KR20200016384A - mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 및 그 응용 - Google Patents

mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 및 그 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약 및 방법을 제공한다. 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 어느 하나의 실시형태에서는 본 발명의 조성물은 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방할 수 있고, 특히 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β) 시그널 및/또는 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 기인하는 것이다.

Description

mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 및 그 응용
본 발명은 mTOR(mechanistic target of rapamycin mammalian target of rapamycin이라고도 불림) 인히비터(inhibitor, 저해제)를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 및 그 응용에 관한 것이다.
시각 정보는 안구의 최전면의 투명한 조직인 각막으로부터 도입된 광이 망막에 도달하여 망막의 신경세포를 흥분시켜 발생한 전기 신호가 시신경을 경유하여 대뇌의 시각야에 전달함으로써 인식된다. 양호한 시력을 얻기 위해서는 각막이 투명한 것이 필요하다. 각막의 투명성은 각막 내피 세포의 펌프 기능과 배리어 기능에 의해 함수율이 일정하게 유지됨으로써 유지된다.
인간의 각막 내피 세포는 출생시에는 1평방 밀리미터당 약 3000개의 밀도로 존재하지만, 한 번 장해를 받으면 재생하는 능력은 매우 한정적이다. 푹스 각막 내피 디스트로피는 각막 내측의 내피 세포가 이상을 초래하여 각막 내피 세포의 밀도가 현저하게 감소하고, 그 결과 각막의 부종을 일으키거나 하는 질환으로 그 원인은 불명하다. 또한, 푹스 각막 내피 디스트로피에서는 콜라겐, 피브로넥틴 등의 세포외 매트릭스가 각막의 후부에 있는 데스메막의 후면의 일부분에 침착되어 구테(Corneal guttae) 및 데스메막의 비후를 발생시킨다. 구테(Corneal guttae) 및 데스메막의 비후는 푹스 각막 내피 디스트로피 환자에서의 눈부심, 안개낌의 원인으로 환자의 QOL을 현저하게 손상시킨다. 이와 같이 피브로넥틴 등의 세포외 매트릭스는 또한, 각막 내피면의 우췌(guttata)나 데스메막의 혼탁 구테 등의 시력 저하의 원인이 되는 증상에 관련되어 있고, 흐림, 각막 혼탁이나 백반 등의 각막의 탁함에 관련되는 각막 내피 장해의 주요 원인이 될 수 있다. 푹스 각막 내피 디스트로피는 각막 이식 이외에 유효한 치료법은 없다고 하는데, 일본에서의 각막 제공은 부족하고, 각막 이식의 대기 환자 약 2600명에 대해 연간 일본에서 행해지고 있는 각막 이식 건수는 1700건 정도이다.
비특허문헌 1: Zaniolo K, et al. Exp Eye Res.; 94(1): 22-31. 2012 비특허문헌 2: Azizi B, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2; 52(13): 9291-9297. 2011 비특허문헌 3: Kelliher C. et al. Exp Eye Res Vol.93(6), 880-888, 2011
푹스 각막 내피 디스트로피에 대해서는 푹스 각막 환자 유래의 각막 내피 세포의 배양(비특허문헌 1 및 3)이나 불사화의 보고(비특허문헌 2)가 있지만, 세포외 매트릭스의 과잉 생산을 수반하는 등의 질환의 특징을 유지한, 치료약, 진행 예방약의 스크리닝에 적절한 세포의 보고는 없기 때문에 그 치료약의 개발에는 한계가 있고, 현재로서는 임상으로 사용되고 있는 치료약은 존재하지 않아 각막 이식에 의지하지 않을 수 없다.
본 발명자들은 mTOR을 저해함으로써 눈, 특히 각막 내피 세포의 세포사(아포토시스)가 억제되어 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피 장해(특히, 푹스 각막 내피 디스트로피의 각막 내피 장해) 등의 안과 질환의 치료 또는 예방에 사용하는 것에 응용하는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 mTOR을 저해함으로써 예상외로 피브로넥틴 등의 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현을 억제할 수 있는 것을 발견하였다. 이에 의해 본 발명자들은 mTOR 인히비터를 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피 장해(예를 들어 구테, 데스메층의 비후, 각막 혼탁, 백반 등의 탁함 증상 등)의 개선, 치료 또는 예방에도 응용 가능한 것을 발견하였다. 세포사와 세포외 매트릭스는 독립된 사상(事象)이기 때문에 둘 다를 억제할 수 있는 것은 바람직하다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 이하의 항목을 제공한다.
(항목 1)
mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
(항목 2)
상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인, 항목 1에 기재된 조성물.
(항목 3)
상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인, 항목 1 또는 2에 기재된 조성물.
(항목 4)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술, 안과 레이저 수술 후의 장해, 가령, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메가로바이러스 각막 내피염으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1~3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 5)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 기인하는 것인, 항목 1~4 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 6)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 구테의 형성, 데스메막의 비후, 각막 두께의 비후, 혼탁, 반흔, 각막 편운, 각막반, 각막 백반, 눈부심 및 안개낌으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 5에 기재된 조성물.
(항목 7)
상기 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피를 포함하는, 항목 1~6 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 8)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스, 에베로리무스, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, 복스탈리시브, 리다포로리무스, NVP-BEZ235, CZ415, 토르키니브, 토린 1, 오미팔리시브, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리시브, WYE-354, 비스투서티브, 토린 2, 타크롤리무스, GSK1059615, 게다톨리시브, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스 및 크리소판산으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1~7 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 9)
상기 mTOR 인히비터가 mTOR 유전자의 발현 억제 물질인, 항목 1~7 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 10)
상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA, 안티센스 핵산 또는 리보자임인, 항목 9에 기재된 조성물.
(항목 11)
상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA이며, 이 siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 센스쇄와, 서열 번호 2에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 안티센스쇄를 포함하는, 항목 9 또는 10에 기재된 조성물.
(항목 12)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 13)
상기 조성물이 점안제인, 항목 1~12 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 14)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1nM로 상기 조성물 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 15)
상기 조성물이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 16)
상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01nM로 상기 조성물 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 17)
상기 조성물이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 18)
상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1nM로 상기 조성물 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 19)
상기 조성물이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
(항목 1A)
피험체 중의 눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 이 방법은 mTOR 인히비터의 유효량을 상기 피험체에 투여하는 공정을 포함하는 방법.
(항목 2A)
상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인, 항목 1A에 기재된 방법.
(항목 3A)
상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인, 항목 1A 또는 2A에 기재된 방법.
(항목 4A)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술, 안과 레이저 수술 후의 장해, 가령, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메가로바이러스 각막 내피염으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1A~3A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 5A)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 기인하는 것인, 항목 1A~4A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 6A)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 구테의 형성, 데스메막의 비후, 각막 두께의 비후, 혼탁, 반흔, 각막 편운, 각막반, 각막 백반, 눈부심 및 안개낌으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 5A에 기재된 방법.
(항목 7A)
상기 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피를 포함하는, 항목 1A~6A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 8A)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스, 에베로리무스, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, 복스탈리시브, 리다포로리무스, NVP-BEZ235, CZ415, 토르키니브, 토린 1, 오미팔리시브, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리시브, WYE-354, 비스투서티브, 토린 2, 타크롤리무스, GSK1059615, 게다톨리시브, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스 및 크리소판산으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1A~7A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 9A)
상기 mTOR 인히비터가 mTOR 유전자의 발현 억제 물질인, 항목 1A~7A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 10A)
상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA, 안티센스 핵산 또는 리보자임인, 항목 9A에 기재된 방법.
(항목 11A)
상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA이며, 이 siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 센스쇄와, 서열 번호 2에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 안티센스쇄를 포함하는, 항목 9A 또는 10A에 기재된 방법.
(항목 12A)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 13A)
상기 mTOR 인히비터가 점안제로서 투여되는, 항목 1A~12A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 14A)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1nM의 농도로 투여되는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 15A)
상기 mTOR 인히비터가 점안제로서 투여되고, 상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 16A)
상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01nM의 농도로 투여되는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 17A)
상기 mTOR 인히비터가 점안제로서 투여되고, 상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 18A)
상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1nM의 농도로 투여되는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 19A)
상기 mTOR 인히비터가 점안제로서 투여되고, 상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1A~8A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 20A)
상기 mTOR 인히비터가 국소 투여되는, 항목 1A~19A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 21A)
상기 mTOR 인히비터가 눈에 국소 투여되는, 항목 1A~20A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 22A)
상기 mTOR 인히비터가 각막에 접촉하도록 투여되는, 항목 1A~21A 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(항목 1B)
눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 mTOR 인히비터의 사용.
(항목 2B)
상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인, 항목 1B에 기재된 사용.
(항목 3B)
상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인, 항목 1B 또는 2B에 기재된 사용.
(항목 4B)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술, 안과 레이저 수술 후의 장해, 가령, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메가로바이러스 각막 내피염으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1B~3B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 5B)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 기인하는 것인, 항목 1B~4B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 6B)
상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 구테의 형성, 데스메막의 비후, 각막 두께의 비후, 혼탁, 반흔, 각막 편운, 각막반, 각막 백반, 눈부심 및 안개낌으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 5B에 기재된 사용.
(항목 7B)
상기 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피를 포함하는, 항목 1B~6B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 8B)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스, 에베로리무스, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, 복스탈리시브, 리다포로리무스, NVP-BEZ235, CZ415, 토르키니브, 토린 1, 오미팔리시브, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리시브, WYE-354, 비스투서티브, 토린 2, 타크롤리무스, GSK1059615, 게다톨리시브, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스 및 크리소판산으로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1B~7B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 9B)
상기 mTOR 인히비터가 mTOR 유전자의 발현 억제 물질인, 항목 1B~7B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 10B)
상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA, 안티센스 핵산 또는 리보자임인, 항목 9B에 기재된 사용.
(항목 11B)
상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA이며, 이 siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 센스쇄와, 서열 번호 2에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 안티센스쇄를 포함하는, 항목 9B 또는 10B에 기재된 사용.
(항목 12B)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스로 이루어지는 군에서 선택되는, 항목 1B~8B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 13B)
상기 의약이 점안제인, 항목 1B~12B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 14B)
상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1nM로 상기 의약 중에 존재하는, 항목 1~8 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 15B)
상기 의약이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1B~8B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 16B)
상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01nM로 상기 의약 중에 존재하는, 항목 1B~8B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 17B)
상기 의약이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1B~8B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 18B)
상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1nM로 상기 의약 중에 존재하는, 항목 1B~8B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 19B)
상기 의약이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는, 항목 1B~8B 중 어느 한 항에 기재된 사용.
(항목 1C)
눈의 증상, 장해 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 mTOR 인히비터.
(항목 2C)
상기 항목 중 하나 또는 복수의 특징을 포함하는, 항목 1C에 기재된 mTOR 인히비터.
(항목 1D)
mTOR 인히비터를 포함하는 각막 내피 세포를 저장하기 위한 조성물.
(항목 2D)
상기 항목 중 하나 또는 복수의 특징을 포함하는, 항목 1D에 기재된 조성물.
(항목 1E)
mTOR 인히비터의 유효량을 각막 내피 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 각막 내피 세포를 보존하기 위한 방법.
(항목 2E)
상기 항목 중 하나 또는 복수의 특징을 포함하는, 항목 1E에 기재된 방법.
(항목 1F)
mTOR 인히비터의 유효량을 각막 내피 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 각막 내피 세포를 증식 또는 각막 내피 세포의 증식을 촉진하기 위한 방법.
(항목 2F)
상기 항목 중 하나 또는 복수의 특징을 포함하는, 항목 1E에 기재된 방법.
본 발명에 있어서, 상기 하나 또는 복수의 특징은 명시된 조합에 더하여 추가로 조합하여 제공될 수 있는 것이 의도된다. 본 발명의 추가적인 실시형태 및 이점은 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽고 이해하면 당업자에게 인식된다.
본 발명은 mTOR 인히비터가 예상외로 푹스 각막 내피 디스트로피 등에서의 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 장해 또는 질환에 기인하는 질환을 처치 또는 예방할 수 있는 것을 발견하여 이러한 질환을 포함하는 눈의 증상, 장해 또는 질환의 처치 또는 예방을 이룰 수 있는 의약을 제공할 수 있다. 또한, 구테 또는 데스메층의 비후, 각막 혼탁, 백반 등의 탁함 증상 등의 세포외 매트릭스(예를 들어 피브로넥틴)의 과잉 생산에 기인하는 각막 내피 세포 장해에 기인하는 질환을 처치 또는 예방할 수 있는 의약도 제공한다. 나아가 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는 각막 내피 세포의 저장을 위한 조성물 또는 각막 내피 세포의 증식을 촉진하기 위한 조성물과 각막 내피 세포를 저장 및/또는 증식하거나 혹은 증식을 촉진하는 방법을 제공한다.
도 1은 iFECD의 현미경 화상을 나타낸다. 좌상이 TGF-β2를 첨가하지 않은 컨트롤군(대조군), 우상이 TGF-β2를 첨가한 군, 좌하가 TGF-β2 및 라파마이신을 첨가한 군, 우하가 TGF-β2 및 카스파제 저해제인 Z-VD-FMK를 첨가한 군을 나타낸다.
도 2는 전체길이 카스파제 3(total caspase 3), 절단형 카스파제 3(cleaved caspase 3), PARP 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2를 첨가하지 않은 컨트롤군, TGF-β2를 첨가한 군, TGF-β2 및 라파마이신을 첨가한 군, TGF-β2 및 카스파제 저해제인 Z-VD-FMK를 첨가한 군을 나타낸다.
도 3은 Akt, p-Akt, S6K, p-S6K 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2를 첨가하지 않은 컨트롤군, TGF-β2를 첨가한 군, TGF-β2 및 라파마이신을 첨가한 군, TGF-β2 및 카스파제 저해제인 Z-VD-FMK를 첨가한 군을 나타낸다.
도 4는 Smad2, p-Smad2, Smad3, p-Smad3 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2를 첨가하지 않은 컨트롤군, TGF-β2를 첨가한 군, TGF-β2 및 라파마이신을 첨가한 군, TGF-β2 및 카스파제 저해제인 Z-VD-FMK를 첨가한 군을 나타낸다.
도 5는 피브로넥틴 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다(n=3). 좌측부터 TGF-β2를 첨가하지 않은 컨트롤군, TGF-β2를 첨가한 군, TGF-β2 및 라파마이신을 첨가한 군, TGF-β2 및 카스파제 저해제인 Z-VD-FMK를 첨가한 군을 나타낸다.
도 6은 아가로스 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 위 패널이 mTOR 및 GAPDH의 아가로스 겔 전기영동의 결과를 나타내고, 아래 패널이 mTOR, S6K, p-S6K 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 각 패널의 좌측부터 Random siRNA 첨가군, TGF-β2+Random siRNA 첨가군, mTOR siRNA 첨가군, TGF-β2+mTOR siRNA 첨가군을 나타낸다.
도 7은 iFECD의 현미경 화상을 나타낸다. 좌상이 Random siRNA 첨가군, 우상이 mTOR siRNA 첨가군, 좌하가 TGF-β2+Random siRNA 첨가군, 우하가 TGF-β2+mTOR siRNA 첨가군을 나타낸다.
도 8은 전체길이 카스파제 3(total caspase 3), 절단형 카스파제 3(cleaved caspase 3), PARP 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 좌측부터 Random siRNA 첨가군, TGF-β2+Random siRNA 첨가군, mTOR siRNA 첨가군, TGF-β2+mTOR siRNA 첨가군을 나타낸다.
도 9는 피브로넥틴 및 GAPDH의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 좌측부터 Random siRNA 첨가군, TGF-β2+Random siRNA 첨가군, mTOR siRNA 첨가군, TGF-β2+mTOR siRNA 첨가군을 나타낸다.
도 10은 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+라파마이신(0.00001nM, 0.0001nM, 0.001nM, 0.01nM, 0.1nM, 1nM, 10nM, 100nM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 11은 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+에베로리무스(0.0001μM, 0.001μM, 0.01μM, 0.1μM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 12는 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+템시로리무스(0.000001μM, 0.00001μM, 0.0001μM, 0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1μM, 10μM), TGF-β2+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 13은 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+PI-103(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1μM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 14는 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+CC-223(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1μM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 15는 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+INK128(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1μM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 16은 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+AZD8055(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1μM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 17은 카스파제 3/7 활성의 그래프를 나타낸다. 좌측부터 TGF-β2 비첨가군, 컨트롤군, TGF-β2(10ng/ml)+KU 0063794(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM, 1μM), TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)를 나타낸다. 통계학적 유의는 Dunnett-t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타냄. n=5).
