WO2006075084A2 - Genes impliques dans la regulation de l'angiogenese, preparations pharmaceutiques les contenant et leurs applications - Google Patents

Genes impliques dans la regulation de l'angiogenese, preparations pharmaceutiques les contenant et leurs applications Download PDF

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Salman Al-Mahmood
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Definitions

  • the present invention belongs to the field of pharmaceutical compositions useful for the treatment of pathologies resulting from deregulation of the mechanism of angiogenesis.
  • the present invention also relates to the polypeptide sequences of the factors encoded by said genes which find their application in the clinical study of the process of angiogenesis, the prognosis, the diagnosis and the treatment of pathologies related to this process as well as in the implementation of pharmacological, pharmacogenomic or pharmacosignalitic tests.
  • Angiogenesis is a fundamental process by which new blood vessels are formed. This process is essential in many normal physiological phenomena such as reproduction, development or healing. In these normal biological phenomena, angiogenesis is under strict control, i.e. it is triggered for a short period, a few days, and then completely inhibited.
  • Arthritis for example, is a condition caused by cartilage damage by invasive neovessels. In diabetic retinopathy, invasion of the retina by neovessels leads to the blindness of patients; the neovascularization of the ocular apparatus presents the major cause of blindness and this neovascularization dominates about twenty diseases of the eye.
  • tumor growth and metastasis are directly related to neovascularization and are dependent on angiogenesis.
  • the tumor stimulates the growth of neovessels for its growth itself.
  • these neovessels present tumor escape routes to join the bloodstream and cause metastases in distant sites such as the liver, lung or bone.
  • angiogenesis may present an important therapeutic basis. Indeed, the promotion of angiogenesis in damaged areas can lead to the formation of lateral and alternative blood vessels to damaged vessels thus providing blood and therefore oxygen and other nutritive and biological factors necessary for survival. affected tissues.
  • neovessels by endothelial cells involves the migration, growth, and differentiation of endothelial cells.
  • the regulation of these biological phenomena is directly related to gene expression.
  • angiogenesis an ever increasing number of studies show that the regulation of angiogenesis is done through an equilibrium between factors acting directly on the endothelial cell. These factors can be stimulating, on the one hand, such as, among others, VEGF, FGFs, IL-8, HGF / SF, PDGF. They can also be inhibiting, as, among others, I 1 IL-10, IL-12, gro- ⁇ and ⁇ , platelet factor 4, angiostatin, the human chondrocyte - derived inhibitor, thrombospondin, the leukemia inhibitory factor.
  • control of angiogenesis therefore represents a strategic axis, at the same time of fundamental research, in order to improve our understanding of the numerous pathological phenomena related to the angiogenesis, but also a base for the development of the new therapies intended to treat the angiogenesis. pathologies related to angiogenesis.
  • a method for identifying novel genes involved in the regulation of angiogenesis has been developed. It has been the subject of a French patent application published under No. FR 2798674 and of an international patent application PCT published under No. WO 01/218312. This method has the particularity of faithfully translating the intimate mechanism regulating angiogenesis by taking into account all the extracellular factors described as agents. angiogenesis regulators, i.e. angiogenic factors, angiostatic factors, as well as the various components of the extracellular matrix. This methodology consists of implementing these different extracellular factors through four well-defined experimental conditions.
  • the endothelial cells are cultured on a component and / or a well-defined mixture of several components of the extracellular matrix and placed under the four experimental conditions, namely: a control condition where the endothelial cells are not stimulated; an angiogenic condition where the endothelial cells are stimulated by one or more angiogenic factors; a condition for inhibiting angiogenesis wherein the endothelial cells are stimulated by one or more angiogenic factors and brought into the presence of one or more angiostatic factors; and another control condition where the endothelial cells are stimulated by one or more angiostatic factors.
  • angiogenesis including positive regulators and negative regulators.
  • the method described above allows the systematic screening of all the angiogenic and angiostatic factors as well as the different components of the extracellular matrix in order to highlight and identify genes encoding cellular constituents involved in the regulation of angiogenesis.
  • gene expression can be analyzed throughout the kinetics of neovessel formation by endothelial cells, this approach provides an in vitro methodology for linking gene expression to biological functional parameters of the endothelial cells. angiogenesis.
  • the invention relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it comprises or consists of i) one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1, 2 , 4, 5, 9 to 11, 13, 17 to 19, 27 to 29 and 34 or its complement or a fragment of said sequences or an equivalent sequence; ii) an antisense sequence of one of the sequences of i), identified in the sequence listing provided in the annex under the numbers SEQ ID 62, 63, 65, 67, 69, 73, 74, 81, 82 and 85 or its complementary or a fragment of said sequences or an equivalent sequence; (iii) the antisense sequence identified in the sequence listing provided in the Annex under the number SEQ ID No. 86 or its complement or a fragment of said sequence or an equivalent sequence.
  • nucleotide sequences having one or more structural modifications, minor (s), not modifying their function should be considered as sequences equivalent to the sequences described above (see (s) the deletion, mutation or addition of bases, the identity of which is at least 90% with the nucleotide sequences identified as SEQ ID Nos. 1 to 34 in the attached sequence listing.
  • fragment is intended to mean a sequence of the 1Orner type, preferably of the 15-mer type and particularly preferably of the 2Orner type.
  • the invention relates to a polypeptide or fragment of said polypeptide, characterized in that it is encoded by one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1, 4, 5. , 13, 17, 18, 19 and 29.
  • said polypeptide comprises or consists of one of the polypeptide sequences identified in the sequence listing provided in the annex under the numbers SEQ ID No. 35,
  • the subject of the invention is an expression vector, characterized in that it comprises: i) a nucleic acid molecule as described previously; ii) a nucleic acid molecule characterized in that it comprises or consists of a) one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No.
  • said vector is chosen from the group of vectors GS-VI to GS-V23, identified by their sequence, bearing the numbers SEQ ID No. 87 to SEQ ID No. 109 in the attached sequence listing.
  • Said vectors can be constructed by any method known to those skilled in the art.
  • constructs are useful on the one hand for preparing therapeutic compositions for the treatment, by cell therapy, of angiogenic disorders and other on the other hand to verify the efficacy of a treatment of an angiogenic disorder in a mammal, in particular in a human being, or else to verify the functionality of the genes possibly involved in the mechanism of angiogenesis, in said mammal.
  • the invention relates to an antibody characterized in that it has an affinity for one of the polypeptide sequences encoded by one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1 to 34, or a fragment of said sequences, particularly coded by one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 and 29 or a fragment thereof.
  • sequences or having an affinity for a polypeptide comprising or consisting of one of the polypeptide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix as SEQ ID NO : 35 to 61, or a fragment thereof, particularly for a polypeptide comprising or consisting of in one of the polypeptide sequences identified in the sequence listing provided in the annex under the numbers SEQ ID No. 35, 37, 38 , 43, 47, 48, 49 or 57 or a fragment of said sequences.
  • Said antibodies can be obtained by any method of immunization in vivo or in vitro, of an animal, in particular a vertebrate and preferably a mammal with any of the polypeptide sequences according to the invention, or the one of their fragments preserving the immunogenicity of the total protein.
  • the antibodies may be polyclonal or monoclonal antibodies. (Kohler G. and Milstein C. Nature 1975 Aug 7; 256 (5517): 495-7.)
  • the invention relates to a genetically modified cell, characterized in that it over-expresses or under-expresses at least one gene involved in the angiogenesis chosen from the genes identified in the sequence listing. appended under the numbers SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 34, particularly the genes identified in the attached sequence listing under the numbers SEQ ID No. 1, 2, 4, 5, 9 to 11, 13, 17 to 19, 27 to 29 and 34.
  • the genetically modified cells may be constructed by any method known to those skilled in the art. In particular, they can be constructed by the method described in the patent application WO 03/074073 and which comprises:
  • step (b) culturing the cells obtained in step (a) in the presence of said antibiotic
  • the invention relates to the drug use of a nucleic acid molecule, a polypeptide, an expression vector, an antibody, or a genetically modified cell as previously described.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active agent at least one substance selected from: i) a nucleic acid molecule characterized in that it comprises or that it corresponds to a) one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided appended under the numbers SEQ ID No. 1 to 34 or its complement or a fragment of said sequences or an equivalent sequence; b) an antisense sequence of one of the sequences of a), identified in the sequence listing provided as SEQ ID Nos. 64, 66, 67, 68, 70 to 72, 75 to 81 and 84, or its complementary or a fragment of said sequences or an equivalent sequence; (c) the antisense sequence identified in the sequence list provided in the Annex under the number
  • SEQ ID No. 86 or its complementary or a fragment of said sequence or an equivalent sequence.
  • a polypeptide characterized in that it is encoded by one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1 to 34 or that it comprises or consists of a polypeptide identified in the list sequence provided in the annex under the numbers SEQ
  • an expression vector characterized in that it comprises a nucleic acid molecule according to i) of the present claim; iv) an antibody characterized in that it has an affinity for one of the polypeptide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID Nos. 35 to 61 or for one of the sequences encoded by the nucleic acid sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID NO : 2, 9-11, 27, 28 and 34; v) a genetically modified cell characterized in that it over-expresses or under-expresses at least one gene chosen from those identified in the attached sequence listing under the numbers SEQ ID No. l to 34.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be intended for the diagnosis, prognosis and / or treatment of pathologies linked to I 1 angiogenesis.
  • the pharmaceutical composition may be intended for the treatment of pathologies related to angiogenesis chosen from: cancers, particularly through vascularization and / or proliferation of tumors, retinopathies, rheumatoid arthritis, Crohn 's disease, atherosclerosis, hyperstimulation of the ovary, psoriasis, endometrium associated with neovascularization, restenosis due to balloon angioplasty, tissue superproduction due to cicatrization , peripheral vascular disease, hypertension, vascular inflammation, Raynaud 's disease and phenomena, aneurysm, arterial restenosis, thrombophlebitis, lymphagyte, lymphodema, scarring and tissue repair, ischemia , angina, myocardial infarction, chronic heart disease, heart failure such as insufficiency congestive heart failure, age - related macular degeneration and osteoporosis.
  • angiogenesis chosen from: cancers, particularly through vascularization and / or proliferation of tumor
  • the invention relates to the use in the preparation of a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, characterized in that it comprises an active agent angiogenesis inhibitor selected from: i. a nucleic acid molecule characterized in that it comprises or that it corresponds to a. a nucleotide sequence identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 4 or 5 or a fragment of said sequence or an equivalent sequence; b. an antisense sequence of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the number SEQ
  • an expression vector characterized in that it comprises a nucleic acid molecule according to i) of the present claim; iv. an antibody characterized in that it has an affinity for one of the polypeptide sequences identified in the sequence listing provided in the annex under the numbers SEQ ID No. 37 or 38 or a fragment of said polypeptides; v. a genetically modified cell characterized in that it overexpresses at least the gene identified in the attached sequence listing under the number SEQ ID No. 4 or 5 or that it sub-expresses at least one gene selected from those identified in the attached sequence list under the numbers SEQ ID No. 1 to 3 and 6 to 34.
  • the subject of the invention is the use in the preparation of a pharmaceutical composition intended to activate angiogenesis, characterized in that it comprises an activating active agent for angiogenesis chosen from: i) a nucleic acid molecule characterized in that it comprises or that it corresponds to a) one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1 to 3 or 6 to 34 or a fragment of said sequence or an equivalent sequence; b) the antisense sequence of one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the annex under the number SEQ ID No. 4 or 5, sequence identified in the sequence listing provided in the appendix under the number SEQ ID No.
  • an activating active agent for angiogenesis chosen from: i) a nucleic acid molecule characterized in that it comprises or that it corresponds to a) one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1 to 3 or 6 to 34 or
  • polypeptide 65 or a fragment of said sequence or an equivalent sequence; ii) at least one polypeptide characterized in that it is encoded by one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the number SEQ ID No. 1 to 3 or 6 to 34 or that it comprises or consists of one of the polypeptides identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No.
  • an expression vector characterized in that it comprises a nucleic acid molecule according to i) of the present claim; iv) an antibody characterized in that it has an affinity for the polypeptide sequence identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 35, 36, 39 to 61 or a fragment of said polypeptides; v) a genetically modified cell characterized in that it overexpresses at least one gene chosen from those identified in the attached sequence listing under the numbers SEQ ID No. 1 to 3 and 6 to 34 or that it sub- expresses a gene or sub-expresses at least the gene identified in the attached sequence listing under the number SEQ ID No. 4 or 5.
  • nucleic acid sequence in the form of DNA or RNA
  • nucleotide sequence chosen from the sequences identified by the numbers SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 34 in the sequence listing in the appendix, or complementary to such a sequence, preferably at least 15 seas.
  • the subject of the invention is the sequences having an identity of at least 85%, preferably 95% and particularly preferably 100% with a sequence chosen from the sequences identified under the numbers SEQ ID No. 62 to SEQ ID No. 86 in the attached sequence listing.
  • the invention relates to RNAi (RNA interference) and more specifically to a siRNA (small interfering RNA) comprising or consisting of a double - stranded nucleotide sequence in the form of RNA, of at least 10 mers, complementary to a corresponding mRNA. at one of nucleotide sequences identified as SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34.
  • the subject of the invention is the use of such an siRNA of at least 10 mers, preferably at least 15 mers comprising or consisting of an RNA complementary to one of the nucleotide sequences identified under the numbers SEQ ID No. : 1 to SEQ ID No: 34 in the attached sequence listing for the preparation of a medicament for the treatment of pathological conditions related to angiogenesis.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing an angiogenic pathology in a mammal, in particular in a human being, of detecting in the cells of said mammal the overexpression or the under-expression of one or more nucleotide sequences identified by the numbers SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 34 in the attached sequence listing.
  • Such a diagnostic method comprises the following steps: the detection of the expression of one or more of said nucleotide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 34, by a cell population of a mammal,
  • the present invention also relates to a method for diagnosis and prognosis of an angiogenic pathology in a mammal, in particular in a human being, of detecting in the cells of said mammal the overexpression or the under-expression of one or more identified polypeptide sequences. by the numbers SEQ ID No. : 35 to SEQ ID NO. : 61 in the sequence list in Annex .
  • said method comprises the following steps: a) the detection of the expression of one or more of said polypeptide sequences SEQ ID No. : 35 to SEQ ID
  • the detection of the expression of the sequences is carried out after putting the endothelial cells in the presence of a biological fluid from a patient.
  • the present invention also relates to a method for verifying the therapeutic efficacy of an angiogenic treatment in a mammal, in particular in a human being, characterized in that it comprises the identification
  • Such a method for verifying the therapeutic efficacy comprises the following steps: the detection of the expression by an isolated cell population of a mammal to which a therapeutic composition for treating an angiogenic disorder is administered, of at least one of the nucleotide sequences identified in the list sequences provided in the annex under the number SEQ ID N 0 1 to SEQ ID N 0 34; detecting the expression of said nucleotide sequence by a reference cell population whose angiogenic state is known, the identification of a possible difference in the level of expression of said sequence by the two cell populations.
  • the verification method is carried out on a cell population of a mammal in vivo, ex-vivo, or on an isolated cell population of said mammal in vitro.
  • the detection of the expression of the sequences is carried out after putting the cells, particularly the endothelial cells, in the presence of a biological fluid resulting from a patient.
  • the present invention also relates to a method for screening compounds useful for the angiogenic treatment of a mammal, in particular a human being.
  • such a screening method comprises the following steps: a) the detection of expression by an isolated cell population of a mammal placed in the presence of a compound likely to have a therapeutic effect on an angiogenic disorder, at least one of the nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID N 0 1 to SEQ ID No. 34, b) the detection of the expression of the same nucleotide sequence by a reference cell population whose angiogenic state is known, c) the identification of any differences in the level of expression of the same nucleotide sequence (s) by the two cell populations.
  • such a screening method also comprises the following steps: the detection of the expression of one or more of said polypeptide sequences identified by the numbers SEQ ID No. : 35 to SEQ ID No. 61 in the attached sequence listing by a cell population placed in the presence of a compound likely to have a therapeutic effect on an angiogenic disorder,
  • the detection of the expression of the sequences is carried out after putting the cells, particularly the endothelial cells, in the presence of a biological fluid originating from a patient. .
  • cancers particularly through the vascularization and / or proliferation of tumors, retinopathies, rheumatoid arthritis, Crohn 's disease, atherosclerosis, hyperstimulation of the ovary, psoriasis, endometrium associated with neovascularization, restenosis due to angioplasty of the balloon, tissue superproduction due to scarring, peripheral vascular disease , hypertension, vascular inflammation, Raynaud 's disease and phenomena, aneurysm, arterial restenosis, thrombophlebitis, lymphagyte, lymphodema, scarring and tissue repair, ischemia, angina, myocardial infarction, chronic heart disease, heart failure such as congestive heart failure, age - related macular degeneration and osteoporosis.
