l'expression des gènes identifiés en corrélation avec la formation de néovaisseaux ou l'inhibition de néovaisseaux respectivement, utilisés, à titre d'exemple, dans le cadre de la présente invention, sont illustrés ci- dessous.
VEGF = Facteur de croissance endothélial vasculaire. FGF2 = Facteur de croissance basique du fibroblaste. PF4 = Facteur plaquettaire 4.
Ang-2 = Angiopoiètine 2 IFN-y = Interféron gamma.
TNF-a = Facteur de nécrose tumorale alpha Le TNF-a qui est un régulateur de l'angiogenèse, il peut induire l'angiogenèse in vivo mais également inhiber la formation des vaisseaux in vitro (Frater-Schroder et al, 2880631 24 1987, Proc Natl Acad Sci U S A,84(15):5277-81; Fajardo et al, 1992, Am J Pathol Mar,140(3):539-44; Niida et al, 1995, Neurol Med Chir (Tokyo),35(4):209-14. Dans notre modèle d'angiogenèse in vitro, le TNF-a est utilisé dans des conditions d'inhibition de l'angiogenèse.
3. Comparaison des expressions géniques.
Les expressions géniques peuvent être alors comparées en utilisant les puces d'ADN, le SAGE, une réaction d'amplification par PCR quantitative, les vecteurs viraux pour construire des banques soustractives, ou encore l'analyse par affichage différentiel.
Dans le cadre des travaux expérimentaux ayant conduit à la présente invention, la Demanderesse a utilisé préférentiellement la technique d'affichage différentiel pour l'identification desdits gènes.
Affichage différentiel Les ARN totaux sont préparés à partir des cellules HUVEC cultivées sur un gel de collagène en présence des différents facteurs utilisés, selon la méthode RNeasy Mini kit (Qiagen) en intégrant une étape de digestion à la DNase I selon le protocole préconisé par le fabricant.
L'affichage différentiel à partir des ARNs totaux est réalisé selon la méthode décrite par Liang et Pardee (1992, Science, 14;257(5072) :967-7)en utilisant l'aP33-ATP en dilution isotopique au cours de l'amplification par PCR pour la visualisation des bandes par autoradiographie des gels d'électrophorèse.
Ainsi, les fragments d'ADN différentiellement présents sur le gel en fonction des conditions de culture analysées sont découpés, réamplifiés, clonés dans un plasmide PGEM easy vector, Promega), séquencés et identifiés par questionnement de la banque BLAST.
4. Vérification de l'implication des gènes identifiés dans le mécanisme de l'angiogenèse.
2880631 25 Test de fonctionnalité des gènes Dans une deuxième étape, :La fonctionnalité de chaque séquence identifiée est testée sur le modèle d'angiogenèse in vitro avec les cellules endothéliales humaines transfectées avec un vecteur d'expression comprenant un oligonucléotide antisens de ladite séquence.
Pour la construction de ces vecteurs, l'amplification du fragment cloné dans le plasmide bactérien est effectuée au moyen d'amorces particulières, choisies parmi les séquences GS-PGS F, GS-PGM-R ou GS-PGM- F et GS-PGS-R s'hybridant aux régions du plasmide encadrant le gène cloné et comprenant également dans leurs extrémités les sites de restriction (sites Sali et Ml.ui), non contenus dans le fragment cloné, et présents dans la région multisite du vecteur d'expression.
Ces deux sites de restriction pouvant être interchangés selon que le fragment ait été cloné dans le plasmide bactérien dans son orientation sens ou antisens.
Ces amorces (voir 20 publiée sous le n WO Tableau I ci-dessous:
Tableau I
GS-PGS-F CGGGTCGACGGCCGCGGGAATTCGATT
GS-PGM-R CGCACGCGTGCGGCCGCGAATTCACTA
GS-PGM-F CGCACGCGTGGCCGCGGGAATTCGATT
GS-PGS-R CGGGTCGACGCGGCCGCGAATTCACTA
Des contrôles effectués avec ces amorces, que l'on peut considérer comme des amorces universelles, en absence du gène cloné, (plasmide vide) ont montré que le fragment amplifié du plasmide (40 paires de bases) lorsqu'il est intégré dans le vecteur d'expression n'altère pas la formation des néovaisseaux dans le test de fonctionnalité in vitro. Les résultats obtenus avec ce vecteur ainsi construit demande de brevet internationale 01/218312) sont indiquées sur le 2880631 26 sont identiques à ceux obtenus avec le vecteur vide (Résultats non montrés) et montrent que ces paires de bases supplémentaires n'altèrent pas l'effet des fragments antisens spécifiques de la séquence identifiée.
Ces amorces contiennent à chacune de leurs extrémités, un site d'une enzyme de restriction différente (Sall: GTCGAC ou Mlul: ACGCGT).
Des fragments amplifiés de chaque gène sont obtenus par PCR à partir des plasmides bactériens contenant le fragment 10 du gène identifié en utilisant lesdites amorces.
Ces fragments sont purifiés, digérés par les enzymes de restriction Sali et Mlul et insérés dans un vecteur d'expression chez les mammifères du type pCi-neo vector, (Promega), lui-même digéré par ces deux enzymes de restriction.
Chaque fragment est introduit dans l'orientation antisens.
D'une façon générale, les vecteurs susceptibles d'être utilisés pour la mise en évidence de la fonctionnalité des gènes identifiés dans la présente invention dans le mécanisme de l'angiogenèse comprennent tout système de vecteurs d'expression chez les mammifères comprenant un promoteur qui permet l'expression d'un gène cloné, à titre d'exemple on peut citer le promoteur fort du cytomégalovirus humain (CMV).
D'autres vecteurs d'expression constitutifs ou inductibles susceptibles d'être également utilisés, sont indiqués dans la liste non- exhaustive ci-après indiquée: Vecteurs commercialisés par la Société Promega; des vecteurs avec un promoteur fort pour un haut niveau d'expression constitutif des gènes chez les cellules de mammifères (pCI Mammalian Expression vector, Expression Vector System cloning vector pALTER(R)*-MAX), des vecteurs commercialisés par la société Invitrogen: (pcDNA3.1, - 2880631 2 7 /hygro, -/Zeo, pcDNA4/HisMAx, -E, paires de basesudCE4, pRcRSV, pRcCMV2, pSecTag2, - /hygro secretion vectors, les vecteurs pEBVHis A, B et C), des vecteurs d'expression chez le mammifère commercialisés par la société Clontech (pIRES, pIRES-EYFP pIRES2-EGFP, pCMV-Myc et pCMV-HA), Epitope-Tagged pTRE, les vecteurs VP16 Minimal Domain (ptTA 2, ptTA 3 et ptTA 4), les vecteurs d'expresion Tet bidirectionnels ( paires de basesI, paires de basesI-EGFP, paires de basesI-G, paires de basesI-L), pRevTRE, pTRE2, pLEGFP-N1 Vecteur Retroviral pLEGFP-C1, les systèmes d'expression adenoviraux Adeno-X, pCMSEGFP, pd1EGFP-N1, pd2ECFP-Ni, pd2EYFP-N1, pEGFP(-C1, -C2, -C3, -N1, -N2, -N3), pEYFP-C1, -N1.
