JP6537092B2 - mTORインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬およびその応用 - Google Patents
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Description
(項目1)
mTORインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための組成物。
(項目2)
前記眼の症状、障害または疾患が、角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記眼の症状、障害または疾患が、トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目1または2に記載の組成物。
(項目4)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED)、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
(項目5)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス(ECM)の過剰発現に起因するものである、項目1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
(項目6)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目5に記載の組成物。
(項目7)
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、PI−103、CC−223、INK128、AZD8055、KU 0063794、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、NVP−BEZ235、CZ415、トルキニブ、トリン1、オミパリシブ、OSI−027、PF−04691502、アピトリシブ、WYE−354、ビスツセルチブ、トリン2、タクロリムス、GSK1059615、ゲダトリシブ、WYE−125132、BGT226、パロミド529、PP121、WYE−687、CH5132799、WAY−600、ETP−46464、GDC−0349、XL388、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、項目1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
(項目9)
前記mTORインヒビターが、mTOR遺伝子の発現抑制物質である、項目1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
(項目10)
前記mTOR遺伝子の発現抑制物質は、mTOR遺伝子に対するsiRNA、アンチセンス核酸またはリボザイムである、項目9に記載の組成物。
(項目11)
前記mTOR遺伝子の発現抑制物質は、mTOR遺伝子に対するsiRNAであり、該siRNAは、配列番号1に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号2に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目9または10に記載の組成物。
(項目12)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目13)
前記組成物が点眼剤である、項目1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
(項目14)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1nMで前記組成物中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目15)
前記組成物が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1mMで該点眼剤中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目16)
前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01nMで前記組成物中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目17)
前記組成物が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01mMで該点眼剤中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目18)
前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1nMで前記組成物中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
前記組成物が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1mMで該点眼剤中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目1A)
被験体中の眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための方法であって、該方法は、mTORインヒビターの有効量を該被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目2A)
前記眼の症状、障害または疾患が、角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目1Aに記載の方法。
(項目3A)
前記眼の症状、障害または疾患が、トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目1Aまたは2Aに記載の方法。
(項目4A)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED)、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目1A〜3Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目5A)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス(ECM)の過剰発現に起因するものである、項目1A〜4Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目6A)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目5Aに記載の方法。
(項目7A)
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目1A〜6Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目8A)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、PI−103、CC−223、INK128、AZD8055、KU 0063794、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、NVP−BEZ235、CZ415、トルキニブ、トリン1、オミパリシブ、OSI−027、PF−04691502、アピトリシブ、WYE−354、ビスツセルチブ、トリン2、タクロリムス、GSK1059615、ゲダトリシブ、WYE−125132、BGT226、パロミド529、PP121、WYE−687、CH5132799、WAY−600、ETP−46464、GDC−0349、XL388、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、項目1A〜7Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目9A)