  • the subject of the invention is also a device comprising a support comprising one or more probes specific for one or more nucleotide sequences identified under the numbers SEQ ID No: 1 to SEQ ID No: 34 in the attached sequence listing for the setting implementation of the screening method of the invention, particularly one or more nucleotide sequences identified in the sequence listing provided in the appendix under the numbers SEQ ID No. 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 and 29, or its complement or a fragment of said sequences.
  • probe is understood to mean any fragment of single-stranded DNA whose sequence is complementary to a desired sequence: this fragment may, for example, be detected by hybridization with a labeled probe (for example by incorporation of radioactive atoms or fluorescent groups), which plays the role of a molecular "hook”.
  • the support of said device is selected from a glass membrane, a metal membrane, a polymer membrane, a silica membrane.
  • Such devices are, for example, DNA chips comprising one or more nucleotide sequences identified under the numbers SEQ ID No: 1 to SEQ ID No: 34 in the attached sequence listing.
  • the invention also relates to a kit intended for measuring the differential display of genes involved in angiogenic disorders comprising a device as previously described, specific primers and the accessories necessary for the amplification of the sequences extracted from a sample, their hybridization with the probes of the device and the performing the differential display measurements.
  • the invention also relates to a kit for the measurement of the differential display of genes involved in angiogenic disorders comprising a genetically modified cell line stably expressing the vector expressing at least one of the nucleotide sequences identified under the numbers SEQ. ID No: 1 to SEQ ID No: 34 in the attached sequence listing, or one of their fragments as a reference cell population and the means necessary for measuring said differential display.
  • the invention also relates to a kit for measuring the differential display of genes involved in angiogenic disorders comprising a genetically modified cell line stably expressing the vector expressing at least one antisense sequence of one of the nucleotide sequences. identified as SEQ ID No: 1 to SEQ ID No: 34 in the attached sequence listing, or a fragment thereof, as the reference cell population and the means necessary for measuring said differential display.
  • Figure 1 shows that the expression of GS-V1, GS-V2, GS-V3 and GS-V5 in human endothelial cells inhibit capillary tube formation and expression of GS-V4 in human endothelial cells stimulates formation of capillary tubes: IA-transfected endothelial cells) GS-V1 encoding the antisense transcript specific for GS-N1; IB) GS-V2 encoding the specific antisense transcript of GS-N2; IC) GS-V3 encoding the GS-N3 specific antisense transcript; ID) GS-V4 encoding the specific antisense transcript of GS-N4 and its counterpart GS-N5; IE) GS-V5 encoding the GS-N6 specific antisense transcript and its GS-N7 counterpart, and the GS-N8 specific antisense transcript and its GS-N9, GS-N10 and GS-NII counterparts; IF) the empty vector (Control).
  • Figure 2 shows that the expression of GS-V6 / GS-V7, GS-V8, GS-V9 and GS-V10 in human endothelial cells inhibits the formation of capillary tubes: endothelial cells transfected with 2A) GS-V6 coding for the specific antisense transcript of GS-N12; 2B) GS-V7 encoding the specific antisense transcript of GS-N13; 2C) GS-V8 encoding the specific antisense transcript of GS-N14; 2D) GS-V9 encoding the specific antisense transcript of GS-N15; 2E) GS-VlO encoding the antisense transcript specific for GS-16; 2F) the empty vector (Control).
  • Figure 3 shows that the expression of GS-VI1, GS-V12, GS-V13, GS-V14, GS-V15, in human endothelial cells inhibits the formation of capillary tubes: endothelial cells transfected with 3A) GS-VII encoding the specific antisense transcript of GS-N17; 3B) GS-V12 encoding the antisense transcript specific for GS-N18 and its counterpart GS-N19; 3C) GS-V13 encoding the antisense transcript specific for GS-N20; 3D) GS-V14 coding for the antisense transcript specific for GS-N21; 3E) GS-V15 encoding the specific antisense transcript of GS-N22; 3F) the empty vector (Control).
  • Figure 4 shows that the expression of GS-V16, GS-V17, GS-V18, GS-V19, GS-V20 in human endothelial cells inhibits the formation of capillary tubes: endothelial cells transfected with 4A) GS-V16 coding for the antisense transcript specific for GS-N23; 4B) GS-V17 encoding the specific antisense transcript of GS-N24; 4C) GS-V18 encoding the GS-N25 specific antisense transcript; 4D) GS-V19 encoding the specific antisense transcript of GS-N26 and its counterparts GS-N27 and GS-N28; 4E) GS-V20 encoding the specific antisense transcript of GS-N29 and 4F) the empty vector (Control).
  • Figure 5 shows that the expression of GS-V21, GS-V22,
  • GS-V23 in human endothelial cells inhibits capillary tube formation: endothelial cells transfected with 5A) GS-V21 encoding GS-N30 specific antisense transcript; 5B) GS-V22 coding for the antisense transcript specific for GS-N31, and its counterparts
  • Umbilical vein endothelial cells under said four culture conditions are then used to identify the genes encoding the cellular constituents involved in the regulation of angiogenesis.
  • the endothelial cells are maintained in complete medium (EGM-2 from Clonetics).
  • FGF2 at concentrations of between 5 ng / ml and 60 ng / ml, preferably between 10 and 40 ng / ml
  • VEGF at concentrations of between 10 ng / ml and 60 ng / ml, preferably between 30 ng / ml and 50 ng / ml
  • PF4 at concentrations between 0, 1 and 5 ⁇ g / ml, preferably between 0.5 ⁇ g / ml and 1 ⁇ g / ml
  • TNF- ⁇ at concentrations of between 20 ng / ml and 100 ng / ml, preferably between 30 ng / ml and 60 ng / ml
  • IFN- ⁇ at concentrations of between 50 ng / ml and 200 ng / ml, preferably between 80 ng / ml and 120 ng / ml
  • Ang-2 at concentrations of between 20 ng / ml and 800 ng /
  • VEGF vascular endothelial growth factor.
  • FGF2 Basic growth factor of the fibroblast.
  • PF4 Platelet factor 4.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • the gene expressions can then be compared using DNA chips, SAGE, a quantitative PCR amplification reaction, viral vectors to construct subtractive libraries, or differential display analysis.
  • HUVEC grown on a collagen gel in the presence of the various factors used, according to the RNeasy Mini kit method (Qiagen) by integrating a DNase I digestion step according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • the differential display from the total RNAs is carried out according to the method described by Liang and Pardee (1992, Science, 14; 257 (5072): 967-7) using the ⁇ P 33 -ATP in isotopic dilution in the course of time. PCR amplification for band visualization by autoradiography of electrophoresis gels.
  • DNA fragments differentially present on the gel as a function of the culture conditions analyzed are cut out, reamplified, cloned in a PGEM plasmid. easy vector, Promega), sequences and identified by questioning the BLAST bank.
  • each identified sequence is tested on the model of in vitro angiogenesis with human endothelial cells transfected with an expression vector comprising an antisense oligonucleotide of said sequence.
  • the amplification of the cloned fragment in the bacterial plasmid is carried out by means of particular primers, selected from GS-PGS-F, GS-PGM-R or GS-PGM-F and GS-PG sequences.
  • PGS-R hybridizing to the regions of the plasmid flanking the cloned gene and also comprising in their ends the restriction sites (SalI and MIuI sites), not contained in the cloned fragment, and present in the multisite region of the expression vector.
  • restriction sites can be interchanged depending on whether the fragment has been cloned into the bacterial plasmid in its sense or antisense orientation.
  • primers contain at each of their ends a site of a different restriction enzyme (SalI: GTCGAC or MIuI: ACGCGT).
  • Amplified fragments of each gene are obtained by PCR from the bacterial plasmids containing the identified gene fragment using said primers. These fragments are purified, digested with SalI and MIuI restriction enzymes and inserted into an expression vector in mammals of the pCi-neo vector type (Promega), itself digested with these two restriction enzymes. Each fragment is introduced in the antisense orientation.
  • the vectors that can be used to demonstrate the functionality of the genes identified in the present invention in the mechanism of angiogenesis include any mammalian expression vector system comprising a promoter which allows the expression of a cloned gene, by way of example, mention may be made of the "strong" promoter of human cytomegalovirus (CMV).
  • CMV cytomegalovirus
  • Other constitutive or inducible expression vectors that may also be used are indicated in the non-exhaustive list below:
  • Vectors marketed by the Promega Company vectors with a "strong" promoter for a high level mammalian cells
  • pCI Mammalian expression vector expression expression expression expression vector cloning vector pALTER (R) * -MAX vectors marketed by Invitrogen: (pcDNA3.1, / hygro, - / Zeo , pcDNA4 / HisMAx, -E, base pairsCE4, pRcRSV, pRcCMV2, pSecTag2, - / hygro secretion vectors, vectors pEBVHis A, B and C), mammalian expression vectors marketed by Clontech (pIRES, pIRES-EYFP pIRES2-EGFP, pCMV-Myc and pCMV-HA), Epitope-tagged pTRE, VP16 Minimal Domain vectors (ptTA 2, ptTA 3 and ptTA 4), bidirectional Tet expression vectors (base
  • Each vector comprising said antisense fragment is then produced in E. CoIi, extracted, purified and quantified.
  • a jug of each vector is incubated in the presence of a transfecting agent (effectene, Qiagen) following the protocol recommended by the manufacturer with the endothelial cells. Twenty-four hours after transfection, the endothelial cells are trypsinized and plated on the extracellular matrix containing the angiogenic factors in this case the matrigel according to the model described by Grant et al. (1989, Cell, 58 (5): 933- 43). After 24h incubation, vessel formation is observed and compared to control cells transfected with the empty mammalian expression vector. 5. Establishment of the library of stable lines expressing the expression vectors containing the gene sequences or their fragments or the antisense sequences.
  • Expression systems may include a selection marker for an antibiotic (a gene of antibiotic resistance) to select transfected cells stably expressing the vector comprising the nucleic acid cloned in said vector and, either in the same vector or in a vector cotransfected 2nd.
  • a selection marker for an antibiotic a gene of antibiotic resistance
  • This expression vector may be a constitutive or inducible expression system.
  • the stable lines for the expression of the antisense oligonucleotide corresponding to each identified gene were obtained with a constitutive expression vector and after selection in the presence of antibiotic.
  • the BAEC endothelial cells are trypsinized and seeded at a rate of 80,000 cells / well in six-well plate in the presence of 700 ⁇ g / ml of antibiotic G418. (Promega) A control well is inoculated with untransfected cells.
  • the medium is changed every three days with a refill of the antibiotic.
  • the control cells are removed after 8 to 10 days, the antibiotic resistant cells are harvested at confluence (after 2 to 3 weeks) and then transferred into culture flasks always in the presence of the antibiotic. Stable lines are then tested for their ability to form or not form vessels in the in vitro angiogenesis assay.
  • nucleic acid sequences identified in the sequence listing provided in the appendix by the numbers SEQ ID No. 1, 2, 4, 5, 9 to 11, 13, 17 to 19, 27 to 29 and 34 and the proteins identified in the sequence listing provided by SEQ ID Nos. 35, 37, 38, 43, 47 to 49 and 57 have not previously been identified as having a biological role and still less as having a role in the process of angiogenesis or the differentiation of endothelial cells into capillary tubes. These proteins are described below.
  • the differential display method described above allowed the identification of the following mRNAs:
  • GS-N1 mRNA of 1041 base pairs, identified by the sequence SEQ ID No: 1 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number BC002759.
  • the sequence of this mRNA has a coding sequence from nucleotide 213 to nucleotide 482.
  • a protein, GS-P1 resulting from the translation of this mRNA (SEQ ID No. 35 in the attached sequence listing) has been identified. This protein is composed of 89 amino acids.
  • GS-N2 4275 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 2 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number BC040192.
  • GS-N3 6104 bp mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 3 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number XM_497078.
  • nucleoporin 188 The sequence of this mRNA has a coding sequence of nucleotide 438 to nucleotide 5687.
  • Nucleoporine 188kDa is part of the family of about thirty proteins called nucleoporins which constitute on the nuclear double membrane large protein structures forming nuclear pores and serving as sites of translocation of macromolecules between the nucleus and cytoplasm. Studies have shown that a nucleoporin has a unique role in the regulation of nuclear pore function and the transport of proteins and RNAs.
  • NUP88 nucleoporin has been associated with high aggression in breast cancer (Agudo et al, Int J Cancer, 2004 May 1, 109 (5): 717-20).
  • NUP98 nucleoporin 98kDa
  • GS-N4 mRNA of 1768 bp, identified by the sequence SEQ ID No: 4 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number BC002509.
  • GS-N4 The sequence of this mRNA (GS-N4) has a coding sequence from nucleotide 176 to nucleotide 1387.
  • a protein, GS-P3, (SEQ ID No. 37 in the attached sequence listing) resulting from the translation of this mRNA has been identified. This protein is composed of 403 amino acids.
  • This sequence is homologous to the GS-N5 sequence.
  • GS-N5 1552 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 5 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number BC008630.
  • GS-N5 The sequence of this mRNA (GS-N5) has a partial coding sequence from nucleotide 1 to nucleotide 949.
  • This new 44kDa protein contains a PHD Zinc finger domain, a motif mainly found in proteins involved in transcriptional regulation in eukaryotes (reviewed Trends Biochem Sci., 1995 Feb; 20 (2): 56-9).
  • GS-N6 3181 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 6 in the attached sequence listing.
  • GS-N6 The sequence of this mRNA (GS-N6) has a coding sequence of nucleotide 213 to nucleotide 2207.
  • This sequence is homologous to the GS-N7 sequence.
  • GS-N7 2404 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 7 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number X03444.
  • the sequence of this mRNA (GS-N7), has a coding sequence of nucleotide 211 to nucleotide 2319.
  • the LMNA gene codes for a protein called lamin A / C isoform 1.
  • the lamins are the main components of the nuclear lamina. These proteins are important in a variety of cellular functions such as nuclear assembly, replication, transcription, and nuclear integrity (reviewed: Curr Opin Cell Biol 2002 Jun, 14 (3): 357-64).
  • GS-N8 mRNA of 2570 base pairs identified by the sequence SEQ ID No: 8 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under the accession number AB005047.
  • GS-N8 The sequence of this mRNA (GS-N8) has a coding sequence from nucleotide 64 to nucleotide 1341.
  • the SAB protein is an SH3 domain binding protein, its role in the signaling voice of Bruton tyrosine kinase (Btk) has been suggested by the demonstration of its binding with the SH3 domain of this kinase (Biochem Biophys Res Commun 1998 Apr 17; 245 (2): 337-43). Its role in the signaling voice of the c-Jun protein N-terminal kinase has also been suggested (Biochem J. 2002 Nov 1; 367 (Pt 3): 577-85).
  • Btk Bruton tyrosine kinase
  • c-Jun N-terminal kinase has been shown to be involved in angiogenesis (Jimenez et al, Oncogene, 2001 Jun 7; 20 (26): 3443-8) and more recently, augmented expression of Btk was observed during in vivo angiogenesis (2004, Zippo et al, Blood).
  • This sequence has sequence homology with GS-N9, GS-N10, GS-NII sequences less than 90%. However these four sequences exhibit a conserved sequence which I 1 antisense, identified in the sequence listing provided in the annex under the number SEQ ID NO: 67, allows the inhibition of the expression.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under the accession number AK090524.
  • GS-N10 mRNA of 5593 base pairs identified by the sequence SEQ ID No: 10 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number AL133111
  • GS-NI1 2774 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 11 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under accession number BX641159.
  • GS-N12 8974 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 12 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under the accession number NM_015382
  • GS-N12 The sequence of this mRNA (GS-N12) has a coding sequence of nucleotide 324 to nucleotide 8162.
  • the HECTD1 protein is stored by its conserved domain in the HECT family of proteins that function as E3 ubiquitin ligase proteins, targeting specific proteins for ubiquitin-mediated proteolysis (Callaghan et al., Oncogene, 1998 Dec 31; 17 (26)). ): 3479-91).
  • the Smurfl protein another member of this family, plays a specific role in osteoblast cell differentiation and bone formation in vivo by inhibiting this differentiation (Zhao et al., J. Biol Chem. 26; 279 (13): 12854-9).
