ES2877411T3 - Composición antisentido de microARN-328 y uso terapéutico - Google Patents

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Abstract

Un oligodesoxirribonucleótido antisentido dirigido a miR-328 en células del epitelio del pigmento retinal (RPE), en donde la secuencia de desoxirribonucleótidos del oligodesoxirribonucleótido es la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición antisentido de microARN-328 y uso terapéutico
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a microARN-328 antisentido en una forma de oligonucleótidos modificados con oligodesoxirribonucleótidos o ácidos nucleicos bloqueados (LNA) y modificados con enlaces fosforotioato, y su uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades oculares como la miopía.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La miopía hace que el ojo se alargue, lo que a su vez estira y adelgaza la retina y la esclerótica del ojo. Por consiguiente, un ojo miope tiene una longitud axial más larga que el ojo normal. Notablemente, la longitud axial puede variar entre individuos. En estudios con animales, un ojo es inducido a la miopía y el otro ojo se usa como control. La diferencia de longitud axial entre el ojo miope inducido y el ojo de control puede usarse para indicar la gravedad de la miopía. Además, también puede usarse el cambio de la diferencia de longitud axial como una lectura para evaluar el efecto terapéutico del tratamiento antimiopía. El alargamiento del globo ocular se considera el principal mecanismo subyacente que provoca complicaciones de la miopía como desprendimiento de retina, degeneración macular. También eso explica porque la corrección de la refracción sin prevenir el alargamiento de la longitud axial (como gafas) no puede prevenir las complicaciones de la miopía.
El gen de caja 6 emparejado (PAX6) pertenece a una familia altamente conservada de factores de transcripción que contienen los dominios de unión a ADN emparejados y de la caja homeótica. El PAX6 está implicado en el desarrollo del sistema nervioso central y del ojo. Desempeña papeles importantes durante la inducción de la diferenciación del cristalino y la retina, y se ha considerado el gen maestro en el desarrollo del ojo. En humanos, las mutaciones en PAX6 se asocian con una variedad de enfermedades oculares humanas que incluyen aniridia, hipoplasia foveal, catarata presenil y queratopatía relacionada con aniridia (revisado por Tsonis y Fuentes). Además de la plausibilidad biológica, un estudio de vinculación de todo el genoma reveló una fuerte vinculación del error de refracción con el locus PAX6. Por consiguiente, el PAX6 se ha propuesto como gen candidato para el desarrollo de la miopía. Un nivel bajo de PAX6 puede ser un factor de riesgo de miopía.
Los microARN (ARNmi) son moléculas de ARN de cadena sencilla no codificantes de aproximadamente 21­ 23 nucleótidos de longitud. En los animales, un ARNmi maduro es complementario a la región no traducida (UTR) 3' de uno o más ARN mensajeros (ARNm). El apareamiento de un ARNmi con su ARNm objetivo provoca una inhibición de la traducción de proteínas y/o la escisión del ARNm. Los ARNmi pueden regular el crecimiento, la diferenciación y la apoptosis celular.
Chen et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 53:2732-2739, 2012) informan que el microARN-328 (miR-328) puede influir en el desarrollo de la miopía mediando el gen PAX6. La CN102533755 divulga oligonucleótido antisentido dirigido a miR-328 en el tratamiento de tumores que sobreexpresan miR-328, especialmente glioma. BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO
La FIG. 1 muestra niveles relativos expresados de miR-328 en células RPE después de la transfección con ADN antisentido de miR-328 (15mer-30mer) y control. Se muestran la media y la desviación estándar (n = 3).
La FIG. 2 muestra niveles relativos expresados de miR-328 en células RPE después de la transfección con ADN antisentido de miR-328 modificado por ácidos nucleicos bloqueados y enlaces fosforotioados (401-406) y control. Se muestran la media y la desviación estándar (n = 3).
La FIG. 3 muestra la longitud axial delta de ratones entre el ojo derecho (miopía) y el ojo izquierdo en ratones tratados con control de solución salina (NS), ADN 16mer, ADN 17mer, LNA 403, lNA404 y LnA 405.
La FIG. 4 muestra la longitud axial delta de ratones entre el ojo derecho (miopía) y el ojo izquierdo en ratones tratados con control de solución salina (solución salina), atropina (atropina) al 1%, a Dn 16mer y LNA 403.