Chaque vecteur comprenant ledit fragment anti-sens est alors produit chez E.Coli, extrait, purifié et quantifié. Un pg de chaque vecteur est incubé en présence d'un agent transfectant (effectene, Qiagen) en suivant le protocole préconisé par le fabricant avec les cellules endothéliales. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules endothéliales sont trypsinées et étalées sur la matrice extracellulaire contenant les facteurs angiogéniques en l'occurrence le matrigel selon le modèle décrit par Grant et al, (1989,Cell,58(5):933-43). Après 24h d'incubation, la formation de vaisseaux est observée et comparée aux cellules témoins transfectées avec le vecteur d'expression de mammifère vide.
5. Etablissement de la banque de lignées stables exprimant les vecteurs d'expression contenant les séquences des gènes ou leurs fragments ou les séquences antisens.
Les systèmes d'expression peuvent comprendre un marqueur de sélection à un antibiotique (un gène de résistance à un antibiotique), pour sélectionner les cellules transfectées exprimant de façon stable le vecteur comprenant l'acide nucléique cloné dans ledit vecteur et ce, soit dans le même vecteur, soit dans un 2ème vecteur co- 2880631 28 transfecté.
Ce vecteur d'expression peut être un système d'expression constitutif ou inductible.
Dans l'exemple particulier ci-dessous décrit, les lignées stables pour l'expression de l'oligonucléotide antisens correspondant à chaque gène identifié ont été obtenues avec un vecteur d'expression constitutif et après sélection en présence d'antibiotique.
Pour ce faire, 24h après la transfection effectuée dans les conditions décrites ci-dessus, les cellules endothéliales BAEC sont trypsinées et ensemencées à raison de 80 000 cellules/puits en plaque de six puits en présence de 700 pg/ml de l'antibiotique G418 (Promega). Un puit contrôle est ensemencé avec des cellules non transfectées.
Le milieu est changé tous les trois jours avec une recharge de l'antibiotique. Les cellules contrôles sont éliminées après 8 à 10 jours, les cellules résistantes à l'antibiotique sont récoltées à confluence (après 2 à trois semaines) puis transférées en flacons de culture toujours en présence de l'antibiotique. Les lignées stables sont ensuite testées pour leur capacité à former ou non des vaisseaux dans le test d'angiogenèse in vitro.
6. Résultats 6.1 Identification des gènes.
Les séquences d'acide nucléiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe par les n SEQ ID N 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19, 27 à 29 et 34 et les protéines identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe par les n SEQ ID N 35, 37, 38, 43, 47 à 49 et 57 n'ont pas été identifiées auparavant comme ayant un rôle biologique quelconque, et encore moins comme ayant un rôle dans le processus de l'angiogenèse ou la différentiation des cellules endothéliales en tubes capillaires. Ces protéines sont décrites ci-dessous.
2880631 29 La méthode d'affichage différentielle ci-dessus décrite a permis l'identification des ARNm suivants: - GS-N1: ARNm de 1041 paires de bases, identifié par la séquence SEQ ID No: 1 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession B0002759.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 213 au nucléotide 482. Une protéine, GSPl,résultant de la traduction de cet ARNm, (SEQ ID No 35 dans la liste de séquences en annexe), a été identifiée. Cette protéine est composée de 89 acides aminés.
- GS-N2: ARNm de 4275 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 2 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession BC040192.
- GS-N3: ARNm de 6104 bp identifié par la séquence SEQ ID No: 3 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession XM 497078.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 438 au nucléotide 5687. Une protéine, GS-P2, (SEQ ID No 36 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, a été identifiée. Cette protéine est composée de 1749 acides aminés, est appelée Nucléoporine 188.
La nucléoporine 188kDa fait partie de la famille d'une trentaine de protéines appelées les nucléoporines qui constituent sur la double membrane nucléaire des larges structures protéiques formant des pores nucléaires et servant de sites de translocation de macromolécules entre le noyau et le cytoplasme. Des études ont montré qu'une nucléoporine a un rôle unique dans la régulation de la fonction du pore nucléaire et le transport de protéines et ARNs. Leur rôle a été plus clair avec la mise en évidence de 2880631 30 leur association avec des maladies spécifiques (revue: Cronshaw et Matunis,Trends Endocrinol Metab. 2004 Jan-Feb;15(1) :34-9.). Par exemple, la surexpression de la nucléoporine NUP88 a été associée à une haute agressivité du cancer du sein (Agudo et al, Int J Cancer. 2004 May 1;109(5):717-20). Des rôles spécifiques ont été aussi démontrés par d'autres types d'études, ainsi par exemple, un rôle spécifique a été suggéré pour la nucléoporine 98kDa (NUP98): la répression de l'expression de cette protéine par la technique des RNai, a permis à certains auteurs de mettre en évidence une altération spécifique de la structure du pore nucléaire et de certaines fonctions comme l'entrée du cDNA du virus HIV dans le noyau suggérant que cette protéine participerait à l'entrée du cDNA du virus dans le noyau(Ebina et al, Microbes Infect. 2004 Jul;6(8):715-24). Autre exemple, La nucléoporine P62 a été impliquée dans le transport de facteurs activateurs de transcription (STAT3) vers le noyau des neurones lorsque ces cellules sont stimulées par l'angiotensine II (Lu et al, Neurosci. 1998 Feb 15; 18(4):1329-36).
Concernant la protéine NUP188, aucun rôle spécifique n'a été encore démontré, son rôle notamment dans la régulation de l'angiogenèse n'a pas encore été décrit.
- GS-N4: ARNm de 1768 bp, identifié par la séquence SEQ ID No: 4 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession B0002509.
La séquence de cet ARNm (GS-N4) présente une séquence codante du nucléotide 176 au nucléotide 1387. Une protéine, GS-P3, (SEQ ID No 37 dans la liste de séquences en annexe) résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée. Cette protéine est composée de 403 acides aminés.
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N5.
- GS-N5: ARNm de 1552 paires de bases identifié par la 2880631 31 séquence SEQ ID No: 5 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession B0008630.
La séquence de cet ARNm (GS-N5) présente une séquence codante partielle du nucléotide 1 au nucléotide 949. Une protéine, GS-P4, (SEQ ID No 38 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, homologue à la protéine GS-P3, composée de 315 acides aminés a été identifiée.
Cette nouvelle protéine de 44kDa contient un domaine PHD Zinc finger, motif principalement trouvé dans les protéines impliquées dans la régulation de la transcription chez les eucaryotes (revue: Trends Biochem Sci. 1995 Feb;20(2):56-9).
- GS-N6: ARNm de 3181 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 6 dans la:Liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 170707.
La séquence de cet ARNm (GS-N6) présente une séquence codante du nucléotide 213 au nucléotide 2207. Une protéine, GS-P5, (SEQ ID No 39 dans la liste de séquences en annexe), appelée lamine A/C isoforme 1, résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 664, a été identifiée.
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N7.
- GS-N7: ARNm de 2404 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 7 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession X03444.
La séquence de cet ARNm (GS-N7), présente une séquence codante du nucléotide 211 au nucléotide 2319. Une protéine, GS-P6, (SEQ ID No 40 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 702 acides aminés, appelée précurseur de la lamine A, a été identifiée.