  • the Nedd4 protein also a member of the HECT family, has been described as regulating the stability and therefore the activity of the growth factor receptor IGF-I (Molecular Insulin-like Growth Factor I) (Mol CeIl Biol 2003 May; 9): 3363-72
  • IGF-I Molecular Insulin-like Growth Factor I
  • HECTD1 The specific role of HECTD1 is not yet described in the literature, and in particular no role has been described in the regulation of angiogenesis for this protein - GS-N13: 5346 base pairs identified under sequence number SEQ ID No. 13 in the attached sequence listing
  • a BLAST search in the GENBANK sequence database identifies it as accession number XM_291344. This mRNA has a coding sequence from nucleotide 1 to nucleotide 3522.
  • a protein, GS-P9, (SEQ ID No. 43 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA has therefore been identified.
  • This protein is composed of 1173 amino acids.
  • protein still e unknown is characterized by a catalytic tyrosine kinase domain.
  • GS-N14 mRNA of 3769 base pairs identified under sequence number SEQ ID No. 14 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search in the database sequences GENBANK allows to identify it under accession number NM__181847.
  • This mRNA has a coding sequence of the nucleotide
  • This protein is composed of 522 amino acids and is called AMIG02.
  • the Amigo 2 protein was recently discovered and has been classified into a new gene family encoding type I transmembrane proteins that contain a secretion signal sequence and a transmembrane domain
  • the Amigo 2 protein is still poorly known, it has never been described as implicated in angiogenesis.
  • GS-N15 mRNA of 7407 base pairs identified under the number SEQ ID No. 15 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search in the GENBANK sequence database makes it possible to identify it under accession number NM_005650 s
  • This mRNA has a coding region of nucleotide 135 to nucleotide 6017. It has therefore been identified a protein, GS-PlI, (SEQ ID No. 45 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA. This protein is composed of 1960 amino acids, and is called transcription factor 20, isoform 1 (TCF20).
  • This protein also known as SPBP, was originally described as a transcription factor that controls the expression of stromolysin, a metalloproteinase involved in tumor invasion and metastasis (Sanz et al., Cell Biol. 15 (6), 3164-3170 (1995). More recently, it has been reported that this protein Although nuclear contains several functional domains and stimulates the transcriptional activity of various transcription factors such as Ets1 or C-Jun, it is suggested to be a transcriptional coactivator (Rekdal et al., J Biol Chenu 2000 Dec 22; 275 (51)). : 40288-300).
  • GS-N16 2104 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 16 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search in the GENBANK sequence database makes it possible to identify it under the accession number NM_016408.
  • This mRNA has a coding sequence from nucleotide 125 to nucleotide 1888.
  • a GS-P12 protein (SEQ ID No. 46 in the attached list of sequences) has been identified, resulting from the translation of this mRNA.
  • This protein is composed of 587 amino acids, and is called protein 1 associated with the CDK5 regulatory subunit (CDK5RAP1).
  • This protein also called C42, or HSPC167, has been isolated and shown to associate with an activating subunit (p25nck5a derived from p35 nck5a ) of a cell cycle-associated protein kinase called cyclin-dependent protein kinase, CDK5 (Ching et al. Wang, Gene, 2000 Jan 25, 242 (1-2): 285-94).
  • cdks regulate proliferation, differentiation, senescence, and apoptosis.
  • Neuronal CDK5 has been implicated in the regulation of differentiation and neuronal migration.
  • the activity of Cdk proteins is regulated by complex mechanisms including phosphorylation of proteins, association with specific inhibitors.
  • CDK5RAP1 has been demonstrated in the regulation of angiogenesis - GS-N17: 5859 base pair mRNA identified as SEQ ID No 17 in the attached sequence listing .
  • a BLAST search in the GENBANK sequence database makes it possible to identify it under the accession number AK074056.
  • This mRNA (GS-N17) has a partial coding sequence from nucleotide 45 to nucleotide 935.
  • a new protein, GS-P13, (SEQ ID No. 47 in the attached sequence listing) has thus been identified, resulting from the translation of this mRNA.
  • This protein is composed of 296 amino acids.
  • This unknown protein, of 33kDa contains BTB / POZ and Kelch domains, the BTB / POZ domain is a conserved domain of protein-protein interaction (Xu et al, Int JMed Med 2004 Jan; 13 (1): 193
  • the proteins containing these domains constitute a large family whose physiological functions are still poorly understood (Ohmachi et al, Genes Cells, 1999).
  • Jun; 4 (6): 325-37 A member of this family has already been described involved in a process such as directed cell migration in Drosophila (Development, 2001 Aug; 128 (15): 3001-15) .
  • GS-N18 1694 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 33 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search in the GENBANK sequence database allows identify it under accession number BC001792.
  • This mRNA (GS-N18), has a coding sequence of nucleotide 164 to nucleotide 448. It has thus been identified a protein, GS-P14, (SEQ ID No. 48 in the attached sequence listing), resulting from the translation. of this
  • MRNA This protein is composed of 94 amino acids.
  • This 10kDa protein has no particular domain but contains a signal sequence of secretion and a transmembrane helix. This sequence is homologous to the GS-N19 sequence.
  • GS-N19 2437 base pair mRNA identified by the sequence SEQ ID No: 19 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search based on GENBANK sequences makes it possible to identify it under the accession number AF370373.
  • This mRNA (GS-N19) has a coding sequence of nucleotide 628 to nucleotide 1533.
  • a protein, GS-P15 (SEQ ID No. 49 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA has thus been identified. .
  • This protein, isoform of the GS-P14 protein is composed of 301 amino acids.
  • This isoform is characterized by a domain called ubiquitin, a family of ubiquitins, molecules involved in the proteolysis of proteins that regulates the "turnover of proteins", in order to control the progression of the cell cycle.
  • GS-N20 a 1714 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 20 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search can identify it under accession number BC022870 in the GENBANK sequence database.
  • the sequence of this mRNA has a coding sequence from nucleotide 90 to nucleotide 1424. It was thus identified a GS-P16 protein resulting from the translation of this mRNA. This protein is composed of 444 amino acids. It is identified as SEQ ID No. 50 in the attached sequence listing, called interferon-induced protein 44 (IFI44).
  • IFI44 interferon-induced protein 44
  • the gene encoding a novel antigen protein, p44 was originally isolated from chimpanzees infected with hepatitis virus (Takahashi et al., 1990, J Gen Virol., 71 (Pt 9): 2005-ll). . Subsequently, it has been identified in humans as inducible by interferon (Kitamura et al, Eur J Biochem 1994 Sep 15; 224 (3): 877-83). To date, this protein has not been described as being involved in angiogenesis.
  • GS-N21 1715 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 21 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search can identify it under the accession number NM_004905 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA, GS-N21 has a coding sequence of nucleotide 52 to nucleotide 726. It has thus been identified a protein, GS-Pl7, (SEQ ID No. 51 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this MRNA, composed of 224 amino acids, called peroxiredoxin 6 (PRDX6).
  • PRDX6 peroxiredoxin 6
  • Peroxiredoxin 6 protein (also known as antioxidant protein 2, non-selenium glutathione peroxidase, acidic calcium-independent phospholipase A2, 1-Cys peroxiredoxin) belongs to the growing and ubiquitous family of peroxiredoxins which are multifunctional enzymes with peroxidase in vitro, and In vivo are involved in many cellular processes known to be responsive to reactive oxygen such as pathophysiological processes including oxygen adaptation, atherosclerosis, cancer, cell differentiation (WAGNER et al, Biochem J. (2002)). 366): 777-785.
  • PRDX6 is a unique non-redundant antioxidant that works independently of other peroxiredoxins and antioxidant proteins.
  • PRDX6 Very abundant in epithelial cells, PRDX6 was found in the cytosol (Wang et al., J. Biol Chem., Vol 278, Issue 27, 25179-25190, JuIy 4, 2003). It has also been found in endothelial cells only in the cytosol (Stuhlmeier et al, Eur J Biochem, 2003 Jan; 270 (2): 334-41).
  • this protein has not been described as having a role in the regulation of angiogenesis.
  • GS-N22 5978 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 22 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number AF220037 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA has a coding sequence from nucleotide 1801 to nucleotide 3933.
  • a protein, GS-P18 SEQ ID No. 52 in the attached list of sequences
  • TRIM9 tripartite isoform beta motif protein
  • the TRIM9 protein belongs to a family characterized by a conserved domain, the tripartite motif (TRIM).
  • the TRIM is composed of three zing binding domain, a RING (R), a B-box type 1 (B1) and a B-box type 2 (B2) followed by a coiled-coil region.
  • R RING
  • B1 B-box type 1
  • B2 B-box type 2
  • TRIM9 protein also contains a fibronectin type III domain, a modulus present in both extracellular and intracellular proteins.
  • Genes of the TRIM family have been involved in processes various, such as cell growth and growth and oncogenesis and other pathologies (EMBO J. 2001 May 1; 20 (9): 2140-51; Berti et al., Mech Dev. 2002 May; 113 (2): 159 -62.) • TRIMII, for example, would play a role in regulating the level of intracellular expression of a neuroprotective peptide that specifically suppresses neurotoxicity related to Alzheimer's disease through the protein-controlled pathway of protein degradation.
  • TRIM9 ubiquitins
  • GS-N23 5858 bp mRNA identified as SEQ ID No. 23 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number AF213987 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA has a coding sequence from nucleotide 66 to nucleotide 2213.
  • a protein, GS-P19 (SEQ ID No. 53 in the attached list of sequences), resulting from the translation of this mRNA, has been identified.
  • This protein is composed of 715 amino acids and is called MCEF protein.
  • the MCEF protein has been described as a new member of the family of AF4 transcription factors involved in lymphoblastic leukaemias Estable et al., J Biomed Sci. 2002 May-Jun; 9 (3) -.234-45).
  • the MCEF protein is still very little studied and to date, no role in the regulation of angiogenesis has been described for this protein.
  • GS-N24 3907 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 24 in the attached sequence listing.
  • a search BLAST makes it possible to identify it under the number accession number NM_012318 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA has a coding sequence of nucleotide 298 to nucleotide 2517.
  • the LETM1 protein contains two "EF-Hand" domains, a transmembrane domain, a leucine Zipper domain and several coiled-coil domains. Based on its possible calcium binding property and its involvement in the calcium signaling pathway, this protein has been suggested to be implicated in a mental illness, Wolf-Hirschhorn syndrome, this protein being deleted in many patients with this syndrome (Endele et al., Genomics, 1999 Sep 1; 60 (2): 218-25. A recent study has shown a mitochondrial localization of this protein (Schlickum et al, Genomics, 2004 Feb; 83 (2)). : 254-61).
  • GS-N25 a mRNA of 7190 base pairs identified under the number SEQ ID No. 41 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number NM_020119 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA has a coding sequence of nucleotide 389 to nucleotide 3097.
  • GS-P21 SEQ ID No. 55 in the attached list of sequences
  • ZAP protein is a CCCH type Zinc finger protein. His current role is in the prevention of retrovirus infection. The expression of this ZAP protein has been shown to cause a deep and specific loss of viral mRNAs in the cytoplasm of the cell without affecting nuclear mRNAs suggesting a role in the inhibition of viral replication of infected cells (Gao et al., Science 2002 Sep 6; 297 (5587): 1703-6 ). No other role is known at present and no role in the regulation of angiogenesis has been described so far for this protein.
  • GS-N26 2359 base pair mRNA identified as SEQ ID No. 26 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number NM_022777 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA, GS-N26 has a coding sequence of nucleotide 41 to nucleotide 598. It has thus been identified a protein, GS-P22, (SEQ ID No. 56 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA. This protein is composed of 185 amino acids and is called RABL5 protein.
  • the gene encoding the RABL5 protein has recently been described (Ota et al., Nat Genet 36 (1), 40-45 (2004) and the protein has been classified by its conserved domains as a member of the Rab GTPAse family. belonging to the superfamily of GTP-binding Ras proteins, which have emerged as cell-membrane regulators, particularly formation, vesicular transport, and membrane fusion (reviews: Prekeris R, Scientific World Journal, 2003 Sep 15; 3: 870-80, Stenmark H and Olkkonen VM., Genome Biol 2001; 2 (5)). This superfamily comprises over 80 highly conserved proteins that are involved in multiple voices of intracellular signaling and function as switches.
  • RABL5 protein is still poorly known and its exact role has not yet been discovered, no role in angiogenesis has been described to date.
  • GS-N26 has a sequence homology with the GS-N27 and GS-N28 sequences of less than 90%. However, these three sequences have a conserved sequence which I 1 antisense, identified in the sequence listing provided in the annex under the number SEQ ID NO: 81, allows the inhibition of the expression.
  • - GS-N27 1782 base pair mRNA, identified under the number SEQ ID No. 27 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under accession number BC050531 in the GENBANK sequence database.
  • GS-N28 mRNA of 2587 base pairs, identified under the number SEQ ID No. 28 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search can identify it under the accession number AL157469 in the GENBANK sequence database.
  • GS-N29 2520 bp mRNA identified under the number SEQ ID No. 29 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number XM_211534 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA (GS-N29) has a coding sequence of nucleotide 484 to nucleotide 792. It has thus been identified a protein, GS-P23, (SEQ ID No. 57 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA.
  • This protein is composed of 102 amino acids.
  • This new 11 kDa protein (102 amino acids) has no particular domain, is extracellular and has a secretory sequence of secretion.
  • GS-N30 mRNA of 7300 base pairs identified under the number SEQ ID No. 30 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under accession number NM__003023 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA (GS-N30), has a coding sequence of nucleotide 262 to nucleotide 1947. It has thus been identified a protein, GS-P24 (SEQ ID No. 58 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA. This protein is composed of 561 amino acids and is called SH3 domain binding protein 2 (SH3BP2).
  • SH3BP2 SH3 domain binding protein 2
  • This protein has been identified in bladder cancer and by its structure it has been suggested to play a role in signaling and could be a negative regulator of the abl oncogene (Bell et al, Genomics, 1997 Sep 1; (2): 163-70 Recently, this protein has been described as an adapter protein in signaling pathways by promoting the transcriptional activity of two NFAT / AP-1 transcription factors (known to be involved in gene transcription). interleukin 2) in T cells through activation of Ras - and calcineurin - dependent pathways (Foucault et al., J Biol Chem 2003 Feb 28, 278 (9): 7146-53).
  • GS-N31 1701 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 31 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number AF380162 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA (GS-N31) has a coding sequence from nucleotide 19 to nucleotide 1542.
  • a protein, GS-P25 (SEQ ID No. 59 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this
  • MRNA This protein is composed of 507 amino acids and is called FAPP2 protein.
  • GS-N31 This mRNA sequence (GS-N31) is homologous to GS-N32 and GS-N33 sequences.
  • GS-N32 2836 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 32 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number AK023180 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA has a coding sequence of nucleotide 323 to nucleotide 1441.
  • a protein, GS-P26 SEQ ID No. 60 in the attached sequence listing
  • amino acids and called Protein similar to FAPP2 protein The gene coding for the protein FAPP2 was identified in 2002 by Strausberg (Proc Natl Acad Sci U.S.A 99 (26), 16899-16903), it is highly similar, moreover, to a protein NY-BR-86 described as a breast cancer antigen (Scanlan et al., 2001, Cancer Immun.1,4).
  • This protein has a conserved glycolipid transfer domain and a pleckstrin homology domain.
  • This domain is shared by a group of novel proteins that have binding specificities with the phosphorylated derivatives of inositol. These Proteins are described as potentially adapter proteins because they do not have catalytic domains. These molecules may be key mediators of cellular responses that are specifically regulated by the second messenger (the phosphorylated derivative of inositol) (Dowler et al., Biochem J. (2000) 351, 19-31).
  • FAPP2 The exact role of FAPP2 is not yet known, its role in angiogenesis has not yet been described.
  • This mRNA sequence (GS-N32) is homologous to GS-N31 and GS-N33 sequences.
  • GS-N33 mRNA of 2004 base pairs identified under the number SEQ ID No. 33 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search can identify it under accession number BC002838 in the GENBANK sequence database.
  • This mRNA has a coding sequence from nucleotide 92 to nucleotide 1414.
  • a protein, GS-P27 (SEQ ID No. 61 in the attached sequence listing), resulting from the translation of this mRNA, composed of 440 acids, has been identified. amino is called Protein linked to the proliferation potential.
  • This mRNA sequence (GS-N33) is homologous to GS-N31 and GS-N32 sequences.
  • GS-N34 1789 base pair mRNA identified under the number SEQ ID No. 34 in the attached sequence listing.
  • a BLAST search makes it possible to identify it under the accession number AK057491 in the GENBANK sequence database.
  • an antisense oligonucleotide specific for each of the identified genes chosen from the oligonucleotides identified by the sequences SEQ ID No. 62 to SEQ ID. : 86 in the attached sequence listing was introduced into the vector pCI-neo expression vector in antisense orientation.