前記mTORインヒビターが、mTOR遺伝子の発現抑制物質である、項目1A〜7Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目10A)
前記mTOR遺伝子の発現抑制物質は、mTOR遺伝子に対するsiRNA、アンチセンス核酸またはリボザイムである、項目9Aに記載の方法。
(項目11A)
前記mTOR遺伝子の発現抑制物質は、mTOR遺伝子に対するsiRNAであり、該siRNAは、配列番号1に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号2に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目9Aまたは10Aに記載の方法。
(項目12A)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目13A)
前記mTORインヒビターが点眼剤として投与される、項目1A〜12Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目14A)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1nMの濃度で投与される、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目15A)
前記mTORインヒビターが点眼剤として投与され、前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1mMで前記点眼剤中に存在する、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目16A)
前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01nMの濃度で投与される、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目17A)
前記mTORインヒビターが点眼剤として投与され、前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01mMで前記点眼剤中に存在する、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目18A)
前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1nMの濃度で投与される、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目19A)
前記mTORインヒビターが点眼剤として投与され、前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1mMで前記点眼剤中に存在する、項目1A〜8Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目20A)
前記mTORインヒビターが局所投与される、項目1A〜19Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目21A)
前記mTORインヒビターが眼に局所投与される、項目1A〜20Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目22A)
前記mTORインヒビターが角膜に接触するように投与される、項目1A〜21Aのいずれか一項に記載の方法。
(項目1B)
眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための医薬の製造のためのmTORインヒビターの使用。
(項目2B)
前記眼の症状、障害または疾患が、角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目1Bに記載の使用。
(項目3B)
前記眼の症状、障害または疾患が、トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目1Bまたは2Bに記載の使用。
(項目4B)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED)、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目1B〜3Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目5B)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス(ECM)の過剰発現に起因するものである、項目1B〜4Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目6B)
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目5Bに記載の使用。
(項目7B)
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目1B〜6Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目8B)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、PI−103、CC−223、INK128、AZD8055、KU 0063794、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、NVP−BEZ235、CZ415、トルキニブ、トリン1、オミパリシブ、OSI−027、PF−04691502、アピトリシブ、WYE−354、ビスツセルチブ、トリン2、タクロリムス、GSK1059615、ゲダトリシブ、WYE−125132、BGT226、パロミド529、PP121、WYE−687、CH5132799、WAY−600、ETP−46464、GDC−0349、XL388、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、項目1B〜7Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目9B)
前記mTORインヒビターが、mTOR遺伝子の発現抑制物質である、項目1B〜7Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目10B)
前記mTOR遺伝子の発現抑制物質は、mTOR遺伝子に対するsiRNA、アンチセンス核酸またはリボザイムである、項目9Bに記載の使用。
(項目11B)
前記mTOR遺伝子の発現抑制物質は、mTOR遺伝子に対するsiRNAであり、該siRNAは、配列番号1に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号2に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目9Bまたは10Bに記載の使用。
(項目12B)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目1B〜8Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目13B)
前記医薬が点眼剤である、項目1B〜12Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目14B)
前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1nMで前記医薬中に存在する、項目1〜8のいずれか一項に記載の使用。
(項目15B)
前記医薬が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1mMで該点眼剤中に存在する、項目1B〜8Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目16B)
前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01nMで前記医薬中に存在する、項目1B〜8Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目17B)