도 18은 시력과 각막 내피 세포 및 ECM 침착의 관계의 개략도를 나타낸다. 각막 내피 세포 및 ECM 침착이 증가함에 따라 시력이 저하되는 것이 나타난다. ECM 침착에 의한 구테 또는 데스메층의 비후는 푹스 각막 내피 디스트로피 환자에 있어서 일반적으로는 30대부터 40대에 발생하기 시작하여 평생 진행된다. 진행에 의해 안개낌, 후광(halo), 글레어, 시력 저하 등의 시력 장해를 일으킨다. 또한, 동시에 각막 내피 세포사가 진행되는데 각막 내피 세포 밀도가 약 1000개/㎟를 밑돌기까지는 펌프 기능이 남겨진 각막 내피가 대상(代償)함으로써 각막의 투명성은 유지된다. 한편, 약 1000개/㎟를 밑돌면 각막에 전방수가 진입됨으로써 각막 부종을 초래하여 위중한 시력 장해를 일으킨다. 본 기술은 ECM 침착 및 각막 내피 세포사를 둘 다 억제함으로써 시기능을 유지할 수 있는 것이다.
도 19는 mTOR 인히비터 점안제(1mM)를 매일 아침 저녁 2회 좌우의 눈에 2μl씩 2개월간 점안한 FECD 모델 마우스에서의 접촉식 각막 내피 스페큘러에 의해 관찰되는 각막 내피 세포상의 대표예를 나타낸다. 컨트롤로서 생리적 식염수(베이스제, 基劑)를 점안한 것을 나타낸다.
도 20은 mTOR 인히비터 점안제가 점안된 FECD 모델 마우스에서의 각막 내피 세포 밀도(개/㎟)의 그래프를 나타낸다. 컨트롤로서 생리적 식염수(베이스제)를 점안한 것을 나타낸다. 통계학적 유의는 Student's t 검정에 의해 행하였다(*는 p<0.05를 나타냄. n=3).
도 21은 mTOR 인히비터 점안제가 점안된 FECD 모델 마우스에서의 구테의 면적(%)의 그래프를 나타낸다. 컨트롤로서 생리적 식염수(베이스제)를 점안한 것을 나타낸다. 통계학적 유의는 Student's t 검정에 의해 행하였다(**는 p<0.01을 나타냄. n=3).
이하, 본 발명을 설명한다. 본 명세서의 전체에 걸쳐 단수형의 표현은 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 단수형의 관사(예를 들어 영어의 경우는 「a」, 「an」, 「the」 등)는 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 특별히 언급하지 않는 한 해당 분야에서 통상 이용되는 의미로 이용되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 그 밖에 정의되지 않는 한 본 명세서 중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 모순되는 경우 본 명세서(정의를 포함하여)가 우선된다.
(정의)
본 명세서에서 수치 앞의 「약」이란 뒤에 이어지는 수치의 ±10%를 의미한다.
본 명세서에서 「mTOR 인히비터」란 mTOR의 시그널 전달을 저해하는 임의의 약제를 말한다. mTOR 인히비터는 수용성의 것이 바람직하다. 수용성이 아니면 용매로서 신체에 적합하기 어려운 것을 사용하는 것이 필요해질 수 있기 때문이다. 수용성인지 어떤지에 대해서는 약국방의 용해도의 정의에 기초하여 분류될 수 있다. 즉, 용질 1g 또는 1mL를 녹이는 데에 필요로 하는 용매량으로서 매우 녹기 쉬움: 1mL 미만; 녹기 쉬움: 1mL 이상 10mL 미만; 약간 녹기 쉬움: 10mL 이상 30mL 미만; 약간 녹기 어려움: 30mL 이상 100mL 미만; 녹기 어려움: 100mL 이상 1000mL 미만; 매우 녹기 어려움: 1000mL 이상 10000mL 미만; 거의 녹지 않음: 10000mL 이상으로 정의되어 있고, 본 명세서에서도 똑같이 평가한다. 수용성이란 물을 용매로 하였을 때에 이들 중 유효량을 용해시키는 것이면 임의의 용해성의 것을 이용할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 수용성의 성분이면 점안제로서도 유리하게 사용된다.
mTOR(mammalian target of rapamycin)은 라파마이신의 표적 분자로서 동정(同定)된 세린·트레오닌 키나아제로, 세포의 분열이나 생존 등의 조절에 중심적인 역할을 한다고 생각되며, SKS; FRAP; FRAP1; FRAP2; RAFT1; RAPT1로서도 알려져 NCBI의 GeneID로서 2475가 부여되어 있으며, 이 정보를 기초로 당업자는 여러 가지 mTOR 인히비터를 설계하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 mTOR 인히비터는 mTOR 저해 활성을 갖는 화합물이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 라파마이신, 템시로리무스, 에베로리무스, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, 복스탈리시브(Voxtalisib(XL765, SAR245409)), 리다포로리무스(Ridaforolimus(Deforolimus, MK-8669)), NVP-BEZ235, CZ415, Torkinib(PP242), 토린 1(Torin 1), 오미팔리시브(Omipalisib(GSK2126458, GSK458)), OSI-027, PF-04691502, 아피톨리시브(Apitolisib(GDC-0980, RG7422)), WYE-354, 비스투서티브(Vistusertib(AZD2014)), 토린 2(Torin 2), 타크롤리무스(Tacrolimus(FK506)), GSK1059615, 게다톨리시브(Gedatolisib(PF-05212384, PKI-587)), WYE-125132(WYE-132), BGT226(NVP-BGT226), 팔로미드 529(Palomid 529(P529)), PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스(Zotarolimus(ABT-578)), 크리소판산(Chrysophanic Acid)을 들 수 있다.
바람직한 mTOR 인히비터로서는 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 이들 의약품은 FDA나 PMDA 등에서 승인되어 있어 안전성이나 독성의 면에서 문제가 최소화되어 있기 때문이다. 더욱 바람직한 mTOR 인히비터는 라파마이신이다. 다른 바람직한 mTOR 인히비터는 템시로리무스이다. 다른 바람직한 mTOR 인히비터는 에베로리무스이지만 이들에 한정되지 않는다.
그 밖의 본 발명에서 이용할 수 있는 mTOR 인히비터로서는 예를 들어 mTOR에 대한 중화 항체, mTOR의 활성을 저해하는 화합물, mTOR을 코드하는 유전자의 전사를 저해하는 화합물(예를 들어 안티센스 핵산, siRNA, 리보자임), 펩티드, 식물 성분, 한방 등의 고전적 의약의 성분 등의 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 안티센스 핵산은 상기 어떤 작용에 의해 mTOR의 시그널 전달 경로의 멤버 등을 코드하는 유전자(핵산)의 발현 및/또는 기능을 저해해도 된다. 하나의 실시형태로서는 상술한 mTOR을 코드하는 유전자의 mRNA의 5'단 근방의 비번역 영역에 상보적인 안티센스 서열을 설계하면 유전자의 번역 저해에 효과적이라고 생각된다. 또한, 코드 영역 혹은 3'의 비번역 영역에 상보적인 서열도 사용할 수 있다. 이와 같이 상술한 mTOR 등을 코드하는 유전자의 번역 영역뿐만 아니라 비번역 영역의 서열의 안티센스 서열을 포함하는 핵산도 본 발명에서 이용되는 안티센스 핵산에 포함된다. 사용되는 안티센스 핵산은 적당한 프로모터의 하류에 연결되고, 바람직하게는 3'측에 전사 종결 시그널을 포함하는 서열이 연결된다. 이와 같이 하여 조제된 핵산은 공지의 방법을 이용함으로써 원하는 동물(세포)로 형질 전환할 수 있다. 안티센스 핵산의 서열은 형질 전환되는 동물(세포)이 갖는 mTOR을 코드하는 유전자 또는 그 일부와 상보적인 서열인 것이 바람직하지만, 유전자의 발현을 유효하게 억제할 수 있는 한에서 완전히 상보적이지 않아도 된다. 전사된 RNA는 표적 유전자의 전사 산물에 대해 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상보성을 가진다. 안티센스 핵산을 이용하여 표적 유전자의 발현을 효과적으로 저해하는 데는 안티센스 핵산의 길이는 적어도 12염기 이상 25염기 미만인 것이 바람직하지만, 본 발명의 안티센스 핵산은 반드시 이 길이에 한정되지 않고, 예를 들어 11염기 이하, 100염기 이상 또는 500염기 이상이어도 된다. 안티센스 핵산은 DNA만으로 구성되어 있어도 되지만, DNA 이외의 핵산, 예를 들어 잠금(locked) 핵산(LNA)을 포함하고 있어도 된다. 하나의 실시형태로서는 본 발명에서 이용되는 안티센스 핵산은 5' 말단에 LNA, 3' 말단에 LNA를 포함하는 LNA 함유 안티센스 핵산이어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서 안티센스 핵산을 이용하는 실시형태에서는 예를 들어 히라시마 및 이노우에, 신생 화학 실험 강좌 2 핵산 IV 유전자의 복제와 발현, 일본 생화학회편, 도쿄 화학 동인, 1993, 319-347.에 기재되는 방법을 이용하여 mTOR의 핵산 서열에 기초하여 안티센스 서열을 설계할 수 있다.
mTOR의 발현 저해는 리보자임 또는 리보자임을 코드하는 DNA를 이용하여 행하는 것도 가능하다. 리보자임이란 촉매 활성을 갖는 RNA 분자를 가리킨다. 리보자임에는 여러 가지 활성을 갖는 것이 존재하지만, 그 중에서도 RNA를 절단하는 효소로서의 리보자임에 초점을 맞춘 연구에 의해 RNA를 부위 특이적으로 절단하는 리보자임의 설계가 가능해졌다. 리보자임에는 그룹 I 인트론형이나 RNase P에 포함되는 M1 RNA와 같이 400뉴클레오티드 이상의 크기의 것도 있지만, 해머헤드형이나 헤어핀형이라고 불리는 40뉴클레오티드 정도의 활성 도메인을 갖는 것도 있다(코이즈미 마코토 및 오츠카 에이코, 단백질 핵산 효소, 1990, 35, 2191.).
예를 들어 해머헤드형 리보자임의 자기 절단 도메인은 G13U14C15라는 서열의 C15의 3'측을 절단하는데, 그 활성에는 U14와 A9의 염기쌍 형성이 중요하게 되며, C15 대신에 A15 또는 U15로도 절단될 수 있는 것이 나타나 있다(Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.). 기질 결합 부위가 표적 부위 근방의 RNA 서열과 상보적인 리보자임을 설계하면 표적 RNA 중의 UC, UU 또는 UA라는 서열을 인식하는 제한 효소적인 RNA 절단 리보자임을 작출할 수 있다(Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285., 코이즈미 마코토 및 오츠카 에이코, 단백질 핵산 효소, 1990, 35, 2191., Koizumi, M. et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 7059.).
또한, 헤어핀형 리보자임도 본 발명의 목적에 유용하다. 이 리보자임은 예를 들어 담배 링 스폿 바이러스의 새틀라이트 RNA의 마이너스쇄에 발견된다(Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). 헤어핀형 리보자임에서도 표적 특이적인 RNA 절단 리보자임을 작출할 수 있는 것이 나타나 있다(Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl. Acids Res, 1991, 19, 6751., 기쿠치 요우, 화학과 생물, 1992, 30, 112.). 이와 같이 리보자임을 이용하여 mTOR 등을 코드하는 유전자의 전사 산물을 특이적으로 절단함으로써 이 유전자의 발현을 저해할 수 있다.
mTOR의 내재성 유전자의 발현 억제는 나아가 표적 유전자 서열과 동일 혹은 유사한 서열을 갖는 2본쇄 RNA를 이용한 RNA 간섭(RNA interference, 이하 「RNAi」라고 약칭함)에 의해서도 행할 수 있다. RNAi는 2본쇄 RNA(dsRNA)가 직접 세포 내에 도입되면 이 dsRNA와 상동인 서열을 갖는 유전자의 발현이 억제되어 현재 주목을 받고 있는 수법이다. 포유류 세포에서는 단쇄 dsRNA(siRNA)를 이용함으로써 RNAi를 유도하는 것이 가능하고, RNAi는 녹아웃 마우스와 비교하여 효과가 안정, 실험이 용이, 비용이 저가인 등 많은 이점을 가지고 있다. siRNA에 대해서는 본 명세서에 있어서 다른 개소에서 상술된다.
본 명세서에서 「siRNA」란 15~40염기로 이루어지는 2본쇄 RNA 부분을 갖는 RNA 분자로서, 상기 siRNA의 안티센스쇄와 상보적인 서열을 갖는 표적 유전자의 mRNA를 절단하여 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능을 가진다. 상세하게는 본 발명에서의 siRNA는 mTOR의 mRNA 중의 연속된 RNA 서열과 상동인 서열로 이루어지는 센스 RNA쇄와, 이 센스 RNA 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 안티센스 RNA쇄로 이루어지는 2본쇄 RNA 부분을 포함하는 RNA이다. 이러한 siRNA 및 후술하는 변이체 siRNA의 설계 및 제조는 당업자의 기량의 범위 내이다. mTOR의 서열의 전사 산물인 mRNA의 임의의 연속되는 RNA 영역을 선택하고, 이 영역에 대응하는 2본쇄 RNA를 제작하는 것은 당업자에게 있어서는 통상적인 시행의 범위 내에서 적절히 행할 수 있는 것이다. 또한, 이 서열의 전사 산물인 mRNA 서열에서 보다 강한 RNAi 효과를 갖는 siRNA 서열을 선택하는 것도 당업자에게 있어서는 공지의 방법에 의해 적절히 실시하는 것이 가능하다. 또한, 한쪽의 쇄가 판명되어 있으면 당업자에게 있어서는 용이하게 다른 쪽의 쇄(상보쇄)의 염기 서열을 알 수 있다. siRNA는 당업자에게 있어서는 시판의 핵산 합성기를 이용하여 적절히 제작하는 것이 가능하다. 또한, 원하는 RNA의 합성에 대해서는 일반적인 합성 수탁 서비스를 이용할 수 있다.
2본쇄 RNA 부분의 길이는 염기로서 15~40염기, 바람직하게는 15~30염기, 보다 바람직하게는 15~25염기, 더욱 바람직하게는 18~23염기, 가장 바람직하게는 19~21염기이다. 이들의 상한 및 하한은 이들 특정의 것에 한정되지 않고, 이들 열거되어 있는 것의 임의의 조합이어도 되는 것으로 이해된다. siRNA의 센스쇄 또는 안티센스쇄의 말단 구조로서는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 평활 말단을 갖는 것이어도 되고, 돌출 말단(오버행)을 갖는 것이어도 되며, 3'단이 돌출된 타입이 바람직하다. 센스 RNA쇄 및 안티센스 RNA쇄의 3'말단에 수개의 염기, 바람직하게는 1~3개의 염기, 더욱 바람직하게는 2개의 염기로 이루어지는 오버행을 갖는 siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제하는 효과가 큰 경우가 많아 바람직한 것이다. 오버행의 염기의 종류는 특별히 제한은 없고, RNA를 구성하는 염기 혹은 DNA를 구성하는 염기 중 어느 것이어도 된다. 바람직한 오버행 서열로서는 3'말단에 dTdT(데옥시 T를 2bp) 등을 들 수 있다. 예를 들어 바람직한 siRNA로서는 모든 siRNA의 센스·안티센스쇄의 3'말단에 dTdT(데옥시 T를 2bp)를 붙이고 있는 것을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
나아가 상기 siRNA의 센스쇄 또는 안티센스쇄 중 한쪽 또는 양쪽에서 1~수개까지의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 siRNA도 이용할 수 있다. 여기서, 1~수염기란 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 1~4염기, 더욱 바람직하게는 1~3염기, 가장 바람직하게는 1~2염기이다. 이러한 변이의 구체예로서는 3'오버행 부분의 염기수를 0~3개로 한 것, 3'-오버행 부분의 염기 서열을 다른 염기 서열로 변경한 것, 혹은 염기의 삽입, 부가 또는 결실에 의해 상기 센스 RNA쇄와 안티센스 RNA쇄의 길이가 1~3염기 다른 것, 센스쇄 및/또는 안티센스쇄에서 염기가 다른 염기로 치환되어 있는 것 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 단, 이들 변이체 siRNA에서 센스쇄와 안티센스쇄가 하이브리다이제이션할 수 있는 것 및 이들 변이체 siRNA가 변이를 가지지 않는 siRNA와 동등한 유전자 발현 억제능을 갖는 것이 필요하다.
나아가 siRNA는 한쪽의 단이 닫힌 구조의 분자, 예를 들어 헤어핀 구조를 갖는 siRNA(Short Hairpin RNA; shRNA)이어도 된다. shRNA는 표적 유전자의 특정 서열의 센스쇄 RNA, 이 센스쇄 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 안티센스쇄 RNA 및 그 두 쇄를 연결하는 링커 서열을 포함하는 RNA이며, 센스쇄 부분과 안티센스쇄 부분이 하이브리다이즈하여 2본쇄 RNA 부분을 형성한다.
siRNA는 임상 사용시에는 이른바 off-target 효과를 나타내지 않는 것이 바람직하다. off-target 효과란 표적 유전자 이외에 사용한 siRNA에 부분적으로 호몰로지가 있는 다른 유전자의 발현을 억제하는 작용을 말한다. off-target 효과를 피하기 위하여 후보 siRNA에 대해 미리 DNA 마이크로어레이 등을 이용하여 교차 반응이 없음을 확인하는 것이 가능하다. 또한, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 등이 제공하는 공지의 데이터베이스를 이용하여 표적이 되는 유전자 이외에 후보 siRNA의 서열과 상동성이 높은 부분을 포함하는 유전자가 존재하지 않는지를 확인함으로써 off-target 효과를 피하는 것이 가능하다.