La FIG. 5 muestra la longitud axial delta de ratones entre el ojo derecho (miopía) y el ojo izquierdo en ratones tratados con control de solución salina (solución salina), atropina al 1%, 10 nM, 100 nM y 1 pM de ADN 16mer. La FIG. 6 muestra la longitud axial delta de conejo entre el ojo derecho (miopía) y el ojo izquierdo en un conejo tratado con control de solución salina (solución salina), 10 pM y 50 pM de ADN 16mer.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definición
Un "ácido nucleico bloqueado" (LNA), a menudo denominado ARN inaccesible, es un nucleótido de ARN modificado. La fracción de ribosa de un nucleótido de LNA se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación 3'-endo (North), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Los nucleótidos de LNA pueden mezclarse con residuos de ADN o ARN en el oligonucleótido siempre que se desee.
Un "oligodesoxirribonucleótido", como se usa en la presente, se refiere a un ácido desoxirribonucleico (ADN) que tiene 5-50 bases, preferiblemente 10-30 bases, o 15-30 bases de longitud. El ADN se modifica opcionalmente en las bases o en el enlace fosfodiéster.
Un "oligoribonucleótido", como se usa en la presente, se refiere a un ácido ribonucleico (ARN) que tiene 5­ 50 bases, preferiblemente 10-30 bases, o 15-30 bases de longitud. El ARN está opcionalmente modificado.
Un "oligonucleótido", como se usa en la presente, se refiere a un oligodesoxirribonucleótido, un oligoribonucleótido o un híbrido de los mismos.
Los "fosforotioatos" son una variante del ADN normal en el que por lo menos uno de los oxígenos no puente de los enlaces fosfodiéster se reemplaza por un azufre. La sulfuración del enlace internucleotídico reduce drásticamente la acción de endonucleasas y exonucleasas. La inclusión de enlaces fosforotioato (PS) aumenta la vida media de los oligonucleótidos en el suero humano; sin embargo, la introducción de enlaces PS puede reducir la afinidad de unión de los oligonucleótidos y puede provocar citotoxicidad.
La presente divulgación está dirigida a secuencias de oligonucleótidos que son antisentido para miR-328. En una realización, los oligonucleótidos son oligodesoxirribonucleótidos que tienen longitudes específicas. En otra realización, los oligonucleótidos tienen modificaciones de LNA y modificaciones de fosforotioato. Los oligonucleótidos de la presente invención son útiles para prevenir o tratar enfermedades oculares como la miopía.
El miR-328 maduro humano tiene la secuencia CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU (SEQ ID NO: 1).
En un primer aspecto, los inventores han diseñado oligodesoxirribonucleótidos antisentido miR-328 (15-22 mer de longitud) de acuerdo con el miR-328 humano maduro, y han diseñado oligodesoxirribonucleótidos antisentido miR-328 (23-30 mer en longitud) de acuerdo con secuencias de miR-328 humano prematuro. Los inventores obtuvieron luego los ADN antisentido de ARNmi-328 que tenían 15-30 bases (15-30mer) y probaron sus actividades. Las secuencias de ADN 15mer-30mer se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Secuencia de ADN antisentido
Figure imgf000003_0001
Los inventores han descubierto que de los 16 ADN antisentido probados, solo el 16mer y el 17mer inhibieron la expresión de miR-328 in vitro. Sorprendentemente, los ADN antisentido (15mer y 18-30mer) no mostraron ninguna actividad para inhibir la expresión de miR-328 in vitro. El 16mer y el 17mer fueron seguros en estudios con animales y mostraron una actividad para el tratamiento de la miopía disminuyendo una longitud axial media en los ratones tratados.
La presente invención está dirigida a ADN 16mer, 5'-AGGGCAGAGAGGGCCA-3' (SEQ ID NO: 3) y ADN 17mer, 5'-AAGGGCAGAGAGGGCCA-3' (SEQ ID NO: 4).