前記医薬が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01mMで該点眼剤中に存在する、項目1B〜8Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目18B)
前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1nMで前記医薬中に存在する、項目1B〜8Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目19B)
前記医薬が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1mMで該点眼剤中に存在する、項目1B〜8Bのいずれか一項に記載の使用。
(項目1C)
眼の症状、障害または疾患の予防または治療に使用するための、mTORインヒビター。
(項目2C)
上記項目の1または複数の特徴を含む、項目1Cに記載のmTORインヒビター。
(項目1D)
mTORインヒビターを含む角膜内皮細胞を保存するための組成物。
(項目2D)
上記項目の1または複数の特徴を含む、項目1Dに記載の組成物。
(項目1E)
mTORインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を保存するための方法。
(項目2E)
上記項目の1または複数の特徴を含む、項目1Eに記載の方法。
(項目1F)
mTORインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を増殖または角膜内皮細胞の増殖を促進するための方法。
(項目2F)
上記項目の1または複数の特徴を含む、項目1Eに記載の方法。
本明細書において、数値の前の「約」とは、後に続く数値の±10%を意味する。
7059.)。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience; Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press; Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates; Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates; Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press; Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates; Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress; Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press; Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press; Adams,R.L.etal.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall; Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim; Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press; Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告{Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
1つの局面において、本発明は、mTORインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための組成物を提供する。特に、mTORインヒビターは、角膜内皮における症状、障害または疾患に有効である。
びデスメ膜の肥厚やこのほか混濁や沈着に関連する症状(遷延化する角膜浮腫による不可逆的な角膜実質混濁など)を改善し、処置しまたは予防することができる。
CAUUCGCAUUCAGUCCAUAtt(配列番号1)
に示されるセンス鎖と
UAUGGACUGAAUGCGAAUGat(配列番号2)
に示されるアンチセンス鎖とを含むがこれに限定されず、mTOR遺伝子に対するアンチセンス効果あるいはRNAi効果させあれば、どのような配列でもよい。これらのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されていてもよい。
別の局面において、本発明は、mTORインヒビターを含む角膜内皮細胞を保存するための組成物を提供する。本発明はまた、mTORインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を保存するための方法を提供する。角膜内皮細胞の保存に使用されるmTORインヒビター等の実施形態は、本明細書において<医薬>において記載される任意の実施形態が利用可能であることが理解される。角膜内皮細胞への接触、インビボであっても、エキソビボであってもインビトロであってもよく、細胞製剤の製造において使用されてもよい。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株(iFECD)を作製した。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985−070)に、8%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)、200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902−500G)、0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819−5G)、20μg/mlアスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544−25G)、50μg/mlゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710−064)および5ng/ml EGF(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)を加えた3T3フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にSB431542(1μmol/l)およびSB203580(4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルホニルフェニル)−5(4−ピリジル)イミダゾール<4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン)(1μmol/l)を添加したもの(本明細書では「SB203580+SB431542+3T3馴化培地」ともいう)で培養した。
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植(デスメ膜内皮角膜移植=DMEK)を実施されたヒト患者3名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。DMEKの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるOptisol−GS(ボシュロム社)に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、SB203580+SB431542+3T3馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はSV40ラージT抗原およびhTERT遺伝子をPCRにより増幅して、レンチウイルスベクター(pLenti6.3_V5−TOPO; Life Technologies Inc)に導入した。その後、レンチウイルスベクターを3種類のヘルパープラスミド(pLP1、pLP2、pLP/VSVG; Life Technologies Inc.)とともにトランスフェクション試薬(Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI)を用いて293T 細胞 (RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japan)に感染させた。48時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、5μg/mlのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、SV40ラージT抗原およびhTERT遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した(iHCEC)。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株(iHCEC)および不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の位相差顕微鏡像をみると、iHCECおよびiFECDはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。iHCECおよびiFECDはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎仔血清(FBS)により維持培養を行った。
