WO2001055172A2 - COMPLEXE ISOLE COMPRENANT UNE PROTEINE NNT-1 ET EN OUTRE AU MOINS UNE PROTEINE CLF-1 ET/OU UNE PROTEINE sCNTFR$g(a) - Google Patents

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Greg Elson
Jean-François Gauchat
Hélène PLUN-FAVREAU
Sylvie Chevalier
Hugues Gascan
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Pierre Fabre Medicament
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the subject of the present invention is a new isolated complex comprising an NNT-1 protein and in addition at least one CLF-1 protein and / or a sCNTFR ⁇ protein as well as antibodies directed specifically against said complex.
  • the invention also comprises a composition comprising said complex as a medicament for the prevention and / or treatment of neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease or Huntington's disease, for the maintenance of muscle mass in the paralyzed, for the treatment of obesity or cancer
  • the IL-6 type cytokine family includes 1TL-6, IL-11, the leukemia inhibitor factor (LIF) inhibitor factor, OSM oncostatin, ciliary neurotrophic factor CNTF (for "Ciliary NeuroTrophic Factor”), cardiotrophin-1 CT-1 as well as neurotrophin-1 NNT-1 also called BSF-3 (for "B cell Stimulatory Factor 3") or CLC (for "Cardiotrophin-Like Cytokine”) (Taga, T et al, Annu.
  • LIF leukemia inhibitor factor
  • OSM oncostatin OSM oncostatin
  • ciliary neurotrophic factor CNTF for "Ciliary NeuroTrophic Factor”
  • cardiotrophin-1 CT-1 as well as neurotrophin-1 NNT-1 also called BSF-3 (for "B cell Stimulatory Factor 3") or CLC (for "Cardiotrophin-Like Cytokine”)
  • BSF-3 for "B cell Stimulatory Factor 3”
  • cytokines use the glycoprotein gpl30 as the receptor chain involved in signal transduction.
  • the cytokines LIF, OSM, CNTF, CT-1 and NNT-1 share a second receptor subunit involved in transduction.
  • the cytokines IL-6, IL-11, CNTF and CT-1 still use an ⁇ chain not involved in the signal transduction which forms a complex with high affinity with gpl30 and / or LIFR ⁇ Soluble forms of the ⁇ chains of receptors for IL-6, IL-11 and CNTF can act as agonists on the corresponding cytokines, which implies that complexes formed between these ⁇ chains and the cytokines can stimulate any cell expressing gpl30 (for IL-6 and IL-11) or the combination of gpl30 and LIFR ⁇ (for CNTF) (Davis, S, et al, Science 259 1736-1739, 1993) This is why these cytokines have redundant functions and pleiotropic effects on the immune
  • the cytokine factor 1 called CLF-1 (for “Cytokine-Like Factor- 1”) has been identified as a protein having a homology with gpl30 and the ⁇ chains of receptors for the family of cytokines close to IL-6 II.
  • IL- 12 is a heterodimeric cytokine comprising two polypeptide chains, p35 and p40
  • the two subunits of r ⁇ L-12 are the products of two independent genes
  • the subunits p35 and p40 are homologous, respectively, to members of the IL family -6 and cytokine receptors
  • the two chains of the IL-12 receptor involved in signal transduction (IL-12R ⁇ 1 and IL-12R ⁇ 2) are they homologous to gpl30
  • the IL-12 / TL-12R system is therefore close to the cytokine system of the IL-6 / gpl30 plus LIFR ⁇ family
  • IL-12 The production of IL-12 is controlled in an original way When it is expressed alone, the p35 subunit is only secreted in very small quantity It is only released by the cells in the presence of the sub -unit p40 The synthesis of this chain is therefore absolutely required for the production of FIL- 12 Unlike p35, p40 expressed alone is secreted in the form of a homodimer capable of binding the receptor and which has an antagonistic effect (Trinchieri, G, Annu Rev Immunol, 13 251-276, 1995) The authors of the present invention have demonstrated the production of CLF-1 homodimers by cells transfected with the corresponding cDNA This observation is compatible with the hypothesis that CLF-1 is involved in a multimeric cytokine of IL-12 type (Elson, GC, et al, J Immunol 161 1371 -1379, 1998)
  • mice deficient for CNTF are only slightly affected in their phenotype and only in adulthood (Masu, Y, et al, Nature 365 27-32, 1993)
  • CNTF-2 a second ligand for CNTFR ⁇
  • mice deficient for CNTF are only slightly affected in their phenotype and only in adulthood (Masu, Y, et al, Nature 365 27-32, 1993)
  • CNTF-2 there are human populations homozygous for CNTF inactivating mutations that are completely asymptomatic (DeChiara, TM, et al, Cell 83 313-322, 1995)
  • mice without CNTFR ⁇ are unable to suckle, die soon after birth and have a dramatic loss in the population of motor neurons (Yssel, H, et al, J Immunol Methods 72.219-227, 1984)
  • the inventors have surprisingly demonstrated that the secretion of the NNT-1 cytokine of the IL-6 family is dependent on the co-expression of CLF-1 and that NNT-1 and CLF-1 form a complex capable of stimulating cell proliferation via a receptor comprising the CNTFR ⁇ , gpl30 and LIFR ⁇ subunits
  • the main object of the present invention is thus an isolated complex comprising an NNT-1 protein, characterized in that it also comprises at least one CLF-1 protein and / or a sCNTFR ⁇ protein
  • the present invention thus relates in particular to an isolated complex, also called CNTF2, characterized in that it comprises an NNT-1 protein and a CLF-1 protein.
  • the invention also relates to the complex comprising the proteins NNT-1 and sCNTFR ⁇ and the complex comprising the proteins NNT-1, CLF-1 and sCNTFR ⁇
  • protein is also meant the terms of peptide or polypeptide, these 3 terms being used interchangeably in the present description
  • NNT-1 protein will be understood to mean the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No 2 and its derived proteins as defined below, by “protein CLF-1 "the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4 or No 6 and their derived proteins as defined below and by” soluble protein sCNTFR ⁇ "the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7 and its derived proteins such as defined below
  • protein derived from the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No 2, is meant in the present description any protein whose sequence comprises a fragment of at least 5 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No. 2, preferably 8, 10, 15, 20, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No 2, capable of forming a complex with the CLF-1 protein of sequence SEQ ID No 4 or No 6 and / or with the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7 Among these proteins derived from the sequence SEQ ID No. 2, preference is given in particular to proteins forming a complex with the CLF-1 protein of sequence SEQ ID No 4 or No. 6, said complex being able to modulate the biological activity of the CNTFR ⁇ / gpl30 / LLFR ⁇ complex receptor
  • biological activity of the receptor complex CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇ is intended to denote in particular that measured by standard techniques below described in the examples such as the phosphorylation of the tyrosine of gp 130 and LIFR ⁇ BAF / 3 and SK-N-MC cells expressing the CNTFR ⁇ , g ⁇ l30 and LIFR ⁇ subunits or their cell proliferation
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No 2 preference is also given to proteins forming a complex with the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7, said complex being capable of modulating the biological activity of the receptor complex gpl30 / LIFR ⁇
  • biological activity of the gpl30 / LIFR ⁇ complex receptor is intended to denote in particular that measured by standard techniques below described in the examples such as the proliferation of BAF3 cells transfected by the cDNAs encoding gpl30 and LIFR ⁇ .
  • Other usable techniques are based on the proliferation of TF-1 cells, the production of dTL-6 by KB cells or the phosphorylation of
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No 2 very particularly preferred are the proteins comprising one of said fragments of the sequence SEQ ID No 2 and forming a complex with the CLF-1 protein of sequence SEQ ID No 4 or
  • the biological activity of said complex being at least 50%, preferably 60% or 80% of that measured for the complex formed with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No 2 and the protein CLF- 1 of sequence SEQ LD No 4 and / or with the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7 in the examples below
  • proteins derived from the sequence SEQ) No 2 preference is also given to proteins comprising one of said fragments of the sequence SEQ ID No 2 and forming a complex with the CLF-1 protein of sequence SEQ ID No 4 or No 6 and / or with the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7, said complex being capable of inhibiting the biological activity of the complex obtained with the protein NNT-1 of sequence
  • No 7 can be used to modulate, in particular decrease, biological activity of the CNTFR ⁇ / gpl30 LIFR ⁇ receptor or of the gpl30 / LIFR ⁇ receptor, in particular the survival, growth or proliferation of cells expressing said complex receptor, in particular tumors
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No 2 particular preference is given to proteins whose sequence has a percentage identity of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID No 2 or with one of its fragments, and comprising at least 5 consecutive amino acids, preferably 8, 10, 15, 20, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No 2
  • said proteins derived from the NNT-1 protein whose sequence has a percentage identity of at least 80%, with the sequence SEQ ID No 2 or with one of its fragments may thus comprise one or more substitutions , preferably conservative, deletions or insertions, compared to the wild type protein NNT- 1 of sequence SEQ LD No.
  • substitution is meant any amino acid substitution which has little or no effect on the charge total, polarity or hydroph obicity of the reference protein, said substitution making it possible to increase or decrease the desired activity of the NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR ⁇ comprising said substituted NNT-1 protein.
  • This desired activity can either be an agonist activity or either antagonist (competitive inhibitor) of the CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇ receptor or of the gpl30 / LIFR ⁇ receptor.
  • protein derived from the CLF-1 protein of sequence SEQ K) No 4 or No 6, is meant in the present description any protein whose sequence comprises a fragment of at least 5 consecutive amino acids of sequence SEQ ID No 4 or No 6, preferably 8, 10, 15, 20, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of sequence SEQ ID No 4 or No 6, capable of forming a complex with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No 2
  • proteins derived from sequence SEQ ID No 4 or No 6 also preferred are proteins forming a complex with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No 2, said complex being capable of modulating the biological activity of the receptor complex CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇ , biological activity as defined above
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No 4 or No 6 very particularly preferred are the proteins comprising one of said fragments of the sequence SEQ ID No 4 or No 6 and forming a complex with the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No 2, the biological activity of said complex being at least 50%, preferably 60% or 80% of that measured for the complex formed with the protein NNT-1 of sequence SEQ LD No 2 and the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No 4 or No 6 also preferred are the proteins comprising one of said fragments of the sequence SEQ ED No 4 or No 6 and forming a complex with the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No 2 , said complex being capable of inhibiting the biological activity of the complex obtained with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No 2 and the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4
  • such a complex as competitive inhibitor of the complex formed with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No 2 and the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4 or No 6, may be used to modulate the biological activity of the receptor complex CNTFR ⁇ / gpBO / LLFR ⁇ , in particular to decrease the survival, growth or proliferation of cells expressing said complex receptor, in particular tumor
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No 4 or No 6 particular preference is given to proteins whose sequence has an identity percentage of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID No 4 or No 6 or with one of their fragments, and comprising at least 5 consecutive amino acids, preferably 8, 10, 15, 20, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No 4 or No 6
  • said proteins derived from the CLF-1 protein may thus comprise a or several substitutions, preferably conservative, deletions or insertions, compared with the protein CLF-1 of sequence SEQ LD No 4 or No 6
  • protein derived from the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 1, is meant in the present description any protein whose sequence comprises a fragment of at least 5 consecutive amino acids of sequence SEQ ID o. 7, preferably 8, 10, 15, 20, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of sequence SEQ ID No. 7, capable of forming a complex with the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No. 2.
  • proteins derived from sequence SEQ ID No. 7 preference is also given to proteins forming a complex with the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No. 2, said complex being capable of modulating the biological activity of the gpl30 / LIFR ⁇ receptor, biological activity as previously defined.
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No. 7 very particularly preferred are the proteins comprising one of said fragments of the sequence SEQ ID No. 7 and forming a complex with the NNT-1 protein of sequence SEQ LD No. 2, l biological activity of said complex being at least 50%, preferably 60% or 80% of that measured for the complex formed with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No. 2 and the soluble protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No. 7.
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No. 7 preference is also given to proteins comprising one of said fragments of the sequence SEQ ID No. 7 and forming a complex with the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No. 2, said complex being capable of inhibiting the biological activity of the complex obtained with the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No. 2 and the sCNTFR ⁇ protein of sequence SEQ ID No. 7.
  • a complex as a competitive inhibitor of the complex formed with the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No. 2 and the protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No. 7, can be used to modulate the biological activity of the gpl30 / LIFR ⁇ receptor, in particular to decrease survival, growth or proliferation of cells expressing said complex receptor, in particular tumor cells.
  • proteins derived from the sequence SEQ ID No. 7 particular preference is given to proteins whose sequence has an identity percentage of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99%, after alignment optimal with the sequence SEQ ID No. 7 or with one of their fragments, and comprising at least 5 consecutive amino acids, preferably 8, 10, 15, 20, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No. 7.
  • said proteins derived from the sCNTFR ⁇ protein whose sequence has a percentage identity of at least 80%, with the sequence SEQ ID No. 7 or with one of their fragments may thus comprise one or more substitutions, preferably conservative, deletions or insertions, compared to the protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after the have optimally aligned, said comparison being carried out by segment or by “comparison window” in order to identify and compare the local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be carried out, in addition to manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad App Math 2 48 2], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J Mol Biol 48 443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc Natl Acad Sci USA 85 2444], by means of computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI, or by comparison software BLAST N or BLAST P)
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. can include additions or deletions compared to the reference sequence for an optimal alignment between these two sequences
  • the percentage identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences
  • BLAST program "BLAST 2 sequences", available on the website http // www ncbi nlm nih gov / BLAST /, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters "open gap penalty" »5, and « extension gap penaltie »2, the chosen matrix being for example the « BLOSUM 62 »matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequence
  • the invention comprises a complex according to the invention, characterized in that it comprises the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No 2, or a protein whose sequence has a percentage identity of at least 80% with the sequence SEQ ID No 2, the CLF-1 protein of sequence SEQ ID No 4 or No 6, or a protein whose sequence has a percentage identity of at least 80% with the sequence SEQ ID No 4 or No 6, and / or a protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7, or a protein whose sequence has a percentage identity of at least 80% with the sequence SEQ ID No 7
  • the complex type expression comprising "A, B and / or C" or also "A, B and / or C" (as in claim 2) or also A / B and / or C "
  • type "A, and / or B and / or C” is intended to denote all the possible combinations of these three elements taken alone, by two or three (A, B, C, A and B, A and C, B and C, A and B and C)
  • NNT- 1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes those characterized in that the NNT-1 protein, the CLF-1 protein or the sCNTFR ⁇ protein is obtained by chemical synthesis or by recombinant route are preferred.
  • Said NNT-1, CLF-1 and sCNTFR ⁇ proteins can be obtained in the form of recombinant proteins, glycosylated or not, by standard techniques of genetic recombination using prokaryotic or eukaryotic cells transformed by plasmid or viral vectors containing nucleic acids encoding for said proteins, or by chemical synthesis
  • the NNT-1 protein is coupled by covalent bond to the CLF-1 protein and / or to the sCNTFR ⁇ protein to form a fusion protein, in particular by chemical coupling
  • the complex according to the invention is characterized in that one or more binding elements are introduced into said protein NNT-1, and / or said protein CLF-1 and / or the protein sCNTFR ⁇ for facilitate chemical coupling, preferably said connecting element introduced is an amino acid
  • binding elements in particular amino acids to facilitate the coupling reactions between said NNT-1 protein, said CLF-1 protein and / or said sCNTFR ⁇ protein.
  • the covalent coupling between said NNT-1 protein, and said CLF-1 protein and / or said sCNTFR ⁇ protein according to the invention can be produced at the N- or C- terminal end of said NNT-1 protein, and / or said CLF- protein 1 and / or said sCNTFR ⁇ protein
  • the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined as a function of the end of said NNT-1 protein, and / or said CLF-1 protein and / or said sCNTFR ⁇ protein chosen to couple
  • the complex according to the invention is characterized in that said fusion protein obtained after coupling between said NNT-1 protein, and said CLF-1 protein and / or said sCNTFR ⁇ protein is prepared by genetic recombination
  • the fusion protein can be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for said NNT-1 protein, of a sequence coding for said CLF-1 protein and / or of a sequence encoding said protein sCNTFR ⁇ .
  • the methods of synthesizing fusion or hybrid molecules include the methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the desired polypeptide sequences.
  • the protein NNT-1, CLF-1 and sCNTFR ⁇ are natural proteins expressed by cells or cell lines, in particular of animal origin, naturally comprising nucleic acids encoding said proteins NNT-1 and / or CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ , in particular by cells capable of naturally producing the complex according to the invention, in particular in the culture medium where they are cultivated.
  • the invention also comprises a complex according to the invention, characterized in that said complex is obtained by a process comprising bringing an NNT-1 protein into contact with a CLF-1 protein and / or a sCNTFR ⁇ protein, preferably in a medium favoring the formation of said complex.
  • the invention also relates to a vector or a system of two or three vectors for co-expression of the proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ in a host cell, said proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ being capable of forming a complex according to the invention, characterized in that said vector or said system of two or three vectors contains a nucleic sequence coding for an NNT-1 protein, a CLF-1 protein and / or a sCNTFR ⁇ protein.
  • the vector or system of two or three vectors according to the invention is characterized in that it comprises the elements allowing the expression of said sequences in a host cell and optionally the secretion of said sequences out of the host cell.
  • expression or co-expression vector is meant both self-replicating expression vectors of the plasmid type and systems intended to ensure integration into cells, but these expression vectors may also be expression vectors of the viral type or even, when it is desired to carry out, for example, gene therapy, naked DNA.