2880631 32 Le gène LMNA code pour une protéine appelée lamine A/C isoforme 1. Les lamines sont les composants principaux de la lamina nucléaire. Ces protéines sont importantes dans une variété de fonctions cellulaires telles que l'assemblage nucléaire, réplication, transcription et intégrité nucléaire (revue: Curr Opin Cell Biol. 2002 Jun; 14(3):357- 64). Des mutations de la lamine A/C a été liée à plusieurs maladies telles que des dystrophies musculaires ou maladies cardiovasculaires (revue: Trends Cardiovasc Med. 2001 Oct; 11(7):280-5) ; la perte d'expression de ce gènea été rapportée dans une forme de cardiopathie dilatée (Virchows Arch. 2003 Nov; 443(5): 664-71. Epub 2003 Jul 26). Mais à ce jour, aucune implication de ce gène n'a été décrit dans la régulation de l'angiogenèse.
- GS-N8: ARNm de 2570 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 8 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession AB005047.
La séquence de cet ARNm (GS-N8) présente une séquence codante du nucléotide 64 au nucléotide 1341. Une protéine, GS-P7, (SEQ ID No 41 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée. Cette protéine est composée de 425 acides aminés et est appelée protéine SAB.
La protéine SAB est une protéine liant le domaine SH3, son rôle dans la voix de signalisation de la tyrosine kinase de Bruton (Btk) a été suggéré par la mise en évidence de sa liaison avec le domaine SH3 de cette kinase (Biochem Biophys Res Commun. 1998 Apr 17;245(2):337-43). Son rôle dans la voix de signalisation de la protéine c-Jun N-terminal kinase a été également suggéré (Biochem J. 2002 Nov 1; 367 (Pt 3) : 577-85). Par ailleurs, la c--Jun N-terminal kinase a été montrée impliquée dans l'angiogenèse (Jimenez et al, Oncogene. 2001 Jun 7;20(26):3443-8) et plus récemment, 2880631 33 l'expression augmentée de la Btk a été observée au cours de l'angiogenèse in vivo (2004, Zippo et al, Blood).
Cependant, à ce jour aucune implication de la protéine SAB n'a été démontrée dans l'angiogenèse.
Cette séquence présente une homologie de séquence avec les séquences GS-N9, GS-N10, GS-N11 inférieure à 90 %. Toutefois ces 4 séquences présentent une séquence conservée dont l'antisens, identifié dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N : 67, permet l'inhibition de l'expression.
- GS-N9: ARNm de 2190 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 9 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession AK090524.
- GS-N10: ARNm de 5593 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 10 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession AL133111 - GS-N11: ARNm de 2774 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 11 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession BX641159.
- GS-N12: ARNm de 8974 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 12 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM_015382 La séquence de cet ARNm (GS-N12) présente une séquence codante du nucléotide 324 au nucléotide 8162. Une protéine, GSP8, (SEQ ID No 42 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée. Cette protéine est composée de 2612 acides aminés, et est appelée protéine HECT domain containing 1 (HECTD1).
La protéine HECTD1 est rangée par son domaine conservé dans la famille de protéines HECT qui fonctionnent comme des 2880631 34 protéines ubiquitine ligases E3, ciblant des protéines spécifiques pour la protéolyse contrôlée par l'ubiquitine (Callaghan et al, Oncogene, 1998 Dec 31; 17(26):3479-91). A titre d'exemples, la protéine Smurfl, autre membre de cette famille joue un rôle spécifique dans la différentiation des cellules ostéoblastes et la formation de l'os in vivo en inhibant cette différentiation (Zhao et al, J Biol Chem. 2004 Mar,26;279(13):12854- 9). La protéine Nedd4, également un membre de la famille HECT a été décrite comme régulant la stabilité et donc l'activité du récepteur du facteur de croissance IGF-I (insulin-like growth factor I) (Mol Cell Biol. 2003 May;23(9):3363-72. Le rôle spécifique de HECTD1 n'est pas encore décrit dans la littérature, et en particulier aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrit pour cette protéine.
- GS-N13: ARNm de 5346 paires de bases identifié sous le numéro de séquence SEQ II) No 13 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession XM 291344.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 1 au nucléotide 3522. Une protéine, GS-P9, (SEQ ID No 43 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm a donc été identifiée. Cette protéine est composée de 1173 acides aminés.
Cette protéine encore inconnue est caractérisée par un domaine catalytique tyrosine kinase.
- GS-N14: ARNm de 3769 paires de bases identifié sous le numéro de séquence SEQ ID No 14 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 181847.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 469 au nucléotide 2037. Une protéine, GS-P10, (SEQ ID No 44 2880631 35 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm a donc été identifiée. Cette protéine est composée de 522 acides aminés et est appelée AMIGO2.
La protéine Amigo 2 a été découverte récemment et a été classée dans une nouvelle famille de gènes codant pour des protéines transmembranaires de type I qui contiennent une séquence signal de sécrétion et un domaine transmembranaire (Kuja-Panula et al, J Cell Biol. 2003; 160(6):963-73). Ces auteurs ont suggéré que ce sont de nouvelles molécules d'adhésion, elles sont exprimées sur les fibres des neurones et participeraient à leur formation.
La protéine Amigo 2 reste encore mal connue, elle n'a encore jamais été décrite comme impliquée dans l'angiogenèse.
- GS-N15: ARNm de 7407 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 15 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 005650.
Cet ARNm présente une région codante du nucléotide 135 au nucléotide 6017. Il a donc été identifié une protéine, GS-P11, (SEQ ID No 45 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 1960 acides aminés, et est appelée facteur de transcription 20, isoforme 1 (TCF20).
Cette protéine, également appelée SPBP, a été décrite à l'origine comme étant un facteur de transcription qui contrôle l'expression de la stromolysine, une metalloproteinases impliquée dans l'invasion de tumeurs et les métastases (Sanz et Mol. Cell. Biol. 15 (6), 3164-3170 (1995).Plus récemment, il a été rapporté que cette protéine nucléaire contient plusieurs domaines fonctionnels et qu'elle stimule l'activité transcriptionnelle de facteurs de transcription variés tels que Etsl ou CJun, elle est suggérée être un coactivateur transcriptionnel (Rekdal et 2880631 36 al, J Biol Chem. 2000 Dec 22;275(51):40288-300).
A ce jour, aucune implication dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrite pour cette protéine.
GS-N16: ARNm de 2104 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 16 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 016408.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 125 au nucléotide 1888. Il a ainsi été identifié une protéine GS-P12, (SEQ ID No 46 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 587 acides aminés, et est appelée protéine 1 associée à la sous unité régulatrice CDK5 (CDK5RAP1).