本実施例では、mTORインヒビターの代表例であるラパマイシンの、眼の細胞障害に対する効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
(ラパマイシンはTGF−β2により誘導される細胞障害を抑制する)
図1に結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトTGF−β2によりiFECDを刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、ラパマイシンでプレトリートメントした場合、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。したがって、ラパマイシンは組み換えヒトTGF−β2により誘導される細胞障害を抑制することが認められた。
本実施例では、mTORインヒビターの代表例であるラパマイシンの、カスパーゼ活性に対する効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800gで12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1%NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質8μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、ウサギ抗Caspase 3抗体(Cell Signaling、9662)、ウサギ抗PARP抗体(Cell Signaling、9542)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はウサギ抗Caspase 3抗体:1000倍希釈、ウサギ抗PARP抗体:2000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社)により解析した。
(ラパマイシンは、TGF−β2により誘導されるカスパーゼ活性を抑制する)
図2にカスパーゼについてのウェスタンブロットの結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトTGF−β2によりiFECDを刺激した場合、活性型である約17kDaの切断カスパーゼ3(約17kDa)が認められた。他方で、ラパマイシン添加群においては、活性型の切断カスパーゼ3はほとんど確認されなかった。したがって、による解析よりラパマイシンは組み換えヒトTGF−β2により誘導されるカスパーゼの活性化を抑制することが認められた。mTORは、カスパーゼのシグナルとは無関係であり、また、mTORインヒビターがカスパーゼの活性化を抑制することも知られていないため、ラパマイシンが、カスパーゼの活性化を抑制できたことは驚くべきことであった。
本実施例では、mTORインヒビターの代表例であるラパマイシンの、TGF−β2により誘導されるS6Kのリン酸化活性に対する効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800gで12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1%NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質5μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、ウサギ抗Akt1抗体(Cell Signaling、2938)、マウス抗Phospho−Akt抗体(Cell Signaling、4051)、ウサギ抗S6K抗体(Cell Signaling、9202)、ウサギ抗Phospho−S6K抗体(Cell Signaling、9204)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はウサギ抗Akt抗体:1000倍希釈、マウス抗Phospho−Akt抗体:1000倍希釈、ウサギ抗S6K抗体:1000倍希釈、ウサギ抗Phospho−S6K抗体:1000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社
)により解析した。
(ラパマイシンはTGF−β2により誘導されるS6Kのリン酸化活性を抑制する)
図3に結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトTGF−β2によりiFECDを刺激した場合、Aktのリン酸化活性が認められた。他方で、ラパマイシン添加群においては、S6Kのリン酸化活性が抑制された。ウェスタンブロットによる解析よりラパマイシンはmTORシグナル経路の阻害作用を有することを確認した。AktはmTORの上流、S6KはmTORの下流に存在する。そのため、mTORインヒビターにより、上流のAktはリン酸化され、他方で下流のS6Kのリン酸化は抑制されたことから、ラパマイシンがmTOR経路を阻害していることが確認された。
本実施例では、mTORインヒビターの代表例であるラパマイシンの、TGF−β2により誘導されるSmad2/3のリン酸化活性に対する抑制効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800gで12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1%NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質8μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、ウサギ抗Smad2抗体(Cell Signaling、5339)、マウス抗Phospho−Smad2抗体(Cell Signaling、3108)、ウサギ抗Smad3抗体(Cell Signaling、9523)、ウサギ抗Phospho−Smad3抗体(Cell Signaling、9520)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はウサギ抗Smad2抗体:1000倍希釈、マウス抗Phospho−Smad2抗体:1000倍希釈、ウサギ抗Smad3抗体:1000倍希釈、ウサギ抗Phospho−Smad3抗体:1000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社)により解析した。
(ラパマイシンはTGF−β2により誘導されるSmad2/3のリン酸化活性を抑制しない)
図4に結果を示す。ラパマイシン存在下で、組み換えヒトTGF−β2により刺激した場合、Smad2及びSmad3のリン酸化活性が認められた。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりラパマイシンは組み換えヒトTGF−β2により誘導されるSmad2/3のリン酸化活性を抑制しないことが認められた。TGF−βの作用は、Smadのリン酸化経路によって伝達されるとされているため、ラパマイシンの細胞障害抑制作用は、TGF−βシグナルの阻害によるものでないことが明らかになった。これは、ラパマイシンが、TGF−βシグナルを直接阻害することなくTGF−βシグナルに起因する角膜内皮の障害等を抑制することを示唆しており、予想外の結果であった。