  • viral vectors those derived from the adenovirus, from the virus associated with adenovirus (AAN), retroviruses, lentiviruses, and preferably HIN derivatives, poxviruses, herpes virus for expression in the eukaryotic system.
  • naked polynucleotides are preferred such as naked AD ⁇ or naked AR ⁇ according to the technique developed by the company NICAL, artificial yeast chromosomes (YAC, yeast artificial chromosome) for expression in yeast, artificial mouse chromosomes (MAC, mouse artificial chromosome) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC) for expression in human cells
  • YAC yeast artificial chromosome
  • MAC mouse artificial chromosome
  • HAC human artificial chromosomes
  • the vector according to the invention comprises elements for controlling the expression of the proteins ⁇ T-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ adapted to the chosen host cell.
  • the invention furthermore includes host cells, in particular eukaryotic and prokaryotic cells, characterized in that they are transformed by the vectors or two-vector systems according to the invention.
  • the host cells are transformed under conditions allowing expression of the two recombinant proteins capable of forming a complex according to the invention
  • the cellular host can be chosen from bacterial cells but also from yeast cells, as well as from plant and animal cells, preferably the host cell is a mammalian cell, but also an insect cell in which methods using baculoviruses can be used, for example
  • These cells can be obtained by introduction into host cells of nucleotide sequence inserted into a vector or system of two vectors as defined above, then the cultivation of said cells ules under conditions allowing the expression of the transfected nucleotide sequence
  • the invention also relates to a method for preparing a complex
  • NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ characterized in that it implements a vector or system of two or three vectors according to the invention More particularly, the invention relates to a method of preparation of an NNT complex -1 / CLF-1 and / or recombinant sCNTFR ⁇ , characterized in that cells transformed according to the invention are cultivated under conditions allowing the expression of the proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ recombinant and that said NNT-1 / CLF-1 and / or recombinant sCNTFR ⁇ complex formed is recovered.
  • the recombinant NNT- 1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex according to the invention is capable of being obtained according to a method of the invention and according to the techniques for producing recombinant proteins known to those skilled in the art.
  • the present invention therefore relates to the NNT-1 / CLF-1 and / or recombinant sCNTFR ⁇ complex capable of being obtained by the method presented above.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient recombinant protein production system requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell.
  • the vector must include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as appropriate regions for transcription regulation. It must be able to be maintained in a stable manner in the cell and may possibly have particular signals specifying the secretion of the proteins translated. These different control signals are chosen according to the cellular host used.
  • the nucleic acid sequences coding for the proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ capable of forming the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host.
  • Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods such as, for example, calcium phosphate precipitation transfection, lipofection, electroporation, thermal shock.
  • the recombinant NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes according to the invention obtained as indicated above, can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • said recombinant NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes according to the invention can be obtained from NNT-1 protein coupled to a CLF-1 protein and / or coupled to an sCNTFR ⁇ protein by genetic fusion as this was mentioned earlier.
  • NNT- 1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes according to the invention which can be formed from NNT-1 and / or CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ proteins obtained by chemical synthesis and can thus contain non-amino acids. natural, are also included in the invention.
  • the methods for purifying recombinant or natural proteins NNT-1, CLF-1 and sCNTFR ⁇ , or NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes according to the invention are known to those skilled in the art.
  • the proteins NNT-1, CLF-1 and sCNTFR ⁇ or the NNT- 1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex according to the invention can be purified from lysates and cellular extracts, from the supernatant of the medium of culture, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immuno-affinity techniques using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.
  • a preferred variant consists in producing a recombinant protein fused to a “carrier” protein (chimeric protein).
  • the advantage of this system is that it allows stabilization and a decrease in the proteolysis of the recombinant product, an increase in the solubility during the in vitro renaturation and / or a simplification of the purification when the fusion partner has a affinity for a specific ligand.
  • Cells characterized in that they contain a vector or system of two vectors according to the invention also form part of the present invention, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, preferably mammalian cells.
  • the invention comprises a complex according to the invention, characterized in that said complex is obtained by a method comprising the following steps: a) culture of a cell containing a DNA sequence coding for the protein NNT-1 and a DNA sequence coding for the CLF-1 protein and / or a DNA sequence coding for a sCNTFR ⁇ protein in a culture medium suitable for said cell; b) recovering said complex formed from the culture medium and / or lysate of said cultured cells.
  • said cell in step a) is a transformed cell according to the invention.
  • said cell in step a) is a cell naturally expressing an NNT-1 protein, a CLF-1 protein and / or a sCNTFR ⁇ protein, that is to say a cell naturally comprising a nucleic sequence encoding for an NNT-1 protein and a nucleic sequence coding for a CLF-1 protein and / or a nucleic sequence coding for a sCNTFR ⁇ protein.
  • cells naturally expressing an NNT-1 protein and a CLF-1 protein and / or a sCNTFR ⁇ protein are particularly preferred, such as those described below in the examples, these examples are not limiting.
  • the NNT-1 protein, the CLF-1 protein and / or the sCNTFR ⁇ protein are secreted outside said cultured cell and the complex formed is directly taken from said culture medium, obtained at step a).
  • the invention also comprises a complex according to the invention, characterized in that said complex is obtained by a process comprising the following steps: a) culture of a cell containing a DNA sequence coding for the protein NNT-1, d a cell containing a DNA sequence coding for the protein CLF-1 and / or a cell containing a DNA sequence coding for the protein sCNTFR ⁇ in a culture medium suitable for each of said cells; b) bringing the NNT-1 proteins and the CLF-1 proteins and / or the sCNTFR ⁇ proteins contained in their respective culture medium and / or in their respective cell lysate into contact; c) recovery of said complex formed in step b).
  • said cells in step a) are cells transformed according to the invention.
  • the cells used in step a) before transformation are of the same type and are cultured after transformation in the same culture medium, contacting the NNT-1 proteins and the CLF-1 proteins and / or sCNTFR ⁇ proteins then contained in the common culture medium and / or in the overall cell lysate occurring naturally.
  • the NNT-1 protein, the CLF-1 protein and / or the sCNTFR ⁇ protein are secreted outside said cultured cells and the complex formed is directly taken from said culture medium obtained in step a)
  • An embodiment of the invention relates to an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention capable of fixing the CNTFR ⁇ receptor
  • An embodiment of the invention also relates to an NNT-1 / s complex
  • the present invention comprises a monoclonal, polyclonal antibody or a fragment thereof, characterized in that it is specifically directed against an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention. It also comprises monoclonal antibodies, polyclonal, or a fragment thereof, directed specifically against an NNT- 1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex or an NNT- 1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention
  • the monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments specifically directed against an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention is characterized in that it is capable of binding specifically to an epitope or determinant of the NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention responsible for the specific interaction of the NNT-1 / CLF-1 complex with the receptor complex CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇
  • the monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments specifically directed against an NNT-1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex or an NNT-1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention is characterized in that it is capable of binding specifically to an epitope or determinant of the NNT- 1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ or NNT-1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention responsible for the specific interaction of the NNT- 1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex or NNT- 1 / sCNTFR ⁇ with the gpl30 / LIFR ⁇ complex receptor
  • the epitopic determinants usually consist of groups of molecules having chemically active surfaces such as amino acids or sugar side chains and having a specific three-dimensional structure and / or a characteristic specific charge.
  • the monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments, directed specifically against an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention will be able to recognize specifically (or with greater affinity) the NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention consisting of the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No. 2 and the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4 or SEQ ID No 6 without however recognizing (or with a significantly lower affinity) the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No 2 and the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4 or SEQ ID No 6 taken separately
  • the monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments, directed specifically against an NNT-1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex or an NNT- 1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention will be able to recognize specifically (or with greater affinity) the NNT-1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex or the NNT-1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention consisting of the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No 2, of the CLF- protein 1 of sequence SEQ ID No 4 or SEQ ID No 6 and of the protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7 without however recognizing (or with a significantly lower affinity) the protein NNT-1 of sequence SEQ ID No. 2, the protein CLF -1 of sequence SEQ ID No 4 or SEQ ID No 6 and the protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ID No 7 taken separately
  • the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR complexes according to the invention make it possible to prepare monoclonal or polyclonal antibodies characterized in that they specifically recognize the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR complexes.
  • the monoclonal antibodies may advantageously be prepared from hybridomas according to the technique described by Kohler and Milstein in 1975 (Nature, 256 495-497, 1975)
  • polyclonal antibodies can be prepared, for example by immunization of an animal, in particular a mouse, with an NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR according to the invention associated with an adjuvant of the immune response, then purification specific antibodies contained in the serum of animals immunized on a column affinity to which the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR complex having served as antigen has previously been fixed
  • a subject of the invention is thus preferably a mono- or polyclonal antibody or their fragments, characterized in that they are capable of specifically recognizing the NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention consisting of the NNT-1 protein of sequence SEQ ID No. 2 and of the protein CLF-1 of sequence SEQ ID No 4 or SEQ D No 6
  • the invention also preferably relates to mono- or polyclonal antibodies or their fragments, characterized in that they are capable of specifically recognizing the NNT-1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention consisting of the NNT-1 protein of sequence SEQ ED No 2 and the protein sCNTFR ⁇ of sequence SEQ ED No 7
  • the antibodies of the invention can also be labeled with an enzymatic, fluorescent or radioactive type of labeling.
  • the monoclonal, polyclonal antibodies or one of their fragments, directed specifically against an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention would be particularly useful for targeting compounds capable of modulating the biological activity of the receptor complex CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇ , or of the NNT- 1 / CLF-1 complex
  • the monoclonal, polyclonal antibodies or one of their fragments, directed specifically against an NNT-1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention would be particularly useful for targeting compounds capable of modulating the biological activity of the receptor complex gpl30 / LIFR ⁇ , or of the NNT- 1 / sCNTFR ⁇ complex
  • the fragments of monoclonal or polyclonal antibody according to the invention comprise any fragment of said monoclonal antibody capable of binding to the epitope of the NNT-1 / CLF-1 and / or CNTFR ⁇ complex to which the monoclonal or polyclonal antibody binds said fragment is derived.
  • fragments include in particular single-chain monoclonal antibodies or monovalent fragments Fab or Fab 'and divalent fragments such as F (ab') 2, which have the same specificity fixation as the monoclonal or polyclonal antibody from which they are derived
  • a fragment according to the invention may also be a single chain Fv fragment produced by methods known to those skilled in the art and as described for example by Skerra et al ( Science, 240 1038-1041, 1988) and King et al (Biochemical J, 290 723-729, 1991)
  • fragments of monoclonal or polyclonal antibodies of the invention can be obtained from monoclonal antibodies or polyclonal as described above by methods such as digestion with enzymes, such as pepsin or papain and / or by cleavage of the disulfide bridges by chemical reduction.
  • the fragments of monoclonal or polyclonal antibodies included in the present invention can be synthesized by automatic peptide synthesizers such as those provided by the company Applied Biosystems, etc., or can be prepared manually using sant techniques known to those skilled in the art and as described for example by Geysen et al (J Immunol Methods, 102 259-274, 1978)
  • sant techniques known to those skilled in the art and as described for example by Geysen et al (J Immunol Methods, 102 259-274, 1978)
  • the monoclonal or polyclonal antibodies according to the invention can for example be purified on an affinity column on which the NNT-1 / CLF-1 and / or sC
  • humanized monoclonal antibodies according to the invention or their fragments can be prepared by techniques known to those skilled in the art (Carter et al, PNAS 89 4285-4289, 1992, Mountain et al, Biotechnol Genêt Eng Rev, 10 1 -142, 1992) Such humanized monoclonal antibodies according to the invention are preferred for their use in therapeutic methods
  • the monoclonal antibodies or their chimeric type fragments according to the invention can be produced using the techniques of genetic recombination
  • the invention also comprises a monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments according to the invention, characterized in that he is marked
  • the monoclonal or polyclonal antibodies according to the invention or their fragments can also, according to the invention, be in the form of labeled antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the monoclonal antibodies labeled according to the invention or their fragments include for example so-called immunoconjugated antibodies which can be conjugated for example with enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase , lysozyme, malate dehydrogenase or glucose-6 phosphate dehydrogenase or by a molecule such as biotin, digoxigenin or 5-bromodeoxyuridine fluorescent markers may also be conjugated to monoclonal antibodies or fragments thereof of the invention and include in particular fluorescein and its derivatives, fluorochrome, rhodamine and its derivatives
  • the monoclonal antibodies of the invention or their fragments can be prepared by methods known to those skilled in the art. They can be coupled to enzymes or fluorescent markers directly or through a spacer group or a linking group such as a polyaldehyde, such as glutaraldehydeque, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DPT A), or in the presence coupling agents such as periodate etc.
  • Conjugates with fluorescein-type markers can be prepared by reaction with an isothiocyanate
  • conjugates may also include chemiluminescent markers such as luminol and dioxetanes or bioluminescent markers such as luciferase and luciferin
  • chemiluminescent markers such as luminol and dioxetanes
  • bioluminescent markers such as luciferase and luciferin
  • radioactive markers such as 14 C are also preferred, e who • can. be detected by known means such as the gamma or scintillation counter, by autoradiography, etc.
  • the invention relates to the use of an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention or of an anti-NNT-1 / CLF-1 antibody, monoclonal, polyclonal or one of their fragments according to the invention, for the preparation of a medicament intended to modulate the biological activity of the receptor complex CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇ , in particular the signal transduction induced by the phosphorylation of the tyrosine of gpl30 and LIFR ⁇ .
  • CNTFR ⁇ / gpl30 / LEFR ⁇ is intended to denote both the induction or the increase as well as its inhibition, in particular when the complex formed between the proteins NNT-1 and CLF-1 or said anti-NNT-1 / CLF-1 antibodies act as a competitive inhibitor or antagonist.
  • said NNT-1 / CLF-1 complex is the complex formed between the NNT-1 protein of sequence SEQ ED No. 2, or a protein whose sequence has a percentage identity of at least 80% with the sequence SEQ ED No. 2, and the protein CLF-1 of sequence SEQ ED No. 4 or No. 6, or a protein whose sequence has a percentage identity of at least 80% with the sequence SEQ ED No. 4 or No. 6, and the drug is intended to induce or increase the biological activity of the CNTFR ⁇ / gpBO / LEFR ⁇ complex receptor.
  • the subject of the invention is also the use of an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention or of a monoclonal, polyclonal anti-NNT-1 / CLF-1 antibody or one of their fragments according to the invention, for the preparation of a medicament intended to increase or decrease the survival, growth, proliferation or differentiation of cells expressing the CNTFR ⁇ / gpl30 / LIFR ⁇ complex receptor.
  • the subject of the invention is in particular the use of an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention or of a monoclonal, polyclonal anti-NNT-1 / CLF-1 antibody or one of their fragments according to the invention, for the preparation of a medicament intended for increase the survival, growth, proliferation or differentiation of central, peripheral neurons and those involved in neuro-muscular function, in particular intended for the treatment of abnormal development of the fetal brain.
  • the invention preferably also relates to the use of an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention or of an anti-NNT-1 / CLF-1 antibody monoclonal, polyclonal or one of their fragments according to the invention, for the preparation of a medicament intended to decrease the survival, growth, proliferation or differentiation of tumor cells expressing the receptor complex CNTFR ⁇ / gpl30 / LEFR ⁇ or a receptor capable of specifically fixing the NNT- complex 1 / CLF-1 according to the invention.
  • the invention also comprises the use of an NNT- 1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ or NNT- 1 / sCNTFR ⁇ complex according to the invention or of anti-antibodies (NNT-1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ or NNT - 1 / sCNTFR ⁇ ) for the preparation of a medicament intended to modulate the biological activity of the gpl30 / LEFR ⁇ receptor, in particular the signal transduction induced by the tyrosine phosphorylation of gpl30 and LIFR ⁇ .
  • Another subject of the invention is the use of an NNT-1 / CLF- 1 / sCNTFR ⁇ or NNT-1 / sCNTFR ⁇ complex or of anti-antibodies (NNT-1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ or NNT- 1 / sCNTFR ⁇ ) according to the invention for the preparation of a medicament intended to modulate the activity of the gpl30 / LEFR ⁇ receptor of cells expressing said gpl30 / LEFR ⁇ receptor, such as the cells involved in the immune system, the hematopoietic system, the nervous system , the reproductive system, the liver, bones or skeletal muscle.
  • the invention also relates to the use of an NNT-1 / CLF-1 complex according to the invention to facilitate the proliferation and / or inhibit the differentiation of stem cells and more particularly of embryonic stem cells. Indeed, it is known that the LIF cytokine allows the proliferation of stem cells and inhibits their differentiation.
  • the invention comprises a complex according to the invention, or a monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments according to the invention as a medicament.
  • the invention also includes a pharmaceutical composition characterized in that it comprises at least one compound chosen from the following compounds:
  • compositions comprising a vector or vector system according to the invention may in particular be used for the transfer of nucleic acid coding for the proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ into a given cell in vivo in as part of a treatment for a neurodegenerative disease by gene therapy.
  • This new technology the scope of which is vast, makes it possible to envisage the treatment of neurodegenerative diseases for which conventional therapeutic alternatives are ineffective or even non-existent and relate to both genetic and acquired diseases.
  • the most practiced approach consists in using a viral vehicle to introduce the therapeutic nucleic acid into the cell to be treated and, in particular, retroviral and adenoviral.