Cette protéine également appelée C42, ou HSPC167, a été isolée et montrée s'associer à une sous unité activatrice (p25nck5a dérivée de p35nck5a) d'une protéine kinase associée au cycle cellulaire appelée protéine kinase dépendante des cyclines, la CDK5 (Ching et Wang, Gene. 2000 Jan 25;242(12):285-94). Chez les cellules en division, les cdks, régulent la prolifération, différentiation, senescence, et apoptose. La CDK5 neuronale a été impliquée dans la régulation de la différentiation et la migration neuronale. L'activité des protéines Cdk est régulée par des mécanismes complexes incluant la phosphorylation de protéines, l'association avec des inhibiteurs spécifiques. Pour la Cdk5, deux activateurs ont été identifiés la p35nck5a, et son isoforme, la p39n k5ai. La protéine CDK5RAP1 a été montré inhiber l'activité kinase de la CDK5 neuronale en s'associant à la p35nck5a (Ching et al, J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 18, 15237-15240, May 3, 2002). D'autre part, récemment, l'augmentation d' expression de la CDK5 et son rôle dans la prolifération et l'apoptose chez les cellules endothéliales (BAE) en prolifération stimulées par le bFGF 2880631 37 ont été rapportés (Sharma et a:L, J Cell Biochem. 2004 Feb 1;91(2):398-409).
Par contre, à ce jour, aucune implication de la CDK5RAP1 n'a été démontrée dans la régulation de 5 l'angiogenèse - GS-N17: ARNm de 5859 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 17 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession AK074056.
Cet ARNm, (GS-N17), présente une séquence codante partielle du nucléotide 45 au nucléotide 935.
Il a été ainsi identifié une nouvelle protéine, GS-P13, (SEQ ID No 47 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 296 acides aminés.
Cette protéine inconnue, de 33kDa, contient des domaines BTB/POZ et Kelch, le domaine BTB/POZ est un domaine conservé d'interaction protéine-protéine (Xu et al, Int J Mol Med. 2004 Jan; 13(1):193-7,. décrits impliqués dans les processus de régulation et transduction du signal (NCBI, Conserved Domain Search). Cependant, les protéines contenant ces domaines constituent une large famille dont les fonctions physiologiques restent encore mal connues (Ohmachi et al, Genes Cells. 1999 Jun;4(6):325-37. Un membre de cette famille a déjà été décrit impliqué dans un processus tel que la migration dirigée des cellules chez la drosophile. (Development, 2001 Aug;128(15):3001-15).
- GS-N18: ARNm de 1694 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 33 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession B0001792.
Cet ARNm, (GS-N18), présente une séquence codante du nucléotide 164 au nucléotide 448. 1l a été ainsi identifié une protéine, GS-P14, (SEQ ID No 48 dans la liste de 2880631 38 séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 94 acides aminés.
Cette protéine de 10kDa n'a aucun domaine particulier mais contient une séquence signale de sécrétion et une hélice transmembranaire.
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N19.
- GS-N19: ARNm de 2437 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No: 19 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro d'accession AF370373.
Cet ARNm (GS-N19) présente une séquence codante du nucléotide 628 au nucléotide 1533. Une protéine, GS-P15, (SEQ ID No 49 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm a ainsi été identifiée. Cette protéine, isoforme de la protéine GS-P14, est composée de 301 acides aminés.
Cette isoforme est caractérisée par un domaine appelé ubiquitine, de la famille des ubiquitines, molécules impliquées dans la protéolyse des protéines qui régule le turnover des protéines , afin de contrôler la progression du cycle cellulaire.
Ces 2 isoformes sont également caractérisés par une séquence signal d'excrétion.
GS-N20: un ARNm de 1714 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 20 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession BCO22870 dans la base de séquences GENBANK.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 90 au nucléotide 1424. Il a été ainsi identifié une protéine GS-P16 résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 444acides aminés.
Elle est identifiée sous le numéro SEQ ID No 50 dans la liste de séquences en annexe, appelée protéine 44 induite 2880631 39 par l'interféron (IFI44).
Le gène codant pour un nouvel antigène la protéine, p44 a été isolé à l'origine chez le chimpanzé infecté par un virus de l'hépatite (Takahashi et al, 1990, J Gen Virol., 71 (Pt 9):2005-11). Par la suite, il a été identifié chez l'homme comme étant inductible par l'interféron (Kitamura et al, Eur J Biochem. 1994 Sep 15;224(3):877-83). A ce jour, cette protéine n'a pas été décrite comme étant impliquée dans 1'angiogenèse.
GS-N21: ARNm de 1715 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 21 dans la]Liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM_004905 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm, GS-N21, présente une séquence codante du nucléotide 52 au nucléotide 726. Il a été ainsi identifié une protéine, GS-P17, (SEQ ID No 51 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 224 acides aminés, appelée peroxiredoxine 6 (PRDX6).
La protéine peroxiredoxine 6 (également appelée antioxidant protein 2; non-selenium glutathione peroxidase; acidic calcium- independent phospholipase A2,1-Cys peroxiredoxin) appartient à La famille grandissante et ubiquitaire de peroxiredoxines qui sont des enzymes multifonctionelles avec une peroxidase in vitro, and in vivo participent dans beaucoup de processus cellulaires connus pour être sensible aux oxygène réactifs tels que les processus physiopathologiques incluant l'adaptation à l'oxygène, l'athérosclérose, le cancer, la différentiation cellulaire (WAGNER et al, Biochem. J. (2002) 366):777-785. Une récente étude décrit que PRDX6 est un unique antioxidant non redundant qui fonctionne indépendamment des autres peroxiredoxines et protéines antioxidantes. Très abondantes dans les cellules épithéliales, PRDX6 a été trouvée dans le 2880631 40 cytosol (Wang et al, J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 27, 25179-25190, July 4, 2003). Elle a également été trouvée dans les cellules endothéliales, uniquement dans le cytosol (Stuhlmeier et al, Eur J Biochem. 2003 Jan;270(2):334-41).
A ce jour cette protéine n'a pas été décrite avoir un rôle dans la régulation de l'angiogenèse.
GS-N22: ARNm de 5978 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 22 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession AF220037 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 1801 au nucléotide 3933. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P18, (SEQ ID No 52 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm composée de 710 acides aminés et appelée protéine motif tripartite isoform beta, TRIM9.
La protéine TRIM9 appartient à une famille caractérisée par un domaine conservé, le motif tripartite (TRIM). Le TRIM est composé de Trois domaine de liaison du zing, un RING(R), un B-box type 1(B1) et un B- box type 2 (B2) suivis par une région coiled-coil. Ces protéines partagent une fonction commune par le fait d'une homo-multimérisation, chacune d'entre elles est associée à un compartiment spécifique de la cellule, la protéine TRIM9 a été rapportée cytoplasmique (EMBO J. 2001 May 1;20(9):2140-51). Le questionnement de la banque de donnée de NCBI sur les domaines conservés montre que la protéine TRIM9 contient également un domaine fibronectine Type III, module présent à la fois dans les protéines extracellulaires et intracellulaires. Les gènes de la famille des TRIM ont été impliqués dans des processus variés, tels que le développement et la croissance cellulaire et l'oncogénèse et autres pathologies (EMBO J. 2001 May 1;20(9):2140-51; Berti et al, Mech Dev. 2002 May;113(2):159-62.). TRIM11, par exemple, jouerait un rôle 2880631 41 dans la régulation du niveau d'expression intracellulaire d'un peptide neuroprotecteur qui supprime spécifiquement la neurotoxicité liée à la maladie d'Alzheimer à travers la voie de dégradation des protéines contrôlée par les ubiquitines (Niikura et al, Eur J Neurosci. 2003 Mar; 17(6):1150-8. TRIM9 est encore mal connu, à l'heure actuelle, il a été rapporté que TRIM9 est principalement confiné dans le système nerveux central.