  • GS-V1 to GS-V23 identified by their sequence SEQ ID No: 87 to SEQ ID No: 109 in the attached sequence listing were used to repress expression of the gene encoding this mRNA in cells. endothelial cells following transfection of the latter by this vector.
  • Human endothelial cells were then stimulated by angiogenic factors.
  • SEQ ID N. 1 to SEQ ID No. 3 inhibits the formation of neovessels by endothelial cells;

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Abstract

L'invention appartient au domaine des compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de pathologies résultant d'une dérégulation du mécanisme de l'angiogenèse. Elle concerne en particulier de nouveaux gènes dont la fonction n'était pas identifiée à ce jour ainsi que des gènes connus mais dont l'implication dans le mécanisme de l'angiogenèse a été mise en évidence pour la première fois.

Description

GENES IMPLIQUES DANS LA REGULATION DE L 'ANGIOGENÈSE, PREPARATIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS .
La présente invention appartient au domaine des compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de pathologies résultant d' une dérégulation du mécanisme de 1 ' angiogenèse.
Elle concerne en particulier de nouveaux gènes dont la fonction n'était pas identifiée à ce jour ainsi que des gènes connus mais dont l ' implication dans le mécanisme de 1 ' angiogenèse a été mis en évidence pour la première fois par la Demanderesse .
Ces gènes sont identifiés par leurs séquences nucléotidiques dans le listage de séquences en annexe .
La présente invention concerne également les séquences polypeptidiques des facteurs codés par lesdits gènes qui trouvent leur application dans l ' étude clinique du processus de l ' angiogenèse , le pronostic , le diagnostic et le traitement de pathologies liées à ce processus ainsi que dans la mise en oeuvre des essais pharmacologiques, pharmacogénomiques, ou pharmacosignalitiques .
L' angiogenèse est un processus fondamental par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins se forment. Ce processus est essentiel dans plusieurs phénomènes physiologiques normaux tels que la reproduction, le développement ou encore la cicatrisation. Dans ces phénomènes biologiques normaux, 1 ' angiogenèse est sous contrôle strict, c 'est-à-dire qu ' elle est déclenchée pendant une période courte, quelques jours , puis complètement inhibée . Cependant, plusieurs pathologies sont liées à une angiogenèse invasive et incontrôlée . L' arthrite, par exemple, est une pathologie due à l ' endommagement des cartilages par les néovaisseaux invasifs . Dans la rétinopathie diabétique, l ' invasion de la rétine par les néovaisseaux conduit à l ' aveuglement des malades ; la néovascularisation de l ' appareil oculaire présente la cause majeure de l ' aveuglement et cette néovascularisation domine une vingtaine de maladies de l ' oeil . Enfin, la croissance et la métastase des tumeurs sont directement liées à la néovascularisation et sont dépendantes de l ' angiogenèse . La tumeur stimule la croissance des néovaisseaux pour sa croissance elle-même . De plus , ces néovaisseaux présentent les voies d'échappement des tumeurs pour joindre la circulation sanguine et provoquer les métastases dans des sites à distance comme le foie , le poumon ou l ' os .
Dans d ' autres pathologies telles que les maladies cardio-vasculaires , les maladies d' artères périphériques , les lésions vasculaires ou cérébrales , l ' angiogenèse peut présenter une base thérapeutique importante . En effet, la promotion de l ' angiogenèse dans les endroits endommagés peut conduire à la formation de néovaisseaux sanguins latéraux et alternatifs aux vaisseaux endommagés fournissant ainsi le sang et par conséquent l ' oxygène et d' autres facteurs nutritifs et biologiques , nécessaires à la survie des tissus concernés .
La formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales implique la migration, la croissance, et la différentiation des cellules endothéliales . La régulation de ces phénomènes biologiques est directement liée à l 'expression génétique . En matière d ' angiogenèse, un nombre sans cesse grandissant d'études montre que la régulation de l ' angiogenèse se fait à travers un équilibre entre des facteurs agissant directement sur la cellule endothéliale. Ces facteurs peuvent être stimulants , d ' une part, tels que , entre autres , le VEGF, le FGFs , l ' IL-8 , le HGF/SF , le PDGF . Ils peuvent aussi être inhibants , comme, entre autres , I 1 IL- 10 , l ' IL-12 , le gro-α et β, le facteur plaquettaire 4 , l ' angiostatine, l ' inhibiteur dérivé de chondrocyte humaine, la thrombospondine, le facteur inhibiteur de la leucémie . ( Jensen, Surg. Neural . , 1998 , 49 , 189-195 ; Tamatani et al . , Carcinogenesis , 1999 , 20 , 957-962 ; Tanaka et al . , Cancer Res . , 1998 , 58 , 3362-3369 ; Ghe et al . , Cancer Res . , 1997 , 57 , 3733-3740 ; Kawahara et al . , Hepatology, 1998 , 28 , 1512-1517 ; Chandhuni et al . , Cancer Res . , 1997 , 57 , 1814-1819 ; Jendraschak et Sage, Semin. Cancer Biol . , 1996 , 7 , 139-146 ; Majewski et al . , J. Invest . Dermatol . , 1996 , 106 , 1114-1119 ) .
Le contrôle de l ' angiogenèse représente donc un axe stratégique , à la fois de recherche fondamentale, afin d' améliorer notre compréhension des nombreux phénomènes pathologiques liés à l ' angiogenèse , mais aussi une base pour l 'élaboration des nouvelles thérapies destinées à traiter les pathologies liées à l ' angiogenèse .
Afin de contrôler l ' angiogenèse, plusieurs groupes pharmaceutiques ont développé des stratégies thérapeutiques basées directement sur l 'utilisation de signaux paracrines , les facteurs stimulateurs et inhibiteurs , comme agents pour promouvoir ou inhiber l ' angiogenèse . Ces stratégies sont basées essentiellement sur l'utilisation de ces facteurs sous leur forme polypeptidique comme agents stimulateurs ou inhibiteurs de l ' angiogenèse, ou encore plus récemment sous la forme de vecteurs d ' expression codant pour les facteurs choisis .
Un procédé permettant l ' identification de nouveaux gènes impliqués dans la régulation de l ' angiogenèse a été mis au point . Il a fait l' objet d'une demande de brevet français publiée sous le n° FR 2798674 et d'une demande de brevet internationale PCT publiée sous le n° WO 01/218312. Cette méthode a la particularité de traduire fidèlement le mécanisme intime régulant l ' angiogenèse en prenant en compte tous les facteurs extracellulaires décrits comme agents régulateurs de l ' angiogenèse, c ' est-à-dire les facteurs angiogéniques , les facteurs angiostatiques , ainsi que les différents composants de la matrice extracellulaire . Cette méthodologie consiste à mettre en œuvre ces différents facteurs extracellulaires à travers quatre conditions expérimentales bien définies . Les cellules endothéliales sont cultivées sur une composante et/ou un mélange bien défini de plusieurs composantes de la matrice extracellulaire et placées sous les quatre conditions expérimentales à savoir : une condition contrôle où les cellules endothéliales ne sont pas stimulées ; une condition angiogénique où les cellules endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs facteurs angiogéniques ; une condition d' inhibition de l ' angiogenèse où les cellules endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs facteurs angiogéniques et mises en présence d'un ou plusieurs facteurs angiostatiques ; et une autre condition de contrôle où les cellules endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs facteurs angiostatiques .
Ces quatre conditions permettent d'obtenir des préparations d'ARNm spécifiques de l ' angiogenèse à savoir de l 'état angiogénique et/ou l' inhibition de l ' angiogenèse et permettent de déceler les gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l ' angiogenèse, incluant des régulateurs positifs et des régulateurs négatifs .
Donc, le procédé ci-dessus décrit permet le criblage systématique de tous les facteurs angiogéniques et angiostatiques ainsi que des différentes composantes de la matrice extracellulaire dans le but de mettre en évidence et identifier les gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l ' angiogenèse . De plus , étant donné que l ' expression génique peut être analysée tout au long de la cinétique de la formation des néovaisseaux par les cellules endothéliales , cette approche constitue une méthodologie in vitro permettant de relier l ' expression génique aux paramètres fonctionnels biologiques de l ' angiogenèse.
L ' identification des 34 gènes rapportés ci-dessous a été effectuée selon la méthodologie décrite ci-dessus , en utilisant les facteurs angiogéniques et angiostatiques , ainsi que le collagène type I comme composant de la matrice extracellulaire pour reproduire les quatre conditions expérimentales . La Demanderesse a par ailleurs prouvé l ' implication de ces 34 nouveaux gènes identifiés par les séquences SEQ ID No . : l à SEQ ID No . : 34 dans la liste de séquences en annexe , dans le mécanisme de régulation de l ' angiogenèse .
Ainsi l ' invention concerne une molécule d ' acide nucléique, caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle consiste en i ) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 2 , 4 , 5 , 9 à 11 , 13 , 17 à 19 , 27 à 29 et 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; ii ) une séquence antisens de l ' une des séquences de i ) , identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID 62 , 63 , 65 , 67 , 69 , 73 , 74 , 81 , 82 et 85 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; iii ) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N°86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente .
Au sens de la présente invention, doivent être considérées comme des séquences équivalentes aux séquences ci-dessus décrites , des séquences nucléotidiques présentant une ou des modification( s ) structurelle ( s ) , mineure( s ) , ne modifiant pas leur fonction, telle ( s ) que délétion, mutation ou addition de bases, dont l ' identité est d' au moins de 90% avec les séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No. : 1 à 34 dans la liste de séquences en annexe .
Au sens de la présente invention, on entend par fragment une séquence de type 1Orners, de préférence de type 15mers et de manière particulièrement préférée de type 2Orners .
L ' intérêt de toutes les séquences décrites dans le présent texte, réside dans le fait qu ' un antisens de ces séquences , lorsque qu ' il est introduit dans une cellule, influence les phénomènes de l ' angiogenèse, c ' est-à-dire que son introduction dans la cellule conduit à une activation ou une inhibition de l ' angiogenèse .
Selon un autre aspect, l ' invention concerne un polypeptide ou fragment dudit polypeptide, caractérisé en ce qu ' il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 4 , 5 , 13 , 17 , 18 , 19 et 29.
Sous une forme de mise en œuvre particulière de l ' invention, ledit polypeptide comprend ou consiste en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 ,
37 , 38 , 43 , 47 , 48 , 49 ou 57.
Selon encore un autre aspect, l ' invention a pour objet un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend i ) une molécule d ' acide nucléique telle que décrite précédemment; ii ) une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle consiste en a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 3, 6 , I 1 8 , 12 , 14 à 16 , 20 à 26 et 30 à 33 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente; b) une séquence antisens de l ' une des séquences de a) , identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 64 , 66 , 67 , 68 , 70 à 72 , 75 à 81 et 84 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; c ) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente . Plus particulièrement ledit vecteur est choisi parmi le groupe de vecteurs GS-Vl à GS-V23 , identifiés par leur séquence, portant les numéros SEQ ID N° 87 à SEQ ID N° 109 dans la liste de séquences en annexe .
Lesdits vecteurs peuvent être construits par toute méthode connue de l ' homme du métier. Particulièrement on citera la méthode décrite dans la demande de brevet WO
03/074073 avec les séquences amorces, décrites dans ce brevet, GS-PGS-F et GS-PGM-R pour des fragments clones en orientation sens dans le plasmide bactérien, soit les amorces GS-PGS-F et GS-PGM-R pour des fragments clones en orientation sens dans le plasmide bactérien.
Ces constructions sont utiles d'une part pour préparer des compositions thérapeutiques destinées au traitement, par thérapie cellulaire, de désordres angiogéniques et d ' autre part pour vérifier l ' efficacité d'un traitement d'un désordre angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, ou encore pour vérifier la fonctionnalité des gènes éventuellement impliquées dans le mécanisme de 1 ' angiogenèse, dans ledit mammifère .
Selon encore un autre aspect, l ' invention concerne un anticorps caractérisé en ce qu' il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 34 , ou un fragment desdites séquences , particulièrement codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 4 , 5 , 13 , 17 , 18 , 19 et 29 ou un fragment desdites séquences , ou ayant une affinité pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N0 35 à 61 , ou un fragment desdites séquences , particulièrement pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 , 37 , 38 , 43 , 47 , 48 , 49 ou 57 ou un fragment desdites séquences .
Lesdits anticorps peuvent être obtenus par toute méthode d' immunisation in vivo ou in vitro, d 'un animal , notamment d'un vertébré et de préférence d'un mammifère avec l 'une quelconque des séquences polypeptidiques selon l ' invention, ou l 'un de leurs fragments conservant l ' immunogénicité de la protéine totale . Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. (Kohler G. and Milstein C . Nature . 1975 Aug 7 ; 256 ( 5517 ) : 495-7. )
L' introduction desdites séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 34 et SEQ ID No. 62 à 86 ( sens et antisens ) ou desdits vecteurs identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N° 87 à SEQ ID N° 109 ou de l 'un de leurs homologues, et l' insertion ultérieure desdits vecteurs dans des cellules de mammifère permet l'obtention de lignées cellulaires sur-exprimant ou sous-exprimant les gènes intervenant dans le mécanisme de 1 ' angiogenèse.
Ainsi, selon encore un autre aspect, l ' invention concerne une cellule génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène impliqué dans l ' angiogenèse choisi parmi les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. l à SEQ ID No. 34 , particulièrement les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. n° 1 , 2 , 4, 5 , 9 à 11, 13 , 17 à 19 , 27 à 29 et 34.
Lesdites cellules génétiquement modifiées peuvent être construites par toute méthode connue de l ' Homme du Métier. Particulièrement, elles peuvent être construites par la méthode décrite dans la demande de brevet WO 03/074073 et qui comprend :
(a) l ' introduction d' un gène de résistance à au moins un antibiotique dans ladite cellule génétiquement modifiée,
(b) la culture des cellules obtenues à l 'étape (a) en présence dudit antibiotique,
(C ) la sélection des cellules viables .
Selon encore un autre aspect, l ' invention a pour objet l 'utilisation à titre de médicament d'une molécule d' acide nucléique, d' un polypeptide, d ' un vecteur d ' expression, d ' un anticorps , ou d ' une cellule génétiquement modifiée tels que décrits précédemment.
Selon encore un autre aspect, l ' invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre d' agent actif au moins une substance choisie parmi : i ) une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle correspond à a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; b) une séquence antisens de l ' une des séquences de a) , identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 64 , 66 , 67 , 68 , 70 à 72 , 75 à 81 et 84 , ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; c ) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro
SEQ ID n° 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente . ii) un polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 34 ou qu ' il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ
ID n° 35 à 61 ou un fragment desdits polypeptides ;
Hi) un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend une molécule d ' acide nucléique selon i ) de la présente revendication ; iv) un anticorps caractérisé en ce qu' il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 à 61 ou pour l ' une des séquences codées par les séquences en acide nucléiques identifiées dans la liste de séquence fournie en annexe sous les n° SEQ ID N0 2 , 9 à 11 , 27 , 28 et 34 ; v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu ' elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No . l à 34. Particulièrement, la composition pharmaceutique selon l ' invention, peut être destinée au diagnostic , au pronostic et/ou au traitement de pathologies liées à I 1 angiogenèse .
Selon une mise en œuvre particulière de l ' invention, la composition pharmaceutique peut être destinée au traitement des pathologies liées à l ' angiogenèse choisie parmi : les cancers , particulièrement au travers de la vascularisation et/ou de la proliférations des tumeurs , les rétinopathies , l ' arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, l ' athérosclérose, l ' hyperstimulation de l 'ovaire , le psoriasis , l ' endométrie associée à la néovascularisation, la resténose due à l ' angioplastie du ballon, la superproduction tissulaire due à la cicatrisation, la maladie vasculaire périphérique , l 'hypertension, l ' inflammation vasculaire, la maladie et les phénomènes de Raynaud, l ' anévrisme , la resténose artérielle, la thrombophlébite, la lymphagyte, le lymphodème , la cicatrisation et la réparation tissulaire , l ' ischémie, l ' angine, l ' infarctus de myocarde, la maladie chronique du cœur, les insuffisances cardiaques telles que l ' insuffisance cardiaque congestive, la dégénération maculaire liée à l ' âge et l 'ostéoporose .
Selon un autre aspect, l ' invention a pour objet l ' utilisation dans la préparation d ' une composition pharmaceutique destinée à inhiber l ' angiogenèse , caractérisée en ce qu 'elle comprend un agent actif inhibiteur de l ' angiogenèse choisi parmi : i . une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle correspond à a. une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 4 ou 5 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; b. une séquence antisens des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ
ID n° 1 à 3 , 6 à 34 , séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 62 à 64 ou 66 à 85 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; c. ou la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le n° SEQ ID N°86 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; ii . un polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 4 ou 5 ou qu ' il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides ; iii . un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend une molécule d ' acide nucléique selon i ) de la présente revendication ; iv. un anticorps caractérisé en ce qu' il a une affinité pour l ' une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides ; v. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4 ou 5 ou qu ' elle sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No . 1 à 3 et 6 à 34.