  • viruses have developed sophisticated mechanisms to cross cell membranes, escape degradation at the level of lysosomes and make their genome penetrate into the nuclei in order to ensure the expression of the therapeutic gene.
  • Non-viral vectors More and more gene transfer methods use non-viral vectors. Other methods of gene transfer can be employed such as for example the delivery of the therapeutic nucleic acid by means of synthetic vectors, such as the cationic lipids which interact spontaneously with the nucleic acid to form positively charged complexes capable of fusing with the anionic cell membranes and penetrate the nucleic acid they transport (see for example Behr, Bioconjugate Chemistry, 5: 382, 1994).
  • an even simpler approach can also be envisaged by direct administration of naked DNA coding for the proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ , in particular in the context of diseases affecting the muscles by intramuscular injection.
  • These non-viral methods generally use a vector or system of plasmid vectors according to the invention carrying the therapeutic genes coding for the two proteins NNT-1 and CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ , and the elements necessary for its expression.
  • compositions comprising a vector or vector system according to the invention may also be used for the transfer of nucleic acid coding for the proteins NNT-1, CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ , into a given cell ex vivo in as part of a treatment for neurodegenerative disease, in particular for the repair or regeneration of neurons or neuronal tissue, which will then be implanted or reimplanted in the patient to be treated (xenograft or allograft).
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition according to the invention for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases, in particular amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease or Huntington's disease, for the treatment of abnormal development of the fetal brain , for the regeneration of nervous tissue or skeletal muscle or for the maintenance of muscle mass in the paralyzed or for the treatment of cancer or obesity.
  • neurodegenerative diseases in particular amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease or Huntington's disease
  • the treatment of abnormal development of the fetal brain for the regeneration of nervous tissue or skeletal muscle or for the maintenance of muscle mass in the paralyzed or for the treatment of cancer or obesity.
  • a pharmaceutical composition according to the invention for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases, in particular amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease or Huntington's disease, for the treatment of abnormal development of the fetal brain , for the regeneration of nervous tissue or skeletal muscle or for the maintenance of muscle mass in the paralyzed or for the
  • compositions according to the invention can also be used to improve fertility, and in particular to avoid endometriosis and / or facilitate the implantation of blastocysts.
  • compositions according to the invention can also be used to facilitate hematopoiesis and particularly in the treatment of thrombocytopenia.
  • the compositions according to the invention also comprise GM-CSF. It was found that the number of platelets produced was increased in the presence of LEF.
  • the compositions according to the invention can be used for the treatment of retinitis and more particularly pigmentary retinitis.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pathology linked to an abnormal expression of the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex, characterized in that it comprises a) a monoclonal, polyclonal antibody or a fragment thereof, according to the invention, and b) a pharmaceutically acceptable excipient
  • the pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that said pathology is chosen from cancers
  • the subject of the invention is also the use of a monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments according to the invention for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of cancer
  • the amount of compounds included in the pharmaceutical compositions according to the present invention and necessary for effective therapy will depend on various factors such as the mode of administration, the targeted part of the body, the physiological state of the patient, the administration of other drugs, possible side effects, etc.
  • the dosage for such preventions or therapeutic treatments should be carried out so as to optimize its safety and effectiveness.
  • animal models can be used to determine the effective amounts of the compounds entering into the compositions.
  • compositions according to the present invention for the treatment or prevention of particular pathologies These methods are in particular discussed in works such as Gilman et al (The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed Pergamon Press, 1990) and Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed, 1990) for methods of administration such as oral, intravenous, intraperitoneal, intramuscular or transdermal methods
  • Pharmaceutically acceptable excipients include in particular water, saline solutions, buffers or any other compound described for example in the Merck Index
  • a diagnostic kit or kit comprising an antibody according to the invention, in particular for the assay (including detection) or identification of NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex.
  • a diagnostic kit characterized in that it comprises the following elements a polyclonal, monoclonal antibody or one of their fragments according to the invention, if appropriate labeled,
  • the invention also includes a method for the detection and / or the NNT- 1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex assay, in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps a) bringing the biological sample (tissue or biological fluid) into contact with a monoclonal antibody , polyclonal or a fragment thereof according to the invention (under conditions allowing an immunological reaction between said antibodies and said NNT-1 / CLF-1 complexes and / or s CNTFR ⁇ ), b) demonstration of the antigen-antibody
  • the invention further comprises the use of a monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments for the diagnosis, in particular in vitro of pathology linked to the abnormal expression of NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex. , especially for the diagnosis of cancer
  • the monoclonal, polyclonal antibodies or their fragments according to the invention can also be used for the identification or the localization, in particular tissue or cellular, and / or the assay of NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR ⁇ , said use being included in the invention
  • the monoclonal, polyclonal antibodies or their fragments according to the invention also constitute a means of analysis of the expression of NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes, in biological samples (fluids or on sections of specific tissues ), for example by immunofluorescence, by enzymatic, radioactive or gold labeling They make it possible in particular to demonstrate and quantify the normal or abnormal specific presence of NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex, in tissues or biological samples, which makes them useful for the identification and localization of the expression of NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR ⁇ , for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of NNT complex -l / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ , but also for monitoring the development of methods of prevention or treatment of pathology requiring said detection or said assay.
  • the monoclonal, polyclonal antibodies or their fragments according to the invention can be advantageously used in any situation where the expression of NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR ⁇ , must be observed qualitatively and / or quantitative.
  • the biological sample consists of a biological fluid, such as serum, whole blood, cells, a tissue sample or biopsies of human origin.
  • any conventional procedure or test can be used to carry out such a detection and / or assay.
  • Said test can be a competition or sandwich test, or any test known to those skilled in the art dependent on the formation of an antibody-antigen immune complex.
  • the monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments can be immobilized or labeled. This immobilization can be carried out on numerous supports known to those skilled in the art.
  • These supports may in particular include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, or natural or modified celluloses. These supports can be either soluble or insoluble.
  • a preferred method involves immunoenzymatic processes according to the ELISA technique, by immunofluorescence, or radioimmunological (RI A) or equivalent.
  • the invention relates to a method for evaluating the affinity of a compound to be tested for the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex, characterized in that it comprises: a) bringing a sample containing said NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex into contact with i) a monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments according to the invention; and ii) said compound to be tested; and b) measuring the amount of said monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments, said amount being inversely proportional to the amount of test compounds attached to said NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex
  • the monoclonal, polyclonal antibodies according to the invention or their fragments can also be used in in vitro methods for the selection of compounds capable of binding to the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex, with the desired affinity.
  • the present invention also comprises methods for the competitive selection of pharmaceutical compounds in which the monoclonal or polyclonal antibodies of the invention or their fragments compete with the test compound capable of binding to the NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR ⁇
  • these compounds, identified by the method according to the invention can be used to occupy these binding sites on the NNT-1 / CLF-1 complex and / or sCNTFR ⁇ , and act as a modulating agent or antagonist of the biological activity of the NNT-1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complexes
  • the present invention also comprises the peptide
  • CLF- 1 (splicing variant) of sequence SEQ ED No 4 as well as any derived peptide whose sequence comprises a fragment of at least 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 or 45 acids consecutive amines of the fragment between positions aa 405 and aa 445 of the sequence SEQ ED No 4
  • SEQ ID No 4 according to the invention are capable of forming an NNT- 1 / CLF-1 and / or sCNTFR ⁇ complex according to the invention, and / or can be obtained by genetic recombination or by chemical synthesis
  • the invention also includes the nucleic acids coding for the peptide CLF-1 of sequence SEQ ED No 4 or one of its peptides derived according to the invention, the vectors comprising such nucleic acids as well as the host cells transformed with the using said vectors or nucleic acids
  • the invention further comprises an antibody capable of specifically recognizing the aa 405 - aa 445 domain, or one of its fragments, of the peptide of sequence SEQ ED No 4
  • the invention also includes any method, using such a peptide of sequence SEQ ED No 4, or one of its derivatives, a nucleic sequence coding for such peptides, or said body
  • FIGS. 1A and IB Formation of a secreted complex between NNT-1 and CLF-1
  • NNT-1 / CLF-1 complexes were isolated from the culture media of the same cells by immunoprecipitation with an anti-C-myc monoclonal antibody and the presence of NNT-1 revealed by Western blot with the anti-monoclonal antibody -C-myc coupled to peroxidase IB Upper part the expression of NNT-1 was detected by “Western blot” in the lysate of cells transfected with the monoclonal anti-C-myc antibody coupled to peroxidase
  • NNT-1 in the same culture media was analyzed by immunoaffinity on protein G-Sepharose and “Western blot” with a monoclonal anti-C-myc antibody coupled to peroxidase Figure 2.
  • the NNT heterocompiex -l / CLF-1 induces proliferation of BAF cells
  • Control BAF cells or stable transfectants expressing the receptors indicated in the figure were cultured in the presence of dilutions of culture medium from COS cells transfected with cDNAs coding for CLF-1 NNT-1 (designated CLC), CLF-1 and NNT- 1 or relevant controls.
  • the incorporation of [3 H] thymidine expressed in CPM was done in triplicate.
  • the x-axis represents the concentration of culture medium expressed as a one-third serial dilution.
  • NNT-1 / CLF-1 complex induces tyrosine phosphorylation of gpl30 and LTFR ⁇ .
  • the cells were incubated for 20 min. with the heterocompiexe NNT-1 / CLF-1 (dilution 1: 7), a preparation purified from cells transfected with a control plasmid (indicated "mock” in the figure; dilution 1: 7) or CNTF (50 ng / ml ). After cell lysis and immunoprecipitation with an anti-LEFR ⁇ antibody, the proteins were separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane and the proteins phosphorylated in tyrosine revealed using a monoclonal anti-phosphotyrosine antibody.
  • Figures 4A and 4B Expression of mRNA encoding NNT-1 and CLF-1 in brain tumor cell lines.
  • Figure 5B Expression of CNTFR was detected by Western blot in the lysate of cells transfected with cDNAs encoding the proteins indicated.
  • Figure 5C The presence of NNT-1 in the culture media of the same cells was detected by immunoprecipitation with the anti-C-myc monoclonal antibody followed by a Western blot of the fraction purified with the anti-protein monoclonal antibody vs.
  • Figure 5D The NNT-1 / CNTFR complexes were isolated from the culture media of the same cells by immunoprecipitation with an anti-CNTFR monoclonal antibody and the presence of NNT-1 revealed by Western blot with the supernatant monoclonal anti-protein C SN antibody.
  • the heterocompiex NNT-1 / sCNTFR induces the proliferation of BAF 3 cells transfected with gpl30 and LIFR ⁇ .
  • the BAF 3 cells transfected in a stable manner with the gpl30 and LIFR ⁇ receptors were cultured in the presence of dilutions of culture medium from COS cells transfected with the cDNAs coding for NNT-1, sCNTFR, NNT-1 and CLF-1 or NNT-1 and sCNTFR
  • the recombinant LEF protein was used as a positive control of cell proliferation
  • the incorporation of [3 H] thymidine expressed in CPM was done in triplicate
  • the abscissa axis represents the concentration of culture medium expressed in the form third-party serial dilution
  • COS I monkey, SK-N-MC human neuroblastoma, U373 MG human glioma and BAF / 3 mouse myeloid lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) and maintained according to Specifications
  • the LN 215, LN 229 and LN 415 glioma lines were generously donated by Dr PY Dietrich (Cantonal University Hospital of Geneva, Geneva, Switzerland) and cultivated in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum ( SVF)
  • SVF fetal calf serum
  • COS I cells were cultured in Yssel medium ⁇ Yssel, De Nries, et al 1984 ID 378 ⁇ after transfection
  • the recombinant cytokines and soluble receptors were obtained from R & D Systems ( Abingdon, Oxon, UK) Cloning of AD ⁇ c encoding ⁇ T-1
  • NNT-1 GenBank, Accession No AI752511
  • cDNA encoding NNT-1 was then amplified by PCR anchored on lymph node cDNA (Race-Ready human lymph node cDNA, Clontech, Palo Alto, CA) using the primer AP-1 (from the Clonetech Marathon amplification kit) and the specific primer for NNT-1 5'-AAGGGGGAGCGAAGAGGAGAAGG-3 '(SEQ ID No 8) (35 PCR cycles, 94 ° C, 30 ", 60 ° C, 30 ", 72 ° C, 1")
  • the amplified cDNA was cloned into the vector pGEM-Teasy (Promega Corp, Madison, WI) and sequenced to produce an NNT-1 derivative containing the C-myc epitope EQKLISEEDL ( SEQ ED No 9) (
  • the cDNA coding for a soluble form of the ⁇ chain of the CNTF receptor was amplified using the primers 5'-CCGCTCGAGGCCCAGAGACACAGTCCACA-3 '(SEQ ID No 14) and 5'-CCGCTCGAGGTCACAGATCTTCGTGGT-3' (SEQ ID No 15), clone in phase with a cDNA fragment coding for the Fc part of human IgGl and transient Transfection sequence
  • COS I cells were cultured at the rate of 1 ⁇ 10 5 cells / well in 6-well culture dishes of 35 mm 2 and transfected the next day with Fugene 6 TM (Roche Diagnostics, Meylan, France) according to the instructions. from the manufacturer For co-transfection, the plasmid / Fugene 6 TM complexes were generated and added to the cells independently Immunoprecipitation of the CLF-1Fc / NNT-lmyc complex and analysis by “Western blot”
  • COS I cells were lysed 72 hours after transfection in REPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) Cell lysates were passed through 0.8 mm syringe needles and cell debris removed by centrifugation The lysates were then mixed 1 l with Tris-Glycine-SDS sample buffer (Novex, San Diego, CA) containing 750 mM ⁇ -mercaptoethanol and heated to 95 ° C for 5 'In parallel, the culture media were centrifuged sequentially at 3000 then 13000 RPM in a microcentrifuge to remove cellular debris The media were incubated for one hour with 25 ⁇ l of protein G- Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Sweden) at 4 ° C After elimination of the G-Sepharose protein, anti-C-myc monoclonal antibody (Sigma Chemical Co St Louis, MO) was
  • the G-Sepharose protein was washed three times with PBS, taken up in 100 ⁇ l of tris-Glycine-SDS sample buffer containing 375 mM of ⁇ -mercaptoethanol and heated to 95 ° C. for 5 'For the immunoprecipitation of the Fc fusion proteins, the same procedure was followed, except that the first incubation was carried out with Sepharose coupled to human serum albumin and the addition of omitted anti-C-myc antibodies The proteins were analyzed by SDS-PAGE on a 12% polyacrylamide gel and electrotransferred on a PNDF membrane (Millipore Corp, Bedford, MA) The membranes were blocked in TBS buffer supplemented with 0.15% Tween-20 and 5% milk powder (blocking buffer) Proteins comprising the C-myc epitope were detected by incubation with an anti-C-myc antibody coupled to peroxidase (Roche Diagnostics) diluted 1100 in blocking buffer The fusion proteins containing an Fc region were revealed using a
  • the SN-N-MC cells were incubated in serum-free culture medium for 16 h, stimulated for 10 minutes at 37 ° C. in the presence of the samples to be tested and then lysed in 10 mM Tris-HCl pH 7 6.5 mM buffer.
  • EDTA 50 mM NaCl, 30 mM sodium pyruvate, 50 mM sodium fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, 1% Brij 96 containing protease inhibitors (1 ⁇ g / ml pepstatin A, 2 ⁇ g / ml leupeptine, 5 ⁇ g / ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, Sigma Chemical Corp)
  • the lysates were stirred for 60 min at 4 ° C and the insoluble fractions removed by centrifugation at 12,000 xg for 30 min After having been adjusted for protein content , the lysates were incubated for 16 h in the presence of specific antibodies directed against LEFR ⁇ (10 ⁇ g Ab / ml, SC-659, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)
  • the antigen-antibody complexes were isolated by chromatography affinity for protein A-Sepharose (Pharmacia), washed
  • NNT-1 cytokine contains a signal peptide (Senaldi et al, 1999; Shi et al, 1999).
  • a derivative of this cytokine (NNT-1-myc) was expressed comprising an epitope recognized by an anti-C-myc antibody in the fibroblastic monkey kidney line COS Although the production of the recombinant protein is clearly detectable in these cells (cf. FIG. 1A), the secretion of NNT-1 in the culture medium was not observed (cf. FIGS.
  • NNT-1 forms a complex with a fusion protein CLF-1 Fc II was then tested if NNT-1 and CLF-1 were released in the form of a heterocomplex
  • the vector of expression coding for NNT-1-myc was co-transfected with cDNAs coding for fusion proteins CLF-1-Fc or sCNTFR ⁇ -Fc
  • transfections with cDNAs for NNT-1-myc, CLF- l-Fc, sCNTFR ⁇ -Fc or the empty expression vector were carried out in parallel
  • the proteins complexed with the Fc fusion proteins were immunoprecipitated and NNT-lmyc revealed by “Western blotting” with an anti-myc antibody NNT-1 was only detected in the culture media of cells co-transfected with NNT-1-myc and CLF-1-Fc, clearly showing the formation of a secreted heterodimeric
  • FIG. 1 EXAMPLE 4.
  • the NNT- 1 / CLF-1 complex induces the proliferation of BAF / 3 cells transfected with cDNAs encoding CNTFR ⁇ gpl30 / LIFR ⁇
  • the ability of the complex to induce the proliferation of BAF / 3 cells transfected with different combinations of cDNAs coding for IL-6R ⁇ , CNTFR ⁇ , gp! 30 and LIFR ⁇ was studied.