Son rôle n'est pas encore défini et à ce jour aucun 10 rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrit pour TRIM9.
GS-N23: ARNm de 5858 bp identifié sous le numéro SEQ ID No 23 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession 15 AF213987 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 66 au nucléotide 2213. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P19, (SEQ ID No 53 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 715 acides aminés et est appelée protéine MCEF.
La protéine MCEF a été décrite comme un nouveau membre de la famille des facteurs de transcription AF4 impliqués dans les leucémies lymphoblastiques Estable et al, J Biomed Sci. 2002 May-Jun; 9(3):234-45).
La protéine MCEF est encore très peu étudiée et à ce jour, aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrit pour cette protéine.
- GS-N24: ARNm de 3907 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 24 dans la:Liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 012318 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 298 au nucléotide 2517. Une protéine, GS-P20, (SEQ ID No 54 dans la liste de séquences en annexe), de 739 acides aminés, 2880631 42 appelée protéine transmembranaire 1 contenant un domaine leucine zipper-EF-hand (LETM1) a ainsi été identifiée.
La protéine LETM1 contient deux domaines EF-Hand , un domaine transmembranaire, un domaine leucine Zipper et plusieurs domaines coiledcoil. Sur la base de sa possible propriété de liaison du Calcium et de son implication dans la voie de signalisation du calcium, cette protéine a été suggéré être impliqué dans une maladie mentale, le syndrome de WolfHirschhorn, cette protéine étant délétée chez beaucoup de patients atteints de ce syndrome (Endele et al, Genomics. 1999 Sep 1;60(2):218-25. Une récente étude, a montré une localisation mitochondriale de cette protéine (Schlickum et ai, Genomics. 2004 Feb;83(2):254-61).
A ce jour, aucun rôle dans l'angiogenèse n'est décrit pour cette protéine.
- GS-N25: un ARNm de 7190 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 41 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 020119 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 389 au nucléotide 3097. Il a été ainsi identifié une protéine, GS-P21, (SEQ ID No 55 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 902 acides aminés et est appelée protéine antivirale zinc finger (ZAP).
La protéine ZAP est une protéine Zinc finger de type CCCH. Son rôle décrit actuellement concerne la prévention de l'infection par les rétrovirus. L'expression de cette protéine ZAP a été montrée qu'elle provoque une profonde et spécifique perte d'ARNms viraux dans le cytoplasme de la cellule sans affecter les ARNms nucléaires suggérant un rôle dans l'inhibition de la réplication virale de cellules infectées (Gao et al, Science. 2002 Sep 6;297(5587):1703-6).
2880631 43 Aucun autre rôle n'est connu à l'heure actuelle et aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrit, à ce jour, pour cette protéine.
GS-N26: ARNm de 2359 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 26 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 022777 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm, GS-N26, présente une séquence codante du nucléotide 41 au nucléotide 598. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P22, (SEQ ID No 56 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 185 acides aminés et est appelée protéine RABL5.
Le gène codant pour la protéine RABL5 a été récemment décrit (Ota et al, Nat. Genet. 36 (1), 40-45 (2004) et la protéine a été classée par ses domaines conservés comme un membre de la famille des Rab GTPAse appartenant à la superfamille de protéines de type Ras liant les GTP, qui ont émergés comme régulateurs au niveau membrane cellulaire, en particulier la formation, le transport vésiculaire et la fusion de membrane (revues: Prekeris R, Scientific World Journal. 2003 Sep 15;3:87080; Stenmark H et Olkkonen VM., Genome Biol. 2001;2(5)). Cette superfamille comprend plus de protéines hautement conservées qui sont impliquées dans de multiples voix de la signalisation intracellulaire. Elles fonctionnent comme des switches moléculaires de la transduction du signal à partir de récepteurs membranaires, en passant d'un état inactif liant le GDP à un état actif liant le GTP pouvant ainsi agir sur différentes molécules effectrices (revue: Coxon FP et Rogers MJ., Calcif Tissue Int. 2003 Jan;72(1):80-4.). Les membres de la famille Ras ont largement été impliqués dans l'oncogenèse soit par mutation soit par une surexpression de la protéine (revue: Oxford et Theodorescu, Cancer Lett. 2003 Jan 28;189(2):117- 2880631 44 28.) Une protéine Rab a déjà été décrite dans l'angiogenèse, appelée VRP (Yonekura et al, Nucleic Acids Res. 1999 Jul 1;27(13):2591-600.
Par contre, la protéine RABL5 reste encore mal connue 5 et son rôle exacte n'a pas encore été découvert, aucun rôle dans l'angiogenèse n'a été décrit à ce jour.
Cette séquence, GS-N26, présente une homologie de séquence avec les séquences GS-N27 et GS-N28 inférieure à 90%. Toutefois ces 3 séquences présentent une séquence conservée dont l'antisens, identifié dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N : 81, permet l'inhibition de l'expression.
- GS-N27: ARNm de 1782 paires de bases, identifié sous le numéro SEQ ID No 27 dans la liste de séquences en annexe.Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession BCO50531 dans la base de séquences GENBANK.
- GS-N28: ARNm de 2587 paires de bases, identifié sous le numéro SEQ ID No 28 dans la:Liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession AL157469 dans la base de séquences GENBANK.
- GS-N29: ARNm de 2520 bp identifié sous le numéro SEQ ID No 29 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession XM_211534 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N29) présente une séquence codante du nucléotide 484 au nucléotide 792. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P23, (SEQ ID No 57 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 102 acides aminés. Cette nouvelle protéine de 11 kDa (102acides aminés) ne présente aucun domaine particulier, elle est supposée extracellulaire et possède une séquence signale de sécrétion.
2880631 45 GS-N30: ARNm de 7300 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No30 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 003023 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N30), présente une séquence codante du nucléotide 262 au nucléotide 1947. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P24 (SEQ ID No 58 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 561 acides aminés et est appelée protéine 2 liant le domaine SH3 (SH3BP2).
Cette protéine a été identifiée dans le cancer de la vessie et de par sa structure, elle a été suggérée jouer un rôle dans la signalisation et pourrait être un régulateur négatif de l'oncogène abl (Bell et al, Genomics. 1997 Sep 1;44(2):163-70. Récemment, Cette protéine a été décrite comme étant une protéine adaptatrice dans des voies de signalisation en promouvant l'activité transcriptionnelle de deux facteurs de transcription NFAT/AP-1 (connus étant impliqués dans la transcription du gène de l'interleukine 2) chez les cellules T à travers l'activation des voies dépendantes de Ras et calcineurine (Foucault et al, J Biol Chem. 2003 Feb 28;278(9):7146É-53). Cette protéine a été également décrite comme régulateur positif de la phosphorylation de la tyrosine de la PLC-gamma chez les cellules basophiles conduisant à leur dégranulation (Sada et al, Blood. 2002 Sep 15;100(6):2138-44). Par ailleurs, une mutation de ce gène a été récemment décrite pouvant avoir un rôle dans une pathologie cystique multioculaire héréditaire, le Chérubisme (Ueki et al, Nat Genet. 2001 Jun, 28(2):125- 6; Lo et al, Am J Med Genet., 2003 Aug 15; 121A(1) : 37-40). A ce jour, aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrit pour cette protéine.