본 발명의 siRNA를 제작하는 데는 화학 합성에 의한 방법 및 유전자 재조합 기술을 이용하는 방법 등 공지의 방법을 적절히 이용할 수 있다. 합성에 의한 방법에서는 서열 정보에 기초하여 통상의 방법에 의해 2본쇄 RNA를 합성할 수 있다. 또한, 유전자 재조합 기술을 이용하는 방법에서는 센스쇄 서열이나 안티센스쇄 서열을 코드하는 발현 벡터를 구축하고, 이 벡터를 숙주 세포에 도입 후 전사에 의해 생성된 센스쇄 RNA나 안티센스쇄 RNA를 각각 취득함으로써 제작할 수도 있다. 또한, 표적 유전자의 특정 서열의 센스쇄, 이 센스쇄 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 안티센스쇄 및 그 두 쇄를 연결하는 링커 서열을 포함하고, 헤어핀 구조를 형성하는 shRNA를 발현시킴으로써 원하는 2본쇄 RNA를 제작할 수도 있다.
siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 활성을 갖는 한에서는 siRNA를 구성하는 핵산의 전체 또는 그 일부는 천연 핵산이어도 되고 수식된 핵산이어도 된다.
본 발명에서의 siRNA는 반드시 표적 서열에 대한 1세트의 2본쇄 RNA일 필요는 없고, 표적 서열을 포함한 영역에 대한 복수 세트(이 「복수」란 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 2~5개 정도의 소수를 가리킴)의 2본쇄 RNA의 혼합물이어도 된다. 여기서 표적 서열에 대응한 핵산 혼합물로서의 siRNA는 당업자에게 있어서는 시판의 핵산 합성기 및 DICER 효소를 이용하여 적절히 제작하는 것이 가능하고, 또한 원하는 RNA의 합성에 대해서는 일반적인 합성 수탁 서비스를 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 siRNA에는 이른바 「칵테일 siRNA」가 포함된다. 또한, 본 발명에서의 siRNA는 반드시 모든 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드(RNA)가 아니어도 된다. 즉, 본 발명에서 siRNA를 구성하는 1 혹은 복수의 리보뉴클레오티드는 대응하는 데옥시리보뉴클레오티드이어도 된다. 이 「대응하는」이란 당 부분의 구조는 다르지만 동일한 염기종(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민(우라실))인 것을 가리킨다. 예를 들어 아데닌을 갖는 리보뉴클레오티드에 대응하는 데옥시리보뉴클레오티드란 아데닌을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드를 말한다.
나아가 본 발명의 상기 RNA를 발현할 수 있는 DNA(벡터)도 또한 mTOR 등의 발현을 억제할 수 있는 핵산의 바람직한 실시형태에 포함된다. 예를 들어 본 발명의 상기 2본쇄 RNA를 발현할 수 있는 DNA(벡터)는 이 2본쇄 RNA의 한쪽의 쇄를 코드하는 DNA 및 이 2본쇄 RNA의 다른 쪽의 쇄를 코드하는 DNA가 각각 발현할 수 있도록 프로모터와 연결한 구조를 갖는 DNA이다. 본 발명의 상기 DNA는 당업자에게 있어서는 일반적인 유전자 공학 기술에 의해 적절히 제작할 수 있다. 보다 구체적으로는 목적의 RNA를 코드하는 DNA를 공지의 여러 가지 발현 벡터에 적절히 삽입함으로써 본 발명의 발현 벡터를 제작하는 것이 가능하다.
본 발명에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 핵산에는 수식된 핵산을 이용해도 된다. 수식된 핵산이란 뉴클레오시드(염기 부위, 당 부위) 및/또는 뉴클레오시드간 결합 부위에 수식이 실시되어 있어 천연 핵산과 다른 구조를 갖는 것을 의미한다. 수식된 핵산을 구성하는 「수식된 뉴클레오시드」로서는 예를 들어 무염기(abasic) 뉴클레오시드; 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 그 밖의 당 수식을 갖는 뉴클레오시드; 펩티드 핵산(PNA), 포스페이트기가 결합된 펩티드 핵산(PHONA), 잠금 핵산(LNA), 모르포리노 핵산 등을 들 수 있다. 상기 당 수식을 갖는 뉴클레오시드에는 2'-O-메틸리보스, 2'-데옥시-2'-플루오로리보스, 3'-O-메틸리보스 등의 치환 오단당; 1',2'-데옥시리보스; 아라비노스; 치환 아라비노스당; 육단당 및 알파-아노머의 당 수식을 갖는 뉴클레오시드가 포함된다. 이들 뉴클레오시드는 염기 부위가 수식된 수식 염기이어도 된다. 이러한 수식 염기에는 예를 들어 5-히드록시시토신, 5-플루오로우라실, 4-티오우라실 등의 피리미딘; 6-메틸아데닌, 6-티오구아노신 등의 퓨린; 및 다른 복소환 염기 등을 들 수 있다.
수식된 핵산을 구성하는 「수식된 뉴클레오시드간 결합」으로서는 예를 들어 알킬 링커, 글리세릴 링커, 아미노 링커, 폴리(에틸렌글리콜) 결합, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합; 메틸포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르프로드러그, 술폰, 술폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, N-메틸히드록실아민, 카르보네이트, 카르바메이트, 모르포리노, 보라노포스포네이트, 포스포르아미데이트 등의 비천연 뉴클레오시드간 결합을 들 수 있다.
본 발명의 2본쇄 siRNA에 포함되는 핵산 서열로서는 mTOR 또는 다른 mTOR의 시그널 전달의 멤버에 대한 siRNA 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 또는 약제를 리포솜 등의 인지질 소포체에 도입하여 그 소포체를 투여하는 것도 가능하다. siRNA 또는 shRNA를 보유시킨 소포체를 리포펙션법에 의해 소정의 세포에 도입할 수 있다. 그리고, 얻어지는 세포를 예를 들어 정맥내, 동맥내 등에 전신 투여한다. 눈의 필요한 부위 등에 국소적으로 투여할 수도 있다. siRNA는 in vitro에서는 매우 우수한 특이적 전사 후 억제 효과를 나타내지만, in vivo에서는 혈청 중의 뉴클레아제 활성에 의해 신속하게 분해되어 버리기 때문에 지속 시간이 한정되기 때문에 보다 최적이고 효과적인 딜리버리 시스템 개발이 요구되어 왔다. 하나의 예로서는 Ochiya, T et al., Nature Med., 5: 707-710, 1999, Curr. Gene Ther., 1: 31-52, 2001에서는 생체 친화성 재료인 아텔로콜라겐이 핵산과 혼합하여 복합체를 형성시키면 생체 중의 분해 효소로부터 핵산을 보호하는 작용이 있어 siRNA의 캐리어로서 매우 적합한 캐리어라고 보고되어 있고 이러한 형태를 이용할 수 있지만, 본 발명의 핵산, 치료 또는 예방약의 도입 방법은 이에는 한정되지 않는다. 이와 같이 하여 생체 내에서는 혈청 중의 핵산 분해 효소의 기능에 의해 신속하게 분해되어 버리기 때문에 장시간 효과의 계속을 달성할 수 있다. 예를 들어 Takeshita F. PNAS.(2003) 102(34) 12177-82, Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109에서는 소 피부 유래의 아텔로콜라겐이 핵산과 복합체를 형성하여 생체 내의 분해 효소로부터 핵산을 보호하는 작용이 있어 siRNA의 캐리어로서 매우 적합하다고 보고되어 있고 이러한 기술을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 「iFECD」(immortalized Fuchs' endothelial corneal dystrophy)는 푹스 각막 내피 디스트로피의 불사화 세포의 약칭이다. iFECD의 제조법에 대해서는 예를 들어 WO2015/015655에 기재되어 있다.
본 명세서에서 「HCEC」(human corneal endothelial cells)란 인간 각막 내피 세포의 약칭이다. 「iHCEC」는 불사화(immortalized) 인간 각막 내피 세포의 약칭이다.
본 명세서에서 「프로그램 세포사」란 미리 프로그램되어 있는 것과 같이 정해진 시기나 환경에서 자발적으로 세포가 죽는 현상을 가리킨다. 프로그램 세포사는 예를 들어 「아포토시스」를 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 「트랜스포밍 증식 인자-β(트랜스포밍 성장 인자-β; 약칭 TGF-β라고도 표시됨)」란 해당 분야에서 이용되는 것과 동일한 의미로 이용되고, 다양한 경화성 질환이나 관절 류머티즘, 증식성 유리체 망막증의 병태(病態) 형성을 담당하고 탈모에 깊게 관여하며 면역 담당 세포의 기능을 억제하는 반면 프로테아제의 과잉 생산을 억제함으로써 폐조직이 분해되어 폐기종에 빠지는 것을 막아 암세포의 증식을 억제하는 등 다채로운 생물 활성을 나타내는 분자량 25kD의 호모다이머 다기능성 사이토카인이다. 「TGF-β 시그널」이란 TGF-β에 의해 매개되는 시그널로서, TGF-β에 의해 야기되는 것을 말한다. TGF-β 시그널 예를 들어 TGF-β2에 의해 매개되는 시그널이 포함되고, 그 밖에 TGF-β1, TGF-β3 등에 의해 매개되는 시그널도 예시된다. TGF-β에 대해 인간에서는 TGF-β1~β3까지의 상동성 약 70%의 3개의 아이소폼이 존재하고 그 작용은 유사하다. TGF-β는 리셉터에 결합할 수 없는 분자량 약 300kD의 비활성인 잠재형으로서 생산되고, 표적 세포 표면이나 그 주위에서 활성화되어 리셉터에 결합할 수 있는 활성형이 되어 그 작용을 발휘한다.
이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 표적 세포에서의 TGF-β의 작용은 Smad라는 정보 전달을 담당하는 일련의 단백질의 인산화 경로에 의해 전달된다고 되어 있다. 우선, 활성형 TGF-β가 표적 세포 표면에 존재하는 II형 TGF-β 리셉터에 결합하면 II형 리셉터 2분자와 I형 TGF-β 리셉터 2분자로 이루어지는 리셉터 복합체가 형성되고, II형 리셉터가 I형 리셉터를 인산화한다. 다음으로 인산화 I형 리셉터는 Smad2 또는 Smad3을 인산화하면 인산화된 Smad2 및 Smad3은 Smad4와 복합체를 형성하여 핵으로 이행하고, 표적 유전자 프로모터 영역에 존재하는 CAGA box라고 불리는 표적 서열에 결합하여 보조 활성제(coactivator)와 함께 표적 유전자의 전사 발현을 유도한다고 되어 있다.
트랜스포밍(형질 전환) 증식 인자-β(TGF-β) 시그널 전달 경로는 그 표적 유전자의 조절에 의해 세포 증식 및 분화, 증식 정지, 프로그램 세포사, 상피 간충직 분화 전환(EMT; 상피 간엽 전환이라고도 함) 등과 같은 많은 세포 활성을 조절할 수 있다. TGF-β 자체(예를 들어 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3), 액티빈 및 뼈 형성 단백질(BMP)이 포함되는 TGF-β 패밀리의 멤버는 세포 증식, 분화, 이동 및 프로그램 세포사 등의 강력한 조절제이다.
TGF-β는 B림프구, T림프구 및 활성화 마크로파지를 포함하고, 많은 세포에 의해 및 많은 다른 세포형에 의해 생산되는 약 24Kd의 단백질이다. 면역계에 대한 TGF-β의 효과 중에는 IL-2 리셉터 유도, IL-1 유발성 흉선 세포 증식의 저해 및 IFN-γ 유발성 마크로파지 활성화의 차단이 있다. TGF-β는 다양한 병적 상태에 관여한다고 생각되며(Border et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:1), 그리고 종양 억제 물질 또는 종양 프로모터 중 어느 하나로서 기능하는 것이 충분히 뒷받침되어 있다.
TGF-β는 2개의 세린/트레오닌키나아제 세포 표면 리셉터인 TGF-βRII 및 ALK5에 의해 그 시그널 전달을 매개한다. TGF-β 시그널 전달은 TGF-βRII가 ALK5 리셉터를 인산화하는 것을 가능하게 하는 리간드 유발성 리셉터 2량체화로 개시된다. 그 인산화는 ALK5 키나아제 활성을 활성화하고, 활성화 ALK5는 다음으로 하류 이펙터 Smad 단백질(MAD의 척추동물 상동체 또는 「Mothers against DPP(Decapentaplegic)」 단백질), Smad2 또는 3을 인산화한다. Smad4와의 p-Smad2/3 복합체는 핵에 들어가 표적 유전자의 전사를 활성화한다.
Smad3은 Smad의 R-Smad(리셉터-활성화 Smad) 서브그룹의 멤버로서, TGF-β 리셉터에 의한 전사 활성화의 직접 매개체이다. TGF-β 자극은 Smad2 및 Smad3의 인산화 및 활성화를 초래하고, 이들은 Smad4(척추동물에서의 「공통(common) Smad」 또는 「co-Smad」)와 복합체를 형성하여 이것이 핵과 함께 축적되어 표적 유전자의 전사를 조절한다. R-Smad는 세포질에 국재하고, 그리고 TGF-β 리셉터에 의한 리간드 유발성 인산화로 co-Smad와 복합체를 형성하여 핵으로 이동하며, 여기서 이들은 크로마틴 및 협동 전사 인자와 관련이 있는 유전자 발현을 조절한다. Smad6 및 Smad7은 저해성 Smad(「I-Smad」)이며, 즉 TGF-β에 의해 전사적으로 유발되어 TGF-β 시그널 전달의 저해제로서 기능한다(Feng et al. (2005) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21:659). Smad6/7은 R-Smad의 리셉터 매개 활성화를 방해함으로써 이들의 저해 효과를 발휘하고; 이들은 R-Smad의 동원 및 인산화를 경합적으로 방해하는 I형 리셉터와 관련된다. Smad6 및 Smad7은 Smad6/7 상호작용 단백질의 유비퀴틴화 및 분해를 초래하는 E3 유비퀴틴 리가아제를 보충하는 것이 알려져 있다.
TGF-β 시그널 전달 경로는 그 밖에 BMP-7 등에 의해 전달되는 경로도 존재하고, 이는 ALK-1/2/3/6을 경유하고 Smad1/5/8을 통해 기능이 발현된다고 되어 있다. TGF-β 시그널 전달 경로에 대해서는 J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91; Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2(1) :e3; Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J.18, 816-827 (2004) ; Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010)11, 97-105; Joel Rosenbloom et al., Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166 등을 참조할 것.
본 명세서에서 「눈의 증상, 장해 또는 질환」이란 눈에서의 임의의 증상, 장해 또는 질환을 말한다. 눈의 증상, 장해 또는 질환은 예를 들어 망막, 유리체액, 수정체, 각막, 강막 또는 눈의 다른 부분의 증상, 장해 또는 질환이다. 본 발명에서의 mTOR 인히비터는 특히 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환에 유효할 수 있다.
본 명세서에서 「트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환」이란 각막 내피 세포에서의 TGF-β에 유도되는 임의의 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환을 가리킨다. 본 발명에서는 각막 내피 세포, 예를 들어 푹스 각막 내피 디스트로피의 모델 세포(예를 들어 iFECD)를 TGF-β2에 폭로한 바 놀랍게도 여러 가지 장해(예를 들어 프로그램 세포사)가 발생하였다. 이러한 현상은 종래 자주 해명되지 않았던 현상이다. 그리고, 본 발명자들은 이 TGF-β 시그널에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환을 더욱 분석한 바 예상외로 mTOR 인히비터에 의해 이 장해를 억제할 수 있는 것을 발견하였다. TGF-β 시그널에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 mTOR의 시그널 전달 경로와는 다른 것으로, TGF-β 시그널에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환으로서는 예를 들어 푹스 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술 후의 장해, 안과 레이저 수술 후의 장해, 가령, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD: posterior polymorphous dystrophy), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED: congenital hereditary endothelial dystrophy), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메가로바이러스 각막 내피염 등에서 TGF-β의 발현이 보이는 것을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 특히 TGF-β2의 발현이 통상보다 항진되어 있는 각막 내피 세포 또는 각막 내피 조직에서는 본 발명에서 발견된 장해 또는 이에 관련되는 장해가 발현 또는 항진되어 있다고 생각되기 때문에 이러한 각막 내피 세포 또는 각막 내피 조직이 보이는 임의의 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 특히 본 발명의 대상으로서 의도된다.