Selon un autre aspect, l ' invention a pour objet l ' utilisation dans la préparation d ' une composition pharmaceutique destinée à activer l ' angiogenèse, caractérisée en ce qu 'elle comprend un agent actif activateur de l ' angiogenèse choisi parmi : i ) une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu' elle comprend ou qu' elle correspond à a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 3 ou 6 à 34 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; b) la séquence antisens de l ' une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 4 ou 5 , séquence identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 65 , ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; ii ) au moins un polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 1 à 3 ou 6 à 34 ou qu ' il comprend ou consiste en un des polypeptides identifiés dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 , 36 , 39 à 61 ou un fragment desdits polypeptides ; iii ) un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend une molécule d ' acide nucléique selon i ) de la présente revendication ; iv) un anticorps caractérisé en ce qu' il a une affinité pour la séquence polypeptidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 , 36 , 39 à 61 ou un fragment desdits polypeptides ; v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 6 à 34 ou qu ' elle sous-exprime un gène ou sous-exprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No . 4 ou 5.
Selon un aspect particulier, un autre objet de l ' invention concerne toute séquence d ' acides nucléiques ( sous forme d'ADN ou d ' ARN) , comprenant ou consistant en au moins 10 mers d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences identifiées par les numéros SEQ ID No . l à SEQ ID No. 34 dans la liste de séquences en annexe, ou complémentaire d ' une telle séquence, de préférence au moins 15 mers .
Tout préférentiellement l ' invention a pour objet les séquences ayant une identité d'au moins 85%, de préférence de 95% et de manière particulièrement préférée de 100% avec une séquence choisie parmi les séquences identifiées sous les numéros SEQ ID N° 62 à SEQ ID N° 86 dans la liste de séquences en annexe . L ' invention concerne en particulier le RNAi (ARN interférence ) et plus spécifiquement un siRNA ( small interfering RNA) comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique double brin sous forme d ' ARN, d' au moins 10 mers , complémentaire d' un ARNm correspondant à l ' une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : 1 à SEQ ID No : 34.
Ainsi l ' invention a pour objet l ' utilisation d' un tel siRNA d' au moins 10 mers , de préférence d' au moins 15 mers comprenant ou consistant en un ARN complémentaire d ' une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : 1 à SEQ ID No : 34 dans la liste de séquences en annexe pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies liées à l ' angiogenèse . La présente invention concerne également une méthode de diagnostic d'une pathologie angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, consistant à détecter dans les cellules dudit mammifère la surexpression ou la sous- expression d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées par les numéros SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 34 dans la liste de séquences en annexe .
Une telle méthode de diagnostic comprend les étapes suivantes : la détection de l ' expression d'une ou plusieurs desdites séquences nucléotidiques SEQ ID N° 1 à SEQ ID N°34 , par une population cellulaire d'un mammifère,
- la détection de l 'expression de celle ( s ) même ( s ) séquence ( s ) par une population cellulaire de référence dont l ' état angiogénique est connu, - l ' identification des différences éventuelles du niveau d' expression de celle ( s ) même ( s ) séquence ( s ) par les deux populations cellulaires .
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic et de pronostic d'une pathologie angiogénique chez un mammifère , notamment chez un être humain, consistant à détecter dans les cellules dudit mammifère la surexpression ou la sous-expression d 'une ou plusieurs séquences polypeptidiques identifiées par les numéros SEQ ID No . : 35 à SEQ ID No . : 61 dans la liste de séquences en annexe .
Selon un mode de mise en œuvre préféré, ladite méthode comporte les étapes suivantes : a) la détection de l 'expression d' une ou plusieurs desdites séquences polypeptidiques SEQ ID No . : 35 à SEQ ID
No . : 61 par une population cellulaire d'un mammifère, b) la détection de l ' expression de celle ( s ) même ( s ) séquence( s ) polypeptidique( s ) par une population cellulaire de référence dont l 'état angiogénique est connu, c ) l ' identification des différences éventuelles du niveau d'expression de celle ( s ) même ( s ) séquence ( s ) polypeptidique ( s ) par les deux populations cellulaires .
Selon un mode particulier de mise en œuvre, dans la méthode de diagnostic de l ' invention la détection de l 'expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules endothéliales en présence d'un fluide biologique issu d'un patient .
La présente invention concerne également une méthode de vérification de l ' efficacité thérapeutique d'un traitement angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être humain, caractérisée en ce qu' elle comporte l ' identification
« in vitro » dans une population cellulaire dudit mammifère, de la surexpression ou de la sous-expression d ' au moins un gène impliqué dans un désordre angiogénique identifié par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 34.
Une telle méthode de vérification de l 'efficacité thérapeutique comprend les étapes suivantes : - la détection de l 'expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère auquel est administrée une composition thérapeutique destinée à traiter un désordre angiogénique, d' au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N0 1 à SEQ ID N0 34 ; la détection de l'expression ladite séquence nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l ' état angiogénique est connu, l ' identification d ' une éventuelle différence du niveau d' expression de ladite séquence par les deux populations cellulaires .
Selon des modes de réalisation préférés , la méthode de vérification est effectuée sur une population cellulaire d'un mammifère in vivo, ex-vivo, ou bien sur une population cellulaire isolée dudit mammifère in vitro
Selon un mode particulier de mise en œuvre, dans la méthode de vérification de l ' invention la détection de l 'expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules, particulièrement les cellules endothéliales, en présence d'un fluide biologique issu d'un patient .
La présente invention concerne également une méthode de criblage de composés utiles pour le traitement angiogénique d'un mammifère, notamment d 'un être humain.
Selon un mode de mise en œuvre préféré , une telle méthode de criblage comprend les étapes suivantes : a) la détection de l 'expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère mise en présence d'un composé susceptible d' avoir un effet thérapeutique sur un désordre angiogénique, d' au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N0 1 à SEQ ID N° 34 , b) la détection de l ' expression de la même séquence nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l ' état angiogénique est connu, c ) l ' identification des différences éventuelles du niveau d' expression de ( s ) celle ( s ) itιême ( s ) séquences nucléotidiques par les deux populations cellulaires . Selon un autre mode de mise en œuvre préféré, une telle méthode de criblage comprend également les étapes suivantes : la détection de l 'expression d'une ou plusieurs desdites séquences polypeptidiques identifiées par les numéros SEQ ID No . : 35 à SEQ ID No. : 61 dans la liste de séquences en annexe par une population cellulaire mise en présence d'un composé susceptible d' avoir un effet thérapeutique sur un désordre angiogénique,
- la détection de l ' expression de celle ou celles mêmes séquences polypeptidiques par une population cellulaire de référence dont l ' état angiogénique est connu,
- l ' identification des différences éventuelles du niveau d'expression de celle( s ) même( s ) séquence( s ) polypeptidique ( s ) par les deux populations cellulaires . Selon un mode particulier de mise en œuvre, dans la méthode de criblage de l ' invention la détection de l ' expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules , particulièrement les cellules endothéliales en présence d'un fluide biologique issu d'un patient . Parmi les désordres angiogéniques, susceptibles d'être diagnostiqués ou traités avec les compositions pharmaceutiques de l ' invention on peut citer : les cancers , particulièrement au travers de la vascularisation et/ou de la proliférations des tumeurs , les rétinopathies , l ' arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, l ' athérosclérose, l ' hyperstimulation de l 'ovaire , le psoriasis , l'endométrie associée à la néovascularisation, la resténose due à l ' angioplastie du ballon, la superproduction tissulaire due à la cicatrisation, la maladie vasculaire périphérique, l ' hypertension, l ' inflammation vasculaire, la maladie et les phénomènes de Raynaud, l ' anévrisme, la resténose artérielle, la thrombophlébite , la lymphagyte, le lymphodème, la cicatrisation et la réparation tissulaire, l ' ischémie, l ' angine , l ' infarctus de myocarde, la maladie chronique du cœur, les insuffisances cardiaques telles que l ' insuffisance cardiaque congestive, la dégénération maculaire liée à l ' âge et l ' ostéoporose .
L ' invention a également pour objet un dispositif comprenant un support comprenant une ou plusieurs sondes spécifiques d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : l à SEQ ID No : 34 dans la liste de séquences en annexe pour la mise en œuvre de la méthode de criblage de l ' invention, particulièrement d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 4 , 5 , 13 , 17 , 18 , 19 et 29 ,ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences .
Dans le cadre de la présente invention on entend par sonde tout fragment d 'ADN simple brin dont la séquence est complémentaire à une séquence recherchée : celle-ci pourra par exemple ainsi être décelée par hybridation avec une sonde marquée (par exemple par incorporation d ' atomes radioactifs ou de groupements fluorescents ) , qui joue le rôle d ' un "hameçon" moléculaire .
Selon des modes de mise en œuvre préférés , le support dudit dispositif est choisi parmi une membrane de verre, une membrane métallique, une membrane polymère , une membrane de silice . De tels dispositifs sont par exemple des puces à ADN comprenant une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : l à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe .
L ' invention a aussi pour objet une trousse destinée à la mesure de l ' affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant un dispositif tel que précédemment décrit, des amorces spécifiques et les accessoires nécessaires à l ' amplification des séquences extraites d'un échantillon, leur hybridation avec les sondes du dispositif et la réalisation des mesures de l ' affichage différentiel .
L' invention a aussi pour objet une trousse destinée à la mesure de l ' affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant une lignée de cellules génétiquement modifiées exprimant de manière stable le vecteur exprimant au moins une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : l à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe, ou un de leurs fragments en tant que population cellulaire de référence et les moyens nécessaires pour la mesure dudit affichage différentiel .
L' invention a aussi pour objet une trousse destinée à la mesure de l ' affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant une lignée de cellules génétiquement modifiées exprimant de manière stable le vecteur exprimant au moins une séquence antisens d'une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : l à SEQ ID No : 34 dans la liste de séquences en annexe , ou un de leurs fragments , en tant que population cellulaire de référence et les moyens nécessaires pour la mesure dudit affichage différentiel .
La vérification de l ' implication des 34 gènes identifiés et de leurs homologues dans le mécanisme de l ' angiogenèse a été effectuée selon la méthodologie décrite dans la section Matériel et méthodes .
Cette implication est illustrée à l ' aide des figures 1 à 11 en annexe , dans lesquelles :
La figure 1 montre que l ' expression de GS-Vl , GS-V2 , GS-V3 et GS-V5 dans les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires et que l'expression de GS-V4 chez les cellules endothéliales humaines stimule la formation des tubes capillaires : cellules endothéliales transfectées avec IA) GS-Vl codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-Nl; IB) GS-V2 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N2 ; IC) GS-V3 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N3 ; ID) GS-V4 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N4 et son homologue GS-N5 ; IE ) GS-V5 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N6 et son homologue GS- N7 , et le transcrit antisens spécifique de GS-N8 et ses homologues GS-N9, GS-NlO et GS-NlI; IF) le vecteur vide (Contrôle) . La figure 2 montre que l ' expression de GS-V6 / GS-V7 , GS-V8 , GS-V9 et GS-V10 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires : cellules endothéliales transfectées avec 2A) GS-V6 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N12 ; 2B) GS-V7 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N13 ; 2C ) GS-V8 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS- N14 ; 2D) GS-V9 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N15 ; 2E ) GS-VlO codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-16 ; 2F) le vecteur vide (Contrôle ) . La figure 3 montre que l 'expression de GS-VIl , GS-V12 , GS-V13 , GS-V14 , GS-V15 , chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires : cellules endothéliales transfectées avec 3A) GS-VlI codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N17 ; 3B) GS-V12 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N18 et son homologue GS-N19 ; 3C) GS-V13 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N20 ; 3D) GS-V14 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N21 ; 3E ) GS-V15 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N22 ; 3F) le vecteur vide ( Contrôle ) .
La figure 4 montre que l 'expression de GS-V16 , GS-V17 , GS-V18 , GS-V19 , GS-V20 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires : cellules endothéliales transfectées avec 4A)GS-V16 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N23 ; 4B)GS-V17 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N24; 4C )GS-V18 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N25 ; 4D)GS-V19 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N26 et ses homologues GS-N27 et GS-N28 ; 4E )GS-V20 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N29 et 4F ) le vecteur vide (Contrôle) .
La figure 5 montre que l ' expression de GS-V21, GS-V22 ,
GS-V23 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la formation des tubes capillaires : cellules endothéliales transfectées avec 5A)GS-V21 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N30 ; 5B) GS-V22 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N31 , et ses homologues
GS-N32 et GS-N33 ; 5C )GS-V23 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N34 ; 5D) Ie vecteur vide
(Contrôle) .
MATÉRIEL ET METHODES
1.Culture des cellules et test d 'angiogenèse Des cellules endothéliales de veines ombilicales (HUVEC ) sous lesdites quatre conditions de culture sont alors utilisées pour identifier les gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l ' angiogenèse .
Les cellules endothéliales sont maintenues en milieu complet (EGM-2 de Clonetics ) .
Pour l ' identification des gènes impliqués dans l ' angiogenèse dans les test in vitro de l ' angiogenèse selon le modèle de Montesano et al. ( 1986 , Proc Natl Acad Sci U S A, 83 ( 19 ) .7297-301 ) . Les cellules sont tout d' abord ensemencées sur un gel de Collagène type I en milieu complet jusqu ' à confluence . Puis , les cellules HUVEC de référence sont cultivées en milieu appauvri en sérum et sans facteurs de croissance : EBM-2 + 2% de sérum et différents facteurs sont ajoutés dans les conditions test.
Le FGF2 : à des concentrations comprises entre 5 ng/ml et 60 ng/ml, de préférence entre 10 et 40 ng/ml ; du VEGF : à des concentrations comprises entre 10 ng/ml et 60 ng/ml, de préférence comprises entre 30 ng/ml et 50 ng/ml ; du PF4 : à de concentrations comprises entre 0 , 1 et 5 μg/ml , de préférence comprises entre 0 , 5 μg/ml et 1 μg/ml ; du TNF-α à des concentrations comprises entre 20 ng/ml et 100 ng/ml , de préférence comprises entre 30 ng/ml et 60 ng/ml ; du IFN-γ : à des concentrations comprises entre 50 ng/ml et 200 ng/ml , de préférence comprises entre 80 ng/ml et 120 ng/ml ; de l 'Ang-2 : à des concentrations comprises entre 20 ng/ml et 800 ng/ml, de préférence comprises entre 200 ng/ml et 400ng/ml ;
Les cellules endothéliales humaines placées sous les quatre conditions de culture précitées sont alors utilisées pour identifier des gènes codant pour les constituants cellulaires impliqués dans la régulation de l ' angiogenèse . 2. Facteurs angiogéniques et angiostatiques . Des facteurs angiogéniques et angiostatiques , ayant un effet sur l ' expression des gènes identifiés en corrélation avec la formation de néovaisseaux ou l ' inhibition de néovaisseaux respectivement, utilisés , à titre d' exemple, dans le cadre de la présente invention, sont illustrés ci- dessous . VEGF = Facteur de croissance endothélial vasculaire . FGF2 ≈ Facteur de croissance basique du fibroblaste . PF4 ≈ Facteur plaquettaire 4. Ang-2 = Angiopoiètine 2 IFN-γ = Interféron gamma. TNF-α = Facteur de nécrose tumorale alpha Le TNF-α qui est un régulateur de l ' angiogenèse , il peut induire l ' angiogenèse in vivo mais également inhiber la formation des vaisseaux in vitro (Frater-Schroder et al, 1987 , Proc Natl Acad Sci U S A, 84 ( 15 ) : 5277-81 ; Fajardo et al, 1992 , Am J Pathol Mar, 140 ( 3 ) : 539-44 ; Niida et al, 1995 , Neurol Med Chir (Tokyo) , 35 ( 4 ) : 209-14. Dans notre modèle d' angiogenèse in vitro, le TNF-α est utilisé dans des conditions d' inhibition de l ' angiogenèse . 3. Comparaison des expressions géniques .
Les expressions géniques peuvent être alors comparées en utilisant les puces d'ADN, le SAGE , une réaction d' amplification par PCR quantitative, les vecteurs viraux pour construire des banques soustractives , ou encore l' analyse par affichage différentiel.