En un segundo aspecto, los inventores han diseñado oligonucleótidos antisentido modificados con LNA y modificados con enlaces de fosforotioato (PS), que varían de 17 a 22 mer de acuerdo con la secuencia de miR-328 humana madura y el principio de gapmer (Kurreck et al, Nucleic Acids Res., 30 1911-1918, 2002). Los mer 15 y 16 de los oligonucleótidos antisentido modificados con LNA no están incluidos, porque las secuencias terminales del extremo 5' de los mer 15 y 16 muestran 3 G consecutivos y el patrón autocomplementario, que puede hacer que el oligonucleótido forme dímeros. Luego, los inventores obtuvieron oligonucleótidos modificados con LNA antisentido de ARNmi-328 que tenían 17-22 bases y probaron sus actividades. Las secuencias de oligonucleótidos miR-328 antisentido que están modificadas con LNA y modificadas con enlaces de PS se muestran en la Tabla 2. Sus secuencias de ADN nativas no modificadas se muestran en formato legible por ordenador de los listados de secuencias como SEQ ID NO: 18-23.
Tabla 2. Secuencia de oli onucleótidos antisentido modificados con LNA modificados con enlace de PS
Figure imgf000004_0001
En la Tabla 2, cada enlace fosfodiéster de las secuencias de ADN se modifica a un enlace de fosforotioato (PS). En la Tabla 2, el núcleo central de cada secuencia de ADN está flanqueado por cuatro nucleótidos modificados con LNA en ambos extremos 5' y 3'.
Los inventores han descubierto que de los 6 oligonucleótidos modificados con LNA/enlaces de PS antisentido probados, solo los 403, 404 y 405 inhibieron la expresión de miR-328 in vitro. Otros ADN modificados con LNA/enlaces de PS antisentido no mostraron ninguna actividad para la inhibición de la expresión de miR-328 in vitro. Además de la actividad in vitro, 403 mostró una actividad para tratar la miopía al disminuir una longitud axial media en los ratones tratados.
La presente invención está dirigida al oligonucleótido modificado con LNA/enlaces de PS antisentido 403. Las composiciones antisentido de ARNmi-328 de la presente invención tienen buena actividad de hibridación hacia ARNmi-328, tienen buena solubilidad en agua y son estables (resistentes a exonucleasas).
PAX6, FMOD y COL1A1 son genes importantes en la patogénesis de la miopía y son genes objetivo directos de miR-328. Se ha demostrado que estos genes desempeñan un papel en el desarrollo de la miopía. Las composiciones antisentido de ARNmi-328 de la presente invención aumentaron los niveles de expresión de PAX6, FMOD y COL1A1 in vitro.
Las composiciones antisentido de ARNmi-328 de la presente invención son útiles para prevenir o tratar enfermedades oculares. En particular, las composiciones antisentido de ARNmi-328 de la presente invención son útiles para prevenir o tratar la miopía.
La presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende oligonucleótidos antisentido de ARNmi-328 de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Una forma preferida para tratar la miopía es una solución tópica o una pomada tópica.
Una solución tópica que contiene ARNmi-328 antisentido puede contener un vehículo fisiológicamente compatible, como pueden seleccionar los expertos en la técnica oftálmica usando criterios convencionales. Los vehículos oftálmicos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, poliéteres de agua como polietilenglicol, polivinilos como alcohol polivinílico y povidona, derivados de celulosa como metilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de petróleo como aceite mineral y vaselina blanca, grasas animales como lanolina, polímeros de ácido acrílico como gel de carboxipolimetileno, grasas vegetales como aceite de cacahuete y polisacáridos como dextranos, y glicosaminoglicanos como hialuronato de sodio y sales como cloruro de sodio y cloruro de potasio.
La formulación incluye opcionalmente un conservante, como cloruro de benzalconio y otros ingredientes inactivos como EDTA. Sin embargo, para uso crónico (más de dos semanas), las formulaciones preferidas son aquellas sin conservantes debido al potencial de daño al epitelio corneal que puede resultar de la exposición frecuente a largo plazo a conservantes como el cloruro de benzalconio. Las formulaciones sin conservantes se preparan en una dosis unitaria y se almacenan en un recipiente de un solo uso.
El pH de la formulación se ajusta añadiendo cualquier ácido, base o tampón de ajuste de pH fisiológica y oftalmológicamente aceptable dentro del intervalo de aproximadamente 5 a 7,5, preferiblemente de 6 a 7. Los ejemplos de ácidos incluyen acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico, clorhídrico y similares, y los ejemplos de bases incluyen hidróxido de sodio, fosfato de sodio, borato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, lactato de sodio, trometamina, THAM (trishidroximetilamino-metano) y similares. Las sales y tampones incluyen citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio, cloruro de amonio y mezclas de los ácidos y bases mencionados anteriormente.