  • NNT-1 / CLF-1 complex To examine the capacity of the NNT-1 / CLF-1 complex to induce intracellular signals, said complex was purified from the culture medium of COS cells co-transfected with the two cDNAs by immunoaffinity and its capacity to induce tyrosine phosphorylation of gpl 30, LEFR ⁇ was tested in BAF / 3 transfectants and SK-N-MC neuroblastoma cells Exposure to the NNT-1 / CLF-1 complex of BAF / 3 cells transfected by the combination of cDNAs encoding CNTFR ⁇ , gpl 30 and LIFR ⁇ induced phosphorylation of L FR ⁇ (see Figure 3).
  • the CNTFR ⁇ , gpl 30 and LIFR ⁇ subunits forming the receptor for the NNT-1 / CLF-1 complex are known to be expressed by several cell lines derived from brain tumor.
  • the coexpression of CLF-1 and NNT-1 by these cells would translate by the production of heterocompiexe and an autocrine activity on their proliferation
  • the expression of the mRNA coding for CLF-1 and NNT-1 was therefore studied by reverse transcriptase PCR (RT-PCR) in cell lines derived from tumors of the brain As shown in Figures 4A and 4B, expression of the mRNA encoding NNT-1 was observed in the cells of neuroblastoma SK-N-MC and glioblastoma U373 Similarly, CLF-1 is detectable by RT-PCR in SK-N- MC cells and in several glioblastoma lines
  • NNT-1 forms a stable complex with CLF-1.
  • the formation of this heterocomplex is essential for the release of NNT-1 into the cell culture medium and represents the first demonstration of such a mechanism for controlling the production in the family of cytokines homologous to EL-6
  • This mode of control is close to that described for the heterodimer EL-12 (cf. FIGS. 1A and IB) (Trinchieri, G, Annu Rev Immunol 13 251-276, 1995 ) It is therefore very likely that although active at high concentration after production in bacteria, NNT-1 is normally secreted and therefore functionally active only in the form of a complex with CLF-1
  • the heterocompiexe NNT- 1 / CLF-1 is capable of inducing the tyrosine phosphorylation of gpl 30, and LEFR ⁇ (cf. FIG. 2) as well as the proliferation of BAF / 3 cells via CNTFR ⁇ , gpl30 and LEFR ⁇ (cf. FIG.
  • NNT-1- receptor complex comprises two ⁇ chains (CLF-1 and CNTFR ⁇ )
  • CNTFR ⁇ was originally identified as a receptor for CNTF (Ip, NY et al, Annu Rev Neurosci 19 491-515, 1996), a cytokine allowing motor neuron survival, inducing differentiation and proliferation of certain neuronal lines and having neuromuscular functions (Alexander, WS, et al, Curr Biol 9 605-608, 1999)
  • the NNT-1 / CLF-1 complex most likely has the same properties
  • the mRNAs encoding NNT-1 and CLF-1 are expressed by a relatively large number of tissues (Senaldi, G, et al, Proc Natl Acad Sci USA 96 1 1458-1 1463, 1999, Shi, Y, et al, Biochem Bio
  • NNT- 1 / CLF-1 complex will therefore be limited by the restricted distribution of one of the receptor chains, CNTFR ⁇
  • the expression of the mRNA coding for CLF-1 mRNA was detected by in situ hybridization in the developing brain , the craniofacial mesenchyme (Takahashi, R, et al, Nat Genêt 7 79-84, 1994) and by Northern blot in skeletal muscles (Elson, GC, et al, J Immunol 161 1371-1379, 1998) Although the expression of NNT-1 mRNA in adult skeletal muscles or the fetal brain has not yet been reported, these observatio They strongly suggest a potential role for the NNT-1 / CLF-1 heterocompiex in the developing brain, especially in neuronal survival and differentiation as well as in neuromuscular function.
  • mice deficient in the gene coding for CNTF although having a neuronal degeneration have a phenotype that is only slightly observed observable late in adults (Masu, Y, et al, Nature, 365 27-32, 1993) It has also been observed that 2.5% of the Japanese population is homozygous for a mutation inactivating the CNTF gene without any effect being detected even in the elderly (DeChiara, TM, et al, Cell, 83 313-322, 1995) Strongly contrasting with these observations, the mice deficient for CNTFR ⁇ do not suckle, die quickly after birth and show a dramatic loss in the population of motor neurons (Yssel, H, et al, J Immunol Methods 72 219-227, 1984) These observations indicate the existence of another unidentified ligand of CNTFR ⁇ important during development, commonly called CNTF-2 It is clear that CNTF-2 most certainly corresponds to the heterocompiex NNT-1 / CLF-1 This hypothesis is support e by observations on mice
  • NNT-1 / CLF-1 complex a ligand for the CNTFR ⁇ receptor
  • NNT-1 / CLF-1 complex is thus able to form a ternary complex with the soluble form of CNTFR ⁇ which has been identified in the cerebrospinal fluid and the skeletal muscles after damage (Davis, S, et al, Science, 259 1736-1739, 1993)
  • Such an NNT-1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex formed in the cerebrospinal fluid would have certain "remote actions" in the central nervous system, making cells normally insensitive, sensitive to the effect of NNT-1 / CLF- 1
  • An NNT- 1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex would thus act on any cell expressing gpl 30 and LEFR ⁇
  • the formation of an NNT- 1 / CLF-1 / sCNTFR ⁇ complex in skeletal muscle and a diffusion in the circulation would allow a systematic action
  • NNT-lmyc / pc a derivative of NNT-1
  • tmCNTFR transmembrane form of CNTFR
  • sCNTFR soluble derivative
  • FIG. 5C These results indicate that the release of NNT-1 by the cells is carried out after the co-expression of sCNTFR or the membrane form of CNTFR II was then tested if NNT-1 and CNTFR were released in the form of a heterocomplex Culture media of cells transfected only with NNT-lmyc / pc or co-transfected es with NNT-lmyc / pc and sCNTFR or tmCNTFR were immunoprecipitated with anti-CNTFR monoclonal antibodies The presence of NNT-lmyc / pc in the resulting purified fractions was analyzed by Western blot NNT-1 was observed only in the purified fractions of the supernatants of cells co-transfected with the cDNAs coding for NNT-1 and sCNTFR or tmCNTFR (cf.
  • FIG. 5D These results demonstrate that NNT-1 and sCNTFR form a secreted complex, and that tmCNTFR can probably be cleaved and thus gave birth to a released form of CNTFR which will generate the NNT-1 / CNTFRs complex
  • NNT-1 / CNTFR complex induces the proliferation of BAF / 3 cells transfected with the cDNAs coding for gpl 30 and LIFR ⁇
  • the culture medium for COS cells co-transfected with NNT-1 / sCNTFR was tested at various concentrations on BAF / 3 transfected with cDNA coding for gpl 30 and LIFR ⁇
  • the culture medium for COS cells transfected with NNT-1 or sCNTFR alone or co-transfected with NNT-1 and CLF-1 was used as a control just like a culture medium containing the purified recombinant LIF protein (rLEF)
  • rLEF purified recombinant LIF protein

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Abstract

La présente invention a pour objet un nouveau complexe isolé comprenant une protéine NNT-1 et en outre au moins une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα ainsi que des anticorps dirigés spécifiquement contre ledit complexe. L'invention comprend également une composition comprenant ledit complexe comme médicament pour la prévention et/ou le traitement de maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson ou la maladie du Huntington, pour la maintenance de la masse musculaire chez les paralysés, pour le traitement de l'obésité ou du cancer.

Description

COMPLEXE ISOLE COMPRENANT UNE PROTEINE NNT-1 ET EN OUTRE AU MOINS UNE PROTEINE CLF-1 ET/OU UNE PROTEINE sCNTFRα
La présente invention a pour objet un nouveau complexe isolé comprenant une protéine NNT-1 et en outre au moins une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα ainsi que des anticorps dirigés spécifiquement contre ledit complexe L'invention comprend également une composition comprenant ledit complexe comme médicament pour la prévention et/ou le traitement de maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington, pour la maintenance de la masse musculaire chez les paralysés, pour le traitement de l'obésité ou du cancer
La famille des cytokines de type IL-6 comprend 1TL-6, l'IL-11, le facteur d'inhibition de la leucémie LIF (pour « Leukemia Inhibitory Factor »), l'oncostatine M OSM, le facteur neurotrophique ciliaire CNTF (pour « Ciliary NeuroTrophic Factor »), la cardiotrophine-1 CT-1 ainsi que la neurotrophιne-1 NNT-1 aussi dénommée BSF-3 (pour « B cell Stimulatory Factor 3 ») ou CLC (pour « Cardiotrophin-Like Cytokine ») (Taga, T et al , Annu. Rev Immunol 15 797-819, 1997 , Senaldi, G , et al , Proc Natl Acad Sci U S A 96 11458-11463, 1999 , Shi, Y et al , Biochem Biophys Res Commun 262 132-138, 1999) Toutes ces cytokines utilisent, comme chaîne de récepteur impliquée dans la transduction du signal, la glycoprotéine gpl30 Les cytokines LIF, OSM, CNTF, CT-1 et NNT-1 partagent une deuxième sous-unité de récepteur impliquée dans la transduction du signal à l'intérieur de la cellule, la chaîne β du récepteur à LIF LIFRβ (Senaldi, G , et al , 1999 , Heinrich, P C , et al , Biochem J , 334 297-314, 1998) Il a été décrit que les cytokines IL-6, IL-11, CNTF et CT-1 utilisent encore une chaîne α non impliquée dans la transduction du signal qui forme un complexe à haute affinité avec gpl30 et/ou LIFRβ Des formes solubles des chaînes α des récepteurs pour IL-6, IL- 11 et CNTF peuvent agir comme agoniste sur les cytokines correspondantes ce qui implique que des complexes formés entre ces chaînes α et les cytokines peuvent stimuler toute cellule exprimant gpl30 (pour IL-6 et IL-11) ou la combinaison de gpl30 et LIFRβ (pour CNTF) (Davis, S , et al , Science 259 1736-1739, 1993) C'est pourquoi ces cytokines ont des fonctions redondantes et des effets pléiotropiques sur le système immunitaire, hématopoiétique, nerveux central et reproductif (Taga, T et al , Annu Rev Immunol 15 797-819, 1997) Elles jouent aussi un rôle dans le contrôle de la fonction du foie et la résorption osseuse (Taga, T et al , Annu Rev Immunol 15 797-819, 1997) Des effets sur la croissance tumorale ont aussi été reportés, l'IL-6 étant un facteur impliqué dans la croissance autocπne de myélomes et l'OS (oncostatine) un facteur de croissance autocrine des sarcomes de Kaposi par ailleurs capable d'inhiber la croissance de cellules de mélanomes Des effets sur l'angiogénèse ont aussi été décrits (Nan Damme, J , et al , J Exp Med 165 914-919, 1987 , Νordan, R P et al , Science 233 566-569, 1986 , Kawano, M , et al , Nature 332 83-85, 1988 , Malik, N , et al , Mol Cell Biol 9 2847-2853, 1989 , Nair, B C , et al , Science 255 1430-1432, 1992 , Miles, S A , et al , Science 255 1432-1434, 1992 , Pepper, M S , et al , Curr Top Microbiol Immunol 213 31-67, 1996)
Le facteur de cytokine 1 dénommé CLF-1 (pour « Cytokine-Like Factor- 1 ») a été identifié comme une protéine ayant une homologie avec gpl30 et les chaînes α des récepteurs pour la famille des cytokines proches de l'IL-6 II a été proposé que CLF-1 agisse comme une chaîne α classique de cette famille ou qu'il participe à une molécule de type IL- 12 (Elson, G C , et al , J Immunol 161 1371-1379, 1998) L'IL-12 est une cytokine hétérodimérique comprenant deux chaînes polypeptidiques, p35 et p40 Les deux sous-unités de r∑L-12 sont les produits de deux gènes indépendants Les sous- unités p35 et p40 sont homologues, respectivement, à des membres de la famille IL-6 et à des récepteurs aux cytokines Les deux chaînes du récepteur à l'IL-12 impliquées dans la transduction du signal (IL-12Rβl et IL-12Rβ2) sont elles homologues à gpl30 Le système IL-12/TL-12R est donc proche du système cytokine de la famille IL-6/gpl30 plus LIFRβ
La production de l'IL-12 est contrôlée de manière originale Lorsqu'elle est exprimée seule, la sous-unité p35 n'est sécrétée qu'en très faible quantité Elle n'est relâchée par les cellules qu'en présence de la sous-unité p40 La synthèse de cette chaîne est donc absolument requise pour la production de FIL- 12 A la différence de p35, p40 exprimée seule est sécrétée sous forme d'un homodimère capable de lier le récepteur et qui a un effet antagoniste (Trinchieri, G , Annu Rev Immunol , 13 251-276, 1995) Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence la production d'homodimères de CLF-1 par des cellules transfectées par l'ADNc correspondant Cette observation est compatible avec l'hypothèse que CLF-1 est impliquée dans une cytokine multimérique de type IL- 12 (Elson, G C , et al , J Immunol 161 1371 -1379, 1998)
Depuis la comparaison des phénotypes des souris pour lesquelles les gènes codant pour le CNTF ou la chaîne α de son récepteur, l'existence d'un deuxième ligand pour CNTFRα a été spéculée Ce ligand est généralement appelé CNTF-2 et serait important pour le développement En effet, les souris déficientes pour CNTF ne sont que peu affectées dans leur phénotype et uniquement à l'âge adulte (Masu, Y , et al , Nature 365 27-32, 1993) De même, il existe des populations humaines homozygotes pour des mutations inactivant CNTF qui sont totalement asymptomatiques (DeChiara, T M , et al , Cell 83 313-322, 1995) A l'opposé de ces observations sur le rôle du CNTF, les souris sans CNTFRα sont incapables de téter, meurent peu après la naissance et ont une perte dramatique dans la population de neurones moteurs (Yssel, H , et al , J Immunol Methods 72.219-227, 1984)
On recherche aussi de nouvelles cytokines capables de se lier aux récepteurs LIFRβ et/ou gpl30 et ainsi capables de stimuler les cellules exprimant ces récepteurs
Ainsi, il reste aujourd'hui un grand besoin d'isoler et d'identifier un nouveau ligand spécifique du récepteur CNTFRα, tout comme de nouveaux ligands spécifiques des récepteurs LIFRβ et/ou gpl30 De tels ligands seraient en effet susceptibles d'avoir un rôle important en particulier dans le développement du système nerveux central, dans la survie des neurones centraux et périphériques ainsi que dans la fonction neuromusculaire Ceci est justement l'objet de la présente invention
Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante que la sécrétion de la cytokine NNT-1 de la famille IL-6 est dépendante de la co-expression de CLF-1 et que NNT-1 et CLF-1 forment un complexe capable de stimuler la prolifération des cellules via un récepteur comprenant les sous-unités CNTFRα, gpl30 et LIFRβ
Lors de cette mise en évidence, il a aussi été constaté de manière surprenante la formation des complexes NNT- 1 /sCNTFRα et NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα , sCNTFRα désignant la chaîne α du récepteur au CNTFR sous forme soluble, agoniste pour CNTF (Davis, S , et al , Science 259 1736-1739, 1993) Ces complexes peuvent agir sur toutes les cellules exprimant LIFRβ et gpl30, et donc avoir des effets sur l'ensemble des systèmes dont les cellules expriment LIFRβ et gpl30, tels que le système immunitaire, hématopoiétique, nerveux, reproductif ainsi que sur le foie, les os et les muscles squelettiques
La présente invention a ainsi pour objet principal un complexe isolé comprenant une protéine NNT-1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα
La présente invention a ainsi notamment pour objet un complexe isolé, dénommé également CNTF2, caractérisé en ce qu'il comprend une protéine NNT-1 et une protéine CLF-1 L'invention concerne encore le complexe comprenant les protéines NNT-1 et sCNTFRα et le complexe comprenant les protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFRα Par « protéine », on entend désigner également les termes de peptide ou polypeptide, ces 3 termes étant utilisés indifféremment dans la présente description
Dans la présente description, en particulier dans les revendications, sauf mention particulière, on entendra désigner par « protéine NNT-1 » la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2 et ses protéines dérivées telles que définies ci-après , par « protéine CLF-1 » la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6 et leurs protéines dérivées telles que définies ci-après et par « protéine soluble sCNTFRα » la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7 et ses protéines dérivées telles que définies ci-après
Par « protéine dérivée » de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2, on entend désigner dans la présente description toute protéine dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No 2, capable de former un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7 Parmi ces protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 2, on préfère notamment les protéines formant un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No. 6, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LLFRβ
Par activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ, on entend désigner en particulier celle mesurée par des techniques standards ci-après décrites dans les exemples comme la phosphorylation en tyrosine de gp 130 et LIFRβ des cellules BAF/3 et SK-N-MC exprimant les sous-unités CNTFRα, gρl30 et LIFRβ ou leur prolifération cellulaire
Parmi ces protéines dérivées de la séquence SEQ ID No 2, on préfère aussi les protéines formant un complexe avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur complexe gpl30/LIFRβ
Par activité biologique du récepteur complexe gpl30/LIFRβ, on entend désigner en particulier celle mesurée par des techniques standards ci-après décrites dans les exemples comme la prolifération des cellules BAF3 transfectées par les ADNc codant pour gpl30 et LIFRβ D'autres techniques utilisables se basent sur la prolifération des cellules TF-1, la production dTL-6 par les cellules KB ou encore la phosphorylation de
STAT-3 dans les cellules HEP62
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No 2, on préfère tout particulièrement les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No 2 et formant un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou
No 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7, l'activité biologique dudit complexe étant au moins de 50 %, de préférence 60 % ou 80 % de celle mesurée pour le complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2 et la protéine CLF- 1 de séquence SEQ LD No 4 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7 dans les exemples ci-après
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ) No 2, on préfère également les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No 2 et formant un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7, ledit complexe étant capable d'inhiber l'activité biologique du complexe obtenu avec la protéine NNT-1 de séquence
SEQ ID No 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7
En effet, de tels complexes, en tant qu'inhibiteurs compétitifs du complexe forme avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID NO 4 ou No 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID
No 7, pourront être utilisés pour moduler, en particulier diminuer, l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpl30 LIFRβ ou du récepteur gpl30/LIFRβ, en particulier la survie, la croissance ou la prolifération de cellules exprimant ledit récepteur complexe, notamment tumorales
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No 2, on préfère notamment les protéines dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No 2 ou avec l'un de ses fragments, et comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No 2 Ainsi, lesdites protéines dérivées de la protéine NNT-1 dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, avec la séquence SEQ ID No 2 ou avec l'un de ses fragments, pourront ainsi comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparée à la protéine sauvage NNT- 1 de séquence SEQ LD No. 2 Par substitution conservatrice, on entend désigner toute substitution d'acide aminé n'induisant que peu ou pas d'effet sur la charge totale, la polarité ou l'hydrophobicité de la protéine de référence, ladite substitution permettant d'accroître ou de diminuer l'activité recherchée du complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα comprenant ladite protéine NNT-1 substituée Cette activité recherchée pouvant être soit une activité agoniste ou soit antagoniste (inhibiteur compétitif) du récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ ou du récepteur gpl30/LIFRβ.