본 명세서에서 「각막 내피 세포에서의 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현」이란 정상적인 각막 내피 세포에서의 세포외 매트릭스의 발현 레벨과 비교하여 비정상적인 수준으로 세포외 매트릭스를 발현하는 것을 말한다. 「비정상적인 수준으로 세포외 매트릭스를 발현하는」이란 피브로넥틴 등의 세포외 매트릭스 단백질이 정상 형태에서의 세포외 매트릭스에서 생산되고 있는 양보다 많이 생산되고 있는 것을 말한다. 생산 상황은 자극이 없는 것에 더하여 필요에 따라 트랜스포밍 증식 인자(TGF)β에 대한 응답에 의해 발현량이 증가하는 것도 포함한다. 예를 들어 인간 각막 내피 세포에 대해 말하면 정상에서의 세포외 매트릭스의 양의 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.4배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.6배 이상, 약 1.7배 이상, 약 1.8배 이상, 약 1.9배 이상, 약 2.0배 이상일 수 있다. 정상에 대한 차이는 통계학적으로 유의미한 것이 바람직하지만 반드시 유의미하지 않아도 되고, 의학적으로 유의미한 차이이면 된다.
본 명세서에서 「세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피 장해」 또는 그 「증상」이란 주로 세포외 매트릭스에 기인하는 탁함이나 침착, 비후 등에 관련되는 장해 또는 그 증상으로, 각막 내피면의 우췌(guttata)나 데스메막의 혼탁 구테 등의 데스메막의 비후 등이 발생하여 시력 저하의 원인이 되는 증상에 관련되는 것이다. 푹스 각막 디스트로피 등의 각막 내피 장해에서는 각막 내피 세포의 세포사(특히 아포토시스)가 원인에 의한 증상 악화와는 다르고, 이 세포외 매트릭스의 과잉 생산은 세포수의 감소가 일어나지 않았다고 해도 시력, 시감각을 악화시키는 것으로, 세포사를 억제할 수 있었다고 해도 대처해야 할 점이다. 「세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 생산에 기인하는 각막 내피 장해」 또는 그 「증상」에는 이하: 혼탁, 반흔, 각막 편운, 각막반, 각막 백반 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
바람직한 실시형태에서는 본 발명이 대상으로 하는 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피에 관한 장해이다. 푹스 각막 내피 디스트로피에 관해서는 각막 내피 세포에서의 TGF-β 유도가 관여하고 있는 것이 나타나 있고, FECD에서의 세포 상실에 관여할 수 있는 것도 나타나 있다. 따라서, TGF-β 시그널 전달 경로의 저해는 FECD의 유효한 치료가 될 수 있는 것이 당연히 예상된다. 그러나, 본 발명자들은 예상외로 mTOR 인히비터가 TGF-β 시그널에 기인하는 장해를 억제할 수 있는 것을 발견하였다.
본 발명의 의약은 푹스 각막 내피 디스트로피 중에서도 하나의 중요한 이상 또는 장해의 원인이 되는 TGF-β2에 유도되는 세포 장해 등을 처치할 수 있는 점에서 푹스 각막 내피 디스트로피의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 이해된다. 특히 본 발명에서는 실시예에 있어서, 푹스 각막 내피 디스트로피 모델에서 TGF-β2에 유도되는 세포 장해 혹은 프로그램 세포사를 억제할 수 있었다는 점에서 본 발명은 푹스 각막 내피 디스트로피 모델에서의 TGF-β2에 관련되는 중증 환자의 치료에 사용할 수 있다고 생각된다. 또한, 본 발명의 의약은 예상외로 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현을 억제하는 것이 가능하고, ECM의 데스메층에의 침착 등의 각막 내피에서의 장해 등을 처치 또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명은 푹스 각막 내피 디스트로피에서의 각막 내피 세포의 장해나 각막 내피 밀도 저하, 구테(guttae)의 형성, 데스메막의 비후, 각막 두께의 비후, 각막 상피 장해, 혼탁, 반흔, 각막 실질 혼탁, 눈부심, 안개낌, 시력 장해, 안통, 눈물 흘림, 충혈, 동통, 수포성 각막증, 눈의 불쾌감, 콘트라스트 저하, 후광, 글레어 및 각막 실질의 부종 등을 처치 또는 예방할 수 있다.
(일반 기술)
본 명세서에서 이용되는 분자 생물학적 수법, 생화학적 수법, 미생물학적 수법은 해당 분야에서 주지이며 관용되는 것으로, 예를 들어 Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 및 그 3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987). Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M.(1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M.J.(1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J.(1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al.(1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T.(I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, 별책 실험 의학 「유전자 도입 & 발현 해석 실험법」 요도샤, 1997 등에 기재되어 있다. 각막 내피 세포에 대해서는 Nancy Joyce 등의 보고{Joyce, 2004 #161}{Joyce, 2003 #7}가 잘 알려져 있는데, 전술한 바와 같이 장기 배양, 계대 배양에 의해 섬유아세포양의 형질 전환을 일으켜 효율적인 배양법의 연구가 현재도 행해지고 있다. 이들은 본 명세서에서 관련되는 부분(전부일 수 있음)이 참고로서 원용된다.
(바람직한 실시형태의 설명)
이하에 바람직한 실시형태의 설명을 기재하지만, 이 실시형태는 본 발명의 예시로서, 본 발명의 범위는 이러한 바람직한 실시형태에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 또한 이하와 같은 바람직한 실시예를 참고하여 본 발명의 범위 내에 있는 개변, 변경 등을 용이하게 행할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들 실시형태에 대해 당업자는 적절히 임의의 실시형태를 조합할 수 있다.
<의약>
하나의 국면에서 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 특히 mTOR 인히비터는 각막 내피에서의 증상, 장해 또는 질환에 유효하다.
mTOR은 세포 내의 시그널 전달에 관여하여 세포 분열, 세포의 생존 등의 조절을 담당하고 있다고 되어 있지만 각막 내피에서의 그 메커니즘은 명백해지지 않았다. 그 때문에 mTOR 인히비터가 안과, 특히 각막 내피, 질환, 장해 또는 증상의 치유 또는 예방에 유효한 것은 예상할 수 없었던 것으로 놀랄 만한 것이다.
하나의 실시형태에서는 각막 내피 세포에서의 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술 후의 장해, 안과 레이저 수술 후의 장해, 가령, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD: posterior polymorphous dystrophy), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED: congenital hereditary endothelial dystrophy), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메가로바이러스 각막 내피염으로 이루어지는 군에서 선택된다.
하나의 추가적인 바람직한 실시형태에서는 본 발명은 푹스 각막 내피 디스트로피에서의 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 증상을 치료 또는 예방하는 작용 효과를 가지며, 이러한 증상의 치료 또는 예방을 위한 의약 또는 치료법 혹은 예방법을 제공한다. 이러한 증상으로서는 각막 내피면의 우췌(guttata), 데스메막의 혼탁 구테, 데스메막의 비후, 안개낌, 후광, 글레어, 시력 저하, 각막 혼탁, 백반 및 시감각의 이상 등을 들 수 있다. 세포외 매트릭스의 과잉 생산에 기인하는 증상에 대해서는 이하에서 더 서술한다.
또 다른 국면에서 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는, 각막 내피 세포에서의 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제공한다. 상술한 바와 같이 mTOR 인히비터는 TGF-β 시그널에 기인하는 각막 내피 장해 등을 처치 또는 예방할 수 있는 것이지만, mTOR 인히비터가 추가로 각막 내피 세포에서의 세포외 매트릭스의 과잉 발현을 억제하는 것이 가능한 것은 놀랄 만한 것이었다. 이는 mTOR 인히비터가 각막 내피 세포에서의 TGF-β 시그널 및 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피 장해를 동시에 처치할 수 있음을 시사한다. 특히 푹스 각막 내피 디스트로피는 TGF-β 시그널에 기인하여 각막 내피 세포의 밀도가 현저하게 감소하고, 나아가 세포외 매트릭스가 데스메막에 침착되어 구테(Corneal guttae) 및 데스메막의 비후를 일으키는 질환이기 때문에 세포외 매트릭스의 과잉 발현을 억제하는 것은 푹스 각막 내피 디스트로피의 치료 및 예방에서의 분명한 개선이 가능하고, 경우에 따라서는 완전한 치유가 가능한 것을 의미한다. 또한, 푹스 각막 내피 디스트로피 등의 각막 내피 장해에서의 세포외 매트릭스 과잉 생산에 의해 발생할 수 있는 구테(Corneal guttae) 및 데스메막의 비후나 그 밖에 혼탁이나 침착에 관련되는 증상(지체화되는 각막 부종에 의한 불가역적인 각막 실질 혼탁 등)을 개선하여 처치 또는 예방할 수 있다.
하나의 실시형태에서는 각막 내피 세포에서의 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 각막 내피 세포에서의 피브로넥틴의 과잉 발현에 기인할 수 있다.
하나의 실시형태에서는 각막 내피 세포에서의 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 구테의 형성, 데스메막의 비후, 각막 두께의 비후, 혼탁, 반흔, 각막 실질 혼탁, 각막 상피 부종, 각막 상피 장해, 눈부심 및 안개낌으로 이루어지는 군에서 선택된다.
다른 국면에서 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는, 각막 내피 세포에서의 TGF-β 시그널 및 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제공한다. mTOR 인히비터는 각막 내피 세포에서의 TGF-β 시그널 및 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피 장해를 동시에 처치 또는 예방할 수 있다.
하나의 실시형태에서는 각막 내피 세포에서의 TGF-β 시그널 및 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 그 밖의 각막 내피 디스트로피 및 약물, 수술, 외상, 감염증, 포도막염 등에 의한 각막 내피 장해로 이루어지는 군에서 선택된다.
하나의 실시형태에서는 각막 내피 세포에서의 TGF-β 시그널 및 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피를 포함한다. 푹스 각막 내피 디스트로피는 TGF-β 시그널에 기인하여 각막 내피 세포의 밀도가 현저하게 감소하고, 나아가 세포외 매트릭스가 데스메막에 침착되어 구테(Corneal guttae) 및 데스메막의 비후 등의 장해 등을 일으키는 질환이기 때문에 세포외 매트릭스의 과잉 발현을 억제하는 것은 푹스 각막 내피 디스트로피의 분명한 개선이 가능하고, 경우에 따라서는 완전한 치유가 가능한 것을 의미한다. mTOR 인히비터에 의한, 푹스 각막 내피 디스트로피 등의 질환에서의 구테(Corneal guttae) 및 데스메막의 비후 등의 장해 등의 개선은 안과 질환에서의 질적 개선을 가져오는 것으로, 앉아서 죽을 수 밖에 없었던 푹스 각막 내피 디스트로피 등의 질환에 있어서 종래에 없는 치료 효과를 부여하게 된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이용법으로서는 예를 들어 점안약을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않고, 전방 내에의 주사, 서방제에의 함침, 결막하 주사, 전신 투여(내복, 정맥 주사) 등의 투여 방법도 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 이용되는 mTOR 인히비터는 눈(예를 들어 각막 내피)의 증상, 장해 또는 질환의 치료 또는 예방에 유효한 한 어떠한 종류의 것을 사용해도 된다. 구체적인 mTOR 인히비터로서는 라파마이신, 템시로리무스, 에베로리무스, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, 복스탈리시브(Voxtalisib(XL765, SAR245409)), 리다포로리무스(Ridaforolimus(Deforolimus, MK-8669)), NVP-BEZ235, CZ415, Torkinib(PP242), 토린 1(Torin 1), 오미팔리시브(Omipalisib(GSK2126458, GSK458)), OSI-027, PF-04691502, 아피톨리시브(Apitolisib(GDC-0980, RG7422)), WYE-354, 비스투서티브(Vistusertib(AZD2014)), 토린 2(Torin 2), 타크롤리무스(Tacrolimus(FK506)), GSK1059615, 게다톨리시브(Gedatolisib(PF-05212384, PKI-587)), WYE-125132(WYE-132), BGT226(NVP-BGT226), 팔로미드 529(Palomid 529(P529)), PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스(Zotarolimus(ABT-578)), 크리소판산(Chrysophanic Acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 의약에 있어서, 상기 mTOR 인히비터는 단독으로 사용되어도 되고 조합하여 사용되어도 된다. 본 발명에서 사용되는 mTOR 인히비터의 농도는 mTOR 인히비터의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있지만, 예를 들어 적어도 약 0.0001nM(nmol/L), 적어도 약 0.001nM, 적어도 약 0.01nM, 적어도 약 0.1nM, 적어도 약 1nM, 적어도 약 10nM, 적어도 약 100nM 또는 적어도 약 1000nM일 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 mTOR 인히비터의 농도의 상한으로서는 약 100μM(μmol/L), 약 10μM, 약 1μM 또는 약 0.5μM를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 mTOR 인히비터의 농도 범위로서는 예를 들어 약 0.01nM~약 100μM, 약 0.1nM~약 100μM, 약 1nM~약 100μM, 약 10nM~약 100μM, 약 100nM~약 100μM, 약 1μM~약 100μM, 약 0.01nM~약 10μM, 약 0.1nM~약 10μM, 약 1nM~약 10μM, 약 10nM~약 10μM, 약 100nM~약 10μM, 약 1μM~약 10μM, 약 0.01nM~약 1μM, 약 0.1nM~약 1μM, 약 1nM~약 1μM, 약 10nM~약 1μM, 약 100nM~약 1μM, 약 0.01nM~약 100nM, 약 0.1nM~약 100nM, 약 1nM~약 100nM, 약 10nM~약 100nM를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 2종 이상의 mTOR 인히비터를 조합하여 사용하는 경우는 각각의 mTOR 인히비터의 농도를 적절히 변경할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는 mTOR 인히비터는 예를 들어 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스와 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택된다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스 등의 mTOR 인히비터에 의한 처치에 의해 다른 mTOR 인히비터에 비해서도 현저한 치료 성적이 나타나고, 특히 푹스 내피 디스트로피 등의 트랜스포밍 증식 인자-β2(TGF-β2)에 관련되는 각막 내피의 질환 또는 장해 혹은 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 관련되는 각막 내피의 질환 또는 장해의 치유 성적이 현저하게 개선되는 것이 발견되어 있기 때문이다. 또한, 이들 mTOR 인히비터는 FDA, PMDA 등에서 이미 승인된 것으로, 안전성 등의 면을 고려해도 의약품으로서 안과용 의약으로서도 투여 가능한 것이 기대되고 있기 때문이다.
본 발명의 의약에 있어서, 상기 화합물은 단독으로 사용되어도 되고 조합하여 사용되어도 된다. 본 발명에서 사용되는 화합물의 농도는 약 0.01nM~100μM(μmol/l) 또는 약 0.1nM~100μM, 통상 약 1nM~100μM, 약 10nM~100μM, 바람직하게는 약 0.1~30μM, 보다 바람직하게는 약 1~10μM이며, 이들의 상한 하한은 적절히 조합하여 설정될 수 있고, 2종 이상의 화합물을 조합하여 사용하는 경우는 적절히 변경할 수 있으며, 다른 농도 범위로서는 예를 들어 통상 약 0.01nM~100μM, 약 0.1nM~100μM 혹은 약 0.001~100μM, 바람직하게는 약 0.01~75μM, 약 0.05~50μM, 약 1~10μM, 약 0.01~10μM, 약 0.05~10μM, 약 0.075~10μM, 약 0.1~10μM, 약 0.5~10μM, 약 0.75~10μM, 약 1.0~10μM, 약 1.25~10μM, 약 1.5~10μM, 약 1.75~10μM, 약 2.0~10μM, 약 2.5~10μM, 약 3.0~10μM, 약 4.0~10μM, 약 5.0~10μM, 약 6.0~10μM, 약 7.0~10μM, 약 8.0~10μM, 약 9.0~10μM, 약 0.01~50μM, 약 0.05~5.0μM, 약 0.075~5.0μM, 약 0.1~5.0μM, 약 0.5~5.0μM, 약 0.75~5.0μM, 약 1.0~5.0μM, 약 1.25~5.0μM, 약 1.5~5.0μM, 약 1.75~5.0μM, 약 2.0~5.0μM, 약 2.5~5.0μM, 약 3.0~5.0μM, 약 4.0~5.0μM, 약 0.01~3.0μM, 약 0.05~3.0μM, 약 0.075~3.0μM, 약 0.1~3.0μM, 약 0.5~3.0μM, 약 0.75~3.0μM, 약 1.0~3.0μM, 약 1.25~3.0μM, 약 1.5~3.0μM, 약 1.75~3.0μM, 약 2.0~3.0μM, 약 0.01~1.0μM, 약 0.05~1.0μM, 약 0.075~1.0μM, 약 0.1~1.0μM, 약 0.5~1.0μM, 약 0.75~1.0μM, 약 0.09~35μM, 약 0.09~3.2μM이고, 보다 바람직하게는 약 0.05~1.0μM, 약 0.075~1.0μM, 약 0.1~1.0μM, 약 0.5~1.0μM, 약 0.75~1.0μM를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
점안제로서 이용되는 경우는 누액 등으로의 희석도 고려하고 독성도 주의하면서 상기 유효 농도의 약 1~10000배, 바람직하게는 약 100~10000배, 예를 들어 약 1000배를 기준으로 하여 제제 농도를 결정할 수 있고, 이들을 웃도는 농도를 설정하는 것도 가능하다. 예를 들어 약 0.01μM(μmol/l)~1000mM(mmol/l), 약 0.1μM~100mM, 약 1μM~100mM, 약 10μM~100mM 혹은 약 0.1μM~30mM, 약 1μM~30mM, 보다 바람직하게는 약 1μM~10mM, 약 10μM~10mM, 약 100μM~10mM, 약 10μM~100mM, 약 100μM~100mM이며, 약 ￥mM~10mM, 약 1mM~100mM일 수 있고, 이들의 상한 하한은 적절히 조합하여 설정될 수 있으며, 2종 이상의 화합물을 조합하여 사용하는 경우는 적절히 변경할 수 있다.