La presión osmótica de la composición oftálmica acuosa es generalmente de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 miliosmolar (mOsM), más preferiblemente de 260 a 340 mOsM. La presión osmótica puede ajustarse usando cantidades apropiadas de agentes iónicos o no iónicos fisiológica y oftalmológicamente aceptables. El cloruro de sodio es un agente iónico preferido y la cantidad de cloruro de sodio varía de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 1% (p/v), y preferiblemente de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 0,45% (p/v). Pueden usarse cantidades equivalentes de una o más sales compuestas de cationes como potasio, amonio y similares y aniones como cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato, bisulfato, bisulfato de sodio, sulfato de amonio y similares además o en lugar de cloruro de sodio para lograr una osmolalidad dentro del intervalo indicado anteriormente. Además, también pueden usarse agentes no iónicos como manitol, dextrosa, sorbitol, glucosa y similares para ajustar la osmolaridad.
Los oligonucleótidos antisentido de ARNmi-328 de la presente invención pueden administrarse a los ojos de un paciente por cualquier medio adecuado, pero preferiblemente se administran en forma de gotas, espray, gel o pomada. En una realización, el oligonucleótido está en forma de gotas y se deja caer sobre la superficie ocular. En otra realización, el oligonucleótido está contenido dentro de un hisopo o esponja que puede aplicarse a la superficie ocular. En otra realización, el oligonucleótido está contenido dentro de un espray líquido o pomada que puede aplicarse a la superficie ocular. En otra realización, el oligonucleótido se inyecta directamente en los tejidos lagrimales o en la superficie del ojo. Alternativamente, el oligonucleótido puede aplicarse al ojo mediante liposomas. Además, el oligonucleótido puede infundirse en la película lagrimal a través de un sistema de bomba-catéter. Como realización adicional, el oligonucleótido puede contenerse dentro, ser transportado por, o unirse a lentes de contacto u otros materiales de liberación controlada compatibles, que se colocan sobre el ojo.
La concentración del oligonucleótido incluido en una solución tópica es una cantidad suficiente para prevenir y/o tratar la miopía. La concentración de oligonucleótido está generalmente en el intervalo de aproximadamente 30 nM-2,5 mM, preferiblemente aproximadamente 100 nM-10 pM, aproximadamente 1 pM-100pM o aproximadamente 15 pM-1,5 mM. "Aproximadamente", como se usa en la presente, se refiere a ±10% del valor enumerado.
La presente divulgación se dirige además a un método para prevenir o tratar la miopía en un sujeto. El método comprende el paso de administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de la composición de oligonucleótidos de microARN-328 antisentido de la presente invención. Se prefiere la vía de administración tópica. "Una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz para prevenir o tratar la miopía, es decir, para evitar que aumente la longitud axial en el ojo, o para reducir la longitud axial en el ojo miope.
La dosis diaria para tratar o prevenir la miopía puede dividirse entre una o varias administraciones de dosis unitarias. La dosis diaria, por ejemplo, puede variar de una gota (aproximadamente 30-50 pl), de una a cuatro veces al día, dependiendo de la edad y la condición del sujeto. Un régimen para la composición de ADN antisentido de miR-328 es una gota de la solución tópica, 1 a 2 veces al día. Alternativamente, la solución tópica puede administrarse una vez a la semana.
Cuando se trata o se previene la miopía, el presente método puede combinarse con otros métodos conocidos por un experto en la técnica.
La presente divulgación también proporciona el uso de una secuencia de desoxirribonucleótidos de acuerdo con la presente invención para la fabricación de una medicación o composición farmacéutica para prevenir o tratar la miopía. En una realización preferida, la medicación o composición farmacéutica es una solución tópica o una pomada tópica.