- GS-N31: ARNm de 1701 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 31 dans la:Liste de séquences en annexe.
2880631 46 Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession AF380162 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N31), présente une séquence codante du nucléotide 19 au nucléotide 1542. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P25, (SEQ ID No 59 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 507 acides aminés et est appelée protéine FAPP2.
Cette séquence d'ARNm (GS-N31) est homologue des 10 séquences GS- N32 et GS-N33.
- GS-N32: ARNm de 2836 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 32 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession AK023180 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 323 au nucléotide 1441. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P26, (SEQ ID No 60 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 372 acides aminés et appelée Protéine similaire à la protéine FAPP2.
Le gène codant pour la protéine FAPP2 a été identifié en 2002 par Strausberg (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903), elle est hautement similaire, par ailleurs, à une protéine NY-BR-86 décrite comme étant un antigène du cancer du sein (Scanlan et al, 2001, Cancer Immun.1, 4) . Cette protéine possède un domaine conservé de transfert de glycolipide et un domaine d'homologie de la pleckstrine. Ce domaine est partagé par un groupe de nouvelles protéines qui possèdent des spécificités de liaisons avec les dérivés phosphorylés de l'inositol. Ces protéines sont décrites comme pouvant être des protéines adaptatrices car elles ne possèdent pas de domaines catalytiques. Ces molécules peuventêtre des médiateurs clés de réponses cellulaires qui sont régulées spécifiquement par 2880631 47 le second messager (le dérivé phosphorylé de l'inositol) (Dowler et al,Biochem. J. (2000) 351, 19-31).
Le rôle exact de FAPP2 n'est pas encore connu, son rôle dans l'angiogenèse n'a pas encore été décrit à ce jour.
Cette séquence d'ARNm (GS-N32) est homologue des séquences GS-N31 et GS-N33.
- GS-N33: ARNm de 2004 paires de bases identifiée sous le numéro SEQ ID No 33 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession B0002838 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 92 au nucléotide 1414. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P27, (SEQ ID No 61 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 440acides aminés est appelée Protéine liée au potentiel de prolifération.
Cette séquence d'ARNm (GS-N33) est homologue des séquences GS-N31 et GS-N32.
GS-N34: ARNm de 1789 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 34 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession AK057491 dans la base de séquences GENBANK.
L'expression des ARNms ci-dessus identifiés est observée dans des cellules endothéliales qui forment des tubes capillaires. La Demanderesse a mis donc en évidence que l'expression différentielle du gène correspondant à chacun de ces ARNms accompagne la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales (Tableau II).
Tableau II
SÉQ.ID Inducteurs de Inhibiteurs de l'expression l'expression SEQ ID No 1 (GS-N1) TNF-a FGF2 SEQ ID No 2 (GS-N2) FGF2 IFN-y SEQ ID No 3 (GS- N3) TNF-a FGF2 SEQ ID No 4 (GS-N4) TNF-a VEGF SEQ ID No 5 (GS-N5) TNF-a VEGF 2880631 4: 8 SEQ ID No 6 (GS-N6) IFN-y VEGF SEQ ID No 7 (GS-N7) IFN- y VEGF SEQ ID No 8 (GS-N8) IFN-y VEGF SEQ ID No 9 (GS-N9) IFN-y VEGF SEQ ID No 10 (GS-N10) IFN-y VEGF SEQ ID No 11 (GS-N11) IFN-y VEGF SEQ ID No 12 (GS-N12) IFN-y VEGF SEQ ID No 13 (GS-N13) IFN-y VEGF SEQ ID No 14 (GSN14) IFN-y VEGF SEQ ID No 15 (GS-N15) IFN-y VEGF SEQ ID No 16 (GS-N16) IFN-y VEGF SEQ ID No 17 (GS-N17) TNF-a VEGF SEQ ID No 18 (GS-N18) TNF-a VEGF SEQ ID No 19 (GS-N19) TNF-a VEGF SEQ ID No 20 (GS-N20) IFN-y VEGF SEQ ID No 21 (GS-N21) IFN-y VEGF SEQ ID No 22 (GS-N22) FGF2 IFN-y SEQ ID No 23 (GS-N23) FGF2 IFN-y SEQ ID No 24 (GS-N24) VEGF IFN-y SEQ ID No 25 (GS-N25) VEGF IFN-y SEQ ID No 26 (GS-N26) VEGF Ang-2 SEQ ID No 27 (GS-N27) VEGF Ang-2 SEQ ID No 28 (GS-N28) VEGF Ang-2 SEQ ID No 29 (GS-N29) VEGF IFN-y SEQ ID No 30 (GS-N30) VEGF IFN-y SEQ ID No 31 (GS-N31) VEGF IFN-y SEQ ID No 32 (GS-N32) VEGF IFN-y SEQ ID No 33 (GS-N33) VEGF IFN-y SEQ ID No 34 (GS-N34) VEGF IFN-y Il apparaît ainsi qu'il existe une corrélation directe entre l'expression de chacun des gènes GS-N1 à GS-N34 et l'état angiogénique des cellules endothéliales.
6.2 Vérification du rôle des gènes identifiés dans la régulation de l'angiogenèse.
De plus, il a été également montré le rôle fonctionnel de ces gènes dans la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales humaines.
En effet, un oligonucléotide antisens spécifique de chacun des gènes identifiés, choisi parmi les oligonucléotides identifiés par les séquences SEQ ID No. : 62 à SEQ ID. : 86 dans la liste de séquences en annexe a été 2880631 49 introduit dans le vecteur d'expression pCI-neo Vector dans l'orientation antisens.
Les vecteurs résultants appelés GS-V1 à GS-V23 identifiés par leurs séquence SEQ ID No: 87 à SEQ ID No: 109 dans la liste de séquences en annexe ont été utilisés pour réprimer l'expression du gène codant pour cet ARNm chez les cellules endothéliales humaines suite à la transfection de ces dernières par ce vecteur.
Les cellules endothéliales humaines ont été stimulées 10 alors par des facteurs angiogéniques.
Les résultats obtenus, pour chacune des séquences illustrées ci- dessous, en utilisant les séquences antisens et les vecteurs correspondants, indiqués dans le tableau III, montrent que: - la répression de l'expression des gènes SEQ ID N. 1 à SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6 à SEQ ID No. 34 inhibe la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales; - la répression des gènes SEQ ID No. 4 et SEQ ID No. 5 stimule la formation la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales; et cela malgré la présence des différents facteurs angiogéniques.
Ces résultats sont illustrés dans les figures correspondantes 1 à 5 en annexe.
TABLEAU III
NOM Gènes SÉQ.ID Protéine SEQ. Séquences antisens Vecteur avec Fig Fig ID l'antisens inseré contrôle 1 SEQ ID No 1 SEQ ID No 35 SEQ ID No 62 SEQ ID No 87 (GS-V1) lA 1F (GS-N1) (GS-P1) (442 paires de bases) 2 SEQ ID No 2 (1330 SEQ ID No 63 SEQ ID No 88 (GS-V2) 1B 1F (GS-N2) paires de bases) 3 SEQ ID No 3 SEQ ID No 36 (278 SEQ ID No 64 SEQ ID No 89 (GS-V3) 1C 1F (GS-N3) paires de bases) (GS-P2) NUP188 4 SEQ ID No 4 SEQ ID No 37 (379 SEQ ID No 65,. r,. No.. , , (GS-N4) (GS-P3) paires de bases) SEQ ID No '" V- 1L.L...