Dans le cadre des travaux expérimentaux ayant conduit à la présente invention, la Demanderesse a utilisé préférentiellement la technique d' affichage différentiel pour l ' identification desdits gènes . Affichage différentiel
Les ARN totaux sont préparés à partir des cellules
HUVEC cultivées sur un gel de collagène en présence des différents facteurs utilisés , selon la méthode RNeasy Mini kit (Qiagen) en intégrant une étape de digestion à la DNase I selon le protocole préconisé par le fabricant .
L ' affichage différentiel à partir des ARNs totaux est réalisé selon la méthode décrite par Liang et Pardee ( 1992 , Science , 14 ; 257 ( 5072 ) : 967-7 )en utilisant l 'αP33-ATP en dilution isotopique au cours de l ' amplification par PCR pour la visualisation des bandes par autoradiographie des gels d' électrophorèse .
Ainsi, les fragments d ' ADN différentiellement présents sur le gel en fonction des conditions de culture analysées sont découpés , réamplifiés , clones dans un plasmide PGEM easy vector, Promega) , séquences et identifiés par questionnement de la banque BLAST.
4. Vérification de l ' implication des gènes identifiés dans le mécanisme de l 'angiogenèse.
Test de fonctionnalité des gènes
Dans une deuxième étape, la fonctionnalité de chaque séquence identifiée est testée sur le modèle d ' angiogenèse in vitro avec les cellules endothéliales humaines transfectées avec un vecteur d ' expression comprenant un oligonucléotide antisens de ladite séquence .
Pour la construction de ces vecteurs , l ' amplification du fragment clone dans le plasmide bactérien est effectuée au moyen d ' amorces particulières , choisies parmi les séquences GS-PGS-F, GS-PGM-R ou GS-PGM-F et GS-PGS-R s ' hybridant aux régions du plasmide encadrant le gène clone et comprenant également dans leurs extrémités les sites de restriction ( sites Sali et MIuI) , non contenus dans le fragment clone , et présents dans la région multisite du vecteur d' expression.
Ces deux sites de restriction pouvant être interchangés selon que le fragment ait été clone dans le plasmide bactérien dans son orientation sens ou antisens .
Ces amorces (voir demande de brevet internationale publiée sous le n° WO 01/218312 ) sont indiquées sur le Tableau I ci-dessous : Tableau I
Figure imgf000026_0001
Des contrôles effectués avec ces amorces , que l 'on peut considérer comme des amorces universelles , en absence du gène clone, (plasmide vide ) ont montré que le fragment amplifié du plasmide ( 40 paires de bases ) lorsqu' il est intégré dans le vecteur d'expression n' altère pas la formation des néovaisseaux dans le test de fonctionnalité in vitro. Les résultats obtenus avec ce vecteur ainsi construit sont identiques à ceux obtenus avec le vecteur vide (Résultats non montrés ) et montrent que ces paires de bases supplémentaires n' altèrent pas l 'effet des fragments antisens spécifiques de la séquence identifiée .
Ces amorces contiennent à chacune de leurs extrémités , un site d ' une enzyme de restriction différente ( Sali : GTCGAC ou MIuI : ACGCGT) .
Des fragments amplifiés de chaque gène sont obtenus par PCR à partir des plasmides bactériens contenant le fragment du gène identifié en utilisant lesdites amorces . Ces fragments sont purifiés, digérés par les enzymes de restriction Sali et MIuI et insérés dans un vecteur d ' expression chez les mammifères du type pCi-neo vector, (Promega) , lui-même digéré par ces deux enzymes de restriction. Chaque fragment est introduit dans l ' orientation antisens .
D 'une façon générale, les vecteurs susceptibles d' être utilisés pour la mise en évidence de la fonctionnalité des gènes identifiés dans la présente invention dans le mécanisme de l ' angiogenèse comprennent tout système de vecteurs d' expression chez les mammifères comprenant un promoteur qui permet l ' expression d'un gène clone, à titre d' exemple on peut citer le promoteur « fort » du cytomégalovirus humain (CMV) . D ' autres vecteurs d'expression constitutifs ou inductibles susceptibles d' être également utilisés , sont indiqués dans la liste non-exhaustive ci-après indiquée :
Vecteurs commercialisés par la Société Promega ; des vecteurs avec un promoteur « fort » pour un haut niveau d ' expression constitutif des gènes chez les cellules de mammifères (pCI Mammalian Expression vector, Expression Vector System cloning vector pALTER(R) *-MAX) , des vecteurs commercialisés par la société Invitrogen : (pcDNA3.1 , /hygro, -/Zeo, pcDNA4/HisMAx, -E, paires de basesudCE4 , pRcRSV, pRcCMV2 , pSecTag2 , - /hygro sécrétion vectors , les vecteurs pEBVHis A, B et C) , des vecteurs d'expression chez le mammifère commercialisés par la société Clontech (pIRES, pIRES-EYFP pIRES2-EGFP , pCMV-Myc et pCMV-HA ) , Epitope- Tagged pTRE, les vecteurs VP16 Minimal Domain (ptTA 2 , ptTA 3 et ptTA 4 ) , les vecteurs d 'expression Tet bidirectionnels ( paires de basesl , paires de basesI-EGFP , paires de basesl- G, paires de basesI-L) , pRevTRE, pTRE2 , pLEGFP-Nl Vecteur Retroviral pLEGFP-Cl , les systèmes d'expression adenoviraux Adeno-X , pCMS-EGFP, pdlEGFP-Nl, pd2ECFP-Nl , pd2EYFP-Nl , pEGFP ( -Cl , -C2 , -C3 , -Nl , -N2 , -N3 ) , pEYFP-Cl , -Nl .
Chaque vecteur comprenant ledit fragment anti-sens est alors produit chez E . CoIi , extrait, purifié et quantifié . Un jug de chaque vecteur est incubé en présence d'un agent transfectant (effectene, Qiagen) en suivant le protocole préconisé par le fabricant avec les cellules endothéliales . Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules endothéliales sont trypsinées et étalées sur la matrice extracellulaire contenant les facteurs angiogéniques en l 'occurrence le matrigel selon le modèle décrit par Grant et al , ( 1989 ,CeIl , 58 ( 5 ) : 933-43 ) . Après 24h d ' incubation, la formation de vaisseaux est observée et comparée aux cellules témoins transfectées avec le vecteur d ' expression de mammifère vide. 5. Etablissement de la banque de lignées stables exprimant les vecteurs d'expression contenant les séquences des gènes ou leurs fragments ou les séquences antisens .
Les systèmes d ' expression peuvent comprendre un marqueur de sélection à un antibiotique (un gène de résistance à un antibiotique) , pour sélectionner les cellules transfectées exprimant de façon stable le vecteur comprenant l ' acide nucléique clone dans ledit vecteur et ce, soit dans le même vecteur, soit dans un 2ème vecteur co- transfecté .
Ce vecteur d'expression peut être un système d' expression constitutif ou inductible .
Dans l ' exemple particulier ci-dessous décrit, les lignées stables pour l 'expression de l 'oligonucléotide antisens correspondant à chaque gène identifié ont été obtenues avec un vecteur d 'expression constitutif et après sélection en présence d' antibiotique .
Pour ce faire, 24h après la transfection effectuée dans les conditions décrites ci-dessus , les cellules endothéliales BAEC sont trypsinées et ensemencées à raison de 80 000 cellules/puits en plaque de six puits en présence de 700 μg/ml de l ' antibiotique G418 (Promega) . Un puit contrôle est ensemencé avec des cellules non transfectées .
Le milieu est changé tous les trois jours avec une recharge de l ' antibiotique. Les cellules contrôles sont éliminées après 8 à 10 jours , les cellules résistantes à l ' antibiotique sont récoltées à confluence ( après 2 à trois semaines ) puis transférées en flacons de culture toujours en présence de l ' antibiotique . Les lignées stables sont ensuite testées pour leur capacité à former ou non des vaisseaux dans le test d' angiogenèse in vitro.
6. Résultats
6.1 Identification des gènes .
Les séquences d' acide nucléiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe par les n° SEQ ID N° 1 , 2 , 4 , 5 , 9 à 11 , 13 , 17 à 19 , 27 à 29 et 34 et les protéines identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe par les n° SEQ ID N° 35 , 37 , 38 , 43 , 47 à 49 et 57 n ' ont pas été identifiées auparavant comme ayant un rôle biologique quelconque, et encore moins comme ayant un rôle dans le processus de l ' angiogenèse ou la différentiation des cellules endothéliales en tubes capillaires . Ces protéines sont décrites ci-dessous . La méthode d' affichage différentielle ci-dessus décrite a permis l ' identification des ARNm suivants :
- GS-Nl : ARNm de 1041 paires de bases , identifié par la séquence SEQ ID No : 1 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC002759.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 213 au nucléotide 482. Une protéine , GS- Pl ,résultant de la traduction de cet ARNm, ( SEQ ID No 35 dans la liste de séquences en annexe ) , a été identifiée . Cette protéine est composée de 89 acides aminés .
- GS-N2 : ARNm de 4275 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 2 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC040192. - GS-N3 : ARNm de 6104 bp identifié par la séquence SEQ ID No : 3 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession XM_497078.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 438 au nucléotide 5687. Une protéine, GS-P2 , ( SEQ ID No 36 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm, a été identifiée . Cette protéine est composée de 1749 acides aminés , est appelée Nucléoporine 188. La nucléoporine 188kDa fait partie de la famille d'une trentaine de protéines appelées les nucléoporines qui constituent sur la double membrane nucléaire des larges structures protéiques formant des pores nucléaires et servant de sites de translocation de macromolécules entre le noyau et le cytoplasme . Des études ont montré qu'une nucléoporine a un rôle unique dans la régulation de la fonction du pore nucléaire et le transport de protéines et ARNs . Leur rôle a été plus clair avec la mise en évidence de leur association avec des maladies spécifiques (revue : Cronshaw et Matunis ,Trends Endocrinol Metab. 2004 Jan- Feb; 15 ( 1 ) : 34-9. ) . Par exemple , la surexpression de la nucléoporine NUP88 a été associée à une haute agressivité du cancer du sein (Agudo et al, Int J Cancer. 2004 May 1; 109 ( 5 ) : 717-20 ) . Des rôles spécifiques ont été aussi démontrés par d ' autres types d'études , ainsi par exemple, un rôle spécifique a été suggéré pour la nucléoporine 98kDa (NUP98 ) : la répression de l 'expression de cette protéine par la technique des RNai, a permis à certains auteurs de mettre en évidence une altération spécifique de la structure du pore nucléaire et de certaines fonctions comme l 'entrée du cDNA du virus HIV dans le noyau suggérant que cette protéine participerait à l 'entrée du cDNA du virus dans le noyau(Ebina et al , Microbes Infect. 2004 Jul; 6 ( 8 ) : 715-24 ) . Autre exemple, La nucléoporine P62 a été impliquée dans le transport de facteurs activateurs de transcription (STAT3 ) vers le noyau des neurones lorsque ces cellules sont stimulées par l ' angiotensine II (Lu et al , Neurosci . 1998 Feb 15 ; 18 ( 4 ) : 1329-36 ) . Concernant la protéine NUP188 , aucun rôle spécifique n' a été encore démontré, son rôle notamment dans la régulation de l ' angiogenèse n' a pas encore été décrit.
- GS-N4 : ARNm de 1768 bp, identifié par la séquence SEQ ID No : 4 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC002509.
La séquence de cet ARNm (GS-N4 ) présente une séquence codante du nucléotide 176 au nucléotide 1387. Une protéine, GS-P3 , (SEQ ID No 37 dans la liste de séquences en annexe) résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée . Cette protéine est composée de 403 acides aminés .
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N5.
- GS-N5 : ARNm de 1552 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 5 dans la liste de séquences en annexe .
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC008630.
La séquence de cet ARNm (GS-N5 ) présente une séquence codante partielle du nucléotide 1 au nucléotide 949. Une protéine, GS-P4 , ( SEQ ID No 38 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm, homologue à la protéine GS-P3 , composée de 315 acides aminés a été identifiée .
Cette nouvelle protéine de 44kDa contient un domaine PHD Zinc finger, motif principalement trouvé dans les protéines impliquées dans la régulation de la transcription chez les eucaryotes ( revue : Trends Biochem Sci . 1995 Feb; 20 ( 2 ) : 56-9 ) .
- GS-N6 : ARNm de 3181 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 6 dans la liste de séquences en annexe .
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_170707.
La séquence de cet ARNm (GS-N6 ) présente une séquence codante du nucléotide 213 au nucléotide 2207. Une protéine , GS-P5 , ( SEQ ID No 39 dans la liste de séquences en annexe) , appelée lamine A/C isoforme 1 , résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 664 , a été identifiée .
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N7.
- GS-N7 : ARNm de 2404 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 7 dans la liste de séquences en annexe .
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession X03444.
La séquence de cet ARNm (GS-N7 ) , présente une séquence codante du nucléotide 211 au nucléotide 2319. Une protéine, GS-P6 , ( SEQ ID No 40 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 702 acides aminés , appelée précurseur de la lamine A, a été identifiée . Le gène LMNA code pour une protéine appelée lamine A/C isoforme 1. Les lamines sont les composants principaux de la lamina nucléaire . Ces protéines sont importantes dans une variété de fonctions cellulaires telles que l ' assemblage nucléaire , réplication, transcription et intégrité nucléaire ( revue : Curr Opin CeIl Biol . 2002 Jun; 14 ( 3 ) : 357-64 ) . Des mutations de la lamine A/C a été liée a plusieurs maladies telles que des dystrophies musculaires ou maladies cardiovasculaires (revue : Trends Cardiovasc Med. 2001 Oct; ll ( 7 ) : 280-5 ) ; la perte d' expression de ce gène a été rapportée dans une forme de cardiopathie dilatée (Virchows Arch. 2003 Nov; 443 (5 ) : 664-71. Epub 2003 JuI 26 ) . Mais à ce jour, aucune implication de ce gène n' a été décrit dans la régulation de l ' angiogenèse .
- GS-N8 : ARNm de 2570 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 8 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AB005047.
La séquence de cet ARNm (GS-N8 ) présente une séquence codante du nucléotide 64 au nucléotide 1341. Une protéine, GS-P7 , ( SEQ ID No 41 dans la liste de séquences en annexe) , résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée . Cette protéine est composée de 425 acides aminés et est appelée protéine SAB.
La protéine SAB est une protéine liant le domaine SH3 , son rôle dans la voix de signalisation de la tyrosine kinase de Bruton (Btk) a été suggéré par la mise en évidence de sa liaison avec le domaine SH3 de cette kinase (Biochem Biophys Res Commun. 1998 Apr 17 ; 245 ( 2 ) : 337-43 ) . Son rôle dans la voix de signalisation de la protéine c-Jun N-terminal kinase a été également suggéré (Biochem J. 2002 Nov 1 ; 367 (Pt 3 ) : 577-85 ) . Par ailleurs , la c-Jun N-terminal kinase a été montrée impliquée dans l ' angiogenèse (Jimenez et al , Oncogene . 2001 Jun 7 ; 20 ( 26 ) : 3443-8 ) et plus récemment, l ' expression augmentée de la Btk a été observée au cours de l ' angiogenèse in vivo ( 2004 , Zippo et al , Blood) .
Cependant, à ce jour aucune implication de la protéine SAB n' a été démontrée dans l' angiogenèse .
Cette séquence présente une homologie de séquence avec les séquences GS-N9 , GS-NlO , GS-NlI inférieure à 90 % . Toutefois ces 4 séquences présentent une séquence conservée dont I 1 antisens , identifié dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ÏD N° : 67 , permet l ' inhibition de l ' expression. - GS-N9 : ARNm de 2190 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 9 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d ' accession AK090524.
- GS-N10 : ARNm de 5593 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 10 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AL133111
- GS-NIl : ARNm de 2774 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 11 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BX641159.
- GS-N12 : ARNm de 8974 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 12 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_015382
La séquence de cet ARNm ( GS-N12 ) présente une séquence codante du nucléotide 324 au nucléotide 8162. Une protéine, GS-P8 , ( SEQ ID No 42 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée . Cette protéine est composée de 2612 acides aminés , et est appelée protéine HECT domain containing 1 (HECTDl ) .