La presente divulgación también proporciona el uso de una secuencia de oligonucleótidos modificada con ácidos nucleicos bloqueados y modificada con enlace fosforotioato de acuerdo con la presente invención para la fabricación de una medicación o composición farmacéutica para prevenir o tratar la miopía. En una realización preferida, la medicación o composición farmacéutica es una solución tópica o una pomada tópica.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Se pretende que estos ejemplos simplemente sean ilustrativos de la presente invención y no deben interpretarse como limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Síntesis y purificación de oligonucleótidos antisentido (ADN)
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido de miR-328 que consisten de nucleótidos de ADN de acuerdo con las secuencias de miR-328 humano maduro y pre-miR-328 humano. Los oligonucleótidos antisentido de ADN se sintetizaron usando el sintetizador de ADN/ARN llamado Dr. Oligo192 (Biolytic Lab Performance Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se prepararon oligonucleótidos antisentido en el intervalo de 15 mer a 30 mer que contenían todos los desoxirribonucleótidos. Los productos se purificaron mediante HPLC. La síntesis y purificación de los oligonucleótidos antisentido fueron realizadas por Genomics BioSci & Tech. Ltd. (Taiwán). Las secuencias de ADN 15mer-30mer se muestran en la Tabla 1.
Ejemplo 2. Síntesis y purificación de oligonucleótidos antisentido (LNA)
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido modificados con LNA y modificados con enlaces de PS que variaban de 17 a 22 mer de acuerdo con la secuencia de miR-328 humana madura y el principio de gapmer; las secuencias modificadas y la versión no modificada se muestran en la Tabla 2. De acuerdo con el diseño, las secuencias antisentido modificadas con LNA y modificadas con enlaces de PS de 17-22 mer fueron sintetizadas y purificadas por Exiqon (Dinamarca).
Ejemplo 3. Pruebas in vitro para la inhibición de la expresión de miR-328 por oligonucleótidos antisentido Cultivo celular, tratamientos y transfección
Se cultivó una línea celular RPE denominada "ARPE-19" en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/medio F12. La línea celular se cultivó con penicilina/estreptomicina al 1% y suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10% a 37° C en una atmósfera humidificada de aire al 95%/dióxido de carbono (CO2) al 5%. Para llevar a cabo los experimentos de transfección, las células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo. Después de lograr una confluencia del 70% en un pocillo, se transfectaron oligonucleótidos antisentido (concentraciones de 30, 50 y 100 nM) con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas de incubación, las células se lisaron para estudios adicionales.
Detección de la inhibición de la expresión de miR-328 por oligonucleótidos antisentido
Se extrajo ARN total de las células cultivadas usando Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza del a Rn se comprobó usando lecturas A260/A280. Primero se transcribió de forma inversa el miR-328 a ADNc de miR-328 usando el siguiente procedimiento: 5 ng de ARN se transcribieron de forma inversa con el cebador específico de miR-328 y el kit de transcriptasa inversa MultiScribe (Applied Biosystems). Para medir la expresión de miR-328, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real en una máquina de PCR en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems) con sonda específica de miR-328 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). El efecto inhibidor de los oligonucleótidos antisentido se evaluó midiendo el nivel de ADNc de miR-328 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de expresión de miR-328 se normalizó al de un pequeño ARN nuclear no codificante U6 como control interno.
Resultados de las pruebas in vitro de inhibición de la expresión de miR-328 por oligonucleótidos antisentido a. Oligonucleótidos antisentido de ADN
Se examinaron dieciséis oligonucleótidos antisentido de ADN, de 15 a 30 mer de longitud preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 para determinar sus efectos inhibidores sobre la expresión de miR-328 en células RPE. Los niveles de expresión de miR-328 relativos se muestran en la FIG. 1. Solo ADN16mer y ADN17mer inhibieron la expresión de miR-328. Los efectos inhibidores de ADN16mer fueron del 39%, 35% y 49% en concentraciones de 30, 50 y 100 nM. Para ADN17mer, los efectos inhibidores fueron del 43%, 41% y 48% en concentraciones de 30, 50 y 100 nM. El resto de oligonucleótidos antisentido (15mer y 18-30mer) no mostraron ningún efecto inhibidor sobre la expresión de miR-328.
B. Oligonucleótidos antisentido modificados con LNA
Se examinaron seis secuencias antisentido modificadas con LNA, denominadas LNA401 a LNA406, para determinar el efecto inhibidor sobre la expresión de miR-328 en células RPE. Los niveles relativos expresados de miR-328 se muestran en la FIG. 2. Solo LNA403, LNA404 y LNA405 inhibieron la expresión de miR-328. Los efectos inhibidores de LNA403 fueron del 97%, 97% y 90% en concentraciones de 30, 50 y 100 nM, respectivamente. LNA404 y LNA405 tenían los mismos efectos inhibidores del 98%, 98% y 99% en concentraciones de 30, 50 y 100 nM, respectivamente. El resto de oligonucleótidos de LNA no mostró ningún efecto inhibidor sobre la expresión de miR-328.