本実施例では、mTORインヒビターの代表例であるラパマイシンの、TGF−β2により誘導されるフィブロネクチンの産生に対する抑制効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800gで12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1%NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質5μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、マウス抗Fibronectin抗体(BD Bioscience、610077)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はマウス抗Fibronectin抗体:15000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社)により解析した。
(ラパマイシンはTGF−β2により誘導されるフィブロネクチンの産生を抑制する)
図5に結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトTGF−β2により刺激した場合、iFECDにおいてフィブロネクチンの産生が認められた。他方で、ラパマシン添加群においては、フィブロネクチンの産生はほとんど確認されなかった。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりラパマイシンは組み換えヒトTGF−β2により誘導されるフィブロネクチンの発現量を抑制することが認められた。mTORがフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの産生に関与していることは知られていなかったため、mTORインヒビターが、細胞外マトリックス産生を抑制することができることは予想外であった。
本実施例では、mTORインヒビターの別の代表例であるmTOR siRNAの、mTORの発現およびS6Kのリン酸化に対する抑制効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、RNeasy mini Kit(QIAGEN、M610A)のBuffer RLT Lysis bufferを350μl添加し、細胞を溶出した。その後、350μlの70%EtOHを添加し、RNeas mini spin column(QIAGEN)に移した後、10000rpmで15秒遠心し、Flow−throughを捨てた。さらに30μlのRNeasy free water(QIAGEN)をRNeasy mini spin columnに添加した後、10000rpmで1分遠心しtotal RNAを抽出した。
抽出したtotal RNA450ng、Rever Tra Ace(TOYOBO)、10mM dNTP Mixture(TOYOBO)、5×RT Buffer(TOYOBO)、ランダムプライマー(invitrogen)をそれぞれ添加し、T3000 Thermocycler(biometra)を用いて補助的DNAを合成した。反応条件は30℃で10分のアニーリング反応、42℃で60分の逆転写反応、99℃で5分の熱変性反応で行った。
合成した補助的DNA1μl、2×GO Taq GreenMaster Mix(Promega)を5μl、mTORのForwardカスタムプライマー(invitrogen)を1μl、Reverseカスタムプライマー(invitrogen)を1μl、H2Oを2μl混合し、T3000 Thermocycler(biometra)を用いて、補助的DNAの塩基配列を増幅させた。反応条件は94℃で2分の初期熱変性反応の後、95℃で30秒の熱変性反応、53℃で20秒のアニーリング反応、72℃で25秒伸長反応を26サイクル行い、さらに72℃で5分の伸長反応を行った。増幅の後、アガロースゲルを用いた電気泳動及びAmershamTM Imager 600(GEヘルスケア・ジャパン)でUV照射によって検出した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800g、12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1% NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質5μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、ウサギ抗mTOR抗体(Cell Signaling、2972)、ウサギ抗S6K抗体(Cell Signaling、9202)、ウサギ抗Phospho−S6K抗体(Cell Signaling、9204)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はウサギ抗mTOR抗体:1000倍希釈、ウサギ抗S6K抗体:1000倍希釈、ウサギ抗Phospho−S6K抗体:1000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社)により解析した。
(mTOR siRNAはmTORの発現およびS6Kのリン酸化を抑制する)
図6に結果を示す。iFECDにおいてmTORに対してRNAiを行った場合、RNAレベル及びタンパクレベルのどちらにおいてもmTORの発現抑制が認められた。また、mTOR siRNAにより、タンパクレベルにおいてS6Kのリン酸化が抑制されたことが認められた。したがって、PCR及びウェスタンブロットによる解析よりmTOR siRNAはmTORの発現およびS6Kのリン酸化を抑制したことが認められた。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
(mTOR siRNAはTGF−β2により誘導される細胞障害を抑制する)
図7に結果を示す。mTOR siRNAを使用せず、組み換えヒトTGF−β2によりiFECDを刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、mTOR siRNAを使用した場合、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。したがって、mTORの発現抑制がTGF−β2により誘導される細胞障害を抑制することが認められた。
本実施例では、mTORインヒビターの別の代表例であるmTOR siRNAの、TGF−β2により誘導されるカスパーゼの活性化に対する抑制効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800gで12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1% NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質6μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、ウサギ抗Caspase 3抗体(Cell Signaling、9662)、ウサギ抗PARP抗体(Cell Signaling、9542)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はウサギ抗Caspase 3抗体:1000倍希釈、ウサギ抗PARP抗体:2000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社)により解析した。
(mTOR siRNAはTGF−β2により誘導されるカスパーゼの活性化を抑制する)
図8に結果を示す。mTOR siRNAを使用せず、組み換えヒトTGF−β2により刺激した場合、iFECDにおいて活性型である約17kDaの切断カスパーゼ3が認められた。他方で、mTOR siRNA添加群においては、活性型の切断カスパーゼ3はほとんど確認されなかった。したがって、ウェスタンブロットによる解析より、mTORのシグナル抑制はTGF−β2により誘導されるカスパーゼの活性化を抑制することが示された。