다른 실시형태에서는 mTOR 인히비터는 라파마이신이다. 사용되는 라파마이신의 농도는 적어도 약 0.1nM이고, 적어도 약 1nM이며, 적어도 약 10nM이고, 바람직하게는 약 100nM이다. 바람직한 실시형태에서는 라파마이신은 점안제로서 이용되고, 그 경우 사용되는 라파마이신의 농도는 적어도 약 0.1mM이며, 적어도 약 1mM이고, 적어도 약 10mM이며, 바람직하게는 적어도 약 100mM이다. 농도의 상한으로서는 포화량 또는 1000mM가 예시된다.
다른 실시형태에서는 mTOR 인히비터는 템시로리무스이다. 사용되는 템시로리무스의 농도는 적어도 약 0.01nM이고, 적어도 약 0.1nM이며, 바람직하게는 약 1nM, 바람직하게는 약 10nM, 보다 바람직하게는 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 1μM, 보다 바람직하게는 약 10μM이다. 템시로리무스는 점안제로서 이용되고, 그 경우 사용되는 템시로리무스의 농도는 적어도 약 0.01mM이며, 적어도 약 0.1mM이고, 적어도 약 1mM이며, 바람직하게는 적어도 약 10mM이다. 농도의 상한으로서는 포화량 또는 1000mM가 예시된다. 다른 실시형태에서는 mTOR 인히비터는 에베로리무스이다. 사용되는 에베로리무스의 농도로서는 적어도 약 0.1nM이고, 적어도 약 1nM이며, 적어도 약 10nM이고, 바람직하게는 약 100nM이다. 에베로리무스는 점안제로서 이용되고, 그 경우 사용되는 에베로리무스의 농도는 적어도 약 0.1mM이며, 적어도 약 1mM이고, 적어도 약 10mM이며, 바람직하게는 적어도 약 100mM이다. 농도의 상한으로서는 포화량 또는 1000mM가 예시된다.
하나의 실시형태에서는 본 발명의 치료 또는 예방하기 위한 의약은 각막 내피를 갖는 임의의 동물, 예를 들어 포유동물을 대상으로 할 수 있고, 바람직하게는 영장류의 각막 내피의 치료 또는 예방을 목적으로 한다. 바람직하게는 이 치료 또는 예방의 대상은 인간의 각막 내피이다.
추가적인 실시형태에서는 mTOR 인히비터는 mTOR 유전자의 발현 억제 물질이어도 된다. mTOR 유전자의 발현 억제 물질로서는 예를 들어 siRNA, 안티센스 핵산 또는 리보자임을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
특정의 실시형태에서는 mTOR 인히비터는 mTOR 유전자에 대한 siRNA이다. 본 발명에서 사용되는 siRNA의 대표적인 예는 이하:
CAUUCGCAUUCAGUCCAUAtt(서열 번호 1)
에 나타나는 센스쇄와
UAUGGACUGAAUGCGAAUGat(서열 번호 2)
에 나타나는 안티센스쇄를 포함하지만 이에 한정되지 않고, mTOR 유전자에 대한 안티센스 효과 혹은 RNAi 효과가 있으면 어떠한 서열로도 된다. 이들 센스쇄 및 안티센스쇄는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있어도 된다.
다른 국면에서는 본 발명은 mTOR 인히비터의 유효량을 이를 필요한 피험체에 투여하는 공정을 포함하는, 눈(예를 들어 각막 내피)의 증상, 장해 또는 질환(각막 내피 세포에서의 TGF-β 시그널 및/또는 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환)의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
본 명세서에서 「피험체」란 본 발명의 치료 및 예방하기 위한 의약 또는 방법의 투여(이식) 대상을 가리키고, 피험체로서는 포유동물(예를 들어 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 말, 양, 원숭이 등)을 들 수 있지만, 영장류가 바람직하고, 특히 인간이 바람직하다.
특정의 질환, 장해 또는 상태의 치료에 유효한 본 발명의 의약의 유효량은 장해 또는 상태의 성질에 따라 변동할 수 있지만, 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 표준적 임상 기술에 의해 결정 가능하다. 나아가 필요에 따라 in vitro 어세이를 사용하여 최적 투약량 범위를 동정하는 것을 보조하는 것도 가능하다. 배합물에 사용하고자 하는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장해의 중대성에 따라서도 변동할 수 있기 때문에 담당 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정해야 한다. 그러나, 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1회당 0.001, 1, 5, 10, 15, 100 또는 1000mg/kg 체중이어도 되고, 이들 중 어느 2개의 값의 범위 내이어도 된다. 투여 간격은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1, 7, 14, 21 또는 28일당 1 또는 2회 투여해도 되고, 이들 중 어느 2개의 값의 범위당 1 또는 2회 투여해도 된다. 투여량, 투여 횟수, 투여 간격, 투여 방법은 환자의 연령이나 체중, 증상, 투여 형태, 대상 장기 등에 따라 적절히 선택해도 된다. 예를 들어 본 발명은 점안제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 의약을 전방 내에 주입할 수도 있다. 또한, 치료약은 치료 유효량 또는 원하는 작용을 발휘하는 유효량의 유효 성분을 포함하는 것이 바람직하다. 치료 마커가 투여 후에 유의미하게 감소한 경우에 치료 효과가 있었다고 판단해도 된다. 유효 용량은 in vitro 또는 동물 모델 시험계로부터 얻어지는 용량-반응 곡선으로부터 추정 가능하다.
<각막 내피 세포의 저장 및 증식>
다른 국면에서 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는 각막 내피 세포를 저장하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 mTOR 인히비터의 유효량을 각막 내피 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 각막 내피 세포를 저장하기 위한 방법을 제공한다. 각막 내피 세포의 저장에 사용되는 mTOR 인히비터 등의 실시형태는 본 명세서에 있어서 <의약>에서 기재되는 임의의 실시형태가 이용 가능한 것으로 이해된다. 각막 내피 세포에의 접촉, in vivo이어도 되고, ex vivo이어도 되고, in vitro이어도 되고, 세포 제제의 제조에서 사용되어도 된다.
다른 국면에서 본 발명은 mTOR 인히비터를 포함하는 각막 내피 세포를 증식하거나 또는 증식을 촉진하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 mTOR 인히비터의 유효량을 각막 내피 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 각막 내피 세포를 증식하거나 또는 증식을 촉진하기 위한 방법을 제공한다. 각막 내피 세포의 증식 또는 증식의 촉진에 사용되는 mTOR 인히비터 등의 실시형태는 본 명세서에 있어서 <의약>에서 기재되는 임의의 실시형태가 이용 가능한 것으로 이해된다. 각막 내피 세포에의 접촉, in vivo이어도 되고, ex vivo이어도 되고, in vitro이어도 되고, 세포 제제의 제조에 사용되어도 된다.
본 명세서에서 인용된 과학 문헌, 특허, 특허출원 등의 참고 문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 같은 정도로 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
이상, 본 발명을 용이한 이해를 위해 바람직한 실시형태를 나타내어 설명하였다. 이하에 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하지만, 상술한 설명 및 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 본 발명을 한정하는 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 범위는 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시형태에도 실시예에도 한정되지 않고, 청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예
이하에 본 발명의 예를 기재한다. 해당하는 경우 생물 시료 등의 취급은 후생노동성, 문부과학성 등에서 규정되는 기준을 준수하고, 해당하는 경우는 헬싱키 선언 또는 그 선언에 기초하여 작성된 윤리 규정에 기초하여 행하였다. 연구를 위한 눈의 기증에 대해서는 모든 고인 기증자의 근친자로부터 동의서를 얻었다. 본 연구는 엘랑겐대학(독일), SightLife™(Seattle, WA) 아이 뱅크의 윤리 위원회 또는 이에 준하는 것의 승인을 받았다.
(조제예: 푹스 각막 내피 디스트로피 환자 유래의 불사화 각막 내피 세포주(iFECD) 모델의 제작)
본 실시예에서는 푹스 각막 내피 디스트로피 환자 유래의 각막 내피 세포로부터 불사화 각막 내피 세포주(iFECD)를 제작하였다.
(배양 방법)
시애틀 아이 뱅크로부터 구입한 연구용 각막으로부터 각막 내피 세포를 기저막과 함께 기계적으로 박리하고, 콜라게나아제를 이용하여 기저막으로부터 벗겨 회수 후 초대 배양을 행하였다. 배지는 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Liquid(INVITROGEN 카탈로그 번호: 31985-070)에 8% FBS(BIOWEST, 카탈로그 번호: S1820-500), 200mg/ml CaCl2·2H2O(SIGMA 카탈로그 번호: C7902-500G), 0.08% 콘드로이틴황산(SIGMA 카탈로그 번호: C9819-5G), 20μg/ml 아스코르빈산(SIGMA 카탈로그 번호: A4544-25G), 50μg/ml 겐타마이신(INVITROGEN 카탈로그 번호: 15710-064) 및 5ng/ml EGF(INVITROGEN 카탈로그 번호: PHG0311)를 더한 3T3 피더 세포용의 순화시킨 것을 기본 배지로서 이용하였다. 또한, 기본 배지에 SB431542(1μmol/l) 및 SB203580(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술포닐페닐)-5(4-피리딜)이미다졸<4-[4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-1H-이미다졸-5-일]피리딘)(1μmol/l)을 첨가한 것(본 명세서에서는 「SB203580+SB431542+3T3 순화 배지」라고도 함)으로 배양하였다.
(취득 방법)
푹스 각막 내피 디스트로피의 임상 진단에 의해 수포성 각막증에 이르러 각막 내피 이식(데스메막 내피 각막 이식=DMEK)이 실시된 인간 환자 3명으로부터 문서에 의한 동의 및 윤리원회의 승인하에 각막 내피 세포를 얻었다. DMEK시에 기계적으로 병적인 각막내 세포와 기저막인 데스메막과 함께 박리하여 각막 저장액인 Optisol-GS(보슈롬사)에 침지하였다. 그 후, 콜라게나아제 처리를 행하여 효소적으로 각막 내피 세포를 회수하고 SB203580+SB431542+3T3 순화 배지에 의해 배양하였다. 배양한 푹스 각막 내피 디스트로피 환자 유래의 각막 내피 세포는 SV40 라지 T항원 및 hTERT 유전자를 PCR에 의해 증폭하여 렌티바이러스 벡터(pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc)에 도입하였다. 그 후, 렌티바이러스 벡터를 3종류의 헬퍼 플라스미드(pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.)와 함께 트랜스펙션 시약(Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI)을 이용하여 293T 세포(RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japan)에 감염시켰다. 48시간의 감염 후에 바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하여 5μg/ml의 폴리브렌을 이용하여 배양한 푹스 각막 내피 디스트로피 환자 유래의 각막 내피 세포의 배양액에 첨가하여 SV40 라지 T항원 및 hTERT 유전자를 도입하였다. 푹스 각막 내피 디스트로피 환자 유래의 불사화 각막 내피 세포주(iFECD)의 위상차 현미경상을 확인하였다. 컨트롤로서 시애틀 아이 뱅크로부터 수입한 연구용 각막으로부터 배양한 각막 내피 세포를 동일한 방법으로 불사화하여 정상 각막 내피 세포의 불사화 세포주를 제작하였다(iHCEC). 건강한 기증자 유래의 불사화 각막 내피 세포주(iHCEC) 및 불사화 각막 내피 세포주(iFECD)의 위상차 현미경상을 보면 iHCEC 및 iFECD는 모두 정상의 각막 내피 세포와 같이 1층의 다각형의 형태를 가진다. iHCEC 및 iFECD는 둘베코 개변 이글 배지(DMEM)+10% 소 태아 혈청(FBS)에 의해 유지 배양을 행하였다.
(실시예 1: TGF-β2에 의해 유도되는 세포 장해에 대한 라파마이신의 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 대표예인 라파마이신의, 눈의 세포 장해에 대한 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 1×105개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+10% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 라파마이신을 첨가하여 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 TGF-β2(Wako, 200-19911) 및 라파마이신을 함유하는 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
(결과)
(라파마이신은 TGF-β2에 의해 유도되는 세포 장해를 억제함)
도 1에 결과를 나타낸다. 라파마이신 비존재 하에서 재조합 인간 TGF-β2에 의해 iFECD를 자극한 경우 현저하게 세포가 장해되어 있는 것이 인정된다. 한편, 라파마이신으로 전처리(pretreatment)한 경우 각막 내피 세포의 장해가 억제되어 있는 것이 관찰되었다. 따라서, 라파마이신은 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 세포 장해를 억제하는 것이 인정되었다.
(실시예 2: TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제 활성의 라파마이신에 의한 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 대표예인 라파마이신의, 카스파제 활성에 대한 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 1×105개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+10% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 라파마이신을 첨가하여 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 TGF-β2(Wako, 200-19911) 및 라파마이신을 함유하는 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g으로 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 8μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 토끼 항 Caspase 3항체(Cell Signaling, 9662), 토끼 항 PARP 항체(Cell Signaling, 9542), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 토끼 항 Caspase 3항체: 1000배 희석, 토끼 항 PARP 항체: 2000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(라파마이신은 TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제 활성을 억제함)
도 2에 카스파제에 대한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 라파마이신 비존재 하에서 재조합 인간 TGF-β2에 의해 iFECD를 자극한 경우 활성형인 약 17kDa의 절단 카스파제 3(약 17kDa)이 인정되었다. 한편, 라파마이신 첨가군에서는 활성형의 절단 카스파제 3은 거의 확인되지 않았다. 따라서, 이에 의한 해석으로부터 라파마이신은 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제의 활성화를 억제하는 것이 인정되었다. mTOR은 카스파제의 시그널과는 무관하고, 또한 mTOR 인히비터가 카스파제의 활성화를 억제하는 것도 알려지지 않았기 때문에 라파마이신이 카스파제의 활성화를 억제할 수 있었던 것은 놀랄 만한 것이었다.
(실시예 3: 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 S6K의 인산화 활성의 라파마이신에 의한 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 대표예인 라파마이신의, TGF-β2에 의해 유도되는 S6K의 인산화 활성에 대한 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 7×104개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+10% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 라파마이신을 첨가하여 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 TGF-β2(Wako, 200-19911) 및 라파마이신을 함유하는 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g으로 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 5μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 토끼 항 Akt1 항체(Cell Signaling, 2938), 마우스 항 Phospho-Akt 항체(Cell Signaling, 4051), 토끼 항 S6K 항체(Cell Signaling, 9202), 토끼 항 Phospho-S6K 항체(Cell Signaling, 9204), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 토끼 항 Akt 항체: 1000배 희석, 마우스 항 Phospho-Akt 항체: 1000배 희석, 토끼 항 S6K 항체: 1000배 희석, 토끼 항 Phospho-S6K 항체: 1000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(라파마이신은 TGF-β2에 의해 유도되는 S6K의 인산화 활성을 억제함)
도 3에 결과를 나타낸다. 라파마이신 비존재 하에서 재조합 인간 TGF-β2에 의해 iFECD를 자극한 경우 Akt의 인산화 활성이 인정되었다. 한편, 라파마이신 첨가군에서는 S6K의 인산화 활성이 억제되었다. 웨스턴 블롯에 의한 해석으로부터 라파마이신은 mTOR 시그널 경로의 저해 작용을 갖는 것을 확인하였다. Akt는 mTOR의 상류, S6K는 mTOR의 하류에 존재한다. 그 때문에 mTOR 인히비터에 의해 상류의 Akt는 인산화되고, 한편 하류의 S6K의 인산화는 억제된 점에서 라파마이신이 mTOR 경로를 저해하고 있는 것이 확인되었다.