Par « protéine dérivée » de la protéine CLF-1 de séquence SEQ K) No 4 ou No 6, on entendra désigner dans la présente description toute protéine dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID No 4 ou No 6, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID No 4 ou No 6, capables de former un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2
Parmi les protéines dérivées de séquence SEQ ID No 4 ou No 6. on préfère également les protéines formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ, activité biologique telle que précédemment définie Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No 4 ou No 6, on préfère tout particulièrement les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No 4 ou No 6 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2, l'activité biologique dudit complexe étant au moins de 50 %, de préférence 60 % ou 80 % de celle mesurée pour le complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ LD No 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No 4 ou No 6, on préfère également les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ED No 4 ou No 6 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2, ledit complexe étant capable d'inhiber l'activité biologique du complexe obtenu avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 En effet, un tel complexe, en tant qu'inhibiteur compétitif du complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6, pourra être utilisé pour moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpBO/LLFRβ, en particulier diminuer la survie, la croissance ou la prolifération de cellules expπmant ledit récepteur complexe, notamment tumorales
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No 4 ou No 6, on préfère notamment les protéines dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No 4 ou No 6 ou avec l'un de leurs fragments, et comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No 4 ou No 6
Ainsi, lesdites protéines dérivées de la protéine CLF-1 dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, avec la séquence SEQ ID No 4 ou No 6 ou avec l'un de leurs fragments, pourront ainsi comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparée à la protéine CLF-1 de séquence SEQ LD No 4 ou No 6
Par « protéine dérivée » de la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No 1, on entendra désigner dans la présente description toute protéine dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID o. 7, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID No. 7, capables de former un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2.
Parmi les protéines dérivées de séquence SEQ ID No. 7, on préfère également les protéines formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur gpl30/LIFRβ, activité biologique telle que précédemment définie.
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 7, on préfère tout particulièrement les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 7 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ LD No. 2, l'activité biologique dudit complexe étant au moins de 50 %, de préférence 60 % ou 80 % de celle mesurée pour le complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine soluble sCNTFRα de séquence SEQ ID No. 7.
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 7, on préfère également les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 7 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ledit complexe étant capable d'inhiber l'activité biologique du complexe obtenu avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ID No. 7. En effet, un tel complexe, en tant qu'inhibiteur compétitif du complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ID No. 7, pourra être utilisé pour moduler l'activité biologique du récepteur gpl30/LIFRβ, en particulier diminuer la survie, la croissance ou la prolifération de cellules exprimant ledit récepteur complexe, notamment tumorales.
Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 7, on préfère notamment les protéines dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 7 ou avec l'un de leurs fragments, et comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 7. Ainsi, lesdites protéines dérivées de la protéine sCNTFRα dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, avec la séquence SEQ ID No. 7 ou avec l'un de leurs fragments, pourront ainsi comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparée à la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad App Math 2 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J Mol Biol 48 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc Natl Acad Sci USA 85 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr , Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P)
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, « BLAST 2 séquences », disponible sur le site http //www ncbi nlm nih gov/BLAST/ , les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres « open gap penaltie » 5, et « extension gap penaltie » 2 , la matrice choisie étant par exemple la matrice « BLOSUM 62 » proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme
L'invention comprend un complexe selon l'invention, caractérise en ce qu'il comprend la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No 2 , la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No 4 ou No 6 , et/ou une protéine sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No 7 De manière générale, dans la présente description, on entend désigner par l'expression de type complexe comprenant "A, B et/ou C" ou encore "A , B et /ou C" (telle que dans la revendication 2) ou encore A/B et/ou C"
- les complexes comprenant A et B,
- les complexes comprenant A et B et C, ou - les complexes comprenant A et C
De manière générale également, par l'expression de type "A, et/ou B et/ou C" on entend désigner toutes les combinaisons possibles de ces trois éléments pris seuls, par deux ou trois (A, B, C, A et B, A et C, B et C, A et B et C)
De manière générale aussi, par l'expression de type couplage entre "A, et B et/ou C", on entend désigner
- le couplage entre A et B,
- le couplage entre A et B et C, ou
- le couplage entre A et C
Parmi lesdits complexes NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα selon l'invention, on préfère ceux caractérisés en ce que la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 ou la protéine sCNTFRα est obtenue par synthèse chimique ou par voie recombinante Lesdites protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFRα peuvent être obtenues sous forme de protéines recombinantes, glycosylées ou non, par les techniques standards de recombinaison génétique en utilisant des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par des vecteurs plasmidiques ou viraux contenant des acides nucléiques codant pour lesdites protéines, ou par synthèse chimique
Parmi lesdits complexes selon l'invention, on préfère également ceux caractérisés en ce que la protéine NNT-1 est couplée par liaison covalente à la protéine CLF-1 et/ou à la protéine sCNTFRα pour former une protéine de fusion, notamment par couplage chimique Dans un mode de réalisation particulier, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine NNT-1, et/ou ladite protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα pour faciliter le couplage chimique, de préférence ledit élément de liaison introduit est un acide aminé
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre ladite protéine NNT-1, ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRα Le couplage covalent entre ladite protéine NNT-1, et ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRα selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N- ou C- terminale de ladite protéine NNT-1, et/ou de ladite protéine CLF-1 et/ou de ladite protéine sCNTFRα Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de ladite protéine NNT-1, et/ou de ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRα choisies à coupler
Dans un autre mode de réalisation particulier, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce que ladite protéine de fusion obtenue après couplage entre ladite protéine NNT-1, et ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRα est préparée par recombinaison génétique
La protéine de fusion peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine NNT- 1 , d'une séquence codant pour ladite protéine CLF-1 et/ou d'une séquence codant pour ladite protéine sCNTFRα. Les procédés de synthèse de molécules de fusion ou hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.V. Goeddel (Gène expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185:3-187, 1990).
Parmi lesdits complexes selon l'invention, on préfère également ceux caractérisés en ce que la protéine NNT-1, CLF-1 et sCNTFRα sont des protéines naturelles exprimées par des cellules ou lignées cellulaires, notamment d'origine animale, comprenant naturellement des acides nucléiques codant pour lesdites protéines NNT-1 et/ou CLF-1 et/ou sCNTFRα, en particulier par des cellules capables de produire naturellement le complexe selon l'invention, en particulier dans le milieu de culture où elles sont cultivées.
L'invention comprend en outre un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant la mise en contact d'une protéine NNT-1 avec une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα, de préférence dans un milieu favorisant la formation dudit complexe.
L'invention concerne aussi un vecteur ou un système de deux ou trois vecteurs de co-expression des protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα dans une cellule hôte, lesdites protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα étant capables de former un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit vecteur ou ledit système de deux ou trois vecteurs contient une séquence nucléique codant pour une protéine NNT- 1 , une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα. Le vecteur ou système de deux ou trois vecteurs selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression desdites séquences dans une cellule hôte et éventuellement la sécrétion desdites séquences hors de la cellule hôte. Par « vecteur d'expression ou de co- expression », on entend aussi bien des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs d'expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus, du virus associé à l'adénovirus (AAN), de rétrovirus, des lentivirus, et de préférence les dérivés de HIN, des poxvirus, du virus de l'herpès pour l'expression en système eucaryote Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADΝ nu ou l'ARΝ nu selon la technique développée par la société NICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines
Selon un mode particulier de réalisation, le vecteur selon l'invention comporte des éléments de contrôle de l'expression des protéines ΝΝT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα adaptés à la cellule hôte choisie
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par les vecteurs ou systèmes de deux vecteurs selon l'invention De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression des deux protéines recombinantes capables de former un complexe selon l'invention L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales , de préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères, mais également une cellule d'insectes dans laquelle on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes de séquence nucléotidique insérée dans un vecteur ou système de deux vecteurs tel que défini ci- dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant l'expression de la séquence nucléotidique transfectée L'invention concerne également une méthode de préparation d'un complexe
NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα caractérisé en ce qu'il met en œuvre un vecteur ou système de deux ou trois vecteurs selon l'invention Plus particulièrement, l'invention porte sur une méthode de préparation d'un complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinant caractérisé en ce que l'on cultive des cellules transformées selon l'invention dans des conditions permettant l'expression des protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFR α recombinantes et que l'on récupère ledit complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinant formé.
Le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinant selon l'invention est susceptible d'être obtenu selon un procédé de l'invention et selon les techniques de production de protéines recombinantes connues de l'homme du métier. La présente invention concerne donc le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinant susceptible d'être obtenu par la méthode ci-dessus présentée. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Un système efficace de production de protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion des protéines traduites. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα capables de former le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinant selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinants selon l'invention obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle. Bien entendu, lesdits complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα recombinants selon l'invention peuvent être obtenus à partir de protéine NNT-1 couplée à une protéine CLF- 1 et/ou couplée à une protéine sCNTFRα par fusion génétique comme cela a été mentionné précédemment. Les complexes NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα selon l'invention qui peuvent être formés à partir de protéines NNT-1 et/ou CLF-1 et/ou sCNTFRα obtenues par synthèse chimique et peuvent ainsi comporter des acides aminés non naturels, sont également compris dans l'invention. Les procédés de purification des protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFRα recombinantes ou naturelles, ou des complexes NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα selon l'invention sont connus de l'homme du métier. Les protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFR α ou le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα selon l'invention, notamment recombinantes, peuvent être purifiées à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.. Une variante préférée consiste à produire une protéine recombinante fusionnée à une protéine « porteuse » (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les cellules caractérisées en ce qu'elles contiennent un vecteur ou système de deux vecteurs selon l'invention font également partie de la présente invention, notamment les cellules procaryotes ou eucaryotes, de préférence les cellules de mammifère.
De préférence, l'invention comprend un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) culture d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine NNT-1 et une séquence d'ADN codant pour la protéine CLF-1 et/ou une séquence d'ADN codant pour une protéine sCNTFRα dans un milieu de culture approprié à ladite cellule ; b) récupération dudit complexe formé à partir du milieu de culture et/ou de lysat desdites cellules cultivées. De préférence, ladite cellule à l'étape a) est une cellule transformée selon l'invention.
De préférence également, ladite cellule à l'étape a) est une cellule exprimant naturellement une protéine NNT-1, une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα, c'est-à-dire une cellule comprenant naturellement une séquence nucléique codant pour une protéine NNT-1 et une séquence nucléique codant pour une protéine CLF-1 et/ou une séquence nucléique codant pour une protéine sCNTFRα.
Parmi les cellules exprimant naturellement une protéine NNT-1 et une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα, on préfère en particulier les cellules issues d'une lignée cellulaire, notamment animale, telles que celles décrites ci-après dans les exemples, ces exemples n'étant pas limitatifs.
Dans un mode de réalisation préféré, la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα sont sécrétées à l'extérieur de ladite cellule cultivée et le complexe formé est directement prélevé à partir dudit milieu de culture, obtenu à l'étape a). L'invention comprend également un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) culture d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine NNT-1, d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine CLF-1 et/ou d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine sCNTFRα dans un milieu de culture approprié pour chacune desdites cellules ; b) mise en contact des protéines NNT-1 et des protéines CLF-1 et/ou des protéines sCNTFRα contenues dans leur milieu de culture respectif et/ou dans leur lysat cellulaire respectif ; c) récupération dudit complexe formé à l'étape b). De préférence, lesdites cellules à l'étape a) sont des cellules transformées selon l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules utilisées à l'étape a) avant transformation sont de même type et sont cultivées après transformation dans un même milieu de culture, la mise en contact des protéines NNT-1 et des protéines CLF-1 et/ou des protéines sCNTFRα contenues alors dans le milieu de culture commun et/ou dans le lysat cellulaire global se faisant naturellement. De manière préférée, la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα sont sécrétées à l'extérieur desdites cellules cultivées et le complexe formé est directement prélevé à partir dudit milieu de culture obtenu à l'étape a)
De manière générale, les procédés de préparation des complexes selon l'invention ci-avant décrits, ou décrits dans les exemples ci-après, font également partie de la présente invention, ainsi que les complexes NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα obtenus ou susceptibles d'être obtenus par ces procédés
Un mode de réalisation de l'invention concerne un complexe NNT- 1 /CLF-1 selon l'invention capable de fixer le récepteur CNTFRα Un mode de réalisation de l'invention concerne aussi un complexe NNT-l/s
CNTFRα selon l'invention capable de fixer le récepteur LIFRβ
Sous un autre aspect, la présente invention comprend un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments, caractérisé en ce qu'il est dirigé spécifiquement contre un complexe NNT- 1 /CLF-1 selon l'invention Elle comprend aussi des anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα ou un complexe NNT- 1 /sCNTFRα selon l'invention
De préférence, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments dirigé spécifiquement contre un complexe NNT- 1 /CLF-1 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant du complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention responsable de l'interaction spécifique du complexe NNT- 1 /CLF-1 avec le récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ
De préférence, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments dirigé spécifiquement contre un complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα ou un complexe NNT-1/sCNTFRα selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant du complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα ou NNT-1/sCNTFRα selon l'invention responsable de l'interaction spécifique du complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα ou NNT- 1 /sCNTFRα avec le récepteur complexe gpl30/LIFRβ Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaînes latérales de sucres et ayant une structure tridimensionnelle spécifique et/ou une charge spécifique caractéristique De manière plus préférée, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, dirigé spécifiquement contre un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention sera capable de reconnaître spécifiquement (ou avec une plus grande affinité) le complexe NNT- 1 /CLF-1 selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou SEQ ID No 6 sans toutefois reconnaître (ou avec une affinité significativement inférieure) la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou SEQ ID No 6 prises séparément
De manière plus préférée, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, dirigé spécifiquement contre un complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα ou un complexe NNT- 1 /sCNTFRα selon l'invention sera capable de reconnaître spécifiquement (ou avec une plus grande affinité) le complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFRα ou le complexe NNT-1/sCNTFRα selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No 2, de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou SEQ ID No 6 et de la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7 sans toutefois reconnaître (ou avec une affinité significativement inférieure) la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou SEQ ID No 6 et la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ID No 7 prises séparément
Les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFR selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement les complexes NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFR Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975 (Nature, 256 495-497, 1975)
Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFR selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFR ayant servi d'antigène
L'invention a ainsi de préférence pour objet des anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le complexe NNT- 1 /CLF-1 selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou SEQ D No 6
L'invention a aussi de préférence pour objet des anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le complexe NNT- 1 /sCNTFRα selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ED No 2 et de la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ED No 7
Les anticorps de l'invention, ou leurs fragments pourront également être marqués par un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif
Un tel anticorps pourrait non seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, en particulier dans la régulation des gènes mais également serait utile au regard des résultats présentés par les inventeurs dans la présente invention, pour d'autres applications comme les applications thérapeutiques ou diagnostics
Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou l'un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention seraient notamment utiles pour le ciblage de composés capables de moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ, ou du complexe NNT- 1 /CLF-1
Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou l'un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT-1/sCNTFRα selon l'invention seraient notamment utiles pour le ciblage de composés capables de moduler l'activité biologique du récepteur complexe gpl30/LIFRβ, ou du complexe NNT- 1 /sCNTFRα
Les fragments d'anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitope du complexe NNT-l/CLF-1 et/ou CNTFRα sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ils sont issus Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al (Science, 240 1038-1041, 1988) et King et al (Biochemical J , 290 723-729, 1991) Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaine et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc , ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al (J Immunol Methods, 102 259-274, 1978) En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al , Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975 Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisé le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα ou l'un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention L'invention comprend en outre un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques ou anti-idiotypes
Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al , PNAS 89 4285-4289, 1992 , Mountain et al , Biotechnol Genêt Eng Rev , 10 1-142, 1992) De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes thérapeutiques
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique L'invention comprend également un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué
Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la β-D- galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl- cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo- désoxyuridine Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, l'umbelliférone etc Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPT A), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc . Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que 14C,
Figure imgf000023_0001
e qui • peuvent . êt.re détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations, par autoradiographie, etc..