SEQ ID No 5 SEQ ID No 38 (379 SEQ ID No 65 SEQ ID No 90 (GS-V4) 1D 1F (GS-N5) (GS-P4) paires de bases) 6 SEQ ID No 6 SEQ ID No 39 (146 SEQ ID No 66 SEQ ID No 91 (GS-V5) lE 1F (GS-N6) paires de bases) (GS-P5) 7 SEQ ID No 7 SEQ ID No 40 (146 SEQ ID No 66 SEQ ID No 91 (GS-V5) lE 1F (GS- N7) paires de bases) (GS-P6) Lamin A precursor 8 SEQ ID No 8 SEQ ID No 41 (128 SEQ ID No 67 SEQ ID No 91 (GS-V5) lE 1F (GS-N8) (GS-P7) paires de bases)
SAB
9 SEQ ID No 9 - (128 SEQ ID No 67 SEQ ID No 91 (GS-V5) lE 1F (GS- N9) paires de bases) NOM Gènes SÉQ.ID Protéine SEQ. Séquences antisens Vecteur avec Fig Fig ID l'antisens inseré contrôle SEQ ID No 10 - (128 SEQ ID No 67 SEQ ID No 91 (GS-V5) 1E 1F (GS-N10) paires de bases) 11 SEQ ID No 11 (128 SEQ ID No 67 SEQ ID No 91 (GS-V5) lE 1F (GS-N11) paires de bases) 12 SEQ ID No 12 SEQ ID No 42 (1162 SEQ ID No 68 SEQ ID No 92 (GS-V6) 2A 2F (GS-N12) (GS-P8) paires de bases) HECTD1 13 SEQ ID No 13 SEQ ID No 43 (1052 SEQ ID No 69 SEQ ID No 93 (GS-V7) 2B 2F (GS-N13) (GS- P9) paires de bases) _ 14 SEQ ID No 14 SEQ ID No 44 (381 SEQ ID No 70 SEQ ID No 94 (GS-V8) 2C 2F (GS-N14) (GS-P10) paires de bases) Amigo2 SEQ ID No 15 SE4GSI No (314 SEQ ID No 71 SEQ ID No 95 (GS-V9) 2D 2F (GS-N15) DP11)45 bases) m,,v,,n 1. L V paires de 16 SEQ ID No 16 SEQGSDPi2)46 (265 SEQ ID No 72 SEQ ID No 96 (GS- 2E 2F (GS-N16) CDK5RAP1 paires de bases) V10) 17 SEQ ID No 17 SEQ(GSI No (577 SEQ ID No 73 SEQ ID No 97 (GS- 3A 3F (GS-N17) DP13)47 paires de bases) V11) 18 SEQ ID No 18 SEQ(GSI No (352 SEQ ID No 74 SEQ ID No 98 (GS- 3B 3F (GS-N18) DP14)48 paires de bases) V12) 19 SEQ ID No 19 SEQ(GSI No (352 SEQ ID No 74 SEQ ID No 98 (GS- 3B 3F (GS-N19) DP15 49 paires de bases) ) V12) SEQ ID No 20 SEQ ID No 50 ID No 75 SEQ ID No 99 (GS- 3C 3F (GS-N20) (GS-P16) (360 paires de bases) IFI44) V13) NOM Gènes SÉQ.ID I Protéine SEQ. Séquences antisens Vecteur avec Fig Fig ID l'antisens inseré contrôle 21 SEQ ID No 21 SEQ ID No 51 SEQ ID No 76 SEQ ID No 100 (GS- 3D 6F (GS-N21) bases) V14) (GS-P17) PRDX6 (601 paires de 22 SEQ ID No 22 SEQ ID No 52 (248 SEQ ID No 77 SEQ ID No 101 (GS- 3E 6F (GS-N22) paires de bases) (GS-P18) V15) TRIM9 23 SEQ ID No 23 SEQ ID No 53 (499 SEQ ID No 78 SEQ ID No 102 (GS- 4A 4F (GS-N23) paires de bases) V16) (GS-P19)
MCEF
24 SEQ ID No 24 SEQ ID No 54 (415 SEQ ID No 79 SEQ ID No 103 (GS- 4B 4F (GS-N24) paires de bases) V17) (GS-P20) LETM1 SEQ ID No 25 SEQ ID No 55 (183 SEQ ID No 80 SEQ ID No 104 (GS- 4C 4F (GS-N25) paires de bases) V18) GS-P21 ( ,nD) (ZA 26 SEQ ID No 26 SEQ ID No 56 (208 SEQ ID No 81 SEQ ID No 105 (GS- 4D 4F (GS-N26) paires de bases) V19) (GRABL5) 27 SEQ ID No 27 (208 SEQ ID No 81 SEQ ID No 105(GS- 4D 4F (GS-N27) paires de bases) V19) 28 SEQ ID No 28 - (208 SEQ ID No 81 SEQ ID No 105 (GS- 4D 4F (GS-N28) paires de bases) V19) 29 SEQ ID No 29 SEQ ID No 57 (580 SEQ ID No 82 SEQ ID No 106(GS- 4E 4F (GS-N29) paires de bases) (GS-P23) V20) SEQ ID No 30 SEQ ID No 58 (302 SEQ ID No 83 SEQ ID No 107(GS- SA 5D (GS-N30) paires de bases) (GS-P24) (SH3BP2) V21) 31 SEQ ID No 31 SEQ ID No 59 (311 SEQ ID No 84 SEQ ID No 108 (GS- 5B 5D (GS-N31) paires de bases) V22) (GS- P25) FAPP2 NOM Gènes SÉQ.ID Protéine SEQ. Séquences antisens Vecteur avec Fig Fig ID l'antisens inseré contrôle 32 SEQ ID No 32 SEQ ID No 60 SEQ ID No 84 SEQ ID No 108 (GS- 5B 5D (GS-N32) (GS-P26) bases) V22) Similaire FAPP2 (311 paires de 33 SEQ ID No 33 SEQGSDP27)61 (311 SEQ ID No 84 SEQ ID No 108 (GS- 5B 5D (GS-N33) FAPP2 paires de bases) V22) 34 SEQ ID No 34 - (438 SEQ ID No 85 SEQ ID No 109 (GS- 5C 5D (GS-N34) paires de bases) V23) _a (321 SEQ ID No 86 SEQ ID No 91 (GS-V5) lE 3EF paires de bases) 54 2880631
Claims (25)
1. Molécule d'acide nucléique isolée, naturelle ou recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle consiste en i) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19, 27 à 29 et 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; ii) une séquence antisens de l'une des séquences de i), identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID 62, 63, 65, 67, 69, 73, 74, 81, 82 et 85 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; iii) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente.