(실시예 4: TGF-β2에 의해 유도되는 Smad2/3의 인산화 활성의 라파마이신에 의한 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 대표예인 라파마이신의, TGF-β2에 의해 유도되는 Smad2/3의 인산화 활성에 대한 억제 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 8×104개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+10% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 라파마이신을 첨가하여 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 TGF-β2(Wako, 200-19911) 및 라파마이신을 함유하는 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g으로 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 8μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 토끼 항 Smad2 항체(Cell Signaling, 5339), 마우스 항 Phospho-Smad2 항체(Cell Signaling, 3108), 토끼 항 Smad3 항체(Cell Signaling, 9523), 토끼 항 Phospho-Smad3 항체(Cell Signaling, 9520), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 토끼 항 Smad2 항체: 1000배 희석, 마우스 항 Phospho-Smad2 항체: 1000배 희석, 토끼 항 Smad3 항체: 1000배 희석, 토끼 항 Phospho-Smad3 항체: 1000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(라파마이신은 TGF-β2에 의해 유도되는 Smad2/3의 인산화 활성을 억제하지 못함)
도 4에 결과를 나타낸다. 라파마이신 존재하에서 재조합 인간 TGF-β2에 의해 자극한 경우 Smad2 및 Smad3의 인산화 활성이 인정되었다. 따라서, 웨스턴 블롯에 의한 해석으로부터 라파마이신은 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 Smad2/3의 인산화 활성을 억제하지 못하는 것이 인정되었다. TGF-β의 작용은 Smad의 인산화 경로에 의해 전달된다고 여겨지고 있기 때문에 라파마이신의 세포 장해 억제 작용은 TGF-β 시그널의 저해에 의한 것이 아님이 명백해졌다. 이는 라파마이신이 TGF-β 시그널을 직접 저해하지 않고 TGF-β 시그널에 기인하는 각막 내피의 장해 등을 억제하는 것을 시사하며 예상외의 결과이었다.
(실시예 5: TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 생산에 대한 라파마이신의 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 대표예인 라파마이신의, TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 생산에 대한 억제 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
6웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 2×105개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+10% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 라파마이신을 첨가하여 24시간 배양하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 TGF-β2(Wako, 200-19911) 및 라파마이신을 함유하는 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지는 DMEM+2% FBS+1% P/S를 사용함). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g으로 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 5μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 마우스 항 Fibronectin 항체(BD Bioscience, 610077), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 마우스 항 Fibronectin 항체: 15000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(라파마이신은 TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 생산을 억제함)
도 5에 결과를 나타낸다. 라파마이신 비존재 하에서 재조합 인간 TGF-β2에 의해 자극한 경우 iFECD에서 피브로넥틴의 생산이 인정되었다. 한편, 라파마이신 첨가군에서는 피브로넥틴의 생산은 거의 확인되지 않았다. 따라서, 웨스턴 블롯에 의한 해석으로부터 라파마이신은 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 발현량을 억제하는 것이 인정되었다. mTOR이 피브로넥틴 등의 세포외 매트릭스의 생산에 관여하고 있는 것은 알려지지 않았기 때문에 mTOR 인히비터가 세포외 매트릭스 생산을 억제할 수 있다는 것은 예상외였다.
푹스 각막 내피 디스트로피에서는 피브로넥틴 등의 세포외 매트릭스의 과잉 생산 및 데스메막에의 침착에 의한, 데스메막 비후, 구테(guttae)의 형성 등의 장해가 발생한다. 이들 장해는 푹스 각막 내피 디스트로피 환자에 있어서 일반적으로는 30대부터 40대에 발생하기 시작하여 평생 진행된다. 진행에 의해 안개낌, 후광, 글레어, 시력 저하 등의 시력 장해를 일으킨다. 나아가 푹스 각막 내피 디스트로피에서는 각막 내피 세포가 계속적으로 장해되지만, 세포 밀도가 약 1000개/㎟를 밑돌기까지는 펌프 기능이 남겨진 각막 내피가 대상함으로써 각막의 투명성은 유지된다. 한편, 약 1000개/㎟를 밑돌면 각막에 전방수가 진입됨으로써 각막 부종이 발생하여 시력 장해를 일으킨다(도 18). 이와 같이 푹스 각막 내피 디스트로피 환자에서는 주로 세포외 매트릭스의 과잉 생산과 각막 내피 세포사의 2가지 원인에 의해 시기능 장해가 발생한다. 본 발명에서의 카스파제 저해제의 기능은 세포외 매트릭스 생산의 억제 및 각막 내피 세포사 억제 둘 다에 작용함으로써 푹스 각막 내피 디스트로피 치료에 특히 유용하다고 할 수 있다.
(실시예 6: mTOR의 발현 및 S6K의 인산화에 대한 mTOR siRNA 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 다른 대표예인 mTOR siRNA의, mTOR의 발현 및 S6K의 인산화에 대한 억제 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 3×104개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 24시간 후 배지를 제거하고, Lipofectamine(invitrogen, 92008) 및 3pmol의 mTOR siRNA(Ambion, AS026M0L)를 첨가하여 24시간 배양하였다(배지: OptiMEM-I(invitrogen, 31985-088)). 사용한 mTOR siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 센스쇄 및 서열 번호 2에 나타나는 안티센스쇄를 가진다. 24시간 후 배지를 제거하고, 37℃(5% CO2)에서 72시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 72시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 GF-β2(Wako, 200-19911)가 들어간 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지: DMEM+2% FBS+1% P/S). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 PCR법에 의해 cDNA의 염기 서열의 증폭을 행하였다.
1) total RNA의 회수
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, RNeasy mini Kit(QIAGEN, M610A)의 Buffer RLT Lysis buffer를 350μl 첨가하여 세포를 용출하였다. 그 후, 350μl의 70% EtOH를 첨가하고 RNeas mini spin column(QIAGEN)으로 옮긴 후 10000rpm으로 15초 원심하여 Flow-through를 버렸다. 나아가 30μl의 RNeasy free water(QIAGEN)를 RNeasy mini spin column에 첨가한 후 10000rpm으로 1분 원심하여 total RNA를 추출하였다.
2) cDNA 합성
추출한 total RNA 450ng, Rever Tra Ace(TOYOBO), 10mM dNTP Mixture(TOYOBO), 5×RT Buffer(TOYOBO), 랜덤 프라이머(invitrogen)를 각각 첨가하고, T3000 Thermocycler(biometra)를 이용하여 보조적 DNA를 합성하였다. 반응 조건은 30℃에서 10분의 어닐링 반응, 42℃에서 60분의 역전사 반응, 99℃에서 5분의 열변성 반응으로 행하였다.
3) PCR법
합성한 보조적 DNA 1μl, 2×GO Taq GreenMaster Mix(Promega)를 5μl, mTOR의 Forward 커스텀 프라이머(invitrogen)를 1μl, Reverse 커스텀 프라이머(invitrogen)를 1μl, H2O를 2μl 혼합하고, T3000 Thermocycler(biometra)를 이용하여 보조적 DNA의 염기 서열을 증폭시켰다. 반응 조건은 94℃에서 2분의 초기 열변성 반응 후 95℃에서 30초의 열변성 반응, 53℃에서 20초의 어닐링 반응, 72℃에서 25초 신장 반응을 26사이클 행하고, 나아가 72℃에서 5분의 신장 반응을 행하였다. 증폭 후, 아가로스 겔을 이용한 전기영동 및 Amersham™ Imager 600(GE 헬스케어 재팬)으로 UV 조사에 의해 검출하였다.
또한, 관찰 후 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g, 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 5μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 토끼 항 mTOR 항체(Cell Signaling, 2972), 토끼 항 S6K 항체(Cell Signaling, 9202), 토끼 항 Phospho-S6K 항체(Cell Signaling, 9204), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 토끼 항 mTOR 항체: 1000배 희석, 토끼 항 S6K 항체: 1000배 희석, 토끼 항 Phospho-S6K 항체: 1000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(mTOR siRNA는 mTOR의 발현 및 S6K의 인산화를 억제함)
도 6에 결과를 나타낸다. iFECD에서 mTOR에 대해 RNAi를 행한 경우 RNA 레벨 및 단백 레벨 어느 쪽에서도 mTOR의 발현 억제가 인정되었다. 또한, mTOR siRNA에 의해 단백 레벨에서 S6K의 인산화가 억제된 것이 인정되었다. 따라서, PCR 및 웨스턴 블롯에 의한 해석으로부터 mTOR siRNA는 mTOR의 발현 및 S6K의 인산화를 억제한 것이 인정되었다.
(실시예 7: TGF-β2에 의해 유도되는 세포 장해에 대한 mTOR siRNA의 억제 효과)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 3×104개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 24시간 후 배지를 제거하고, Lipofectamine(invitrogen, 92008) 및 3pmol의 mTOR siRNA(Ambion, AS026M0L)를 첨가하여 24시간 배양하였다(배지: OptiMEM-I(invitrogen, 31985-088)). 사용한 mTOR siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 센스쇄 및 서열 번호 2에 나타나는 안티센스쇄를 가진다. 24시간 후 배지를 제거하고, 37℃(5% CO2)에서 72시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 72시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 GF-β2(Wako, 200-19911)가 들어간 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지: DMEM+2% FBS+1% P/S). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
(결과)
(mTOR siRNA는 TGF-β2에 의해 유도되는 세포 장해를 억제함)
도 7에 결과를 나타낸다. mTOR siRNA를 사용하지 않고 재조합 인간 TGF-β2에 의해 iFECD를 자극한 경우 현저하게 세포가 장해되어 있는 것이 인정된다. 한편, mTOR siRNA를 사용한 경우 각막 내피 세포의 장해가 억제되어 있는 것이 관찰되었다. 따라서, mTOR의 발현 억제가 TGF-β2에 의해 유도되는 세포 장해를 억제하는 것이 인정되었다.
(실시예 8: TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제의 활성화에 대한 mTOR siRNA의 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 다른 대표예인 mTOR siRNA의, TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제의 활성화에 대한 억제 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 3×104개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 24시간 후 배지를 제거하고, Lipofectamine(invitrogen, 92008) 및 3pmol의 mTOR siRNA(Ambion, AS026M0L)를 첨가하여 24시간 배양하였다(배지: OptiMEM-I(invitrogen, 31985-088)). 사용한 mTOR siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 센스쇄 및 서열 번호 2에 나타나는 안티센스쇄를 가진다. 24시간 후 배지를 제거하고, 37℃(5% CO2)에서 72시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 72시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 GF-β2(Wako, 200-19911)가 들어간 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지: DMEM+2% FBS+1% P/S). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g으로 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 6μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 토끼 항 Caspase 3항체(Cell Signaling, 9662), 토끼 항 PARP 항체(Cell Signaling, 9542), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 토끼 항 Caspase 3항체: 1000배 희석, 토끼 항 PARP 항체: 2000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(mTOR siRNA는 TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제의 활성화를 억제함)
도 8에 결과를 나타낸다. mTOR siRNA를 사용하지 않고 재조합 인간 TGF-β2에 의해 자극한 경우 iFECD에서 활성형인 약 17kDa의 절단 카스파제 3이 인정되었다. 한편, mTOR siRNA 첨가군에서는 활성형의 절단 카스파제 3은 거의 확인되지 않았다. 따라서, 웨스턴 블롯에 의한 해석으로부터 mTOR의 시그널 억제는 TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제의 활성화를 억제하는 것이 나타났다.
(실시예 9: 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 생산에 대한 mTOR siRNA의 억제 효과)
본 실시예에서는 mTOR 인히비터의 다른 대표예인 mTOR siRNA의, TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 생산에 대한 억제 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분간 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
12웰 플레이트에 iFECD를 1웰당 3×104개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 24시간 후 배지를 제거하고, Lipofectamine(invitrogen, 92008) 및 3pmol의 mTOR siRNA(Ambion, AS026M0L)를 첨가하여 24시간 배양하였다(배지: OptiMEM-I(invitrogen, 31985-088)). 사용한 mTOR siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 센스쇄 및 서열 번호 2에 나타나는 안티센스쇄를 가진다. 24시간 후 배지를 제거하고, 37℃(5% CO2)에서 48시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 48시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 GF-β2(Wako, 200-19911)가 들어간 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지: DMEM+2% FBS+1% P/S). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 단백질의 웨스턴 블롯을 행하였다.
1) 단백질의 회수
부유 및 죽은 세포도 회수하기 위해 빙상에서 배지를 회수하고, 세포를 1×PBS(-)로 2회 세정한 용액도 회수하여 4℃, 800g으로 12분 원심하여 상청을 버리고 침전물을 얻었다. 세정한 세포는 빙상에서 단백질 추출용 완충액(RIPA; 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 1% NP-40)을 더하여 단백질을 추출하였다. 그 후, 상기 부유 및 죽은 세포의 원심 후의 침전물도 함께 현탁하여 추출하였다. 회수한 액을 초음파 장치(BIORUPTOR, TOSHO DENKI 제품)로 냉수 중에서 30초, 3회 분쇄 후에 4℃, 15000rpm으로 10분 원심하여 단백질의 상청을 회수하였다.
2) 웨스턴 블롯법
상기 추출한 단백질 7μg을 SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 1차 항체는 마우스 항 Fibronectin 항체(BDBioscience, 610077), 마우스 항 GAPDH 항체(MBL사, M171-3)를 이용하였다. 2차 항체는 페록시다아제로 표지한 항토끼 항체, 항마우스 항체(GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V)를 이용하였다. 1차 항체는 토끼 항 Caspase 3항체: 1000배 희석, 토끼 항 PARP 항체: 2000배 희석, 마우스 항 GAPDH 항체: 5000배 희석하고, 2차 항체는 5000배 희석하였다. 검출에는 Chemi Lumi ONE Ultra(나칼라이 테스크, 11644-40)를 사용하였다. 검출한 밴드의 강도는 루미노-이미지 애널라이저 LAS-4000mini(후지필름사) 및 ImageQuantTM software(GE Healthcare사)에 의해 해석하였다.
(결과)
(mTOR siRNA는 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 생산을 억제함)
도 9에 결과를 나타낸다. mTOR siRNA를 사용하지 않고 재조합 인간 TGF-β2에 의해 자극한 경우 iFECD에서 피브로넥틴의 생산이 인정되었다. 한편, mTOR siRNA 첨가군에서는 피브로넥틴의 생산은 거의 확인되지 않았다. 따라서, 웨스턴 블롯에 의한 해석으로부터 mTOR siRNA는 재조합 인간 TGF-β2에 의해 유도되는 피브로넥틴의 발현을 억제하는 것이 인정되었다.
(실시예 10: TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제 활성에 대한 각 mTOR 인히비터의 억제 효과)
본 실시예에서는 각종 mTOR 인히비터의, TGF-β2에 의해 유도되는 카스파제 활성에 대한 억제 효과를 실증하였다.
(재료 및 방법)
iFECD를 배양 중의 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 사전에 37℃로 따뜻하게 해 둔 1×PBS(-)를 첨가하고 세정을 행하였다. 이 작업을 2회 반복하였다. 다시 1×PBS(-)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 3분 인큐베이트하였다. PBS(-) 제거 후, 0.05% Trypsin-EDTA(나칼라이 테스크, 32778-34)를 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 5분 인큐베이트하였다. 그 후, 배지에서 현탁하고 1500rpm으로 3분 원심함으로써 세포를 회수하였다. 배지는 DMEM(나칼라이 테스크, 08456-36)+10% FBS(Biowest, S1820-500)+1% P/S(나칼라이 테스크, 26252-94)를 사용하였다.
96웰 플레이트에 불사화 FECD 환자 유래 각막 내피 세포(로트: iFECD3-5)를 1웰당 4×103개의 비율로 파종하고 37℃(5% CO2)에서 24시간 배양하였다(배지: DMEM+10% FBS+1% P/S). 24시간 후 배지를 제거하고, 각 mTOR 인히비터를 첨가하여 24시간 배양하였다(배지: DMEM+2% FBS+1% P/S). 24시간 후 배지를 제거하고, 10ng/ml의 재조합 인간 TGF-β2(Wako, 200-19911) 및 각 mTOR 인히비터를 함유하는 배지를 첨가하여 24시간 배양을 행하였다(배지: DMEM+2% FBS+1% P/S). 24시간 후, 위상차 현미경 하에서 세포 형태 및 아포토시스를 관찰하였다.
관찰 후, 이하의 순서로 Caspase-Glo(등록상표) 3/7 Assay에 의한 카스파제 3/7 활성의 측정을 행하였다.
1웰당 50μl가 되도록 배지를 버리고, Caspase Glo(등록상표) 3/7 Assay Reagent(Caspase-Glo(등록상표) 3/7 Assay Buffer와 Caspase-Glo(등록상표) 3/7 Assay Substrate의 혼합액)(Promega, G8091) 용액을 배지와 1:1이 되도록 50μl/well 더하였다. 여기에서의 작업은 차광으로 행하였다. 셰이커를 120분-1 정도로 2분 잘 혼합하여 실온에서 40분 정치(靜置)시켰다. 정치 후, Assay plate(Corning, 3912, Assay plate 96well, white polystyrene)로 80μl를 옮기고 GloMax-Multi Detection System(Promega, E7051)을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
본 실시예에서 사용한 mTOR 인히비터는 이하와 같다.