Sous un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1 /CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ, notamment la transduction de signal induite par la phosphorylation de la tyrosine de gpl30 et LIFRβ.
Par modulation de l'activité biologique du récepteur complexe
CNTFRα/gpl30/LEFRβ, on entend désigner aussi bien l'induction ou l'accroissement que son inhibition, en particulier lorsque le complexe formé entre les protéines NNT- 1 et CLF-1 ou lesdits anticorps anti-NNT-1 /CLF-1 agissent en tant qu'inhibiteur compétitif ou antagoniste.
De préférence, ledit complexe NNT-l/CLF-1 est le complexe formé entre la protéine NNT-1 de séquence SEQ ED No. 2, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ED No. 2, et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ED No. 4 ou No. 6, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ED No. 4 ou No. 6, et le médicament est destiné à induire ou à accroître l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gpBO/LEFRβ.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1 /CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter ou à diminuer la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation de cellules exprimant le récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LIFRβ.
L'invention a en particulier pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1 /CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation des neurones centraux, périphériques et ceux impliqués dans la fonction neuro-musculaire, en particulier destiné au traitement d'anomalie de développement du cerveau foetal.
L'invention a de préférence également pour objet l'utilisation d'un complexe NNT- 1 /CLF-1 selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1 /CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation de cellules tumorales exprimant le récepteur complexe CNTFRα/gpl30/LEFRβ ou un récepteur capable de fixer spécifiquement le complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention.
L'invention comprend encore l'utilisation d'un complexe NNT- 1 /CLF-1 /sCNTFR α ou NNT- 1 /sCNTFRα selon l'invention ou d'anticorps anti-(NNT-l /CLF-1 /sCNTFRα ou NNT- 1 /sCNTFRα) pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité biologique du récepteur gpl30/LEFRβ, notamment la transduction de signal induite par la phosphorylation de la tyrosine de gpl30 et LIFRβ.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-1/CLF- 1/sCNTFRα ou NNT-1/sCNTFRα ou d'anticorps anti-(NNT-l /CLF-1 /sCNTFRα ou NNT- 1 /sCNTFRα) selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité du récepteur gpl30/LEFRβ des cellules exprimant ledit récepteur gpl30/LEFRβ, telles que les cellules impliquées dans le système immunitaire, le système hématopoïétique, le système nerveux, le système reproductif, le foie, les os ou le muscle squelettique.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention pour faciliter la prolifération et/ou inhiber la différentiation des cellules souches et plus particulièrement des cellules souches embryonnaires. En effet, il est connu que la cytokine LIF permet la prolifération des cellules souches et inhibent leur différentiation.
Sous un autre aspect, l'invention comprend un complexe selon l'invention, ou un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention en tant que médicament. L'invention comprend également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants :
- un complexe selon l'invention ;
- un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention ; - un vecteur ou système de vecteurs, ou une cellule transformée selon l'invention ; et
- une cellule capable d'exprimer naturellement une protéine NNT-1 et une protéine CLF- 1 et/ou une protéine sCNTFRα.
De telles compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur ou système de vecteurs selon l'invention, pourront en particulier être utilisées pour le transfert d'acide nucléique codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα dans une cellule donnée in vivo dans le cadre d'un traitement d'une maladie neurodegenerative par thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies neurodégénératives pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces voire inexistantes et concernent aussi bien les maladies génétiques qu'acquises. L'approche la plus pratiquée consiste à utiliser un véhicule viral pour introduire l'acide nucléique thérapeutique dans la cellule à traiter et, en particulier, rétroviral et adénoviral. En effet, les virus ont développé des mécanismes sophistiqués pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation au niveau des lysosomes et faire pénétrer leur génome dans les noyaux afin d'assurer l'expression du gène thérapeutique.
De plus en plus de méthodes de transfert de gènes font appel à des vecteurs non viraux. D'autres méthodes de transfert de gènes peuvent être employées comme par exemple la délivrance de l'acide nucléique thérapeutique au moyen de vecteurs synthétiques, tels que les lipides cationiques qui interagissent spontanément avec l'acide nucléique pour former des complexes chargés positivement capables de fusionner avec les membranes cellulaires anioniques et faire pénétrer l'acide nucléique qu'ils transportent (voir par exemple Behr, Bioconjugate Chemistry, 5:382, 1994). Enfin, une approche encore plus simple peut également être envisagée par administration directe d'ADN nu codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα, notamment dans le cadre des maladies touchant les muscles par injection intramusculaire. Ces méthodes non virales mettent généralement en oeuvre un vecteur ou système de vecteurs plasmidiques selon l'invention portant les gènes thérapeutiques codant pour les deux protéines NNT-1 et CLF-1 et/ou sCNTFRα, et les éléments nécessaires à son expression.
De telles compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur ou système de vecteurs, selon l'invention pourront également être utilisées pour le transfert d'acide nucléique codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα, dans une cellule donnée ex vivo dans le cadre d'un traitement de maladie neurodegenerative, en particulier pour la réparation ou la régénération de neurones ou tissu neuronal, qui seront ensuite implantés ou réimplantés dans le patient à traiter (xénogreffe ou allogrefte).
L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique selon l'invention pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington, pour le traitement d'anomalie de développement du cerveau fœtal, pour la régénération du tissu nerveux ou du muscle squelettique ou pour la maintenance de la masse musculaire chez les paralysés ou encore pour le traitement du cancer ou de l'obésité. En effet, parmi les applications potentielles du complexe NNT- 1 /CLF-1 en tant qu'activateur spécifique du récepteur CNTF, on peut citer également son utilisation dans la préparation de médicament destiné au traitement de l'obésité et de ses maladies associées comme l'hyperglycémie comme décrit en particulier dans les demandes de brevets WO 98/22128, WO 98/32458 et WO 99/08701. Il a été démontré que des souris rendues obèses maigrissaient suite à un traitement avec la protéine CNTF. Un dérivé du CNTF, l'axokine, a également permis d'obtenir des résultats similaires et confirme ainsi l'utilité du complexe NNT- 1 /CLF-1 dans le traitement de l'obésité.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour améliorer la fertilité, et notamment pour éviter les endométrioses et/ou faciliter l'implantation des blastocystes.
Elles peuvent encore être mises en œuvre pour faciliter l'hématopoïèse et particulièrement dans le traitement de la thrombocytopénie. Dans ce cas, les compositions selon l'invention comprennent en outre du GM-CSF. Il a été constaté que le nombre de plaquettes produites était augmenté en présence de LEF. Enfin, les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour le traitement des rétinites et plus particulièrement des rétinites pigmentaires. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention de pathologie liée à une expression anormale du complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, caractérisée en ce qu'elle comprend a) un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de ses fragments, selon l'invention , et b) un excipient pharmaceutiquement acceptable
De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention, est caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi les cancers
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du cancer
La quantité de composés comprise dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie efficace dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie du corps ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres médicaments, des éventuels effets secondaires, etc Le dosage pour de telles préventions ou traitements thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son efficacité En général, des modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités efficaces des composés entrant dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention pour le traitement ou la prévention des pathologies particulières Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman et al (The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed Pergamon Press, 1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed , 1990) pour des méthodes d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse, intrapéritonale, intramusculaire ou transdermique Les excipients pharmaceutiquement acceptables incluent notamment l'eau, les solutions salines, les tampons ou tout autre composé décrit par exemple dans l'Index de Merck
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse ou nécessaire de diagnostic comprenant un anticorps selon l'invention, notamment pour le dosage (dont la détection) ou l'identification de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, dans un échantillon biologique, de préférence in vitro En particulier, une trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants - un anticorps polyclonal, monoclonal ou un de leurs fragments selon l'invention, le cas échéant marqué ,
- le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique , - le cas échéant, un réactif permettant la détection des complexes antigène- anticorps produits par la réaction immunologique, ce réactif pouvant également porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où ledit anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments n'est pas marqué L'invention comprend également un procédé pour la détection et/ou le dosage de complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) avec un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention (dans des conditions permettant une réaction immunologique entre lesdits anticorps et lesdits complexes NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα ) , b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé
L'invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments pour le diagnostic, en particulier in vitro de pathologie liée à l'expression anormale de complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, notamment pour le diagnostic de cancer
Par ailleurs, les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention, peuvent également être utilisés pour l'identification ou la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, ladite utilisation étant comprise dans l'invention
Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent également un moyen d'analyse de l'expression de complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, dans des échantillons biologiques (fluides ou sur des coupes de tissus spécifiques), par exemple par immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale de complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.
Plus généralement, les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative. De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.
Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments peut être immobilisé ou marqué. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art.
Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio- immunologique (RI A) ou équivalent. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode pour évaluer l'affinité d'un composé à tester pour le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la mise en contact d'un échantillon contenant ledit complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα, avec i) un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention ; et ii) ledit composé à tester ; et b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à tester fixés sur ledit complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα
Les anticorps monoclonaux, polyclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent être utilisés également dans des méthodes in vitro pour la sélection de composés susceptibles de se fixer au complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRα, avec l'affinité recherchée Ainsi, la présente invention comprend également des méthodes de sélection par compétition de composés pharmaceutiques dans lesquelles les anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention ou leurs fragments entrent en compétition avec le composé à tester susceptible de se fixer au complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFRα Ainsi, ces composés, identifiés par la méthode selon l'invention pourront être utilisés pour occuper ces sites de fixation sur le complexe NNT- 1 /CLF-1 et/ou sCNTFR α, et agir en tant qu'agent modulateur ou antagoniste de l'activité biologique des complexes NNT- 1/CLF-l et/ou sCNTFRα Sous un dernier aspect, la présente invention comprend également le peptide
CLF- 1 (variant d'épissage) de séquence SEQ ED No 4 ainsi que tout peptide dérivé dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 acides aminés consécutifs du fragment compris entre les positions aa 405 et aa 445 de la séquence SEQ ED No 4 De préférence, de tels peptides dérivés du variant d'épissage CLF-1 de séquence
SEQ ID No 4 selon l'invention sont capables de former un complexe NNT- 1/CLF-l et/ou sCNTFRα selon l'invention, et/ou pourront être obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique
L'invention comprend aussi les acides nucléiques codant pour le peptide CLF-1 de séquence SEQ ED No 4 ou l'un de ses peptides dérivés selon l'invention, les vecteurs comprenant de tels acides nucléiques ainsi que les cellules hôtes transformées à l'aide desdits vecteurs ou acides nucléiques
L'invention comprend en outre un anticorps capable de reconnaître spécifiquement le domaine aa 405 - aa 445, ou l'un de ses fragments, du peptide de séquence SEQ ED No 4 L'invention comprend également toute méthode, mettant en oeuvre un tel peptide de séquence SEQ ED No 4, ou l'un de ses dérivés, une séquence nucléique codant pour de tels peptides, ou ledit corps
L'utilisation de peptides de séquence SEQ ED No 4 ou l'un de ses peptides dérivés selon l'invention dans toute application connue de l'art antérieur pour le peptide CLF-1 de séquence SEQ ED No 6 est également comprise dans la présente invention
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci- après
Légende des figures :
Figures 1A et IB. Formation d'un complexe sécrété entre NNT-1 et CLF-1
1A Partie du haut l'expression de NNT-1 a été détectée par « Western blot » dans le lysat des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les protéines indiquées
Partie du bas les complexes NNT- 1/CLF-l ont été isolés des milieux de culture des mêmes cellules par immunoprécipitation avec un anticorps monoclonal anti-C-myc et la présence de NNT-1 révélée par Western blot avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc couplé à la péroxydase IB Partie du haut l'expression de NNT-1 a été détectée par « Western blot » dans le lysat des cellules transfectées avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc couplé à la péroxydase
Partie du milieu les protéines de fusion contenant une région Fc sécrétée dans le surnageant des cellules transfectées ont été révélées par immunoaffinité sur protéine G- Sepharose et « Western blot » avec un anticorps dirigé contre les IgG humaines couplé à la péroxydase
Partie du bas la présence de NNT-1 dans les mêmes milieux de cultures a été analysée par immunoaffinité sur protéine G-Sepharose et « Western blot » avec un anticorps monoclonal anti-C-myc couplé à la péroxydase Figure 2. L'heterocompiexe NNT-l/CLF-1 induit la prolifération des cellules BAF
3 transfectées avec gpl30/LiFRβ et CNTFRα. Les cellules BAF contrôles ou les transfectants stables exprimant les récepteurs indiqués dans la figure ont été cultivés en présence de dilutions de milieu de cultures de cellules COS transfectées avec les ADNc codant pour CLF-1 NNT-1 (dénommé CLC), CLF-1 et NNT- 1 ou les contrôles relevants. L'incorporation de [3H] thymidine exprimée en CPM a été faite en triplicate. L'axe des x représente la concentration de milieu de culture exprimée sous forme de dilution en série au tiers.
Figure 3. Le complexe NNT-l/CLF-1 induit la phosphorylation en tyrosine de gpl30 et LTFRβ.
Les cellules ont été incubées pour une durée de 20 min. avec l'heterocompiexe NNT-l/CLF-1 (dilution 1 :7), une préparation purifiée des cellules transfectées avec un plasmide contrôle (indiqué « mock » dans la figure ; dilution 1 :7) ou du CNTF (50 ng/ml). Après lyse des cellules et immunoprécipitation avec un anticorps anti-LEFRβ, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, transférées sur une membrane PVDF et les protéines phosphorylées en tyrosine révélées à l'aide d'un anticorps monoclonal anti- phosphotyrosine.
Partie gauche : cellules BAF transfectées avec les ADNc codant pour CNTFα /gpl30/LEFRβ.
Partie droite : cellules SK-N-MC. Figures 4A et 4B. Expression de l'ARNm codant pour NNT-1 et CLF-1 dans les lignées cellulaires de tumeur de cerveau.
L'ARN total a été isolé des cellules indiquées et analysé par RT-PCR à l'aide d'amorces spécifiques pour NNT-1, CLF-1 ou β-actin (contrôle). Figures 5A, 5B, 5C et 5D. Formation d'un complexe sécrété entre NNT-1 et sCNTFR. Figure 5 A : L'expression de NNT-1 a été détectée par Western blot dans le lysat des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les protéines indiquées. Figure 5B : L'expression de CNTFR a été détectée par Western blot dans le lysat des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les protéines indiquées. Figure 5C : La présence de NNT-1 dans les milieux de culture des mêmes cellules a été détectée par immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc suivi d'un Western blot de la fraction purifiée avec l'anticorps monoclonal anti-protéine C. Figure 5D Les complexes NNT-1/CNTFR on été isolés des milieux de culture des mêmes cellules par immunoprécipitation avec un anticorps monoclonal anti-CNTFR et la présence de NNT-1 révélée par Western blot avec l'anticorps monoclonal anti-proteine C SN surnageant , EP immunoprécipitation , WB Western blot
Figure 6. L'heterocompiexe NNT-1/ sCNTFR induit la prolifération des cellules BAF 3 transfectées avec gpl30 et LIFRβ.