本実施例では、mTORインヒビターの別の代表例であるmTOR siRNAの、TGF−β2により誘導されるフィブロネクチンの産生に対する抑制効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分間遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を1×PBS(−)で2回洗浄した溶液も回収し、4℃、800gで12分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液(RIPA;50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1% SDS、0.5% DOC、1% NP−40)を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI製)にて冷水中で30秒、3回粉砕後に、4℃、15000rpmで10分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
上記抽出したタンパク質7μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、マウス抗Fibronectin抗体(BDBioscience、610077)、マウス抗GAPDH抗体(MBL社、M171−3)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体(GE Healthcare Biosciences、NA931V,NA934V)を用いた。1次抗体はウサギ抗Caspase 3抗体:1000倍希釈、ウサギ抗PARP抗体:2000倍希釈、マウス抗GAPDH抗体:5000倍希釈し、2次抗体は5000倍希釈した。検出にはChemi Lumi ONE Ultra(ナカライテスク、11644−40)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS−4000mini(富士フィルム社)及びImageQuantTM software(GE Healthcare社)により解析した。
(mTOR siRNAは組み換えヒトTGF−β2により誘導されるフィブロネクチンの産生を抑制する)
図9に結果を示す。mTOR siRNAを使用せず、組み換えヒトTGF−β2により刺激した場合、iFECDにおいてフィブロネクチンの先生が認められた。他方で、mTOR siRNA添加群においては、フィブロネクチンの産生はほとんど確認されなかった。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりmTOR siRNAは組み換えヒトTGF−β2により誘導されるフィブロネクチンの発現を抑制することが認められた。
本実施例では、各種mTORインヒビターの、TGF−β2により誘導されるカスパーゼ活性に対する抑制効果を実証した。
iFECDを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に37℃に温めておいた1×PBS(−)を添加し、洗浄を行った。この作業を2回繰り返した。再び1×PBS(−)を添加し、37℃(5% CO2)で3分インキュベートした。PBS(−)除去後、0.05% Trypsin−EDTA(ナカライテスク、32778−34)を添加し、37℃(5% CO2)で5分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、1500rpmで3分遠心することで細胞を回収した。培地は、DMEM(ナカライテスク、08456−36)+10%FBS(Biowest、S1820−500)+1%P/S(ナカライテスク、26252−94)を使用した。
差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
・ラパマイシン(Wako、#53123−88−9)
・エベロリムス(Cayman Chemical、#11597)
・テムシロリムス(Tocris Bioscience、#5264)
・PI−103(Cayman Chemical、#10009209)
・CC−223(Cayman Chemical、#19917)
・INK128(Cayman Chemical、#11811)
・AZD8055(Cayman Chemical、#16978)
・KU 0063794(Tocris Bioscience、#3725)
(ラパマイシン)
結果を図10に示す。Caspase−Glo(登録商標) 3/7 Assayは、アポトーシス誘導に伴うカスパーゼ3/7の活性を測定することができる。カスパーゼ3/7の活性が高いほど、細胞障害が誘導されていることを表す。図10より、0.00001、0.0001、0.001、0.01nMのラパマイシンを添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ3/7の活性に有意な差は認められなかった。一方で0.1、1、10、100nMのラパマイシンを添加すると、コントロール群と比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。0.1nMという極めて低い濃度でもラパマイシンはカスパーゼ3/7活性を有意に抑制することが明らかになった。
結果を図11に示す。0.0001、0.001、0.01、0.1μMのエベロリムスを添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。0.0001μMという極めて低い濃度でもエベロリムスはカスパーゼ3/7活性を有意に抑制することが明らかになった。
結果を図12に示す。0.000001μMのテムシロリムスを添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ3/7の活性に有意な差は認められなかった。一方で0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μMのテムシロリムスを添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制されたことを認めた。0.00001μMという極めて低い濃度でもテムシロリムスはカスパーゼ3/7活性を有意に抑制することが明らかになった。
結果を図13に示す。1μMのPI−103を添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ3/7の活性に有意な差は認められなかった。一方で0.001、0.01、0.1μMのPI−103を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。
結果を図14に示す。0.001、0.01、0.1、1μMのCC−223を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。
結果を図15に示す。0.001、0.01、0.1、1μMのINK128を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。
結果を図16に示す。0.01、0.1、1μMのAZD8055を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。
結果を図17に示す。0.001、0.01μMのKU 0063794を添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ3/7の活性に有意な差は認められなかった。一方で0.1、1μMのKU 0063794を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ3/7の活性が抑制したことを認めた。
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィマウスモデル用いた評価系におけるmTORインヒビターのin vivoでの効果を実証した。
詳細には、本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィのモデルマウスである8型コラーゲンの変異を有するマウス(Col8a2 Q455K/Q455K)にmTORインヒビターの点眼を行ってin vivoでの効果を確認した。