·라파마이신(Wako, #53123-88-9)
·에베로리무스(Cayman Chemical, #11597)
·템시로리무스(Tocris Bioscience, #5264)
·PI-103(Cayman Chemical, #10009209)
·CC-223(Cayman Chemical, #19917)
·INK128(Cayman Chemical, #11811)
·AZD8055(Cayman Chemical, #16978)
·KU 0063794(Tocris Bioscience, #3725)
(결과)
(라파마이신)
결과를 도 10에 나타낸다. Caspase-Glo(등록상표) 3/7 Assay는 아포토시스 유도에 따른 카스파제 3/7의 활성을 측정할 수 있다. 카스파제 3/7의 활성이 높을수록 세포 장해가 유도되어 있음을 나타낸다. 도 10으로부터 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01nM의 라파마이신을 첨가한 경우는 컨트롤과 비교하여 카스파제 3/7의 활성에 유의미한 차이는 인정되지 않았다. 한편, 0.1, 1, 10, 100nM의 라파마이신을 첨가하면 컨트롤군과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다. 0.1nM라는 매우 낮은 농도에서도 라파마이신은 카스파제 3/7 활성을 유의미하게 억제하는 것이 명백해졌다.
(에베로리무스)
결과를 도 11에 나타낸다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1μM의 에베로리무스를 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다. 0.0001μM라는 매우 낮은 농도에서도 에베로리무스는 카스파제 3/7 활성을 유의미하게 억제하는 것이 명백해졌다.
(템시로리무스)
결과를 도 12에 나타낸다. 0.000001μM의 템시로리무스를 첨가한 경우는 컨트롤과 비교하여 카스파제 3/7의 활성에 유의미한 차이는 인정되지 않았다. 한편, 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μM의 템시로리무스를 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다. 0.00001μM라는 매우 낮은 농도에서도 템시로리무스는 카스파제 3/7 활성을 유의미하게 억제하는 것이 명백해졌다.
(PI-103)
결과를 도 13에 나타낸다. 1μM의 PI-103을 첨가한 경우는 컨트롤과 비교하여 카스파제 3/7의 활성에 유의미한 차이는 인정되지 않았다. 한편, 0.001, 0.01, 0.1μM의 PI-103을 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다.
(CC-223)
결과를 도 14에 나타낸다. 0.001, 0.01, 0.1, 1μM의 CC-223을 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다.
(INK128)
결과를 도 15에 나타낸다. 0.001, 0.01, 0.1, 1μM의 INK128을 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다.
(AZD8055)
결과를 도 16에 나타낸다. 0.01, 0.1, 1μM의 AZD8055를 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다.
(KU 0063794)
결과를 도 17에 나타낸다. 0.001, 0.01μM의 KU 0063794를 첨가한 경우는 컨트롤과 비교하여 카스파제 3/7의 활성에 유의미한 차이는 인정되지 않았다. 한편, 0.1, 1μM의 KU 0063794를 첨가하면 컨트롤과 비교하여 유의미하게 카스파제 3/7의 활성이 억제되었음을 인정하였다.
(실시예 11: 마우스 모델에서의 in vivo 평가)
본 실시예에서는 푹스 각막 내피 디스트로피 마우스 모델을 이용한 평가계에서의 mTOR 인히비터의 in vivo로의 효과를 실증하였다.
상세하게는 본 실시예에서는 푹스 각막 내피 디스트로피의 모델 마우스인 8형 콜라겐의 변이를 갖는 마우스(Col8a2 Q455K/Q455K)에 mTOR 인히비터의 점안을 행하여 in vivo에서의 효과를 확인하였다.
(재료 및 방법)
푹스 각막 내피 디스트로피의 모델 마우스인 Alpha2 Collagen VIII(Col8a2) Q455K 노크인 마우스(Hum Mol Genet. 2012 Jan 15; 21(2): 384-93.)를 이용하여 in vivo에서의 평가를 행하였다. 이 모델 마우스는 인간에서의 푹스 각막 내피 디스트로피에 인정되는 것과 같이 guttae라고 불리는 세포외 매트릭스(콜라겐이나 피브로넥틴 등)의 각막 내피 기저막(데스메막)에의 침착 및 각막 내피 장해에 의한 세포 밀도 감소를 인정하기 때문에 푹스 각막 내피 디스트로피의 좋은 모델이라고 한다.
이러한 마우스에 대해 mTOR 인히비터를 점안 투여, 전방내 투여, 유리체내 투여, 결막하 투여, 전신 투여를 행하거나 혹은 유전자 치료에 의해 각막 내피의 mTOR 경로를 저해함으로써 푹스 각막 내피 디스트로피의 치료 또는 발증을 예방 혹은 병태의 진행을 늦출 수 있기 때문에 본 실시예에 있어서 효과 확인을 위해 이용하였다.
(mTOR 인히비터 점안제의 조제)
mTOR 인히비터의 점안제로서 토리셀(등록상표) 점적 정주액 25mg(화이자저 주식회사)(템시로리무스)을 이용하였다. 본 제품과 본 제품에 첨부되어 있는 희석용 액을 2:3의 비율로 혼합하여 9.7mM 혼합액 92.78μl를 제작하였다. 나아가 오츠카 생식주(오츠카 제약 주식회사)(생리식염액) 807.22μl로 희석하여 1mM 혼합액 900μl를 1.5ml 튜브에 조제하였다. 다음으로 제작한 1mM 혼합액 9μl와 오츠카 생식주 891μl를 이용하여 10μM 혼합액 900μl를 조제하였다. 조제 후, 1.5ml 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 차광 상태로 하고 4℃ 냉장고에서 저장하였다.
(마우스에 대한 점안 시험)
푹스 각막 내피 디스트로피(FECD)의 모델 마우스인 8형 콜라겐의 변이를 갖는 마우스(Col8a2Q455K / Q455K)를 이용하였다(Johns Hopkins University로부터 입수함). 점안 시험 전의 각막 내피상으로부터 FECD의 중증도의 그레이딩을 행하고, 동일한 정도의 증상을 갖는 생후 20~24주령의 FECD 모델 마우스를 이용하였다. 조제한 mTOR 인히비터 점안제(1mM, 10μM)를 마우스 45마리에 대해 매일 아침 저녁 2회 좌우의 눈 2μl씩 점안하였다. 컨트롤로는 오츠카 생식주를 이용하였다. 점안 기간은 3개월로 하고, 그동안 실험 담당자는 mTOR 인히비터 점안제 및 컨트롤 점안제(오츠카 생식주)에 대해 블라인드의 상태로 실험을 행하였다.
(점안제의 유효성 평가)
점안 시험 개시 전에 접촉식 각막 내피 스페큘러(KSSP slit-scanning wide-field contact specular microscope(Konan medical Inc., Hyogo, Japan))로 각막 내피상을 관찰하여 그레이딩을 행하였다. 점안 시험 개시 후 4주간 간격으로 접촉식 각막 내피 스페큘러를 이용하여 마우스의 각막 내피상을 관찰하여 mTOR 인히비터 점안제의 유효성을 평가하였다.
(결과)
mTOR 인히비터 점안제(1mM)를 매일 아침 저녁 2회 좌우의 눈에 2μl씩 2개월간 점안한 FECD 모델 마우스에서의 접촉식 각막 내피 스페큘러에 의해 관찰되는 각막 내피 세포상의 대표예를 도 19에 나타낸다. 컨트롤로서 생리적 식염수를 점안한 것을 나타낸다. 컨트롤에 비해 mTOR 인히비터 점안제의 점안을 행한 개체에서는 각막 내피 세포의 크기가 작고 세포 밀도가 높다. 나아가 접촉식 각막 내피 스페큘러에 의해 흑색으로 관찰되는 구테(guttae)라고 불리는 세포외 매트릭스의 사마귀 형상의 침착상의 발생이 억제되었다(도 19).
컨트롤의 각막 내피 세포 밀도가 평균 1558개/㎟인 것에 반해 mTOR 인히비터 점안군에서는 평균 1957개/㎟로 유의미하게 높고, FECD 모델 마우스에서 인정되는 각막 내피 세포 밀도 감소가 억제되었다(도 20). 이는 FECD 환자에 있어서 mTOR 인히비터의 점안 투여에 의해 각막 내피 세포 감소를 억제함으로써 각막 내피 세포 밀도가 통상 약 1000개/㎟ 이하가 되었을 때에 인정되는 경우가 많은 각막 실질 부종, 각막 상피 부종 등의 발생을 예방할 수 있음을 시사한다.
또한, 구테(guttae)의 범위는 컨트롤이 평균 3.02%인 것에 반해 mTOR 인히비터 점안군에서는 평균 0.58%로 유의미하게 낮고, FECD 모델 마우스에서 인정되는 구테의 발생이 억제되었다(도 21). 15마리의 마우스에서 동일한 해석을 한 바, Guttae의 범위에 대해 통계학적 유의차를 볼 수 있었다. 구테는 각막 실질 부종, 각막 상피 부종을 가지지 않는 조기의 FECD 환자에서조차 광의 난반사 등에 의한 시기능의 저하를 초래하는 것이 알려져 있다. 따라서, 이 결과는 FECD 환자에 있어서 mTOR 인히비터의 점안 투여에 의해 구테의 발생을 억제함으로써 광의 난반사에 의한 시기능의 저하를 억제할 수 있음을 시사한다.
(실시예 12: 진단 및 치료예)
푹스 각막 내피 디스트로피 및 유사한 각막 내피 질환으로 진단되었을 때에(구체예로서는 1) 세극등 현미경 검사에 의한 구테 형성, 데스메막 비후, 각막 상피 부종, 각막 실질 부종의 관찰, 2) 스페큘러 마이크로스코프에 의한 구테상, 각막 내피 장해상의 관찰, 3) 펜타캠, OCT, 초음파 각막 두께 측정 장치 등에 의한 각막 부종의 관찰, 4) 유전자 진단에 의해 고위험으로 판단된 경우) 사용한다. 본 발명의 조성물을 점안약, 전방내 주사, 서방제를 이용한 투여, 유리체내 주사, 결막하 주사로서 이용하여 치료할 수 있다.
유효 성분 이외의 각 성분으로서는 예를 들어 일본약국방 또는 그 등가물에 적합한 시판의 것을 이용할 수 있다.
(실시예 13: 점안제의 조제예)
본 실시예에서는 제제예로서 mTOR 인히비터를 함유하는 점안제를 이하와 같이 제조한다.
각 농도의 피험 물질의 조성을 이하에 나타낸다.
라파마이신 유효량(예를 들어 종농도 0.1mM)
염화나트륨 0.85g
인산이수소나트륨 이수화물 0.1g
(임의로) 벤잘코늄 염화물 0.005g
수산화나트륨 적량
정제수 적량
전량 100mL(pH 7.0)
농도는 이하로 이루어지는 베이스제를 이용하여 희석해도 된다.
염화나트륨 0.85g
인산이수소나트륨 이수화물 0.1g
(임의로) 벤잘코늄 염화물 0.005g
수산화나트륨 적량
정제수 적량
전량 100mL(pH 7.0)
(실시예 14: 마우스에의 점안 시험)
본 실시예에서는 푹스 각막 내피 디스트로피의 모델 마우스인 8형 콜라겐의 변이를 갖는 마우스(Col8a2 Q455K/Q455K)에 mTOR 인히비터의 점안을 행하였다. 이 모델 마우스는 푹스 각막 내피 디스트로피에 인정되는 세포외 매트릭스(콜라겐이나 피브로넥틴 등)의 침착을 나타낸다.
(재료 및 방법)
이상과 같이 본 발명의 바람직한 실시형태를 이용하여 본 발명을 예시하였지만, 본 발명은 청구범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 인용한 특허, 특허출원 및 문헌은 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되어 있는 것과 같이 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 하는 것으로 이해된다. 본원은 일본특허출원 2017-118619호(2017년 6월 16일 출원)에 대해 우선권 주장을 행하는 것으로, 이들 내용 전체가 본 명세서에서 참조로서 원용된다.
각막 내피 세포에서의 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β) 시그널 및/또는 세포외 매트릭스의 과잉 발현에 기인하는 각막 내피 장해의 치료 또는 예방을 위한 의약이 제공되고, 특히 푹스 각막 내피 디스트로피의 각막 내피 장해를 치료 또는 예방하기 위한 의약이 제공되었다. 이러한 기술에 기초한 제제 등에 관련되는 기술에 관여하는 산업(제약 등)에 있어서 이용 가능한 기술이 제공된다.
<서열표 프리텍스트>
서열 번호 1: mTOR siRNA의 센스쇄
서열 번호 2: mTOR siRNA의 안티센스쇄
SEQUENCE LISTING <110> The Doshisha <120> A medicament for treating or preventing conditions, disorders or diseases of the eye comprising mTOR inhibitors and use of the same <130> DU004PCT <150> JP 2017-118619 <151> 2017-06-16 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sense strand of siRNA <400> 1 cauucgcauu caguccauat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Antisense strand of siRNA <400> 2 uauggacuga augcgaauga t 21

Claims (20)

  1. mTOR 인히비터를 포함하는, 눈의 증상, 장해 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 눈의 증상, 장해 또는 질환이 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β)에 기인하는 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 각막 이식 후 장해, 각막 내피염, 외상, 안과 수술, 안과 레이저 수술 후의 장해, 가령, 후부 다형성 각막 디스트로피(PPD), 선천성 유전성 각막 내피 디스트로피(CHED), 특발성 각막 내피 장해 및 사이토메가로바이러스 각막 내피염으로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 세포외 매트릭스(ECM)의 과잉 발현에 기인하는 것인 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 각막 내피의 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피, 구테의 형성, 데스메막의 비후, 각막 두께의 비후, 혼탁, 반흔, 각막 편운, 각막반, 각막 백반, 눈부심 및 안개낌으로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증상, 장해 또는 질환은 푹스 각막 내피 디스트로피를 포함하는 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스, 에베로리무스, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, 복스탈리시브, 리다포로리무스, NVP-BEZ235, CZ415, 토르키니브, 토린 1, 오미팔리시브, OSI-027, PF-04691502, 아피톨리시브, WYE-354, 비스투서티브, 토린 2, 타크롤리무스, GSK1059615, 게다톨리시브, WYE-125132, BGT226, 팔로미드 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스 및 크리소판산으로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 인히비터가 mTOR 유전자의 발현 억제 물질인 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA, 안티센스 핵산 또는 리보자임인 조성물.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    상기 mTOR 유전자의 발현 억제 물질은 mTOR 유전자에 대한 siRNA이며, 이 siRNA는 서열 번호 1에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 센스쇄와, 서열 번호 2에 나타나는 핵산 서열 또는 1~3염기의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 핵산 서열로 이루어지는 안티센스쇄를 포함하는 조성물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 인히비터가 라파마이신, 템시로리무스 및 에베로리무스로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 점안제인 조성물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1nM로 상기 조성물 중에 존재하는 조성물.
  15. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 라파마이신이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01nM로 상기 조성물 중에 존재하는 조성물.
  17. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 템시로리무스이며, 적어도 약 0.01mM로 상기 점안제 중에 존재하는 조성물.
  18. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1nM로 상기 조성물 중에 존재하는 조성물.
  19. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 점안제이고, 상기 mTOR 인히비터가 에베로리무스이며, 적어도 약 0.1mM로 상기 점안제 중에 존재하는 조성물.