Ejemplo 4. Estudio in vivo para la evaluación de la eficacia de los oligonucleótidos antisentido en el tratamiento de la miopía
Modelo animal
Se adquirieron ratones C57BL/6J de 21 días en el National Laboratory Animal Center, Taiwán. Todos los experimentos con animales cumplieron con la Declaración de ARVO para el Uso de animales en la investigación oftálmica y visual. El procedimiento de inducción de miopía se describe brevemente como sigue: se cubrieron los ojos derechos de los ratones de 23 días para inducir la miopía (es decir, miopía) y se los ojos izquierdos se dejaron sin cubrir. Luego, los ojos derechos de los ratones con miopía inducida fueron tratados con 30 j l de solución salina (es decir, grupo control), ADN16mer, ADN17mer, LNA403, LNA404, o LNA405, a 1 jM en el día 30, 37 y 44. Los ratones se sacrificaron el 51° día y se recogieron los ojos. Los ojos aislados se fotografiaron con un microscopio de disección y se midieron las longitudes axiales usando imageJ. La miopía provoca el alargamiento de la longitud axial, que es el principal cambio patológico en la miopía. La diferencia de longitud axial (es decir, longitud axial delta) entre el ojo derecho cubierto y el ojo izquierdo no cubierto del mismo ratón indica la gravedad de la miopía. Los resultados se resumen en la Tabla 3 y la FIG. 3. La evaluación estadística se realizó usando la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró significativo el análisis con valores de p <0,05.
Tabla 3. Lon itud axial delta de^ ratones tratados con oli onucleótidos antisentido o solución salina^
Figure imgf000007_0001
ADN16mer y ADN17mer
La longitud axial delta media en ratones tratados con ADN16mer y ADN17mer fue estadísticamente significativamente menor que la de los animales de control. ADN16mer y ADN17mer redujeron significativamente la longitud axial delta en 0,077 mm y 0,065 mm en comparación con el grupo de control. Los resultados mostraron que ADN16mer y ADN17mer eran eficaces en el tratamiento de la miopía en ratones.
Oligonucleótidos antisentido modificados con LNA
Las longitudes axiales delta medias en ratones tratados con LNA403-405 fueron más pequeñas que en los animales de control. LNA403 redujo la longitud axial delta en 0,054 mm, LNA404 redujo la longitud axial delta en 0,025 mm y LNA405 redujo la longitud axial delta en 0,035 mm, en comparación con el grupo de control. Sin embargo, solo LNA 403 muestra una significación estadística (valor de p<0,05). Los resultados mostraron que LNA403 fue eficaz en el tratamiento de la miopía en ratones.
Ejemplo 5. Validación de ADN 16Mer y LNA 403
Modelo animal
Se adquirieron ratones C57BL/6J de 21 días de edad en el National Laboratory Animal Center, Taiwán. Todos los experimentos con animales cumplieron con la Declaración de ARVO para el Uso de animales en la investigación oftálmica y visual. El procedimiento de inducción de miopía se describe brevemente como sigue: se cubrieron los ojos derechos de los ratones de 23 días durante 4 semanas para inducir miopía (es decir, miopía) y los ojos izquierdos se dejaron sin cubrir. Luego, los ojos derechos de los ratones con miopía inducida se trataron con 30 j l de solución salina (es decir, grupo de control negativo), 1% de atropina (es decir, grupo de control positivo), ADN16mer o LNA403 a 1 |jM en los días 30, 37 y 44. Los ratones fueron sacrificados el día 51 y se recogieron los ojos. Los ojos aislados se fotografiaron con un microscopio de disección y se midieron las longitudes axiales usando imageJ y un software patentado para la medición automática. La miopía provoca el alargamiento de la longitud axial, que es el principal cambio patológico de la miopía. La diferencia de longitud axial (es decir, longitud axial delta) entre el ojo derecho cubierto y el ojo izquierdo no cubierto del mismo ratón indica la gravedad de la miopía. Los resultados se resumen en la Tabla 4 y la FIG. 4. La evaluación estadística se realizó usando la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró significativo el análisis con valores de p <0,05.