La protéine HECTDl est rangée par son domaine conservé dans la famille de protéines HECT qui fonctionnent comme des protéines ubiquitine ligases E3 , ciblant des protéines spécifiques pour la protéolyse contrôlée par l 'ubiquitine (Callaghan et al, Oncogene, 1998 Dec 31 ; 17 (26 ) : 3479-91 ) . A titre d ' exemples , la protéine Smurfl, autre membre de cette famille joue un rôle spécifique dans la différentiation des cellules ostéoblastes et la formation de l ' os in vivo en inhibant cette différentiation ( Zhao et al , J Biol Chem. 2004 Mar, 26 ; 279 ( 13 ) : 12854-9 ) . La protéine Nedd4 , également un membre de la famille HECT a été décrite comme régulant la stabilité et donc l ' activité du récepteur du facteur de croissance IGF-I ( insulin-like growth factor I ) (Mol CeIl Biol . 2003 May; 23 ( 9 ) : 3363-72. Le rôle spécifique de HECTDl n' est pas encore décrit dans la littérature, et en particulier aucun rôle dans la régulation de l ' angiogenèse n' a été décrit pour cette protéine . - GS-N13 : ARNm de 5346 paires de bases identifié sous le numéro de séquence SEQ ID No 13 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession XM_291344. Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 1 au nucléotide 3522. Une protéine, GS-P9 , (SEQ ID No 43 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm a donc été identifiée . Cette protéine est composée de 1173 acides aminés . Cette protéine encore inconnue est caractérisée par un domaine catalytique tyrosine kinase .
- GS-N14 : ARNm de 3769 paires de bases identifié sous le numéro de séquence SEQ ID No 14 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM__181847.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
469 au nucléotide 2037. Une protéine, GS-PlO , ( SEQ ID No 44 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm a donc été identifiée . Cette protéine est composée de 522 acides aminés et est appelée AMIG02.
La protéine Amigo 2 a été découverte récemment et a été classée dans une nouvelle famille de gènes codant pour des protéines transmembranaires de type I qui contiennent une séquence signal de sécrétion et un domaine transmembranaire
(Kuja-Panula et al , J CeIl Biol . 2003 ; 160 ( 6 ) : 963-73 ) . Ces auteurs ont suggéré que ce sont de nouvelles molécules d' adhésion, elles sont exprimées sur les fibres des neurones et participeraient à leur formation.
La protéine Amigo 2 reste encore mal connue, elle n ' a encore jamais été décrite comme impliquée dans 1 ' angiogenèse .
- GS-N15 : ARNm de 7407 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 15 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_005650 s
Cet ARNm présente une région codante du nucléotide 135 au nucléotide 6017. Il a donc été identifié une protéine, GS-PlI , ( SEQ ID No 45 dans la liste de séquences en annexe) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 1960 acides aminés , et est appelée facteur de transcription 20 , isoforme 1 (TCF20 ) .
Cette protéine, également appelée SPBP , a été décrite à l ' origine comme étant un facteur de transcription qui contrôle l ' expression de la stromolysine, une metalloproteinases impliquée dans l ' invasion de tumeurs et les métastases ( Sanz et Mol . CeIl . Biol . 15 ( 6 ) , 3164-3170 ( 1995 ) .Plus récemment, il a été rapporté que cette protéine nucléaire contient plusieurs domaines fonctionnels et qu' elle stimule l ' activité transcriptionnelle de facteurs de transcription variés tels que Etsl ou C-Jun, elle est suggérée être un coactivateur transcriptionnel (Rekdal et al, J Biol Chenu 2000 Dec 22 ; 275 (51 ) : 40288-300 ) .
A ce jour, aucune implication dans la régulation de 1 ' angiogenèse n' a été décrite pour cette protéine .
— GS-N16 : ARNm de 2104 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 16 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_016408.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 125 au nucléotide 1888. Il a ainsi été identifié une protéine GS-P12 , ( SEQ ID No 46 dans la liste de séquences en annexe) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 587 acides aminés , et est appelée protéine 1 associée à la sous unité régulatrice CDK5 (CDK5RAP1 ) .
Cette protéine également appelée C42 , ou HSPC167 , a été isolée et montrée s ' associer à une sous unité activatrice (p25nck5a dérivée de p35nck5a) d'une protéine kinase associée au cycle cellulaire appelée protéine kinase dépendante des cyclines , la CDK5 (Ching et Wang, Gène . 2000 Jan 25 ; 242 ( 1- 2 ) : 285-94 ) . Chez les cellules en division, les cdks , régulent la prolifération, différentiation, sénescence, et apoptose . La CDK5 neuronale a été impliquée dans la régulation de la différentiation et la migration neuronale . L ' activité des protéines Cdk est régulée par des mécanismes complexes incluant la phosphorylation de protéines , l ' association avec des inhibiteurs spécifiques . Pour la Cdk5 , deux activateurs ont été identifiés la p35"σA5a, et son isoforme, la p39πck5ai. La protéine CDK5RAP1 a été montré inhiber l ' activité kinase de la CDK5 neuronale en s ' associant à la p35nσ*5a fChing et al, J. Biol . Chem. , Vol . 277 , Issue 18 , 15237-15240 , May 3 , 2002 ) . D ' autre part, récemment, l ' augmentation d' expression de la CDK5 et son rôle dans la prolifération et l ' apoptose chez les cellules endothéliales (BAE ) en prolifération stimulées par le bFGF ont été rapportés ( Sharma et al , J CeIl Biochem. 2004 Feb l ; 91 ( 2 ) : 398-409 ) .
Par contre , à ce jour, aucune implication de la CDK5RAP1 n' a été démontrée dans la régulation de l ' angiogenèse - GS-N17 : ARNm de 5859 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 17 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AK074056.
Cet ARNm, (GS-N17 ) , présente une séquence codante partielle du nucléotide 45 au nucléotide 935.
Il a été ainsi identifié une nouvelle protéine, GS-P13 , ( SEQ ID No 47 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 296 acides aminés . Cette protéine inconnue, de 33kDa, contient des domaines BTB/POZ et Kelch, le domaine BTB/POZ est un domaine conservé d ' interaction protéine-protéine (Xu et al, Int J Mol Med. 2004 Jan; 13 ( 1 ) : 193-7. décrits impliqués dans les processus de régulation et transduction du signal (NCBI , Conserved Domain Search) . Cependant, les protéines contenant ces domaines constituent une large famille dont les fonctions physiologiques restent encore mal connues (Ohmachi et al, Gènes Cells . 1999 Jun; 4 ( 6 ) : 325-37. Un membre de cette famille a déjà été décrit impliqué dans un processus tel que la migration dirigée des cellules chez la drosophile . (Development, 2001 Aug; 128 ( 15 ) : 3001-15 ) .
- GS-N18 : ARNm de 1694 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 33 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC001792.
Cet ARNm, (GS-N18 ) , présente une séquence codante du nucléotide 164 au nucléotide 448. Il a été ainsi identifié une protéine, GS-P14 , (SEQ ID No 48 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 94 acides aminés .
Cette protéine de 1OkDa n' a aucun domaine particulier mais contient une séquence signale de sécrétion et une hélice transmembranaire . Cette séquence est homologue de la séquence GS-N19.
- GS-N19 : ARNm de 2437 paires de bases identifié par la séquence SEQ ID No : 19 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AF370373. Cet ARNm ( GS-N19 ) présente une séquence codante du nucléotide 628 au nucléotide 1533. Une protéine, GS-P15 , ( SEQ ID No 49 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm a ainsi été identifiée . Cette protéine , isoforme de la protéine GS-P14 , est composée de 301 acides aminés .
Cette isoforme est caractérisée par un domaine appelé ubiquitine, de la famille des ubiquitines , molécules impliquées dans la protéolyse des protéines qui régule le « turnover des protéines » , afin de contrôler la progression du cycle cellulaire .
Ces 2 isoformes sont également caractérisés par une séquence signal d ' excrétion.
— GS-N20 : un ARNm de 1714 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 20 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC022870 dans la base de séquences GENBANK.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 90 au nucléotide 1424. Il a été ainsi identifié une protéine GS-P16 résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 444acides aminés . Elle est identifiée sous le numéro SEQ ID No 50 dans la liste de séquences en annexe, appelée protéine 44 induite par l ' interféron ( IFI44 ) .
Le gène codant pour un nouvel antigène la protéine, p44 a été isolé a l ' origine chez le chimpanzé infecté par un virus de l ' hépatite (Takahashi et al, 1990 , J Gen Virol . , 71 (Pt 9 ) : 2005-ll ) . Par la suite, il a été identifié chez l ' homme comme étant inductible par l ' interféron (Kitamura et al, Eur J Biochem. 1994 Sep 15 ; 224 ( 3 ) : 877-83 ) . A ce jour, cette protéine n' a pas été décrite comme étant impliquée dans l ' angiogenèse .
— GS-N21 : ARNm de 1715 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 21 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_004905 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm, GS-N21 , présente une séquence codante du nucléotide 52 au nucléotide 726. Il a été ainsi identifié une protéine, GS-Pl7 , (SEQ ID No 51 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 224 acides aminés , appelée peroxiredoxine 6 (PRDX6 ) .
La protéine peroxiredoxine 6 (également appelée antioxidant protein 2 ; non-selenium glutathione peroxidase; acidic calcium-independent phosphόlipase A2 , l-Cys peroxiredoxin) appartient à la famille grandissante et ubiquitaire de peroxiredoxines qui sont des enzymes multifonctionelles avec une peroxidase in vitro, and in vivo participent dans beaucoup de processus cellulaires connus pour être sensible aux oxygène réactifs tels que les processus physiopathologiques incluant l ' adaptation à l ' oxygène , l ' athérosclérose , le cancer , la différentiation cellulaire (WAGNER et al , Biochem. J. ( 2002 ) 366 ) : 777-785. Une récente étude décrit que PRDX6 est un unique antioxidant non redundant qui fonctionne indépendamment des autres peroxiredoxines et protéines antioxidantes . Très abondantes dans les cellules épithéliales , PRDX6 a été trouvée dans le cytosol (Wang et al, J. Biol . Chem. , Vol . 278 , Issue 27 , 25179-25190 , JuIy 4 , 2003 ) . Elle a également été trouvée dans les cellules endothéliales , uniquement dans le cytosol ( Stuhlmeier et al, Eur J Biochem. 2003 Jan; 270 ( 2 ) : 334-41 ) .
A ce jour cette protéine n' a pas été décrite avoir un rôle dans la régulation de l ' angiogenèse .
— GS-N22 : ARNm de 5978 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 22 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AF220037 dans la base de séquences GENBANK. Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 1801 au nucléotide 3933. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P18 , (SEQ ID No 52 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm composée de 710 acides aminés et appelée protéine motif tripartite isoform beta, TRIM9.
La protéine TRIM9 appartient a une famille caractérisée par un domaine conservé, le motif tripartite (TRIM) . Le TRIM est composé de Trois domaine de liaison du zing, un RING(R) , un B-box type 1 (Bl ) et un B-box type 2 (B2 ) suivis par une région coiled-coil . Ces protéines partagent une fonction commune par le fait d'une homo-multimérisation, chacune d 'entre elles est associée à un compartiment spécifique de la cellule , la protéine TRIM9 a été rapportée cytoplasmique (EMBO J. 2001 May 1; 20 ( 9 ) : 2140-51 ) . Le questionnement de la banque de donnée de NCBI sur les domaines conservés montre que la protéine TRIM9 contient également un domaine fibronectine Type III , module présent à la fois dans les protéines extracellulaires et intracellulaires . Les gènes de la famille des TRIM ont été impliqués dans des processus variés , tels que le développement et la croissance cellulaire et l 'oncogénèse et autres pathologies (EMBO J. 2001 May l; 20 ( 9 ) : 2140-51 ; Berti et al, Mech Dev. 2002 May; 113 ( 2 ) : 159-62. ) • TRIMlI , par exemple, jouerait un rôle dans la régulation du niveau d' expression intracellulaire d' un peptide neuroprotecteur qui supprime spécifiquement la neurotoxicité liée à la maladie d'Alzheimer à travers la voie de dégradation des protéines contrôlée par les ubiquitines (Niikura et al , Eur J Neurosci . 2003 Mar; 17 ( 6 ) : 1150-8. TRIM9 est encore mal connu, à l ' heure actuelle, il a été rapporté que TRIM9 est principalement confiné dans le système nerveux central .
Son rôle n 'est pas encore défini et à ce jour aucun rôle dans la régulation de l ' angiogenèse n' a été décrit pour TRIM9.
— GS-N23 : ARNm de 5858 bp identifié sous le numéro SEQ ID No 23 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d ' accession AF213987 dans la base de séquences GENBANK. Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 66 au nucléotide 2213. Il a ainsi été identifié une protéine , GS-P19 , ( SEQ ID No 53 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 715 acides aminés et est appelée protéine MCEF . La protéine MCEF a été décrite comme un nouveau membre de la famille des facteurs de transcription AF4 impliqués dans les leucémies lymphoblastiques Estable et al, J Biomed Sci . 2002 May-Jun; 9 ( 3 ) -.234-45 ) .
La protéine MCEF est encore très peu étudiée et à ce jour, aucun rôle dans la régulation de l ' angiogenèse n ' a été décrit pour cette protéine .
- GS-N24 : ARNm de 3907 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 24 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_012318 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 298 au nucléotide 2517. Une protéine, GS-P20 , ( SEQ ID No 54 dans la liste de séquences en annexe ) , de 739 acides aminés , appelée protéine transmembranaire 1 contenant un domaine «leucine zipper-EF-hand» (LETMl ) a ainsi été identifiée .
La protéine LETMl contient deux domaines «EF-Hand» , un domaine transmembranaire, un domaine leucine Zipper et plusieurs domaines coiled-coil. Sur la base de sa possible propriété de liaison du Calcium et de son implication dans la voie de signalisation du calcium, cette protéine a été suggéré être impliqué dans une maladie mentale, le syndrome de Wolf-Hirschhorn, cette protéine étant délétée chez beaucoup de patients atteints de ce syndrome (Endele et al, Genomics . 1999 Sep 1 ; 60 ( 2 ) : 218-25. Une récente étude, a montré une localisation mitochondriale de cette protéine ( Schlickum et al, Genomics . 2004 Feb; 83 ( 2 ) : 254-61 ) .
A ce jour, aucun rôle dans l ' angiogenèse n' est décrit pour cette protéine . - GS-N25 : un ARNm de 7190 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 41 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_020119 dans la base de séquences GENBANK. Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 389 au nucléotide 3097. Il a été ainsi identifié une protéine, GS-P21, (SEQ ID No 55 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 902 acides aminés et est appelée protéine antivirale zinc finger ( ZAP) .
La protéine ZAP est une protéine Zinc finger de type CCCH. Son rôle décrit actuellement concerne la prévention de l ' infection par les rétrovirus . L ' expression de cette protéine ZAP a été montrée qu' elle provoque une profonde et spécifique perte d'ARNms viraux dans le cytoplasme de la cellule sans affecter les ARNms nucléaires suggérant un rôle dans l ' inhibition de la réplication virale de cellules infectées (Gao et al, Science . 2002 Sep 6 ; 297 ( 5587 ) : 1703-6 ) . Aucun autre rôle n' est connu à l'heure actuelle et aucun rôle dans la régulation de l ' angiogenèse n' a été décrit, à ce jour, pour cette protéine .
— GS-N26 : ARNm de 2359 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 26 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM_022777 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm, GS-N26 , présente une séquence codante du nucléotide 41 au nucléotide 598. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P22 , ( SEQ ID No 56 dans la liste de séquences en annexe) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 185 acides aminés et est appelée protéine RABL5.
Le gène codant pour la protéine RABL5 a été récemment décrit (Ota et al, Nat . Genêt. 36 ( 1 ) , 40-45 ( 2004 ) et la protéine a été classée par ses domaines conservés comme un membre de la famille des Rab GTPAse appartenant à la superfamille de protéines de type Ras liant les GTP , qui ont émergés comme régulateurs au niveau membrane cellulaire, en particulier la formation, le transport vésiculaire et la fusion de membrane (revues : Prekeris R, Scientific World Journal . 2003 Sep 15 ; 3 : 870-80 ; Stenmark H et Olkkonen VM. , Génome Biol . 2001 ; 2 ( 5 ) ) . Cette superfamille comprend plus de 80 protéines hautement conservées qui sont impliquées dans de multiples voix de la signalisation intracellulaire . Elles fonctionnent comme des switches moléculaires de la transduction du signal a partir de récepteurs membranaires , en passant d'un état inactif liant le GDP à un état actif liant le GTP pouvant ainsi agir sur différentes molécules effectrices (revue : Coxon FP et Rogers MJ. , Calcif Tissue Int . 2003 Jan; 72 ( l ) : 80-4. ) . Les membres de la famille Ras ont largement été impliqués dans l 'oncogenèse soit par mutation soit par une surexpression de la protéine ( revue : Oxford et Theodorescu, Cancer Lett . 2003 Jan 28 ; 189 ( 2 ) : 117- 28. ) Une protéine Rab a déjà été décrite dans l ' angiogenèse , appelée VRP ( Yonekura et al, Nucleic Acids Res . 1999 JuI 1 ; 27 ( 13 ) .2591-600.