  20. mTOR 인히비터를 포함하는, 각막 내피 세포의 저장 및/또는 증식 혹은 증식의 유지에 사용하기 위한 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20200121652A1 (en) * 2017-06-16 2020-04-23 The Doshisha Compounds having caspase inhibitory activity, pharmaceutical agent containing said compounds and for treating or preventing corneal endothelial symptoms, disorders, or diseases, and application of said pharmaceutical agent

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070105761A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-10 Combinatorx, Incorporated Methods, compositions, and kits for the treatment of opthalmic disorders
WO2010129622A1 (en) * 2009-05-04 2010-11-11 Macusight, Inc. Mtor pathway inhibitors for treating ocular disorders
WO2013086236A2 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Advanced Cell Technology, Inc. Method of directed differentiation producing corneal endothelial cells, compositions thereof, and uses thereof

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA924953B (en) 1991-07-25 1993-04-28 Univ Louisville Res Found Method of treating ocular inflammation
JP4687837B2 (ja) 1999-09-29 2011-05-25 ライオン株式会社 眼科用組成物
US6730691B1 (en) 2000-02-10 2004-05-04 Miles A. Galin Uses of alpha adrenergic blocking agents
JP2004331501A (ja) 2001-03-01 2004-11-25 M's Science Corp 新規化合物またはその誘導体を含有する抗炎症剤
JPWO2003011276A1 (ja) 2001-07-26 2004-11-18 株式会社エムズサイエンス ＮＦκＢ阻害剤
JP4296345B2 (ja) 2002-03-29 2009-07-15 参天製薬株式会社 ２−フェニルベンゾチアゾリン誘導体
CN1642929B (zh) 2002-03-29 2010-05-12 参天制药株式会社 含有2-苯基苯并噻唑啉衍生物的κ-阿片样物质受体激动剂
JP4482726B2 (ja) 2002-08-29 2010-06-16 参天製薬株式会社 Ｒｈｏキナーゼ阻害剤とプロスタグランジン類からなる緑内障治療剤
EP1539157B1 (en) 2002-09-18 2013-08-21 Trustees Of The University Of Pennsylvania Rapamycin for use in inhibiting or preventing choroidal neovascularization
JP4243701B2 (ja) 2002-09-25 2009-03-25 参天製薬株式会社 ベンズアミド誘導体を有効成分とするリウマチ治療薬
JP4314433B2 (ja) 2002-11-18 2009-08-19 参天製薬株式会社 Ｒｈｏキナーゼ阻害剤とβ遮断薬からなる緑内障治療剤
JP2004256524A (ja) 2003-02-05 2004-09-16 Santen Pharmaceut Co Ltd ステロイド副作用抑制組成物
WO2004069822A1 (ja) 2003-02-05 2004-08-19 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. ステロイド副作用抑制組成物
JP2004254509A (ja) 2003-02-24 2004-09-16 Japan Science & Technology Agency 形質転換不死化細胞株の樹立方法とその細胞株
JP4360292B2 (ja) 2003-07-04 2009-11-11 参天製薬株式会社 疼痛閾値低下抑制剤
EP1647274A4 (en) 2003-07-17 2008-12-10 Ono Pharmaceutical Co REMEDY AGAINST PRURIT COMPRISING A PIPERIDINE DERIVATIVE AS AN ACTIVE INGREDIENT
JP2005047909A (ja) 2003-07-17 2005-02-24 Santen Pharmaceut Co Ltd ピペリジン誘導体を有効成分とする掻痒治療剤
US7083802B2 (en) 2003-07-31 2006-08-01 Advanced Ocular Systems Limited Treatment of ocular disease
JP2007008816A (ja) 2003-10-15 2007-01-18 Ube Ind Ltd 新規イソキノリン誘導体
JP2007015928A (ja) 2003-10-15 2007-01-25 Ube Ind Ltd 新規オレフィン誘導体
JP4110324B2 (ja) 2003-10-15 2008-07-02 宇部興産株式会社 新規インダゾール誘導体
JP2005336173A (ja) 2004-04-27 2005-12-08 Santen Pharmaceut Co Ltd 骨粗鬆症治療剤
WO2005102331A1 (ja) 2004-04-27 2005-11-03 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. 骨粗鬆症治療剤
JP2005336174A (ja) 2004-04-27 2005-12-08 Santen Pharmaceut Co Ltd 変形性関節症治療剤
FR2871693B1 (fr) 2004-06-17 2006-08-25 Galderma Sa Utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant du calcitriol et du propionate de clobetasol pour le traitement du psoriasis
JP2007297283A (ja) 2004-07-28 2007-11-15 Santen Pharmaceut Co Ltd 新規桂皮酸関連化合物
JP2006117653A (ja) 2004-09-27 2006-05-11 Santen Pharmaceut Co Ltd 皮膚疾患治療剤
JP2006117654A (ja) 2004-09-27 2006-05-11 Santen Pharmaceut Co Ltd 呼吸器疾患治療剤
JP4885513B2 (ja) 2004-11-01 2012-02-29 ロート製薬株式会社 オキシメタゾリン含有水性組成物
US20060122282A1 (en) 2004-12-03 2006-06-08 Todd Leonard Method for treating skin disorders with xanthophylls
JP2006254896A (ja) 2005-01-07 2006-09-28 Effector Cell Institute Inc ヒト肝細胞様細胞およびその利用
CA2512667A1 (en) 2005-01-07 2006-07-07 Takahiro Ochiya Human hepatocyte-like cells and uses thereof
US8663639B2 (en) 2005-02-09 2014-03-04 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Formulations for treating ocular diseases and conditions
KR101387456B1 (ko) 2005-02-09 2014-04-21 산텐 세이야꾸 가부시키가이샤 질환 또는 상태의 치료를 위한 액체 제제
JP2006257080A (ja) 2005-02-18 2006-09-28 Santen Pharmaceut Co Ltd ステロイド化合物の副作用軽減または回避方法
JP4134093B2 (ja) 2005-04-27 2008-08-13 Ｎｅｃインフロンティア株式会社 ハンドベルトを備える携帯端末
JP4922588B2 (ja) 2005-09-13 2012-04-25 参天製薬株式会社 角結膜障害治療剤
JP4825636B2 (ja) 2005-09-14 2011-11-30 参天製薬株式会社 グルココルチコイド受容体結合活性を有する新規１，２−ジヒドロキノリン誘導体
CN102229562B (zh) 2005-09-14 2013-11-13 参天制药株式会社 具有糖皮质激素受体结合活性的1,2-二氢喹啉衍生物
US20070196350A1 (en) 2006-02-22 2007-08-23 Bartels Stephen P Compositions and Methods for Effecting Controlled Posterior Vitreous Detachment
JP5054996B2 (ja) 2006-03-14 2012-10-24 参天製薬株式会社 グルココルチコイド受容体結合活性を有する新規１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン誘導体
DK1995242T3 (da) 2006-03-14 2012-12-17 Santen Pharmaceutical Co Ltd Hidtil ukendt 1,2,3,4-tetrahydroquinoxalinderivat med glucocorticoidreceptorbindingsaktivitet.
JP2007291091A (ja) 2006-03-30 2007-11-08 Santen Pharmaceut Co Ltd 角結膜障害治療剤
US20070280902A1 (en) 2006-06-01 2007-12-06 Laura Rabinovich-Guilatt Method for treating eye disease or conditions affecting the posterior segment of the eye
TW200815398A (en) 2006-06-08 2008-04-01 Ube Industries A novel indazole derivative having spirocyclic structure in the side chain
MX2009002235A (es) 2006-08-30 2009-03-13 Jagotec Ag Formulaciones de dosis oral, solidas, de liberacion controlada que comprenden nisoldipina.
ES2391910T3 (es) 2006-11-14 2012-12-03 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Derivado de 1,2-dihidroquinolina que tiene un grupo (fenil sustituido o heterociclil sustituido)carboniloxi-alquilo inferior y un grupo fenilo introducido por éster como sustituyentes
US8063034B2 (en) 2007-01-29 2011-11-22 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Oxadiazole derivatives and thiadiazole derivatives having neovascularization inhibitory activity
JP2008255112A (ja) 2007-03-13 2008-10-23 Santen Pharmaceut Co Ltd ２，２，４−トリメチル−６−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン誘導体からなるグルココルチコイド受容体アゴニスト
CN101646441B (zh) 2007-03-29 2012-09-12 参天制药株式会社 含有氟米龙的混悬型滴眼剂
AU2008234141A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Combinatorx Incorporated Methods for treating neovascular ocular diseases
MX2009012885A (es) 2007-05-29 2009-12-10 Santen Pharmaceutical Co Ltd Nuevo derivado de 1,2,3,4-tetrahidroquinoxalina que tiene, como sustituyente, grupo fenilo que tiene estructura de ester de acido sulfonico o estructura de amida de acido sulfonico introducida en este, y tiene actividad de enlace al receptor de gluco
US8110226B2 (en) 2007-07-20 2012-02-07 Mylan Pharmaceuticals Inc. Drug formulations having inert sealed cores
JP2009084273A (ja) 2007-09-13 2009-04-23 Santen Pharmaceut Co Ltd １，３，３−トリメチル−７−フェニル−３，４−ジヒドロ−１ｈ−キノキサリン−２−オン誘導体からなるグルココルチコイド受容体アゴニスト
WO2009035068A1 (ja) 2007-09-13 2009-03-19 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. 新規１，３，３－トリメチル－７－フェニル－３，４－ジヒドロ－１ｈ－キノキサリン－２－オン誘導体
MX2010003364A (es) 2007-10-08 2010-07-06 Lux Biosciences Inc Composiciones oftalmicas que comprenden inhibidores de calcineurina o inhibidores de mtor.
EP2229174A1 (en) 2007-12-04 2010-09-22 Novagali Pharma S.A. Compositions comprising corticosteroid prodrug such as dexamethasone palmitate for the treatment of eye disorders
GEP20146061B (en) 2008-05-12 2014-03-25 Santen Pharmaceutical Co Ltd Glucocorticoid receptor agonist composed of 2,2,4-trimethyl-6-phenyl- 1,2-dihydroquinoline derivative having substituted oxy group
JP2010077119A (ja) 2008-08-25 2010-04-08 Santen Pharmaceut Co Ltd ウレイド基、アミノカルボニル基及び置換フェニル基を置換基として有するピロール誘導体を有効成分として含有する骨・関節疾患の予防又は治療剤
JP2010090117A (ja) 2008-09-12 2010-04-22 Santen Pharmaceut Co Ltd スルホン酸エステル構造を導入したフェニル基を置換基として有する新規１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン誘導体からなるグルココルチコイド受容体アゴニスト
JP2010154842A (ja) 2008-12-03 2010-07-15 Koji Kawakami Ｅｇｆｒを標的にした新規抗がんキメラペプチド
MX348282B (es) 2009-02-13 2017-06-05 Romark Laboratories L C * Formulaciones farmaceuticas de liberacion controlada de nitazoxanida.
CN102858997B (zh) 2009-11-02 2014-06-18 新加坡科技研究局 用于监测细胞状态和用于永生间充质干细胞的方法
AU2010335654B2 (en) 2009-12-22 2015-04-09 Leo Pharma A/S Cutaneous composition comprising vitamin D analogue and a mixture of solvent and surfactants
WO2011088209A2 (en) 2010-01-13 2011-07-21 Cytochroma Inc. 1-deoxy analogs of vitamin d-related compounds
WO2011098578A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Bioneer A/S Liposome system for ocular administration
WO2011129371A1 (ja) 2010-04-14 2011-10-20 国立大学法人鳥取大学 ５－ＦＵ単独及びＩＦＮ－α／５－ＦＵ併用時の抗腫瘍効果を増強する遺伝子群
KR102173938B1 (ko) 2010-08-18 2020-11-04 테레사 데이셔 림프양 조직에 줄기 세포와 조상 세포 결합을 저해하고, 그리고 림프 조직에서 배 중심을 재생하기 위한 조성물과 방법
KR101258166B1 (ko) * 2010-09-01 2013-04-25 연세대학교 산학협력단 Ｔｇｆｂｉ 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법
US9737531B2 (en) 2012-07-12 2017-08-22 Glytech, Llc Composition and method for treatment of depression and psychosis in humans
KR20140002735A (ko) 2011-02-09 2014-01-08 산텐 세이야꾸 가부시키가이샤 3-히드록시-6H-벤조[c]크로멘-6-온 유도체 및 그 제조 방법
ES2897740T3 (es) 2011-12-28 2022-03-02 Kyoto Prefectural Public Univ Corp Normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea
US20140371459A1 (en) 2012-01-20 2014-12-18 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Industrial process for preparation of 1,2-dihydroquinoline derivative or a salt thereof, and intermediate for preparation thereof
JP2014019650A (ja) 2012-07-13 2014-02-03 Santen Pharmaceut Co Ltd スルホンアミド化合物とタフルプロストの組み合わせ
TWI643619B (zh) 2012-07-13 2018-12-11 日商參天製藥股份有限公司 一種用於預防或治療青光眼或高眼壓症、或降低眼壓之醫藥組合物及其用途
JP2014139161A (ja) 2012-12-20 2014-07-31 Santen Pharmaceut Co Ltd １，２−ジヒドロキノリン合成中間体の製造方法
WO2014117117A1 (en) 2013-01-28 2014-07-31 The Johns Hopkins University Chronic nsaid treatment for fuchs endothelial corneal dystrophy
WO2014148574A1 (ja) 2013-03-22 2014-09-25 参天製薬株式会社 Ｉｌ－２産生抑制
JP2014196268A (ja) 2013-03-29 2014-10-16 公益財団法人東京都医学総合研究所 フルベストラントを含む神経変性疾患の治療又は予防のための医薬組成物
AP2015008875A0 (en) 2013-05-10 2015-11-30 Cipla Ltd Low dose pharmaceutical composition
JP6497812B2 (ja) 2013-06-28 2019-04-10 学校法人慶應義塾 マイボーム腺機能不全の処置剤
US11730722B2 (en) 2013-07-30 2023-08-22 Kyoto Prefectural Public University Corporation Corneal endothelium ECM therapeutic medicaments
WO2015015655A1 (ja) 2013-07-30 2015-02-05 京都府公立大学法人 フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法
EP3031802A4 (en) 2013-08-09 2017-07-12 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Production method for 3, 3-dimethyl-3, 4-dihydro-1h-quinoxaline-2-one derivative and intermediate for said production method
US11382904B2 (en) 2013-10-31 2022-07-12 Kyoto Prefectural Public University Corporation Therapeutic drug for diseases related to endoplasmic reticulum cell death in corneal endothelium
JP5846338B2 (ja) 2014-01-10 2016-01-20 参天製薬株式会社 ピリジルアミノ酢酸化合物を含む医薬製剤
KR102111157B1 (ko) 2014-01-10 2020-05-14 산텐 세이야꾸 가부시키가이샤 피리딜아미노아세트산 화합물과 폴리옥시에틸렌 피마자유를 함유하는 의약 조성물
GEP20196982B (en) 2014-01-10 2019-06-25 Pharmaceutical Co Ltd Santen Pharmaceutical composition containing pyridylamino acetic acid compound
CN106459137B (zh) 2014-05-01 2019-04-12 整体生物系统有限责任公司 用于治疗眼部病症的膜附着性自组装体系
WO2015169944A1 (en) 2014-05-08 2015-11-12 Panoptes Pharma Ges.M.B.H. Compounds for treating ophthalmic diseases and disorders
WO2016047592A1 (ja) 2014-09-22 2016-03-31 国立研究開発法人科学技術振興機構 抗インフルエンザウイルス剤、及び抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法
WO2016187718A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Isa Odidi Controlled extended release pregabalin
JP2016216425A (ja) 2015-05-26 2016-12-22 沢井製薬株式会社 カルベジロール含有錠剤
US20180185489A1 (en) 2015-07-01 2018-07-05 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Depot preparation containing citric acid ester
EA201890570A1 (ru) 2015-08-25 2018-08-31 Сантен Фармасьютикал Ко., Лтд. [4-(1,3,3-триметил-2-оксо-3,4-дигидро-1h-хиноксалин-7-ил)фенокси]этилокси соединение или его соль
JP2017118619A (ja) 2015-12-22 2017-06-29 株式会社日立情報通信エンジニアリング スイッチトキャパシタを備えたレギュレータシステム
EP3381472A4 (en) 2015-12-24 2019-07-31 The Doshisha MEDICINAL PRODUCTS FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF DISTURBANCES CAUSED BY TGF SIGNALS AND USE THEREOF
JP6273636B2 (ja) 2015-12-24 2018-02-07 学校法人同志社 カスパーゼ阻害剤を含む、ＴＧＦ−βに起因する障害を治療または予防するための医薬およびその応用
US11433090B2 (en) 2017-06-16 2022-09-06 The Doshisha mTOR-inhibitor-containing medicine for treating or preventing ophthalmic symptoms, disorders, or diseases, and application thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070105761A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-10 Combinatorx, Incorporated Methods, compositions, and kits for the treatment of opthalmic disorders
WO2010129622A1 (en) * 2009-05-04 2010-11-11 Macusight, Inc. Mtor pathway inhibitors for treating ocular disorders
WO2013086236A2 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Advanced Cell Technology, Inc. Method of directed differentiation producing corneal endothelial cells, compositions thereof, and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Scientific Reports, 7(1), 1-10, 2017. 1. 5. *
비특허문헌 1: Zaniolo K, et al. Exp Eye Res.; 94(1): 22-31. 2012
비특허문헌 2: Azizi B, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2; 52(13): 9291-9297. 2011
비특허문헌 3: Kelliher C. et al. Exp Eye Res Vol.93(6), 880-888, 2011

Also Published As

Publication number Publication date
KR102619458B1 (ko) 2023-12-29
WO2018230711A1 (ja) 2018-12-20
US20230013177A1 (en) 2023-01-19
CA3067332A1 (en) 2018-12-20
JP2019151640A (ja) 2019-09-12
RU2020101227A (ru) 2021-07-16
US11433090B2 (en) 2022-09-06
JP6537092B2 (ja) 2019-07-03
JPWO2018230711A1 (ja) 2019-06-27
EP3639854A1 (en) 2020-04-22
AU2018283250B2 (en) 2022-09-01
EP3639854A4 (en) 2021-03-03
US20210121494A1 (en) 2021-04-29
CN110944668A (zh) 2020-03-31
RU2020101227A3 (ko) 2021-10-14
US20200113925A1 (en) 2020-04-16
AU2018283250A1 (en) 2020-01-16

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