Les cellules BAF 3 transfectées d'une façon stable avec les récepteurs gpl30 et LIFRβ ont été cultivées en présence de dilutions de milieu de cultures de cellules COS transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1, sCNTFR, NNT-1 et CLF-1 ou NNT-1 et sCNTFR La protéine LEF recombinante a été utilisée comme contrôle positif de la prolifération cellulaire L'incorporation de [3H] thymidine exprimée en CPM a été faite en triplicate L'axe des abscisses représente la concentration de milieu de culture exprimée sous forme de dilution en série au tiers
EXEMPLE 1 Matériels et Méthodes
Cultures cellulaires
Les lignées de singe COS I, de neuroblastome humain SK-N-MC, de gliome humain U373 MG et myéloide de souris BAF/3 ont été obtenues de l'« American Type Culture Collection » (ATCC, Rockville, MD) et maintenues selon les spécifications Les lignées de gliomes LN 215, LN 229 et LN 415 ont été généreusement données par le Dr P-Y Dietrich (Hôpital Cantonal Universitaire de Genève, Genève, Suisse) et cultivées dans du milieu DMEM additionné de 10 % de sérum de veau foetal (SVF) Pour les purifications de protéines, les cellules COS I ont été cultivées dans du milieu de Yssel {Yssel, De Nries, et al 1984 ID 378} après transfection Les cytokines recombinantes et les récepteurs solubles ont été obtenus de R & D Systems (Abingdon, Oxon, UK) Clonage de l'ADΝc codant pour ΝΝT-1
Une EST (« Expressed Séquence Tag ») codant pour NNT-1 (GenBank, No d'accession AI752561) a été identifiée par recherche bio-informatique TBLASTN en utilisant la séquence en acide aminé connu de NNT-1 dans la requête de recherche L'ADNc codant pour NNT-1 a ensuite été amplifié par PCR ancrée sur de l'hADNc de ganglion lymphatique (Race-Ready human lymph node cDNA , Clontech, Palo Alto, CA) à l'aide de l'amorce AP-1 (du kit d'amplification Marathon de Clonetech) et de l'amorce spécifique pour NNT-1 5'-AAGGGGGAGCGAAGAGGAGAAGG-3' (SEQ ID No 8) (35 cycles de PCR, 94°C, 30» , 60°C, 30» , 72°C, 1») L'ADNc amplifié a été clone dans le vecteur pGEM-Teasy (Promega Corp , Madison, WI) et séquence Pour produire un dérivé de NNT-1 contenant l'épitope C-myc EQKLISEEDL (SEQ ED No 9) (NNT- lmyc) l'ADNc de NNT-1 a été amplifié de l'insert du vecteur pGEM-Teasy à l'aide des amorces 5'-CGCGGATCCGCCATGGACCTCCGAGC-3' (SEQ ED No 10) et 5'- GCGGAATTCAGAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCGAAGCCATGAGC CCCCAG-3' (SEQ ED No 11) (10 cycles de PCR, 94°C, 30» , 60°C, 30» , 72°C, 45») L'ADNc codant pour NNT-lmyc a été clone dans le vecteur d'expression pCDNA3 (Invitrogen, Leek, Hollande) à l'aide des enzymes de restriction Bam HI et Eco RI et vérifié par séquençage Clonage d'un nouveau variant d'épissage de CLF-1 et production d'ADNc chimérique codant pour une protéine de fusion CLF-l-Fc
Par criblage bio-informatique utilisant BLASTN sur la banque de donnée EST au NCBI (http// www ncbi nlm nih BLAST), nous avons identifié un EST codant pour un nouveau variant d'épissage de CLF-1 (GenBank, accession No AI406406) contenant 293 nucléotides additionnels par rapport à la séquence publiée de CLF-1 en raison de l'utilisation d'une séquence acceptrice d'épissage pour l'exon 9 dans la séquence du gène en amont de celle publiée pour CLF-1 L'ADNc codant pour ce variant d'épissage (SEQ ID No 3) a été amplifié de l'ADNc de poumon foetal humain (Clonetech) à l'aide des amorces 5'-CGCGAATTCCCATGCCCGCCGGCCGCCG-3' (SEQ ID No 12) et 5'- CGCGAATTCTAACTAGGGTGAGTATGTTC-3' (SEQ ED No 13) (30 cycles de PCR, 94°C, 30» , 60°C, 30» , 72°C, 2») L'ADNc amplifié a été clone dans le site de restriction Eco RI du vecteur pCDNA3 (Invitrogen) La séquence en acide aminé de la protéine codée par cet ADNc ne diverge qu'à l'extrémité C-terminale de la séquence originale de CLF-1 Pour produire un ADNc codant pour une protéine de fusion CLF-1- Fc, la région codante de CLF-1 a été amplifiée par PCR, clonée en phase avec un fragment d'ADNc codant pour la région Fc de l'IgGl humaine et séquencée Production d'un ADNc chimérique codant pour une protéine de fusion CNTFRα- Fc
L'ADNc codant pour une forme soluble de la chaîne α du récepteur au CNTF a été amplifié à l'aide des amorces 5'-CCGCTCGAGGCCCAGAGACACAGTCCACA-3' (SEQ ID No 14) et 5'-CCGCTCGAGGTCACAGATCTTCGTGGT-3' (SEQ ID No 15), clone en phase avec un fragment d'ADNc codant pour la partie Fc de l'IgGl humaine et séquence Transfection transitoire
Les cellules COS I ont été mises en culture à raison de 1 x 105 cellules/puits dans des boîtes de culture à 6 puits de 35mm2 et transfectées le lendemain avec du Fugene 6™ (Roche Diagnostics, Meylan, France) selon les instructions du fabricant Pour les co- transfections, les complexes plasmides/Fugene 6™ ont été générés et ajoutés aux cellules indépendamment Immunoprécipitation du complexe CLF-lFc/NNT-lmyc et analyse par « Western blot »
Les cellules COS I ont été lysées 72 heures après transfection dans du tampon REPA (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 % Nonidet P40, 0,5 % déoxycholate de sodium, 0,1 % SDS) Les lysats cellulaires ont été passés à travers des aiguilles de seringues de 0,8 mm et les débris cellulaires éliminés par centrifugation Les lysats ont ensuite été mélangés 1 1 avec du tampon échantillon Tris-Glycine-SDS (Novex, San Diego, CA) contenant 750 mM de β-mercaptoéthanol et chauffés à 95°C pour 5' En parallèle, les milieux de cultures ont été centrifugés séquentiellement à 3000 puis 13000 RPM dans une microcentrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires Les milieux ont été incubés une heure avec 25 μl de protéine G-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suède) à 4°C Après élimination de la protéine G-Sepharose, de l'anticorps monoclonal anti-C- myc (Sigma Chemical Co St Louis, MO) a été ajouté (concentration finale 10 μg/ml) pour 2 heures à 4°C 50 μl de protéine G-Sepharose ont ensuite été ajoutés et l'incubation poursuivie pour une heure La protéine G-Sepharose a été lavée trois fois avec du PBS, reprise dans 100 μl de tampon échantillon tris-Glycine-SDS contenant 375 mM de β-mercaptoéthanol et chauffée à 95°C pour 5' Pour l' immunoprécipitation des protéines de fusion Fc, la même procédure a été suivie, excepté que la première incubation a été effectuée avec de la Sepharose couplée à de l'albumine sérique humaine et l'addition d'anticorps anti-C-myc omise Les protéines ont été analysées par SDS- PAGE sur un gel polyacrylamide 12 % et électrotransférées sur une membrane PNDF (Millipore Corp , Bedford, MA) Les membranes ont été bloquées dans du tampon TBS additionné de 0,15 % Tween-20 et 5 % de lait en poudre (tampon de blocage) Les protéines comprenant l'épitope C-myc on été détectées par incubation avec un anticorps anti-C-myc couplé à la péroxydase (Roche Diagnostics) dilué 1 1000 dans du tampon de blocage Les protéines de fusion contenant une région Fc ont été révélées à l'aide d'un anti-IgG humain couplé à la péroxydase (dilution 1 2000 dans du tampon de blocage , Amersham France SA) La péroxydase a été révélée par chimiluminescence (ECL , Amersham France S A ) en suivant les instructions du fabricant Purification du CLF-l-Fc et du complexe ΝΝT-lmyc/CLF-1-Fc
Les milieux de cultures des cellules transfectées avec les ADNc codant pour CLF-l-Fc ou NNT-1-myc et CLF-l-Fc ont été récoltés 3 jours après transfection Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation, les milieux de cultures concentrés 10 x à l'aide de concentrateurs Centricon-30 (Millipore corp ) puis pré-incubés avec 25 μl/ml de Sepharose couplée à l'albumine humaine Les complexes CLF-l-Fc/NNT-1- myc ont été purifiés par affinité en incubant les milieux de cultures concentrés avec des billes magnétiques anti-IgG de souris (3 x 108 α-mouse IgG Dynabeads M-450 , Dynal A.S , Olso, Norvège) préincubées avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc Les complexes ont été élues des billes par l'addition de peptide C-myc (concentration finale 100 μg/ml , Roche Diagnostics) pour 16 h à 4°C L'excès de peptides a été éliminé par dilution et successive sur une colonne Microcon-30 (Millipore Corp ) La présence de CLF-l-Fc et NNT-1-myc dans le complexe purifié par immunoaffinité a été vérifiée par « Western blot », comme décrit dans la section précédente (Pierce, Rockford, EL) Analyse de la phosphorylation en tyrosine
Les cellules SN-N-MC ont été incubées dans du milieu de culture sans sérum pour 16 h, stimulées 10 minutes à 37°C en présence des échantillons à tester puis lysées dans du tampon 10 mM Tris-HCl pH 7 6, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 30 mM pyruvate de sodium, 50 mM fluorure de sodium, 1 mM orthovanadate de sodium, 1 % Brij 96 contenant des inhibiteurs de protéases (1 μg/ml pepstatine A, 2 μg/ml leupeptine, 5 μg/ml aprotinine, 1 mM phénylméthylsulphonyl fluorure , Sigma Chemical Corp ) Les lysats ont été agités durant 60 min à 4°C et les fractions insolubles éliminées par centrifugation à 12 000 x g pour 30 min Après avoir été ajustés pour le contenu en protéines, les lysats ont été incubés pour 16 h en présence d'anticorps spécifiques dirigés contre LEFRβ (10 μg Ab/ml, SC-659 , Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) Les complexes antigènes-anticorps ont été isolés par chromatographie d'affinité sur protéine A-Sepharose (Pharmacia), lavés dans du tampon de lyse et élues dans du tampon échantillon Tris-Glycine-SDS contenant 375 mM β-mercaptoéthanol, analysés par SDS- PAGE et transférés sur une membrane PNDF Après blocage, la membrane a été incubée successivement avec un anticorps monoclonal anti-phosphotyrosine (4G10, 1 μg/ml , UBI, Lake Placid, ΝY) et un anticorps polyclonal de chèvre anti-souris couplé à la péroxydase (dilué 1 4000 , Biosource, Camarillo, CA) L'anticorps lié à la membrane a été révélé par chimiluminescence Prolifération des cellules BAF/3 Les cellules BAF/3 sont négatives pour l'expression de nombreux récepteurs des cytokines et peuvent être transfectées pour exprimer de manière stable des combinaisons variées de récepteurs pour les cytokines de la famille IL-6 Dans cette étude, les cellules BAF/3 transfectées exprimant les combinaisons suivantes de récepteurs ont été utilisées gpl30, gpl30 + LEFRβ, gρl30 + OSMR β (chaîne β du récepteur OSM), gpl30 + EL- 6Rα, gpl30 + LEFRβ + EL-6Rα, gpl30 + LIFRβ + CΝTFRα Les cellules parentales ou transfectées ont été mises en culture en triplicata à raison de 104 cellules/puits dans 100 μl milieu de culture additionné de 10 % de SNF et de dilution sérielle des échantillons à tester Après une incubation de 72 heures à 37°C, 0,5 μCi de [6-3H]- thymidine (74 GBq/mmol , Amersham France S A ) a été ajouté à chaque puits pour une durée de 4 heures L'incorporation a été mesurée à l'aide d'un compteur β Détection des ARΝ codants pour CLF-1 et ΝΝT-1 par RT-PCR
L'ARN a été isolé à l'aide de TRIzol (Life Technologies, Paisley, UK) L'ADNc a été synthétisé avec de la transcriptase reverse SuperScript II en utilisant 5 μg d'ARN comme substrat et des hexamères comme amorce (Life Technologies) Un cinquantième de l'ADNc a ensuite été amplifié par PCR à l'aide, respectivement, des amorces 5'- TGGCTCCTGCCTCTATGTTG-3' (SEQ ED No 16) et 5'- CCACTCGGTAGCGGATCTGG-3' (SEQ ID No 17) pour CLF-1, et 5'-CTCAATCG CACAGGGGAC-3' (SEQ ID No 18) et 5'-AAGGGGGAGCGAAGAGGAGAAGG-3' (SEQ ID No 8) pour NNT-1 Le produit de PCR a été analysé par électrophorèse sur gel agarose EXEMPLE 2 NNT- 1 n'est sécrété qu'en présence de CLF-1
La cytokine NNT-1 contient un peptide signal (Senaldi et al , 1999 ; Shi et al , 1999). Un dérivé de cette cytokine (NNT-1-myc) a été exprimé comprenant un épitope reconnu par un anticorps anti-C-myc dans la lignée fibroblastique de rein de singe COS Bien que la production de la protéine recombinante soit clairement détectable dans ces cellules (cf figure 1A), la sécrétion de NNT-1 dans le milieu de culture n'a pas été observée (cf figures 1A et IB et résultats non présentés) Pour tester si la co-expression d'une seconde chaîne était requise pour la sécrétion de NNT-1, comme décrit pour l'E - 12, l'ADNc codant pour NNT-1-myc a été transfecté seul ou co-transfecté avec celui codant pour CLF-1 dans les cellules COS Le milieu de culture a été analysé pour la présence de NNT-1-myc par immunoprécipitation et « Western blot » La cytokine NNT-1 n'a été observée que dans les surnageants des cellules co-transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1 et CLF-1 (cf figure 1A) Ces résultats indiquent que le relargage de NNT-1 par les cellules est dépendant de la co-expression de CLF-1 EXEMPLE 3 NNT-1 forme un complexe avec une protéine de fusion CLF-1 Fc II a été ensuite testé si NNT-1 et CLF-1 étaient relâchés sous forme d'un hétérocomplexe Le vecteur d'expression codant pour NNT-1-myc a été co-transfecté avec des ADNc codant pour des protéines de fusion CLF-l-Fc ou sCNTFRα-Fc Comme contrôle, des transfections avec les ADNc pour NNT-1-myc, CLF-l-Fc, sCNTFRα-Fc ou le vecteur d'expression vide ont été effectuées en parallèle Les protéines complexées avec les protéines de fusion Fc ont été immunoprécipitées et NNT- lmyc révélé par « Western blotting » avec un anticorps anti-myc NNT-1 n'a été détecté que dans les milieux de culture des cellules co-transfectées avec NNT-1-myc et CLF-l- Fc, montrant clairement la formation d'un complexe sécrété hétérodimérique entre ces deux protéines (cf. figure IB) EXEMPLE 4 . Le complexe NNT- 1/CLF-l induit la prolifération des cellules BAF/3 transfectées avec les ADNc codant pour CNTFRα gpl30/LIFRβ Pour identifier les composants du récepteur pour NNT/CLF-1, la capacité du complexe à induire la prolifération de cellules BAF/3 transfectées avec différentes combinaisons des ADNc codant pour IL-6Rα, CNTFRα, gp!30 et LIFRβ a été étudiée Le milieu de culture des cellules COS co-transfectées avec NNT- 1/CLF-l ou NNT- 1/CLF-l -Fc a été testé à des concentrations variées sur les transfectants BAF/3 Le milieu de culture de cellules COS transfectées avec NNT-1 ou CLF-1 seul a été utilisé comme contrôle Une prolifération n'a été observée que sur les cellules BAF/3 co- transfectées avec la combinaison des ADNc codant pour CNTFRα, gpl30 et LEFRβ Aucune incorporation de [3H]-thymidine n'a été observée dans les cellules transfectées avec gpl30 ou gpl30 et LIFRβ (figure 2) Ces résultats montrent que le complexe NNT- 1/CLF-l est biologiquement actif et soulignent l'importance de la chaîne α du récepteur au CNTF dans la formation d'un récepteur fonctionnel pour cette cytokine hétéromérique EXEMPLE 5 Le complexe NNT- 1/CLF-l induit la phosphorylation en tyrosine de gpl 30 et LIFRβ dans les cellules SK-N-MC et les BAF/3 transfectées
Pour examiner la capacité du complexe NNT- 1/CLF-l à induire les signaux intracellulaires, ledit complexe a été purifié du milieu de culture de cellules COS co- transfectées avec les deux ADNc par immunoaffinité et sa capacité à induire la phosphorylation en tyrosine de gpl 30, LEFRβ a été testée dans des transfectants BAF/3 et des cellules de neuroblastome SK-N-MC L'exposition au complexe NNT- 1/CLF-l des cellules BAF/3 transfectées par la combinaison des ADNc codant pour CNTFRα, gpl 30 et LIFRβ a induit la phosphorylation de L FRβ (cf figure 3). Aucune phosphorylation n'a été observée avec le contrôle représenté par les protéines purifiées par immunoaffinité de cellules COS transfectées avec un vecteur d'expression vide (cf figure 3) D'une manière similaire, l'induction de la phosphorylation de gpl30 et LIFRβ a été observée sur les cellules de neuroblastome SK-N-MC qui sont connues pour exprimer CNTFRα, gpl 30 et LIFRβ (cf figure 3) à l'heterocompiexe a été suivie de la phosphorylation en tyrosine de gpl 30, démontrant que le complexe est biologiquement actif Ces résultats sont en accord avec les observations que les préparations de NNT-1 recombinant produit dans des bactéries peuvent induire la phosphorylation en tyrosine de gpl 30, LIFRβ et STAT 3 EXEMPLE 6 Profils d'expression des ARNm codant pour CLF-1 et NNT-1
Les sous-unités CNTFRα, gpl 30 et LIFRβ formant le récepteur au complexe NNT- 1/CLF-l sont connues pour être exprimées par plusieurs lignées cellulaires dérivées de tumeur du cerveau La coexpression de CLF-1 et NNT-1 par ces cellules se traduirait par la production de l'heterocompiexe et une activité autocrine sur leur prolifération L'expression des ARNm codant pour CLF-1 et NNT-1 a donc été étudiée par transcriptase reverse-PCR (RT-PCR) dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs du cerveau Comme montré dans les figures 4A et 4B, l'expression de l'ARNm codant pour NNT-1 a été observée dans les cellules du neuroblastome SK-N-MC et du glioblastome U373 De manière similaire, CLF-1 est détectable par RT-PCR dans les cellules SK-N- MC et dans plusieurs lignées de glioblastome
Ces exemples montrent que NNT-1 forme un complexe stable avec CLF-1 La formation de cet hétérocomplexe est indispensable pour le relargage de NNT-1 dans le milieu de culture des cellules et représente la première démonstration d'un tel mécanisme de contrôle de la production dans la famille des cytokines homologue à l'EL-6 Ce mode de contrôle est proche de celui décrit pour l'hétérodimère EL- 12 (cf figures 1A et IB) (Trinchieri, G , Annu Rev Immunol 13 251-276, 1995) Il est ainsi fort probable que bien qu'active à haute concentration après production dans les bactéries, NNT-1 n'est normalement sécrétée et donc fonctionnellement active que sous forme d'un complexe avec CLF-1