2. Polypeptide ou fragment dudit polypeptide, naturel ou recombinant, isolé, caractérisé en ce qu'il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend ou qu'il consiste en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 37, 38, 43, 47, 48, 49 ou 57.
4. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend i) une molécule d'acide nucléique selon la revendication 1; ii) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle consiste en 2880631 55 a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 3, 6, 7, 8, 12, 14 à 16, 20 à 26 et 30 à 33 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; b) une séquence antisens de l'une des séquences de a), identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 64, 66, 67, 68, 70 à 72, 75 à 81 et 84 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; c) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente.
5. Anticorps, caractérisé en ce qu'il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34, ou un fragment desdites séquences, particulièrement codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29 ou un fragment desdites séquences, ou ayant une affinité pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 35 à 61, ou un fragment desdites séquences, particulièrement pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 37, 38, 43, 47, 48, 49 ou 57 ou un fragment desdites séquences.
56 2880631
6. Cellule génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène impliqué dans l'angiogenèse choisi parmi les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 34, particulièrement les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. n 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19, 27 à 29 et 34.
7. A titre de médicament une molécule d'acide nucléique selon la revendication 1, un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, un vecteur d'expression selon la revendication 4, un anticorps selon la revendication 5, une cellule génétiquement modifiée selon la revendication 6.
8. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent actif au moins une substance choisie parmi: i) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle correspond à a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; b) une séquence antisens de l'une des séquences de a), identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 64, 66, 67, 68, 70 à 72, 75 à 81 et 84, ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; c) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ii) un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par 2880631 57 une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34 ou qu'il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35 à 61 ou un fragment desdits polypeptides; iii) un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de la présente revendication; iv) un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35 à 61 ou pour l'une des séquences codées par les séquence en acide nucléiques identifiées dans la liste de séquence fournie en annexe sous les n SEQ ID N 2, 9 à 11, 27, 28 et 34; v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 34.
9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, destinée au diagnostic, pronostic et/ou au traitement de pathologies liées à l'angiogenèse.
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce que la pathologies liées à l'angiogenèse est choisie parmi les cancers, particulièrement au travers de la vascularisation et/ou de la proliférations des tumeurs, les rétinopathies, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, l'athérosclérose, l'hyperstimulation de l'ovaire, le psoriasis, l'endométrie associée à la néovascularisation, la resténose due à l'angioplastie du 2880631 58 ballon, la superproduction tissulaire due à la cicatrisation, la maladie vasculaire périphérique, l'hypertension, l'inflammation vasculaire, la maladie et les phénomènes de Raynaud, l'anévrisme, la resténose artérielle, la thrombophlébite, la lymphagyte, le lymphodème, la cicatrisation et la réparation tissulaire, l'ischémie, l'angine, l'infarctus de myocarde, la maladie chronique du coeur, les insuffisances cardiaques telles que l'insuffisance cardiaque congestive, la dégénération maculaire liée à l'âge et l'ostéoporose.
11. Utilisation dans la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber l'angiogenèse, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif inhibiteur de l'angiogenèse choisi parmi: i. une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle correspond à a. une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 4 ou 5 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; b. une séquence antisens des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 1 à 3, 6 à 34, séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID rn 62 à 64 ou 66 à 85 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; c. ou la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le n SEQ ID N 86 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; ii. un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique identifiée dans la liste 2880631 59 de séquences fournie en annexe sous le numéros SEQ ID n 4 ou 5 ou qu'il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides; iii. un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de la présente revendication; iv. un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour l'une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides; v. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle surexprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4 ou 5 ou qu'elle sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 6 à 34.
12. Utilisation dans la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à activer l'angiogenèse, caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif activateur de l'angiogenèse choisi parmi: i. une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle correspond àune des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 3 ou 5 à 34 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; ii. la séquence antisens de la séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 4 ou 5, séquence identifiée dans la liste de séquences fournie en 2880631 60 annexe sous le numéro SEQ ID n 65, ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; iii. au moins un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéros SEQ ID n 1 à 3 ou 4 à 34 ou qu'il comprend ou consiste en un des polypeptides identifiés dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéro SEQ ID n 35, 36, 38 à 61 ou un fragment desdits polypeptides; iv. un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de la présente revendication; v. un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour l'une des séquences polypeptidiques, identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 36, 38 à 61 ou un fragment desdits polypeptides,; vi. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 5 à 34 ou qu'elle sous-exprime un gène ou sous-exprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4.
13. Séquence d'acides nucléiques (sous forme d'ADN ou d'ARN), comprenant ou consistant en au moins 10 mers d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences identifiées par les numéros SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 34 dans la liste de séquences en annexe, ou complémentaire ou antisens d'une telle séquence.
14. ARN inhibiteurs (ARNi) comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique sous forme d'ARN, d'au moins 10 mers, complémentaire d'un ARNm correspondant à l'une des 2880631 61 séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34.
15. Utilisation non thérapeutique d'un ARN d'au moins 10 mers, comprenant ou consistant en un ARN complémentaire d'une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe comme ARN inhibiteur.
16. Utilisation d'un ARN d'au moins 10 mers, comprenant ou consistant en un ARN complémentaire d'une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No: 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe dans la préparation d'une composition destinée à inhiber l'expression des ARNs.
17. Méthode de vérification de l'efficacité thérapeutique d'un traitement angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, caractérisée en ce qu'elle comporte l'identification in vitro dans une population cellulaire dudit mammifère, de la surexpression ou de la sousexpression d'au moins un gène impliqué dans un désordre angiogénique identifié par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34.
18. Méthode de vérification de l'efficacité thérapeutique selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes: - la détection de l'expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère auquel est administrée une composition thérapeutique destinée à traiter un désordre angiogénique, d'au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34; - la détection de l'expression ladite séquence 2880631 62 nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l'état angiogénique est connu, l'identification d'une éventuelle différence du niveau d'expression de ladite séquence par les deux populations cellulaires.
19. Méthode de vérification selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisée en ce que la détection de l'expression de ladite séquence est effectuée après avoir mis la population cellulaire en présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
20. Méthode de criblage de composés utiles pour le traitement d'un désordre angiogénique d'un mammifère, notamment d'un être humain, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes: a) la détection de l'expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère mise en présence d'un composé susceptible d'avoir un effet thérapeutique sur un désordre angiogénique, d'au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34, b) la détection de l'expression de la même séquence nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l'état angiogénique est connu, c) l'identification des différences éventuelles du niveau d'expression de(s) celle(s) même(s) séquences nucléotidiques par les deux populations cellulaires.
21. Méthode de criblage selon la revendication 20, caractérisée en ce que la détection de l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules en présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
22. Dispositif comprenant un support comprenant une ou plusieurs sondes spécifiques d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de 2880631 63 séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34, pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage selon les revendications 20 ou 21.
23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que la sonde est spécifique d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29,ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences.
24. Trousse destinée à la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant un dispositif selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, des amorces spécifiques et les accessoires nécessaires à l'amplification des séquences extraites d'un échantillon, leur hybridation avec les sondes du dispositif et la réalisation des mesures de l'affichage différentiel.
25. Trousse selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une lignée stable de cellules génétiquement modifiées, selon la revendication 6, en tant que population cellulaire de référence.
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