フックス角膜内皮ジストロフィのモデルマウスであるAlpha2 Collagen VIII (Col8a2) Q455K ノックインマウス(Hum Mol Genet. 2012 Jan 15;21(2):384−93.)を用いて、in vivoでの評価が行った。このモデルマウスはヒトにおけるフックス角膜内皮ジストロフィに認められるのと同様にguttaeと呼ばれる細胞外マトリックス(コラーゲンやフィブロネクチンなど)の角膜内皮基底膜(デスメ膜)への沈着および角膜内皮障害による細胞密度減少を認めるため、フックス角膜内皮ジストロフィの良いモデルであるとされる。
mTORインヒビターの点眼剤として、トーリセル(登録商標)点滴静注液25mg(ファイザー株式会社)(テムシロリムス)を用いた。本製品と本製品に添付されている希釈用液を2:3の割合で混合し、9.7mM混合液92.78μlを作製した。さらに大塚生食注(大塚製薬株式会社)(生理食塩液)807.22μlで希釈し、1mM混合液900μlを1.5mlチューブに調製した。次に、作製した1mM混合液9μlと大塚生食注891μlを用いて10μM混合液900μlを調製した。調製後、1.5mlチューブをアルミホイルで覆い遮光状態にし、4℃冷蔵庫で保存した。
フックス角膜内皮ジストロフィ(FECD)のモデルマウスである8型コラーゲンの変異を有するマウス(Col8a2Q455K/Q455K)を用いた(Johns Hopkins Universityより入手した。)。点眼試験前の角膜内皮像から、FECDの重症度のグレーディングを行い、同程度の症状を持つ生後20〜24週齢のFECDモデルマウスを用いた。調製したmTORインヒビター点眼剤(1mM、10μM)を、マウス45匹に対し毎日朝夕の2回、左右の眼2μlずつ点眼した。コントロールには大塚生食注を用いた。点眼期間は3ヶ月とし、その間、実験担当者はmTORインヒビター点眼剤およびコントロール点眼剤(大塚生食注)についてブラインドの状態で実験を行った。
点眼試験開始前に、接触式角膜内皮スペキュラー(KSSP slit−scanning wide−field contact specular microscope(Konan medical Inc.,Hyogo,Japan))で角膜内皮像を観察し、グレーディングを行った。点眼試験開始後、4週間おきに接触式角膜内皮スペキュラーを用いてマウスの角膜内皮像を観察し、mTORインヒビター点眼剤の有効性を評価した。
mTORインヒビター点眼剤(1mM)を、毎日朝夕の2回、左右の眼に2μlずつ2ヶ月間点眼したFECDモデルマウスにおける接触式角膜内皮スペキュラーにより観察される角膜内皮細胞像の代表例を図19示す。コントロールとして、生理的食塩水を点眼したものを示す。コントロールと比べてmTORインヒビター点眼剤の点眼を行った個体では角膜内皮細胞の大きさが小さく、細胞密度が高い。さらに、接触式角膜内皮スペキュラーにより黒く観察されるグッテー(guttae)と呼ばれる細胞外マトリックスの疣状の沈着像の発生が抑えられた(図19)。
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に(具体例としては、1)細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、2)スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、3)ペンタカム、OCT、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、4)遺伝子診断により高リスクと判断された場合)使用する。本発明の組成物を、点眼薬、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射として用いて治療することができる。
本実施例では、製剤例として、mTORインヒビターを含有する点眼剤を以下のように製造する。
塩化ナトリウム 0.85g
リン酸二水素ナトリウム二水和物 0.1g
(任意に)ベンザルコニウム塩化物 0.005g
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量100mL(pH7.0)
濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。
リン酸二水素ナトリウム二水和物 0.1g
(任意に)ベンザルコニウム塩化物 0.005g
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量100mL(pH7.0)
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィのモデルマウスである8型コラーゲンの変異を有するマウス(Col8a2 Q455K/Q455K)にmTORインヒビターの点眼を行った。このモデルマウスは、フックス角膜内皮ジストロフィに認められる細胞外マトリクス(コラーゲンやフィブロネクチンなど)の沈着を呈する。
(材料および方法)
配列番号2:mTOR siRNAのアンチセンス鎖
Claims (13)
- mTORインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための組成物であって、該症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィである、組成物。
- 前記眼の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス(ECM)の過剰発現に起因するものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、PI−103、CC−223、INK128、AZD8055、KU 0063794、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、NVP−BEZ235、CZ415、トルキニブ、トリン1、オミパリシブ、OSI−027、PF−04691502、アピトリシブ、WYE−354、ビスツセルチブ、トリン2、タクロリムス、GSK1059615、ゲダトリシブ、WYE−125132、BGT226、パロミド529、PP121、WYE−687、CH5132799、WAY−600、ETP−46464、GDC−0349、XL388、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、mTOR遺伝子に対するsiRNA、アンチセンス核酸またはリボザイムである、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、mTOR遺伝子に対するsiRNAであり、該siRNAは、配列番号1に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号2に示される核酸配列、または1〜3塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および/または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項1、2または4に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が点眼剤である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1nMで前記組成物中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約0.1mMで該点眼剤中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01nMで前記組成物中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約0.01mMで該点眼剤中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1nMで前記組成物中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が点眼剤であり、前記mTORインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約0.1mMで該点眼剤中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
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