L'heterocompiexe NNT- 1/CLF-l est capable d'induire la phosphorylation en tyrosine de gpl 30, et LEFRβ (cf figure 2) ainsi que la prolifération des cellules BAF/3 via CNTFRα, gpl30 et LEFRβ (cf. figure 3) Si l'on considère NNT-1 comme une cytokine conventionnelle et CLF-1 comme une chaîne α soluble, le complexe NNT-1- récepteur comprend deux chaînes α (CLF-1 et CNTFRα) Une telle organisation est sans précédent dans cette famille Comme son nom l'indique, CNTFRα a été identifiée à l'origine comme un récepteur pour le CNTF (Ip, N Y et al , Annu Rev Neurosci 19 491-515, 1996), une cytokine permettant la survie des neurones moteur, induisant la différentiation et la prolifération de certaines lignées neuronales et ayant des fonctions neuromusculaires (Alexander, W.S , et al , Curr Biol 9 605-608, 1999) Agissant sur le même récepteur, le complexe NNT- 1/CLF-l a très probablement les mêmes propriétés Les ARNm codant pour NNT-1 et CLF-1 sont exprimés par un relativement grand nombre de tissus (Senaldi, G , et al , Proc Natl Acad Sci U S A 96 1 1458-1 1463, 1999 , Shi, Y , et al , Biochem Biophys Res Commun 262 132-138, 1999 et Elson, G C , et al , J Immunol 161 1371-1379, 1998) L'expression de CNTFRα semble par contre être restreinte au tissu nerveux en développement ou adulte et au muscle squelettique Les effets du complexe NNT- 1/CLF-l vont donc être limités par la distribution restreinte d'une des chaînes du récepteur, CNTFRα L'expression de l'ARNm codant pour CLF-1 mRNA a été détectée par hybridation in situ dans le cerveau en développement, le mésenchyme craniofacial (Takahashi, R , et al , Nat Genêt 7 79-84, 1994) et par Northern blot dans les muscles squelettiques (Elson, G C , et al , J Immunol 161 1371-1379, 1998) Bien que l'expression de l'ARNm de NNT- 1 dans les muscles squelettiques adultes ou le cerveau foetal n'ait pas encore été reportée, ces observations suggèrent fortement un rôle potentiel pour l'heterocompiexe NNT- 1 /CLF-1 dans le cerveau en développement, spécialement dans la survie et la différentiation neuronale ainsi que dans la fonction neuromusculaire
Les souris déficientes pour le gène codant pour CNTF, bien que présentant une dégénération neuronale ont un phénotype peu affecté observable que tardivement chez les adultes (Masu, Y , et al , Nature, 365 27-32, 1993) Il a aussi été observé que 2,5 % de la population japonaise est homozygote pour une mutation inactivant le gène du CNTF sans qu'aucun effet puisse être détecté même chez les sujets âgés (DeChiara, T M , et al , Cell , 83 313-322, 1995) Contrastant fortement avec ces observations, les souris déficientes pour CNTFRα ne tètent pas, meurent rapidement après la naissance et montrent une perte dramatique dans la population de neurones moteurs (Yssel, H , et al , J Immunol Methods 72 219-227, 1984) Ces observations indiquent l'existence d'un autre ligand non identifié de CNTFRα important au cours du développement, communément appelé CNTF-2 II est clair que CNTF-2 correspond très certainement à l'heterocompiexe NNT-l/CLF-1 Cette hypothèse est supportée par les observations sur les souris dans lesquelles le gène codant pour CLF-1 a été inactivé ces souris ont un phénotype superposable à celui observé chez les souris déficientes pour CNTFRα (Takahashi, R , et al , Nat Genêt 7 79-84, 1994) CNTFRα, gpl 30 et LIFRβ sont connues pour être exprimées par de nombreuses lignées de neuroblastomes Une forte expression des ARNm codant pour CLF-1 et NNT- 1 a pu être observée dans les lignées de neuroblastomes et de glioblastomes Sachant que l'induction d'un signal via gpl 30 et LEFRβ peut induire la prolifération cellulaire, il est fortement probable que le complexe NNT- 1/CLF-l est impliqué comme facteur de croissance dans ces types de tumeurs cérébrales De plus, comme les ARNm pour CLF-1 et NNT-1 sont détectables dans le muscle, NNT- 1/CLF-l devrait également être impliqué dans la croissance de certaines tumeurs dérivées du muscle comme des myosarcomes Nous avons observé par cytométπe en flux que des lignées dérivées de myosarcomes expriment CNTFRα (résultats non présentés)
Le complexe NNT- 1/CLF-l, ligand du récepteur CNTFRα, est capable ainsi de former un complexe ternaire avec la forme soluble de CNTFRα qui a été identifiée dans le fluide cérébro-spinal et les muscles squelettiques après dommage (Davis, S , et al , Science, 259 1736-1739, 1993) Un tel complexe NNT- 1/CLF-l /sCNTFRα formé dans le fluide cérébro-spinal aurait certaines «actions à distance» dans le système nerveux central, rendant des cellules normalement insensibles, sensibles à l'effet de NNT-1/CLF- 1 Un complexe NNT- 1/CLF-l /sCNTFRα agirait ainsi sur toute cellule exprimant gpl 30 et LEFRβ La formation d'un complexe NNT- 1/CLF-l /sCNTFRα dans le muscle squelettique et une diffusion dans la circulation permettrait une action systématique
Comme déjà mentionné, CLF-1 et NNT-1 ont une distribution tissulaire large et il apparaît donc probable que l'activité de CLF-l/NNT-1 est limitée par l'expression restreinte de CNTFRα Contrairement aux autres membres de la famille IL-6, des effets de CNTF sur l'hématopoièse n'ont pas été reportés Toutefois, l'addition de CNTFRα soluble ou la transfection de l'ADNc codant du CNTFRα dans les cellules précurseurs hématopoiétiques les rend sensibles au CNTF (Davis, S , et al , Science, 259 1736-1739, 1993 , Ip, N Y , et al , Neuron 10 89-102, 1993) Ces observations indiquent que bien que des formes solubles du récepteur rendent ces cellules sensibles au CNTF, le CNTFRα n'est pas normalement exprimé par les précurseurs hématopoiétiques Toutefois, les souris dans lesquelles le gène codant pour CLF-1 a été inactivé ont un nombre réduit de précurseurs hématopoiétiques ce qui suggère un rôle de cette protéine dans la régulation de l'hématopoièse (Takahashi, R , et al , Nat Genêt 7 79-84, 1994) Il est probable qu'un complexe entre NNT-1, CLF-1 et CNTFRα est responsable de cet effet, bien qu'une réduction de l'hématopoièse dans les souris déficientes pour CNTFRα n'ait pas été reportée EXEMPLE 7 NNT-1 est aussi sécrété en présence de CNTFR et les deux protéines forment un complexe sécrété hétérodimérique
Il a été testé si la co-expression de CNTFR avec un dérive de NNT-1 (NNT- lmyc/pc) résulte dans la sécrétion de NNT-lmyc/pc L'ADNc codant pour NNT-lmyc/pc a été transfecté seul ou co-transfecté avec celui codant soit pour CLF-1, soit pour la forme transmembranaire de CNTFR (tmCNTFR), soit pour un dérivé soluble (sCNTFR) dans les cellules COS La présence de NNT-1-myc/pc dans le milieu de culture a été analysé par immunoprécipitation et « Western blot » La cytokine NNT-1 n'a été observée que dans les surnageants des cellules co-transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1 et soit CLF-1 soit les deux formes de CNTFR (cf figure 5C) Ces résultats indiquent que le relargage de NNT-1 par les cellules est réalisé après la co- expression de sCNTFR ou la forme membranaire de CNTFR II a été ensuite testé si NNT-1 et CNTFR étaient relâchés sous forme d'un hétérocomplexe Les milieux de culture des cellules transfectées seulement avec NNT-lmyc/pc ou co-transfectées avec NNT-lmyc/pc et sCNTFR ou tmCNTFR ont été immunoprécipites avec des anticorps monoclonaux anti-CNTFR La présence de NNT-lmyc/pc dans les fractions purifiées en résultant a été analysée par Western blot NNT-1 n'a été observée que dans les fractions purifiées des surnageants des cellules co-transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1 et sCNTFR ou tmCNTFR (cf figure 5D) Ces résultats démontrent que NNT-1 et sCNTFR forment un complexe sécrété, et que tmCNTFR peut probablement être clivé et ainsi donné naissance à une forme relarguée de CNTFR qui va générer le complexe NNT-1/CNTFRs
EXEMPLE 8 Le complexe NNT-1/CNTFR induit la prolifération des cellules BAF/3 transfectées avec les ADNc codant pour gpl 30 et LIFRβ
Le milieu de culture des cellules COS co-transfectées avec NNT-1/sCNTFR a été testé à des concentrations variées sur les BAF/3 transfectées avec des ADNc codant pour gpl 30 et LIFRβ Le milieu de culture de cellules COS transfectées avec NNT-1 ou sCNTFR seul ou co-transfectées avec NNT-1 et CLF-1 a été utilisé comme contrôle tout comme un milieu de culture contenant la protéine LIF recombinante purifiée (rLEF) Ce contrôle a été ajouté du fait que le récepteur complexe fonctionnel de LIF comprend gpl30 et LIFRβ Une prolifération n'a été observée qu'avec le milieu de culture des cellules COS co-transfectées avec NNT-1 et sCNTFR et avec rLEF (figure 6) Ces résultats montrent que le complexe NNT- 1 /sCNTFR est biologiquement actif sur des cellules exprimant uniquement gpl 30 et LEFRβ et démontrent que l'activité de cette cytokine hétérodimérique est indépendante de la protéine CNTFR membranaire

Claims

REVENDICATIONS
1 Complexe isolé comprenant une protéine NNT-1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une protéine CLF- 1 et/ou une protéine sCNTFRα 2 Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend i) la protéine NNT-1 de séquence SEQ ED No 2, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ED No 2 , ii) la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No 4 ou No 6, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins
80 % avec la séquence SEQ ED No 4 ou No 6 , et/ou iii) la protéine sCNTFRα de séquence SEQ ED No 7 ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité après alignement optimal d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ED No 7 3 Complexe selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine
NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα est obtenue par synthèse chimique ou par voie recombinante
4 Complexe selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα sont des protéines naturelles exprimées par des cellules ou lignées cellulaires, notamment d'origine animale
5 Complexe selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant la mise en contact de la protéine NNT- 1 avec la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα, de préférence dans un milieu favorisant la formation dudit complexe 6 Complexe selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la protéine NNT-1 est couplée par liaison covalente à la protéine CLF-1 et/ou à la protéine sCNTFRα pour former une protéine de fusion
7 Vecteur ou un système de deux ou trois vecteurs de co-expression, caractérisé en ce que ledit vecteur ou ledit système de deux ou trois vecteurs contient une séquence nucléique codant pour une protéine NNT-1, une séquence nucléique codant pour une protéine CLF-1 et/ou une séquence nucléique codant pour une protéine sCNTFRα
8 Vecteur ou un système de deux ou trois vecteurs selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite protéine NNT-1 exprimée, ladite protéine CLF-1 exprimée et/ou ladite protéine sCNTFRα exprimée sont capables de former un complexe lorsqu'elles sont mises en contact l'une avec l'autre
9 Cellule, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur ou un système de deux ou trois vecteurs selon la revendication 7 ou 8
10 Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule eucaryote ou procaryote 1 1 Cellule selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule de mammifère
12 Procédé de préparation d'un complexe tel que défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un vecteur ou système de deux ou trois vecteurs selon la revendication 7 ou 8, ou une cellule selon l'une des revendications 9 à 11 13 Procédé de préparation d'un complexe tel que défini dans la revendication
1, caractérisé en ce que l'on cultive des cellules transformées selon l'une des revendications 9 à 11 dans des conditions permettant l'expression des protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRα et que l'on récupère ledit complexe formé
14 Procédé de préparation d'un complexe tel que défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) culture d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine NNT- 1 et une séquence d'ADN codant pour une protéine CLF-1 et/ou une séquence d'ADN codant pour une protéine sCNTFRα dans un milieu de culture approprié à ladite cellule , b) récupération dudit complexe formé à partir du milieu de culture et/ou de lysat desdites cellules cultivées
15 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite cellule à l'étape a) est une cellule selon l'une des revendications 9 à 11
16 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite cellule à l'étape a) est une cellule exprimant naturellement une protéine NNT-1, une protéine
CLF- 1 et/ou une protéine sCNTFRα 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite cellule à l'étape a) est une cellule issue d'une lignée cellulaire animale
18 Procédé selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRα sont sécrétées à l'extérieur de ladite cellule cultivée et le complexe formé est directement prélevé à partir du milieu de culture
19 Procédé de préparation d'un complexe tel que défini dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) culture d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine NNT- 1, d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine CLF-1 et/ou d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine sCNTFRα dans un milieu de culture approprié pour chacune desdites cellules , b) mise en contact des protéines NNT-1, des protéines CLF-1 et/ou des protéines sCNTFRα contenues dans leur milieu de culture respectif et/ou dans leur lysat cellulaire respectif , c) récupération dudit complexe formé à l'étape b)
20 Complexes susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'une des revendications 12 à 19
21 Complexe NNT- 1/CLF-l tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6 et 20, caractérisé en ce que ledit complexe est capable de fixer le récepteur CNTFRα
22 Complexe NNT- 1 /sCNTFRα tel que défini dans les revendications 1 à 6 et 20, caractérisé en ce que ledit complexe est capable de fixer le récepteur LEFRβ
23 Anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT- 1/CLF-l tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, 20 et 21
24 Anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT- 1/CLF-l /sCNTFRα ou un complexe NNT- 1 /sCNTFRα tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, 20 et 22
25 Utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6 et 20 à 21, ou d'un anticorps selon la revendication 23, pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRα/gp 130/LIFRβ
26 Utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 ou d'un anticorps selon la revendication 25, pour moduler la transduction de signal induite par la phosphorylation de la tyrosine de gpl 30 et LIFRβ 27 Utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l ou d'un anticorps selon la revendication 25, pour accroître ou diminuer la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation de cellules exprimant le récepteur complexe CNTFRα/gp 130/LEFRβ
28 Utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l ou d'un anticorps selon la revendication 27, caractérisée en ce que lesdites cellules exprimant le récepteur complexe CNTFRα/gp 130/LIFRβ sont des neurones centraux, périphériques, des neurones impliqués dans la fonction neuro-musculaire ou des cellules du muscle squelettique
29 Utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l ou d'un anticorps selon la revendication 27, pour diminuer la survie, la croissance ou la prolifération de cellules tumorales. 30 Utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon la revendication 27, pour faciliter la prolifération et/ou inhiber la différentiation des cellules souches
31 Utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l /sCNTFRα ou NNT-1/ sCNTFRα tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, 20 et 22 ou d'un anticorps selon la revendication 24, pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité biologique du récepteur gpl 30/LEFRβ de cellules exprimant ledit récepteur gpl30/LIFRβ
32 Utilisation selon la revendication 31, caractérisée en ce que lesdites cellules exprimant ledit récepteur gpl30/LIFRβ sont les cellules impliquées dans le système immunitaire, le système hématopoiétique, le système nerveux, le système reproductif, le foie, les os ou le muscle squelettique
33 Complexe selon l'une des revendications 1 à 6, 20 à 22 ou un anticorps selon la revendication 23 ou 24 en tant que médicament
34 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants a) un complexe selon l'une des revendications 1 à 6, 20 à 22 , b) un anticorps selon la revendication 23 ou 24 , c) un vecteur ou système de vecteurs selon la revendication 7 ou 8 , d) une cellule selon l'une des revendications 9 à 11 ; et e) une cellule animale capable d'exprimer naturellement une protéine NNT-1, une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRα 35 Composition pharmaceutique selon la revendication 34, pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, pour la réparation ou la régénération du tissu nerveux ou du muscle squelettique, ou pour la maintenance de la masse musculaire chez les paralysés
36 Composition pharmaceutique selon la revendication 34, pour la prévention ou le traitement de la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de
Parkinson ou la maladie de Huntington
37 Composition pharmaceutique selon la revendication 34, pour le traitement de l'obésité ou de ses maladies associées
38 Composition pharmaceutique selon la revendication 34, pour la prévention ou le traitement du cancer
39 Composition pharmaceutique selon la revendication 34, pour améliorer la fertilité, et notamment pour éviter les endométrioses et/ou faciliter l'implantation des blastocystes, pour faciliter l'hématopoièse et particulièrement dans le traitement de la thrombocytopénie, ou pour le traitement des rétinites et plus particulièrement des rétinites pigmentaires
40 Trousse de diagnostic comprenant un anticorps monoclonal, polyclonal, ou un de leurs fragments selon revendication 23 ou 24
41 Utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal, ou un de leurs fragments selon revendication 23 ou 24 pour le dosage ou l'identification in vitro d'un complexe tel que défini dans la revendication 1 dans un échantillon biologique
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