Tabla 4. Lon itud axial delta de ratones tratados con atro ina oli onucleótidos antisentido o solución salina
Figure imgf000008_0002
Para comparar adicionalmente la eficacia de ADN 16mer y LNA 403 con el fármaco antimiopía bien documentado (atropina), probamos estos tres tipos de gotas para los ojos. Debe tenerse en cuenta que usamos atropina al 1% que es una concentración 10 veces mayor que la concentración clínica, y se ha demostrado que la atropina al 1% es la más eficaz que la concentración más baja. Como el ADN 16mer y LNA403 se disolvieron en solución salina normal, usamos solución salina normal como control negativo. Los datos anteriores mostraron que tanto el ADN 16mer como el LNA403 eran más eficaces que la atropina al 1% para reducir el alargamiento del globo ocular.
Ejemplo 6. Confirmación de ADN 16Mer por un tercero independiente
También usamos un CRO para confirmar nuestros resultados de ADN 16mer.
Modelo animal
El procedimiento de inducción de la miopía es: Se adquirieron ratones C57BL/6J de 21 días de edad en el National Laboratory Animal Center, Taiwán. Todos los experimentos con animales cumplieron con la Declaración de ARVO para el Uso de animales en la investigación oftálmica y visual. El procedimiento de inducción de la miopía se describe brevemente como sigue: se cubrieron los ojos derechos de los ratones de 23 días durante 4 semanas para inducir la miopía y los ojos izquierdos se dejaron sin cubrir. Luego, los ojos derechos de los ratones con miopía inducida se trataron con 30 j l de solución salina (es decir, grupo de control negativo), 1% de atropina (es decir, grupo de control positivo), 10 nM, 100 nM, y 1 jM de ADN 16mer en el día 30, 37 y 44. Los ratones se sacrificaron el día 51 y se recogieron los ojos. Los ojos aislados se fotografiaron con un microscopio de disección y se midieron las longitudes axiales usando imageJ y un software patentado para la medición automática. La miopía provoca el alargamiento de la longitud axial, que es el principal cambio patológico de la miopía. La diferencia de longitud axial (es decir, longitud axial delta) entre el ojo derecho cubierto y el ojo izquierdo no cubierto del mismo ratón indica la gravedad de la miopía.
Los resultados de los experimentos CRO se muestran en la Tabla 5 y la FIG. 5. Los resultados de terceras partes replican por completo nuestros datos.
Tabla 5. Lon itud axial delta de ratones tratados con atro ina oli onucleótidos ântisentido o solución salina
Figure imgf000008_0001
Ejemplo 7. Confirmación de efecto de ADN 16mer en un 2° animal
Modelo animal
El procedimiento de inducción de la miopía: Se adquirieron conejos pigmentados de 3 días de edad en la granja de ganado DA-ZONG, Taiwán. Todos los experimentos con animales cumplieron con la Declaración de ARVO

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un oligodesoxirribonucleótido antisentido dirigido a miR-328 en células del epitelio del pigmento retinal (RPE), en donde la secuencia de desoxirribonucleótidos del oligodesoxirribonucleótido es la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
2. El oligodesoxirribonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de desoxirribonucleótidos del oligodesoxirribonucleótido es la SEQ ID NO: 3.
3. El oligodesoxirribonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de desoxirribonucleótidos del oligodesoxirribonucleótido es la SEQ ID NO: 4.
4. Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad ocular, que comprende el oligodesoxirribonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la enfermedad ocular es miopía.
6. Un oligonucleótido modificado con ácidos nucleicos bloqueados y modificados con enlaces de fosforotioato dirigido a miR-328 en células del epitelio del pigmento retinal (RPE), en donde el oligonucleótido modificado con enlaces de fosforotioato tiene una secuencia de oligonucleótidos de la SEQ ID NO: 21, en donde desde el extremo 5’ al extremo 3’ de la SEQ ID NO: 21, las posiciones 1, 2, 3, 4, 17, 18, 19 y 20 están modificadas por un ácido nucleico bloqueado y cada enlace de fosfodiéster de la SEQ ID NO: 21 se modifica a un enlace de fosforotioato.
7. Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad ocular, que comprende el oligonucleótido modificado con ácidos nucleicos bloqueados y modificados con enlaces de fosforotioato de acuerdo con la reivindicación 6 y un portador farmacéuticamente aceptable.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad ocular es miopía.
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