Par contre, la protéine RABL5 reste encore mal connue et son rôle exacte n' a pas encore été découvert, aucun rôle dans l ' angiogenèse n' a été décrit à ce jour.
Cette séquence , GS-N26 , présente une homologie de séquence avec les séquences GS-N27 et GS-N28 inférieure à 90% . Toutefois ces 3 séquences présentent une séquence conservée dont I 1 antisens , identifié dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N° : 81 , permet l ' inhibition de l ' expression.
- GS-N27 : ARNm de 1782 paires de bases , identifié sous le numéro SEQ ID No 27 dans la liste de séquences en annexe .Une recherche BLAST permet de l' identifier sous le numéro d ' accession BC050531 dans la base de séquences GENBANK.
- GS-N28 : ARNm de 2587 paires de bases , identifié sous le numéro SEQ ID No 28 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AL157469 dans la base de séquences GENBANK.
- GS-N29 : ARNm de 2520 bp identifié sous le numéro SEQ ID No 29 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession XM_211534 dans la base de séquences GENBANK. Cet ARNm (GS-N29 ) présente une séquence codante du nucléotide 484 au nucléotide 792. Il a ainsi été identifié une protéine , GS-P23 , ( SEQ ID No 57 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 102 acides aminés . Cette nouvelle protéine de 11 kDa ( 102acides aminés ) ne présente aucun domaine particulier, elle est supposée extracellulaire et possède une séquence signale de sécrétion. - GS-N30 : ARNm de 7300 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No30 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession NM__003023 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N30 ) , présente une séquence codante du nucléotide 262 au nucléotide 1947. Il a ainsi été identifié une protéine , GS-P24 (SEQ ID No 58 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est composée de 561 acides aminés et est appelée protéine 2 liant le domaine SH3 (SH3BP2 ) . Cette protéine a été identifiée dans le cancer de la vessie et de par sa structure , elle a été suggérée jouer un rôle dans la signalisation et pourrait être un régulateur négatif de l 'oncogène abl (Bell et al, Genomics . 1997 Sep 1 ; 44 ( 2 ) : 163-70. Récemment, Cette protéine a été décrite comme étant une protéine adaptatrice dans des voies de signalisation en promouvant l ' activité transcriptionnelle de deux facteurs de transcription NFAT/AP-1 (connus étant impliqués dans la transcription du gène de l ' interleukine 2 ) chez les cellules T à travers l ' activation des voies dépendantes de Ras et calcineurine (Foucault et al , J Biol Chem. 2003 Feb 28 ; 278 ( 9 ) : 7146-53 ) . Cette protéine a été également décrite comme régulateur positif de la phosphorylation de la tyrosine de la PLC-gamma chez les cellules basophiles conduisant à leur dégranulation ( Sada et al, Blood. 2002 Sep 15 ; 100 ( 6 ) : 2138-44 ) . Par ailleurs , une mutation de ce gène a été récemment décrite pouvant avoir un rôle dans une pathologie cystique multioculaire héréditaire, le Chérubisme (Ueki et al, Nat Genêt . 2001 Jun, 28 (2 ) : 125- 6 ; Lo et al , Am J Med Genêt . , 2003 Aug 15 ; 121A( I ) : 37- 40 ) . A ce jour, aucun rôle dans la régulation de l ' angiogenèse n' a été décrit pour cette protéine .
- GS-N31 : ARNm de 1701 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 31 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AF380162 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N31 ) , présente une séquence codante du nucléotide 19 au nucléotide 1542. Il a ainsi été identifié une protéine , GS-P25 , ( SEQ ID No 59 dans la liste de séquences en annexe) , résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 507 acides aminés et est appelée protéine FAPP2.
Cette séquence d 'ARNm ( GS-N31 ) est homologue des séquences GS-N32 et GS-N33. - GS-N32 : ARNm de 2836 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 32 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AK023180 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 323 au nucléotide 1441. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P26 , ( SEQ ID No 60 dans la liste de séquences en annexe ) , résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 372 acides aminés et appelée Protéine similaire à la protéine FAPP2. Le gène codant pour la protéine FAPP2 a été identifié en 2002 par Strausberg (Proc . Natl . Acad. Sci . U. S .A. 99 ( 26 ) , 16899-16903 ) , elle est hautement similaire, par ailleurs , à une protéine NY-BR-86 décrite comme étant un antigène du cancer du sein ( Scanlan et al , 2001 , Cancer Immun.1, 4 ) . Cette protéine possède un domaine conservé de transfert de glycolipide et un domaine d' homologie de la pleckstrine . Ce domaine est partagé par un groupe de nouvelles protéines qui possèdent des spécificités de liaisons avec les dérivés phosphorylés de l ' inositol . Ces protéines sont décrites comme pouvant être des protéines adaptatrices car elles ne possèdent pas de domaines catalytiques . Ces molécules peuvent être des médiateurs clés de réponses cellulaires qui sont régulées spécifiquement par le second messager ( le dérivé phosphorylé de l ' inositol ) (Dowler et al,Biochem. J. ( 2000 ) 351, 19-31 ) .
Le rôle exact de FAPP2 n' est pas encore connu, son rôle dans l ' angiogenèse n' a pas encore été décrit à ce jour.
Cette séquence d'ARNm (GS-N32 ) est homologue des séquences GS-N31 et GS-N33.
- GS-N33 : ARNm de 2004 paires de bases identifiée sous le numéro SEQ ID No 33 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession BC002838 dans la base de séquences GENBANK. Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 92 au nucléotide 1414. Il a ainsi été identifié une protéine, GS-P27 , ( SEQ ID No 61 dans la liste de séquences en annexe) , résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 440acides aminés est appelée Protéine liée au potentiel de prolifération.
Cette séquence d'ARNm (GS-N33 ) est homologue des séquences GS-N31 et GS-N32.
— GS-N34 : ARNm de 1789 paires de bases identifié sous le numéro SEQ ID No 34 dans la liste de séquences en annexe . Une recherche BLAST permet de l ' identifier sous le numéro d' accession AK057491 dans la base de séquences GENBANK.
L ' expression des ARNms ci-dessus identifiés est observée dans des cellules endothéliales qui forment des tubes capillaires . La Demanderesse a mis donc en évidence que l ' expression différentielle du gène correspondant à chacun de ces ARNms accompagne la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales (Tableau II ) . Tableau II
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
II apparaît ainsi qu' il existe une corrélation directe entre l'expression de chacun des gènes GS-Nl à GS-N34 et l'état angiogénique des cellules endothéliales .
6.2 Vérification du rôle des gènes identifiés dans la régulation de l 'angiogenèse.
De plus , il a été également montré le rôle fonctionnel de ces gènes dans la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales humaines .
En effet, un oligonucléotide antisens spécifique de chacun des gènes identifiés , choisi parmi les oligonucléotides identifiés par les séquences SEQ ID No. : 62 à SEQ ID. : 86 dans la liste de séquences en annexe a été introduit dans le vecteur d'expression pCI-neo Vector dans 1 ' orientation antisens .
Les vecteurs résultants appelés GS-Vl à GS-V23 identifiés par leurs séquence SEQ ID No : 87 à SEQ ID No : 109 dans la liste de séquences en annexe ont été utilisés pour réprimer l ' expression du gène codant pour cet ARNm chez les cellules endothéliales humaines suite à la transfection de ces dernières par ce vecteur .
Les cellules endothéliales humaines ont été stimulées alors par des facteurs angiogéniques .
Les résultats obtenus, pour chacune des séquences illustrées ci-dessous , en utilisant les séquences antisens et les vecteurs correspondants , indiqués dans le tableau III , montrent que :
- la répression de l ' expression des gènes SEQ ID N. l à SEQ ID No . 3 , SEQ ID No. 6 à SEQ ID No . 34 inhibe la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales ;
- la répression des gènes SEQ ID No . 4 et SEQ ID No . 5 stimule la formation la formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales ; et cela malgré la présence des différents facteurs angiogéniques .
Ces résultats sont illustrés dans les figures correspondantes 1 à 5 en annexe . TABLEAU III
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
K)
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle consiste en i ) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 2 , 4 , 5 , 9 à 11 , 13 , 17 à 19 , 27 à 29 et 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; ii) une séquence antisens de l ' une des séquences de i ) , identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID 62 , 63 , 65 , 67 , 69 , 73 , 74 , 81 , 82 et 85 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; iii ) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N°86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente .
2. Polypeptide ou fragment dudit polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 4 , 5 , 13 , 17 , 18 , 19 et 29.
3. Polypeptide selon la revendication 2 , caractérisé en ce qu ' il comprend ou qu' il consiste en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 , 37 , 38 , 43 , 47 , 48 , 49 ou 57.
4. Vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend i ) une molécule d ' acide nucléique selon la revendication 1 ; H) une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle consiste en a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 3 , 6 , 7 , 8, 12 , 14 à 16, 20 à 26 et 30 à 33 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; b) une séquence antisens de l 'une des séquences de a) , identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n°
64, 66 , 67 , 68, 70 à 72 , 75 à 81 et 84 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; c ) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro
SEQ ID n° 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite, séquence ou une séquence équivalente.
5. Anticorps, caractérisé en ce qu' il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 34, ou un fragment desdites séquences, particulièrement codées par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1, 4 , 5 , 13 , 17 , 18 , 19 et 29 ou un fragment desdites séquences , ou ayant une affinité pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N° 35 à 61, ou un fragment desdites séquences , particulièrement pour un polypeptide comprenant ou consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 , 37 , 38 , 43 , 47 , 48 , 49 ou 57 ou un fragment desdites séquences .
6. Cellule génétiquement modifiée , caractérisée en ce qu 'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène impliqué dans l ' angiogenèse choisi parmi les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No . 1 à SEQ ID No. 34 , particulièrement les gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. n° 1 , 2 , 4 , 5 , 9 à 11 , 13 , 17 à 19 , 27 à 29 et 34.
7. Composition pharmaceutique comprenant à titre d' agent actif au moins une substance choisie parmi : i ) une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle correspond à a) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 34 ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; b) une séquence antisens de l ' une des séquences de a) , identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 64, 66 , 67 , 68 , 70 à 72 , 75 à 81 et 84, ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences ou une séquence équivalente ; d) la séquence antisens identifiée dans la liste de séquence fournie en annexe sous le numéro
SEQ ID n° 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; il) un polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 34 ou qu ' il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ
ID n° 35 à 61 ou un fragment desdits polypeptides ;
Hi) un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend une molécule d ' acide nucléique selon i ) de la présente revendication ; iv) un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 à 61 ou pour l 'une des séquences codées par les séquence en acide nucléiques identifiées dans la liste de séquence fournie en annexe sous les n° SEQ ID N° 2 , 9 à 11, 27 , 28 et 34; v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. l à 34.
8. Utilisation, pour la préparation d' une composition pharmaceutique destinée à inhiber l ' angiogenèse, d'un agent actif inhibiteur de l ' angiogenèse choisi parmi : i. une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu' elle comprend ou qu' elle correspond à a. une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 4 ou 5 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; b. une séquence antisens des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 1 à 3 , 6 à 34 , séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 62 à 64 ou 66 à 85 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; c. ou la séquence antisens identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le n° SEQ ID N°86 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; ii . un polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéros SEQ ID n° 4 ou 5 ou qu ' il comprend ou consiste en un polypeptide identifié dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides ; iii . un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend une molécule d' acide nucléique selon i) de la présente revendication ; iv. un anticorps caractérisé en ce qu' il a une affinité pour l ' une des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 37 ou 38 ou un fragment desdits polypeptides ; v. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu' elle sur-exprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4 ou 5 ou qu ' elle sous-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 6 à 34.
9. Utilisation, pour la préparation d' une composition pharmaceutique destinée à activer l ' angiogenèse, d'un agent actif activateur de l ' angiogenèse choisi parmi : i . une molécule d ' acide nucléique caractérisée en ce qu ' elle comprend ou qu ' elle correspond à a. une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 à 3 ou 5 à 34 ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente ; b. la séquence antisens de la séquence nucléotidique identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 4 ou 5 , séquence identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n° 65 , ou un fragment de ladite séquence ou une séquence équivalente; ii . au moins un polypeptide caractérisé en ce qu ' il est codé par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous le numéros SEQ ID n° 1 à 3 ou 4 à 34 ou qu ' il comprend ou consiste en un des polypeptides identifiés dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéro SEQ
ID n° 35 , 36 , 38 à 61 ou un fragment desdits polypeptides; iii . un vecteur d ' expression, caractérisé en ce qu ' il comprend une molécule d ' acide nucléique selon i) de la présente revendication ; iv. un anticorps caractérisé en ce qu' il a une affinité pour l ' une des séquences polypeptidiques , identifiée dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 35 , 36 , 38 à 61 ou un fragment desdits polypeptides , ; v. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce qu'elle sur-exprime au moins un gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No . 1 à 3 et 5 à 34 ou qu ' elle sous-exprime un gène ou sous- exprime au moins le gène identifié dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4.
10. Séquence d ' acides nucléiques ( sous forme d'ADN ou d ' ARN) , comprenant ou consistant en au moins 10 mers d 'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences identifiées par les numéros SEQ ID No . l à SEQ ID No . 34 dans la liste de séquences en annexe, ou complémentaire ou antisens d ' une telle séquence.
11. siRNA comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique double brin sous forme d ' ARN, d' au moins 10 mers , de préférence d' au moins 15 mers , complémentaire d' un ARNm correspondant à l ' une des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : l à SEQ ID No : 34.
12. Utilisation d ' un siRNA selon la revendication 11 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies liées à l ' angiogenèse .
13. Méthode de vérification de l 'efficacité thérapeutique d'un traitement angiogénique chez un mammifère , notamment chez un être humain, caractérisée en ce qu' elle comporte l ' identification «in vitro» dans une population cellulaire dudit mammifère, de la surexpression ou de la sous-expression d' au moins un gène impliqué dans un désordre angiogénique identifié par une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N0 1 à SEQ ID N0 34.
14. Méthode de vérification de l ' efficacité thérapeutique selon la revendication 13 caractérisée en ce qu ' elle comporte les étapes suivantes : la détection de l 'expression par une population cellulaire isolée d' un mammifère auquel est administrée une composition thérapeutique destinée à traiter un désordre angiogénique, d' au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N0 1 à SEQ ID N0 34 ; - la détection de l ' expression ladite séquence nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l'état angiogénique est connu, l ' identification d ' une éventuelle différence du niveau d'expression de ladite séquence par les deux populations cellulaires .
15. Méthode de vérification selon l ' une quelconque des revendications 13 ou 14 , caractérisée en ce que la détection de l ' expression de ladite séquence est effectuée après avoir mis la population cellulaire en présence d'un fluide biologique issu d'un patient .
16. Méthode de criblage de composés utiles pour le traitement d'un désordre angiogénique d'un mammifère , notamment d 'un être humain, caractérisée en ce qu' elle comporte les étapes suivantes : a) la détection de l ' expression par une population cellulaire isolée d'un mammifère mise en présence d'un composé susceptible d' avoir un effet thérapeutique sur un désordre angiogénique, d ' au moins une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 34 , b) la détection de l ' expression de la même séquence nucléotidique par une population cellulaire de référence dont l 'état angiogénique est connu, c ) l ' identification des différences éventuelles du niveau d'expression de ( s ) celle ( s ) même ( s ) séquences nucléotidiques par les deux populations cellulaires .
17. Méthode de criblage selon la revendication 16 , caractérisée en ce que la détection de l ' expression des séquences est effectuée après avoir mis les cellules en présence d'un fluide biologique issu d 'un patient.
18. Dispositif comprenant un support comprenant une ou plusieurs sondes spécifiques d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N0 1 à SEQ ID N° 34 , pour la mise en œuvre d'une méthode de criblage selon les revendications 16 ou 17.
19. Dispositif selon la revendication 18 , caractérisé en ce que la sonde est spécifique d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n° 1 , 4 , 5 , 13 , 17 , 18 , 19 et 29 , ou son complémentaire ou un fragment desdites séquences .
20. Trousse destinée à la mesure de l' affichage différentiel de gènes impliqués dans des désordres angiogéniques comprenant un dispositif selon l 'une quelconque des revendications 18 ou 19 , des amorces spécifiques et les accessoires nécessaires à l ' amplification des séquences extraites d'un échantillon, leur hybridation avec les sondes du dispositif et la réalisation des mesures de l ' affichage différentiel .
21. Trousse selon la revendication 20 , caractérisée en ce qu ' elle comprend en outre une lignée stable de cellules génétiquement modifiées , selon la revendication 6 , en tant que population cellulaire de référence .
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